Name: studying the stoichiometry of epidermal growth factor receptor in intact cells using correlative microscopy
Uploaded: 2015-09-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy at JoVE.com

We thank E. Arzt for his support through INM, M. Koch for help with the ESEM, and DENS Solutions for providing the microchips. Research in part supported by the Leibniz Competition 2013.

라벨 및 고정 시약 1. 준비 <ol><li> 멸균 인산 완충 식염수를 사용하여 라벨링 완충액 (BSA-GEL-PBS), pH 7.4의 (PBS)를 준비한다. 1 % BSA (소 알부민 분획 V, 비오틴 - 무료) 및 0.2 % 젤라틴 (GEL, 차가운 물 물고기 피부)와 소용돌이와 보충 / 잘 흔들어. 참고 : 4 ° C에서 ~ 5 일 동안 저장 될 수 있습니다. </li><li> 멸균 된 인산 완충 식염수, pH가 7.4에서 세척 버퍼 (BSA-PBS)를 준비합니다. 1 % BSA와 소용돌이와 보충 / 잘 흔들어. 참고 : 4 ° C에서 ~ 5 일 동안 저장 될 수 있습니다. </li><li> 200 밀리미터에서 50 밀리미터 붕산 버퍼 (BB) 붕산 원액을 준비, pH는 200 mM의 나트륨 테트라와 8.3로 조정. 참고 : 4 ° C에서 ~ 12 개월 동안 저장할 수 있습니다. </li><li> 0.2 M 나트륨 cacodylate 원액 0.1 M cacodylate 버퍼 (CB)를 준비, pH는 0.1 M 자당으로 보충, 7.4로 조정. 주 : 열린 원액을 4 ℃에서 ~ 5 일 동안 저장 될 수있다. </li><li> (PBS에 G를 0.1 M 글리신을 준비LY-PBS). 참고 : 4 ℃에서 1 ~ 2 개월 동안 저장할 수 있습니다. </li><li> 갓 만든 또는 연 16 % PFA의 유리 병, 원액, EM 등급에서 CB의 3 % 파라 포름 알데히드 (3 % PFA)을 준비합니다. 주 : 열린 원액을 4 ℃에서 ~ 5 일 동안 저장 될 수있다. </li><li> CB 갓 (또는 유리 병을 오픈)에서 (2 % GA) 25 % GA 원액, EM 등급에서 2 % 글루 타르 알데히드를 준비합니다. 주 : 열린 원액을 4 ℃에서 ~ 5 일 동안 저장 될 수있다. </li><li> 300 nm의 EGF-비오틴 라벨 솔루션을 준비 <ol><li> , BSA-GEL-PBS에서 6 μm의의 EGF-비오틴 원액을 희석 마이크로 칩 당 100 ~ 200 μL의 볼륨을 사용합니다. 몇 시간 내에 사용하십시오. </li></ol></li><li> 10 nM의 STR-QD 라벨 솔루션을 준비 <ol><li> 8,000 XG에서 4 분의 스트렙 타비 딘 - QD 원액을 원심 분리기 뜨는을 가지고 BB에서 1​​:10 희석. 양자점의 다른 유형은 예 QD655 또는 QD800 사용될 수있다. , BSA-GEL-PBS의 최종 농도로 희석 마이크로 칩 당 75 ~ 100 μl를 사용합니다. 내 사용몇 시간. </li></ol></li></ol> 실리콘 나이트 막 마이크로 칩 2. 준비 <ol><li> 청정실 조직 및 고성능 액체 크로마토 그래피 (HPLC) 등급 에탄올, 광학 현미경에 사용되는 바와 같이, 유리 현미경 슬라이드를 청소한다. </li><li> 낮은 먼지 수준 층류 워크 벤치에서 100 mm 직경의 페트리 접시를 열고 접시에 청소 현미경 유리를하다; 열린 접시를 둡니다. </li><li> 우선적으로 탄소 섬유 또는 다른 코팅으로 코팅 깨끗한 핀셋, 함께, 스토리지 상자의 유리 슬라이드 위에 얇은 (50 ㎚) 질화 실리콘 막으로 4-10 마이크로 칩, 다른 후 하나를 가지고. 