그래서이 방법은 에스트로겐 수용체 알파와 선택적 에스트로겐 수용체 변조기의 메커니즘을 조절하는 에스트로겐 리간드의 능력에 대한 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 간단한 방법이라는 것입니다. 세포내 리간드 의존성 에스트로겐 수용체 알파 리간드 결합 도메인 이질 활성을 입증한다.
절차를 시연하는 것은 태너 제퍼슨, 우리 그룹의 포스트 독 학생이 될 것입니다. 이 방법은 세포에서 에스트로겐 수용체 리간드 결합 도메인 이산화 활성을 검출하기 위해 세 가지 상이한 플라스미드를 사용합니다. pG5-Luc는 이산화 활성의 효능을 검출하기 위한 루시파라제 기자 플라스미드이다.
pBIND 마우스 에스트로겐 수용체 알파 EF는 pG5-Luc 리포터에 대한 GAL4 반응요소에 결합하는 주요 융합 마우스 에스트로겐 알파 리간드 결합 도메인 발현 플라스미드에 갈라토세 반응성 전사 인자 GAL4 DNA 결합이다. pACT 마우스 에스트로겐 수용체 알파 EF는 포진 심플렉스 바이러스 를 변형시키는 세그먼트 단백질 VP16 활성화 도메인 융합 마우스 에스트로겐 수용체 알파 리간드 결합 도메인 발현 플라스미드pG5-Luc 리포터에 직접 결합하지 않는다. 적절한 리간드가 존재할 때, pBIND 마우스 에스트로겐 수용체 알파 EF 및 pACT 마우스 에스트로겐 수용체 알파 EF 플라스미드에서 유래된 단백질은 에스트로겐 수용체 알파 리간드 결합 도메인을 통해 결합한다.
이산화의 효율은 루시파아제 활성에 의해 결정된다. 가장 중요한 단계는 pBIND 마우스 에스트로겐 수용체 알파 EF 유래 단백질의 활성을 제어하는 것이다. pBIND 유래 에스트로겐 수용체 알파 리간드 의 활성은 pACT 에스트로겐 수용체 알파 EF 플라스미드없이 각 리간드에서 도메인을 결합하여 리간드 의존형 에스트로겐 수용체 리간드 결합 도메인 이질 활성을 분석하기 전에 평가되어야 한다.
먼저 적절한 플라스미드 조합을 조합당 1.5밀리터 마이크로센심분리기 튜브 2개에 추가합니다. DNA 혼합물의 두 가지 조합을 준비한다. 첫 번째 튜브에는 pG5-Luc, pBIND-에스트로겐 수용체 알파 EF 및 빈 pACT 플라스미드가 포함되어 있습니다.
두 번째 튜브에는 pG5-Luc, pBIND-에스트로겐 수용체 알파 EF 및 pACT-에스트로겐 수용체-알파 EF 플라스미드가 포함되어 있습니다. DNA를 침전시키기 위하여는, 3개의 어금음 나트륨 아세테이트의 DNA 혼합물 부피의 1/9를 추가하고 각 관에 있는 DNA 혼합물에 100% 에탄올의 20X 3개의 어진 나트륨 아세테이트 부피를 추가하고 관을 소용돌이시다. 다음 아침 최대 속도로 원심분리하기 전에 밤새 20도의 혼합물을 보관하십시오.
수퍼네이터를 버리고 튜브 당 75 %에탄올의 120 마이크로 리터에서 보이지 않는 펠릿을 다시 일시 중단하여 튜브 내부에 붙어있는 DNA를 헹구십시오. 동일한 조건에서 두 번째 원심 분리 후, 슈퍼 나티츠를 버리고 진공 농축기에서 DNA를 30 분 동안 건조시십시오. 트랜스펙트의 경우, 준비된 인간 간세포 암종 세포를 세척당 0.5 밀리리터의 실온 PBS로 두 번 세척하고 10% 숯제거 된 열 불활성 태아 소 소 럼과 2 개의 라밀라로 보충된 신선한 37도 의 0.5 밀리리터로 세포를 공급하십시오.
다음으로, 개별 1.5 밀리리터 미세센심분리기 튜브에서 우물 수당 DMEM의 적절한 부피에서 건조 된 플라스미드 DNA 혼합물 및 형질 시약을 일시 중단합니다. 각 DMEM 중단 된 플라스미드 DNA 혼합물 튜브에 동일한 양의 형질 전환 시약 배지를 추가합니다. 실온에서 5-10분 동안 배양한 후, 세포 배양기 인큐베이터에서 6시간 간 배분하기 위해 24웰의 인간 간세포 암세포 세포 배양판의 적절한 실험용 웰에 DNA 혼합물 25마이크로리터를 첨가한다.
