농균 매개 변환은 유전자 변형 감자 식물을 생산하는 쉬운 방법입니다. 특정 유전자 기능 및 장기 생리학에 그들의 기여를 이해 하기 위해. 농균 균 류 균 에 의해 변환 신속 하 게 작동 하는 뿌리를 평가 하기 위한 강력한 도구, 유사한 결과 농업 박테리움 tumefaciens 변환에 의해 얻을 수 있습니다.
이 절차를 시연하는 것은 산드라 페르난데스-피난, 포스트 닥터, 그리고 제니퍼 로페즈, 우리 실험실에서 maste5r의 학생입니다. 효모 추출물 국물 5밀리리터 또는 YEB 배지에서 하룻밤 사이에 단일 아그로박테리움 식민지를 섭씨 28도에서 섭씨 28도에서 항생제로 보충하여 분당 200회전으로 성장하십시오. tumefaciens 변환을 위해, 다음 날 아침 광학 밀도를 측정합니다.
600 나노미터 또는 OD 600의 광학 밀도가 0.6 내지 1에 도달하면, 농균 배양의 원심분리기 1밀리리터및 항생제 없이 신선한 YEB 배지의 1밀리리터로 펠릿을 재보종한다. 두 번째 세척 후, 항생제 없이 신선한 YEB 배지에서 펠릿을 재연하여 0.8의 최종 OD 600을 획득하고 세균세포를 얼음 위에 놓는 적절한 농도로 재차한다. A.rhizogenes를 이용한 식물 변환의 경우, 기증자 공장을 2MS 중간 배양에서 120 x 120 밀리미터 평방 플레이트로 신중하게 이전하고, 외과 바늘을 사용하여 A.rhyzogenes 배양에서 다른 줄기 간극에 3 개의 마이크로리터를 주입합니다.
그런 다음 즉시 0.1 밀리머아 아세토시링존으로 보충된 솔리드 MS 배지를 함유한 새로운 사각형 플레이트로 공장 전체를 즉시 이송합니다. 두 번째 식물을 동일한 플레이트에 배치한 후 동일한 방식으로 변형된 후, 수술용 테이프로 플레이트를 밀봉하고 4일 동안 접시를 성장 캐비닛 내부에 수직으로 놓습니다. A.rhizogenes를 죽이고 4 일 동안 성장 캐비닛 내부에 수직으로 밀봉 된 플레이트를 배치하는 cefotaxime 나트륨으로 보충 MS 매체와 사각형 접시에 식물을 전송합니다.
10~12일 후에는 새로운 털이 많은 뿌리가 나타납니다. 그들의 변환은 형광 스테레오 현미경에 의해 확인될 수 있습니다. 이때, 각 식물의 토착 뿌리를 소비하고, Ms 배지를 가진 새로운 사각형 접시로 식물을 옮기고, 세포메 나트륨으로 보충하여 A.rhizogenes을 죽입니다.
복합 식물을 얻으려면, 형질 털이 뿌리는 CEfotaxime 나트륨으로 보충 된 MS 배지에서 또 다른 3 ~ 4 주 동안 자랄 수 있습니다. A.tumefaciens를 사용하여 식물 변환을 위해. 3~4주 된 식물의 잎을 페트리 접시에 담아 잘라내고 메스를 사용하여 잎 의 중심에서 가장자리까지 1~3개의 가로 컷을 만듭니다.
그리고 페티올을 제외합니다. 즉시 잎을 신선한 2MS 액체 매체의 10 밀리리터가 들어있는 페트리 접시에 넣고 축축한 면을 위로 올려 놓고 접시를 덮습니다. A.tumefaciens 배양의 80 마이크로리터를 액체 배지에 빠르게 추가하고 1분 동안 배지를 부드럽게 저어 세균용 용액을 균질적으로 분배합니다.