부드럽게 자신의 측면에 마이크로 칩을 잡고 얇은 실리콘 질화물 막으로 구성, 깨지기 쉬운 위쪽에 손이 닿지 않도록. 항상 막면이 위를 유지하기 위해 큰 관심을 가지고 그것을 만지지 마십시오. 마이크로 칩은 직사각형이어야하며 자신의 질화 실리콘으로 덮여 수직 평면 가장자리가 참고 :그들은 쉽게 파지 할 수 있도록, 얼굴. </li><li> 페트리 접시의 뚜껑을 닫고 흄 후드에 가져다. 새로운 클린 룸 조직을 얻고 배양 접시 옆을 입금. 50 ~ 70 mL의 아세톤 하나, 에탄올 비슷한 볼륨과 다른, HPLC 등급을 모두 작성하여 두 깨끗한 200 mL 유리 비커를 준비합니다. 먼저 클린 룸 조직에 유리 슬라이드에서 마이크로 칩을 전송합니다. </li><li> 조직으로부터, 보호 레지스트 층을 제거하기 위해 아세톤으로 제 비이커에 의해 마이크로 칩 하나씩 전송할. 부드럽게 마이크로 칩이 잘 세척되도록 비커를 몇 번 이동하는 동안, 2 분을 기다립니다. </li><li> 그들을 건조 아무 말도없이, 직접 에탄올로 비커에 마이크로 칩을 전송합니다. 2 분을 기다립니다. 그런 다음 층류 워크 벤치에 비커를 전송합니다. 새로운 클린 룸 조직을 가져옵니다. </li><li> 조직에 칩을 전송하고 몇 분 동안 그들을 건조 할 수 있습니다. , 페트리 접시에 유리 슬라이드에 마이크로 칩을 이동 접시를 닫습니다,및 플라즈마 세정기로 가져온다. </li><li> 플라즈마 세정기에 마이크로 칩과 유리 슬라이드 증착. 질화 실리콘 막 표면의 친수성을 렌더링하기 5 분 세정 프로그램을 실행. 참고 : 우리의 플라즈마 청소기에 적용 적합한 설정은 다음과 같습니다 70 mTorr로, O 2 11.5 SCCM과 ar을위한 35.0 SCCM, 50 W 앞으로 무선 주파수 (RF) 대상, 5 W의 RF 범위와 최대의 가스 흐름. RF를 반영합니다. </li><li> 다시 페트리 접시에 마이크로 칩으로 유리 슬라이드를 넣고 뚜껑을 닫습니다. 지금부터 멸균 마이크로 칩을 유지하기 위해주의하십시오. </li><li> 가능한 막 파열 또는 남아있는 먼지 입자의 광학 현미경 마이크로 칩의 창 영역을 검사합니다. </li><li> 층류 워크 벤치에 페트리 접시를 준비한다. </li><li> 층류 워크 벤치에서 다음 항목을 넣 튜브 / 병이 0.01 %가 폴리 -L- 라이신 솔루션 멸균 함유 (. PLL, 몰 150,000-300,000을 중량, 멸균 여과하고, 세포 배양 시험), HPLC등급의 물, 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM)를 10 % 소 태아 혈청, 혈청없이 DMEM, 새로운 청정실 조직, 무균 24- 웰 플레이트 (12 웰 플레이트가 또한 사용될 수있다), 96- 멸균 보충 웰 플레이트, 멸균 피펫 팁, 피펫, 평면, 둥근 팁, 핀셋. </li><li> 24 웰 플레이트를 타고, 및 PLL 잘 하나를 작성 및 HPLC 등급 워터와 우물, 약을 사용합니다. 물론 당 1 ml의 부피. 약 사용, 96 웰 플레이트를 타고 무 혈청 DMEM 잘 모든 마이크로 칩에 대한 두 DMEM 보충 혈청 우물 하나를 입력합니다. 물론 당 200 μL의 볼륨. </li><li> 마이크로 칩을 처리하기 위해 멸균 팁을 사용 핀셋 지금부터. 간단히 염이어서 핀셋의 끝을 냉각함으로써, 예를 들어,이를. </li><li> 제 청정실 조직에 유리 슬라이드에서 마이크로 옮긴다. 조직에서 잘 PLL 채워진에 여섯 마이크로 칩까지 전송할 5 분 동안 마이크로 칩을 품어. 아니E : 더 마이크로 칩과 실험을 위해, 24 웰 플레이트에 추가 우물을 입력합니다. </li><li> 그 후 첫 번째 물이 채워진 우물에, 하나씩, 그들을 배치하여 마이크로 칩을 씻어, 거기에서 두 번째 아니라 물이 채워진에. PLL의 제거를 방지하기 위해 더 이상 약 분 이상 물에 마이크로 칩을 두지 마십시오. </li><li> 마지막으로 96 웰 플레이트의 DMEM 가득 우물에 개별적으로 배치합니다. 