그리고 인큐베이션의 끝은, 10%의 숯 제거 열활성화 FBS, 2밀리머 L-글루타민, 1%페니실린 연쇄상 구균, 그리고 리간드 퍼11시간 동안 세포를 16시간 동안 보충한 신선한 37도 페놀 무적무합한 MEM의 0.5 밀리리터로 트랜스페션 배지를 대체한다. 다음 날 아침, 우물당 PBS 1밀리리터로 세포를 씻고 각 웰의 세포를 잘 부착하고 100 마이크로리터당 수동 리시스 버퍼를 잘 부착하고 소용돌이 믹서로 활발한 흔들림을 합니다. 그런 다음 액체 질소에서 세포 용액을 동결합니다.
이중 루시파라기 분석 의 날에, 접시가 실온에 도달 할 때까지 셰이커에 lysates를 흔들어, 96 잘 흰색 플라스틱 플레이트의 개별 우물에 용해의 10 마이크로 리터를 전송합니다. 그런 다음 마이크로 플레이트 판독기에서 각 셀 리세이트 샘플의 루시파아제 활성을 읽습니다. pBIND 마우스 에스트로겐 수용체 알파 EF 및 pACT 플라스미드의 치료는 10 나노몰러 estradiol을 가진 세포에 체형 세포를 자극하여 에스트로겐 수용체 알파 리간드 결합 도메인으로 루시파아제 활성을 자극하여 리간드 의존성 트랜스활성화 기능 도메인, AF-2를 포함한다.
하나 및 10 나노 몰러 농도는, pBIND와 pACT 마우스 에스트로겐 수용체 알파 EF plasmids의 조합으로 전염된 세포에서 루시파라제 활성을 유도, 에스트로겐 수용체 알파 리간드 결합 도메인 이질 도메인 이질 활성을 평가하기 위한 이 절차의 타당성을 최대 1 나노몰어 치료에서 제시한다. 4-하이드록시-타목시펜을 가진 치료는 pBIND 마우스 에스트로겐 수용체 알파 EF 및 pACT 플라스미드 전세포에서 루시파라제 활성을 유도하지 않으며, 에스트로겐 수용체 알파의 AF-2 기능이 이 리간드에 의해 활성화되지 않음을 시사한다. 그러나 최대 10나노몰러 농도는 pBIND 및 pACT 마우스 에스트로겐 수용체 알파 EF 플라스미드의 조합으로 감염된 세포에서 루시파라제 활성을 유도하며, 이는 이 절차가 4-하이드록시-타목시펜 치료의 최대 10나노몰라에서 에스트로겐 수용체 알파 리간드 결합 도메인 이질 활성을 평가하는 것이 가능하다는 것을 시사한다.
pBIND 및 pACT 마우스 에스트로겐 수용체 알파 리간드 결합 도메인 발현 플라스미드와 4-하이드록시-타목시펜의 조합으로부터의 활성은 pBIND 및 pACT 인간 에스트로겐 수용체 알파 리간드 결합 도메인 발현 플라스미드의 조합보다 현저히 높다. 이는 마우스 에스트로겐 수용체 알파 리간드 결합 도메인의 4-하이드록시-타목시펜 의존호모세이머화 활성이 인간 에스트로겐 수용체 알파 리간드 결합 도메인보다 더 강력하다는 것을 나타낸다. 또한, 인간 F 도메인을 함유한 마우스 에스트로겐 수용체 알파 리간드 결합 도메인의 4-하이드록시-타목시펜 의존호모세이머화 활성은 야생형 마우스 에스트로겐 수용체 알파 리간드 결합 도메인보다 현저히 낮다.
대조적으로, 마우스 F 도메인을 함유하는 인간 에스트로겐 수용체 알파 리간드 결합 도메인의 4-하이드록시-타목시펜 의존호모이머화 활성은 인간 에스트로겐 수용체 알파 리간드 결합 도메인의 4-하이드록시-타목시펜-의존형 호모디머화 활성보다 현저히 높다. 이것은 F 도메인이 종 특정 4-하이드록시 타목시펜 의존에 의존하는 에스트로겐 수용체 알파 리간드 결합 도메인 호모이머화 활동에 영향을 미친다는 것을 시사한다. 이 절차를 시도하는 동안, GAL4 DNA 결합 도메인 융합 에스트로겐 수용체 알파 리간드 의 기저 활성을 리간드로 도메인 활성을 테스트하는 것이 중요합니다.
이러한 활동은 차량 치료와 동일해야 합니다.
