农杆菌和根瘤菌--马铃薯介导的马铃薯转化与葡萄染色诱导素基因的启动子活性

农业细菌转化是生产转基因马铃薯植物的一种简单方法。为了了解特定的基因功能及其对器官生理学的贡献。农业细菌根质转化是快速评估基因功能根的一个有力工具，因为农业细菌的转化可以取得类似的结果。

演示这个程序的将是桑德拉·费尔南德斯-皮南，博士后，和詹妮弗·洛佩兹，一个桅杆5r的学生从我们的实验室。首先在5毫升酵母提取物汤（YEB培养剂）中隔夜种植单个农业菌群，在28摄氏度的50毫升离心管中补充抗生素，每分钟旋转200次。对于一个 tumefaciens 的变换，请第二天早上测量光学密度。

当600纳米或OD 600的光学密度达到0.6至1时，将一毫升的农业细菌培养物离心，将颗粒重新在一毫升新鲜YEB介质中，无需抗生素。第二次洗涤后，在没有抗生素的新鲜YEB介质中重新暂停颗粒，以适当的浓度获得最终OD 600的0.8，并将细菌细胞放在冰上。对于使用 A.rhizogenes 进行植物转化，请小心地将供体植物从 2MS 中等培养体转移到 120 乘 120 毫米的方形板，并使用手术针将来自 A.rhyzogenes 培养的三微升注射到不同的茎内皮。

然后立即将整个植物转移到一个新的方形板，其中包含固体MS介质，辅以0.1毫摩尔乙酰西林酮。将第二个植物放在同一个板上后，以相同方式进行转化，用手术胶带密封板，并将板垂直放置在生长柜内四天。将植物转移到含有MS介质的方形板中，并辅以cefotaxime钠，杀死A.rhizogenes，将密封板垂直放在生长柜内四天。

10到12天后，新的毛根会出现。它们的转化可以通过荧光立体显微镜得到确认。此时，切除每株植物的原生根，将植物转移到一个新的方形板与MS介质，辅以cefotaxime钠杀死A.rhizogenes。

为了获得复合植物，让转基因毛根在MS介质中再生长三到四周，辅以cefotaxime钠。用于使用 A.tumefaciens 进行植物改造。在培养皿中切割和放置一个三到四周大的植物的叶子，并使用手术刀将一到三个横向切口从叶子的中心切到边缘，而不切掉叶子的碎片。

并排除小动物。立即将叶子放入含有 10 毫升新鲜 2MS 液体介质的培养皿中，向上加面，并盖住盘子。快速将 80 微升的 A.tumefaciens 培养剂添加到液体介质中，轻轻搅拌介质一分钟，以均匀分布细菌溶液。

然后用铝箔小心地密封并盖上板，在24摄氏度的室内进行为期两天的孵育。在转换期结束时，将叶子的叶面向上，转移到无情的诱导介质上，用钳子刮在生长柜中孵育一周。在孵育结束时，将叶子，轴侧向上，转移到钳子刮的射射诱导介质上，并在生长柜中孵育叶子。

当出现的滑道大约两厘米高时，从每个无情的滑道上切出三个新兴的滑道。将多达五个不同的滑道转化事件放入含有MG介质的单独培养瓶中，并辅以cefotaxime钠，并适当标记该子集，在生长柜中孵育三到四周，直到滑道充满活力。在孵化结束时，选择每个事件中最具活力的植物，并切开滑道的各处，从每个植物中切开三到四个内极。

将片段放入含有 2MS 介质的培养瓶中，并辅以 cefotaxime 钠，然后种植植物，直到它们形成充满活力的滑道和根。要进行β-葡萄糖素酶或GUS组织化学记者基因测定，用90%冷冻丙酮在冰上2至3周的体外植物培养物固定根部。在固定结束时，用蒸馏水洗两次根部，并在真空下用新鲜的GUS染色溶液处理根部20分钟。

在真空处理结束时，将根部在37摄氏度的黑暗中放置约4小时。当蓝色可见时，用70%乙醇洗两次根部，并在明亮的现场显微镜下显示染色。变变的毛质根在绿灯照射时表现出红色荧光，而负控制未转化的农业细菌则没有这种荧光，表明 DS 红色转化标记是否适合识别转基因毛质根。

在这里，显示由 A.tumefaciens 获得的转基因植物根部和 A.rhizogenes 获得的转基因毛根的 GUS 染色。正如观察到的，根随着 A、tumefaciens 和体外生长而转化，在内皮层和骨骼之间的细胞层中表现出蓝色染色。在更发达的根中，蓝色标记在外部层中是零碎的，与外显层相对应。

在由 A.rhizogenes 获得的转化毛根中，在水培中生长，GUS 标记特别位于内皮内皮内，在受伤区域和外皮中出现横向根。除了快速的方法外，用农业细菌根质获得的转基因根也携带来自根诱导质粒的DNA，这可能解除一些直接控制过程的调节。用农业细菌根质获得的转基因毛根可以在它们拍摄时保持，但也可以在现场，直到在体外繁殖，进行大规模的过境生产。

马铃薯转化为检查基因功能和启动子的活化提供了很好的工具，也为高农艺兴趣物种提供了方法规则。转基因生物使用后应安全丢弃，以避免环境污染。此外，气体溶液含有有毒的氰化物衍生物，因此请进行耐磨保护并安全丢弃溶液。