세포 현탁액이 준비 될 때까지 CO 2 인큐베이터에서 96 웰 플레이트를 저장한다. </li></ol> 마이크로 칩에 대한 세포의 3. 준비 <ol><li> 약의 농도의 세포 현탁액을 제조 COS7 세포의 계대 배양을 수행한다. 5 × 105 세포 / ㎖. 세포가 단 분산되어 있는지 확인합니다. </li><li> 마이크로 칩으로 96 웰 플레이트를 가지고 각각의 마이크로 칩에 세포 현탁액 한 방울을 추가합니다. 5 분을 기다립니다. </li><li> CHO하는 도립 현미경으로 마이크로 칩의 창 영역을 조사하기 시작무 혈청 DMEM으로 새로운 웰에 그것을 전송하기위한 바로 그 순간 OSE. 주 : 세포 밀도가 좋은 150 X 400 ㎛의 창 크기 24 COS7 세포에 대응하는, 2,500 ㎛의 2 면적 당 약 하나의 셀에 의해 달성된다. 높은 세포 밀도가 최대 세포의 평탄화를 저해 할 위험이있다. 셀이 죄 막에 정착 한 후, 그것은 새로운 잘으로 전송하는 동안 떨어져 부동에 저항 할 수있는 충분한 접착력을 개발하기 위해 3 ~ 5 분을 필요로주의하십시오. </li><li> 충분한 세포가 윈도우에 부착 한 경우 다음 웰에 마이크로 칩을 전송합니다. 이 위를 향하도록 세포와 항상 마이크로 칩을 유지하고이 쪽의 접촉을 피하십시오. </li><li> 전송 한 후, 다시 각각의 마이크로 칩 창을 검사합니다. 너무 많은 세포가 떨어져 세척하고 남은 세포의 수가 부족하면 다시 씹다 세포 현탁액 (새로 형성된 세포 덩어리를 깰)를 반복 3.1-3.5 단계를 반복합니다. </li><li> 전송 된 모든 마이크로 칩은 충분히있을 때자신의 창 영역에 세포 부착,. 무 혈청 DMEM과 마지막 우물에 칩을 전송 CO 2 배양기에 다시 96 웰 플레이트를 놓고 세포가 복구 할 수 있도록 몇 시간, 최선의 O / N에 대한 평평. </li></ol> 4. EGFR 라벨, 고정 및 형광 현미경 <ol><li> 다음 단계를 위해, 96 웰, 24 웰 플레이트를 사용한다. 각각의 솔루션 우물을 미리 작성하고 마이크로 칩 당 하나의 행이나 열을 사용합니다. 24 웰 플레이트는 CB, PFA 및 GA와 정착 단계에 대한 흄 후드에서 사용된다. 항상 위를 향하도록 세포와 마이크로 칩을 전송하고이 쪽의 접촉을 피하십시오. </li><li> 잘 신선한 BSA-GEL-PBS로에 마이크로 칩을 배치하여 마이크로 칩을 씻어 후 5 분 동안 37 ° C에서 인큐베이터에서 96 웰 플레이트를 놓습니다. </li><li> 37 ℃에서 3 분 동안 300 나노 EGF - 비오틴 솔루션을 품어. 세포가 EGF 표지 된 EGFR의 세포 내 이입을 시작하기 때문에, 인트하기 위해 가능한 한 빨리 진행P 4.4. </li><li> PBS로 3 시간, CB 1 시간 (현재 96 웰 플레이트는 실온에서 다시입니다)를 씻어. </li><li> 10 분 동안 3 % PFA에 품어. </li><li> 칩에게 CB 1 시간, PBS로 3 회 씻어. </li><li> 2 분 동안 GLY-PBS에 품어 1 시간 PBS로 2 회 씻어. </li><li> 10 분 동안 10 nM의 STR-QD 부화. </li><li> BSA-PBS로 4 번 씻어. </li><li> 유리 바닥 35mm 요리를 실온에서 BSA-PBS로 미리 충전에 마이크로 칩을 담근다. </li><li> QD 표지 세포의 미분 간섭 대비 (DIC) 이미지와 형광 이미지를 획득. <ol><li> QD655 표지 세포의 개요 이미지 40X 공기 목적을 사용합니다. 방출 된 형광 광을 가장 효율적으로 수집 할 수 있도록 (예를 들어, 63X의 경우) 오일 침지 목표를 사용한다; QD800 표지 세포 이미징 때이 특히 필요하다. </li><li> 420 나노 수이 상기 발광 컬렉션 (340)과 380 nm의 사이에서 형광 여기 광에 양자점을 노출하고있게 필터 큐브를 사용대부분의 양자점 (이 경우 필터 큐브) 표. </li><li> 샘플을 손상시킬 수있는 너무 강한 빛을 피하기 위해 빛의 강도를 최소화합니다. 