그런 다음 조심스럽게 밀봉하고 24도 섭씨 챔버에서 2 일 배양 알루미늄 호일로 접시를 덮습니다. 변환 기간이 끝나면 잎을 축축측으로 위로 옮기고, 냉담한 유도 매체로 옮기고, 성장 캐비닛에서 1주일 동안 핀셋으로 긁어냅니다. 인큐베이션의 끝에서 잎, 축면을 위로 옮기고, 트위저 스크랩 된 촬영 유도 매체에 옮기고, 성장 캐비닛에 잎을 배양한다.
등장 슈트가 약 2센티미터 높이일 때, 각 냉담한 슈트 세 개를 잘라냅니다. 최대 5개의 서로 다른 슈트 변환 이벤트를 세포로메 나트륨으로 보충한 MG 배지를 함유한 개별 배양 플라스크로 배치하고, 슈트가 활발해질 때까지 성장 캐비닛에서 3~4주 간 배양에 적합한 서브세트를 라벨링한다. 인큐베이션이 끝나면 각 이벤트의 가장 활발한 식물을 선택하고 각 플랜트에서 3~4개의 상호 노드로 슈트의 정량 세그먼트를 잘라냅니다.
세그먼트를 세포로메 나트륨으로 보충한 2MS 매체를 포함하는 배양 플라스크에 넣고 활발한 슈트와 뿌리를 개발할 때까지 식물을 재배합니다. 베타 글루쿠로니다제 또는 GUS 히스토케미컬 리포터 유전자 분석작업을 수행하기 위해 2~3주 간 체외식물 배양에 90%의 차가운 아세톤으로 얼음 위에서 20분간 뿌리를 정한다. 고정의 끝에서, 증류수에 뿌리를 두 번 세척하고 20 분 동안 진공 상태에서 신선한 GUS 염색 용액으로 뿌리를 처리합니다.
진공 처리의 끝에, 약 4 시간 동안 어둠 속에서 섭씨 37도에 뿌리를 놓습니다. 파란색이 보이면 70%에탄올로 뿌리를 두 번 씻고 밝은 필드 현미경으로 염색을 시각화합니다. 변형된 털이 많은 뿌리는 녹색 빛으로 조명될 때 붉은 꽃집, 변형되지 않은 아그로박테리움은 이러한 꽃집을 보여주지 않으며, 이는 형질형 털이 많은 뿌리를 식별하기 위한 DS 빨간 변형 마커의 적합성을 나타냅니다.
여기서, A.tumefaciens및 A.rhizogenes에 의해 얻어진 형질형성 털이 뿌리에 의해 얻어진 형질형성 식물의 뿌리에서 GUS 염색이 도시된다. 관찰된 바와 같이, 뿌리는 A, tumefaciens 및 시험관 내 에서 자란, 내피질과 stele 사이 세포 층, 내피에서 파란 얼룩을 보여줍니다. 더 발달된 뿌리에서, 파란색 라벨링은 외신에 대응하는 외부 층의 패치입니다.
A.rhizogenes에 의해 얻어지고, 수경재배에서 자란 변형된 털이 뿌리에서, GUS 마커는 특히 상처부위와 외수성에서 측면 뿌리의 출현에 내분비 내에 위치한다. 빠른 방법 이외에, 아그로박테리움 뿌리겐으로 얻은 형질전환 뿌리는 또한 일부 직접 제어 된 프로세스를 조절 할 수있는 뿌리 유도 플라스미드에서 DNA를 운반했다. 아그로박테리움 맥균유전자로 얻은 형질전환뿌리는 촬영 중에 유지될 수 있지만, 대규모 대중교통 생산을 위해 시험관내로 전파될 때까지 현장에서 사용할 수 있다.
감자 변환은 유전자 기능 및 프로모터 활성화를 확인하고, 또한 높은 농업 적 관심의 종에서 방법론 규칙을 생산하는 좋은 도구를 제공합니다. 유전자 변형 유기체는 환경 오염을 피하기 위해 사용 후 안전하게 폐기해야합니다. 또한 가스 용액에는 독성 시안화물 유도체가 포함되어 있으므로 보호를 착용하고 용액을 안전하게 폐기하십시오.