모든 양자점의 신호가 포착되도록 양자점의 형광이 깜박이는 동작을 가지고 있음을 지적, 적어도 300 밀리 초에 노출 시간을 설정합니다. </li><li> 광 강도를 조정하고, 광 강도를 최소화하면서 증폭은, 가시 화상 노이즈없이 선명한 화상을 제공 할 수있다. 참고 : 이미지 시리즈가 같은 지역에서 촬영하는 경우 또는, 짧은 노출 시간을 사용할 수 있습니다. 이러한 일련의 결과 이​​미지 따라서 평균화 및 소음 감소를 초래 최대 투영 이미지를 산출하기 위해 처리 될 수있다. </li></ol></li><li> BSA-PBS로 가득 96 웰 플레이트의 우물에 다시 (세포가 위를 향하도록) 이미징 마이크로 칩을 놓습니다. </li><li> CB에 마이크로 칩 1 번 씻어. </li><li> 10 분 동안 2 % (GA)에 품어. </li><li> CB에서 1​​ 시간, BSA-PBS로 3 회 씻어. </li><li> ESEM의 난 때까지 스토어 마이크로 칩maging는 BSA-PBS에 새로운 96 웰 플레이트의 우물을 미리 작성. 모든 마이크로 칩은 HPLC 등급 물 네 우물의 행을 입력합니다. 주의 : 샘플을 몇 주 동안 4 ℃에서 유지 될 수 있지만, 전체 영상 일련 이틀 수행 될 때 최상의 결과가 달성된다. 양자점은 천천히 따라서 ESEM 이미징이 완료되기 전에 10 일 이상 기다려야하지 않는 것이 좋습니다, 샘플에서 분리하기 시작합니다. 참고 : 형광 이미지가 향후 분석을 위해 저장됩니다. 이미지에서 세포의 위치를​​ 용이하게 죄 창의 코너 지역화 및 모서리에 상대적으로 위치 측정을 통해 전자 현미경 이미지와 상관 될 수있다. 주 : 고품질의 형광 이미지를 인쇄하고 ESEM 이미지를 기록 할 때 방향을 위해 그것들을 사용하는 것이 바람직하다. </li></ol> 전체 세포의 5. 젖은 ESEM-STEM <ol><li> 젖은 STEM에 대한 ESEM 준비 <ol><li> 가스 차 전자 D를 탑재etector (GSED) 및 (시료 밑에 위치) STEM 검출기를 포함하는 펠티에 단계. </li><li> 무대를 통해 냉각수의 흐름을 시작하고 3 ° C까지 온도를 설정합니다. </li><li> 무대 XY 제로 좌표를 설정하고 약 6 mm로 작동 거리를 조정합니다. </li></ol></li><li> 마이크로 칩이 스티로폼 박스, 냉동 냉각 소자에 예를 들어, 냉각과 ESEM 촬상 동안, 96- 웰 플레이트를 유지한다. </li><li> 미리 냉각 ESEM-STEM 단계로 샘플을로드하기 위해, 냉각 용기에서 96 웰 플레이트을 닫고 열린 ESEM 스테이지에 배치합니다. 옆에 새로운 클린 룸 조직을 넣습니다. </li><li> 신속하게 잘 HPLC 등급의 물이 가득에 대한 두 번째 위해 네 번, 각 시간을 찍기에 의해 (이 위를 향하도록 셀) 마이크로 칩을 씻어. </li><li> 클린 룸 조직에 마이크로 칩 잠깐의 뒷면을 가릴과 미리 냉각 단계에 마이크로 칩을 놓습니다. 세포가 젖은 남아 있는지 확인이 될 수 있습니다반사 표면에 의해 인식 (무딘 표면 결과를 건조). </li><li> 냉각 HPLC 등급 물 3 μL (피펫 팁으로 표면에 닿지 않도록해야합니다)와 시료 표면을 젖은, 무대에서 샘플을 수정합니다. </li><li> 샘플에 가까운 무대에 세 개의 추가 3 μL 물방울를 놓습니다. </li><li> 시료 챔버를 닫고 </li><li> . 압력에게 아빠 (800) 사이에 1500을 다섯 번 순환에 의해 시료 챔버를 제거 (800) 아빠와 함께 자전거를 종료합니다. </li><li> 에 전자빔 (30 kV로)를 스위치 마이크로 칩 창의 위치를 검색하는 데, 즉 두 검출기, GSED 및 STEM 탐지기와 낮은 배율하에 시료를 조사한다. 주 : 물 층이 너무 두꺼운 경우, 윈도우가 표시되지 않을 수있다. 이 경우, 760 파에 압력을 낮추는 시작하고 몇 분을 기다립니다. 창 먼저 GSED으로 보이게된다. </li><li> specim을 이동시킴으로써 이미지의 중심에서의 SiN 막 윈도우를 위치무대 EN과 750-720 아빠에 압력을 줄일 수 있습니다. 주 : 수층이 충분히 얇 으면, 윈도우는 STEM 검출기를 보이게된다. </li><li> 지금부터, 이미지를 기록하기 위해 STEM 검출기의 암 필드 세그먼트를 사용한다. 우선, 전체 윈도우 영역에있는 모든 셀을 도시 한 두 개의 이미지를 획득. </li><li> , 광학 현미경의 이미지와 함께이 ESEM 이미지를 비교 죄 윈도우의 모서리를 찾습니다. </li><li> 이 확대, 회전 및 미러링 수를 비교하여 두 현미경 양상의 프레임 좌표 연관. 두 이미지에 동일한 세포를 찾습니다. </li><li> 이러한 eucentric 높이, 미세 초점과 렌즈의 비점 수차의 보정으로 이미지 설정을 조정하는 작은 기능을 아주 작은 먼지 입자 또는 셀 영역을 선택합니다. 적어도 50.000X의 배율 작품은 전자 탐침 전류 약 0.6 nA의 30 μS 화소의 드웰 시간, 1024 X 884 픽셀 크기의 이미지를 사용한다. 참고 : 기타 설정은 또한 ㄱ있다E는 한 전자 선량의 증가가 회피된다 쓰인다. 주 : 매우 청결 작업 때에도 프로토콜 청정실 환경에서 수행되지 않기 때문에, 칩 표면이 실질적으로 항상 일부 먼지 입자를 함유한다. </li><li> QD 표지 세포에서 줄기 이미지를 기록하려면, 형광 이미지를 참조하여 관심의 셀을 선택합니다. 참고 : 강한 QD 신호를 나타내는 세포로 시작하는 것이 가장 좋습니다. </li><li> 이 셀의 줄기 개요 이미지를 기록합니다. </li><li> 셀 테두리가 볼 수있는 주변 지역으로 이동 50.000X 배율에 도달 확대합니다. </li><li> 개별 양자점을 보여주는 기록 이미지, 20 ~ 30 마이크로 초 화소 체류 시간을 사용합니다. 번만 고배율 방사선 손상, 화상 영역마다 않기 위해. 참고 : 일반적으로,이 단계 모두 초점과 비점 수차의 보정에, 일부 미세 조정이 필요합니다. </li><li> 고배율 이미지, 줌아웃, AC 및 충분한 수의 촬영 후첩 다른 줄기 개요 이미지, 바로 어두운 사각형 높은 배율로 촬영 한 지역을 묘사. 주의 : 이러한 개요 이미지 나중에 ESEM 형광 이미지의 상관 관계 및 셀룰러 맥락 고배율 이미지의 정확한 위치를 결정하는 역할을한다. </li><li> 관심 다음 셀로 진행 관련 화상으로 시작 고배율 일련의 이미지를 기록하고 관련 화상으로 끝난다. </li><li> ESEM 이미징 세션이 종료되면 챔버 배출을 시작하기 전에 8백50부터 9백까지 파에 압력을 증가시킨다. 주 : 압력이 증가가 여전히 습윤면에 마이크로 칩을 회수의 기회를 향상시킨다; 그러나, 이것은 항상 달성 될 수 없다. 원한다면 밖으로 건조 된 적이없는 샘플은 이후의 다른 시점에 ESEM에서 재조사, BSA-PBS로 복원 될 수있다. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

전체 세포와 같은 EGFR과 막 단백질의 공간적 분포 및 화학 양론을 공부하는 것은 그 기능과 11-14 이들의 가능한 변화에 대한 중요한 상황에 맞는 정보를 제공합니다. 이 정보는 직접 또는 전지 셀 (15) 간의 차이는 단백질의 위치 파악에 대해 손실되는 일반적으로 사용되는 생화학 적 방법을 이용하여 세포 내 수준의 단량체, 이합체, 및 클러스터의 분포를 연구하기 위해 도전. 그 화학량 개별 그대로 셀 4-7의 컨텍스트 내에서 연구 할 수 있도록 여기에 기재된 라벨과 현미경 방법은 몇 나노 미터 길이 규모 단백질 복합체의 시각화를 허용한다. 이것은 (슈퍼 해상도) 광학 현미경 (23)의 해상도는 단백질 복합체에 종사하는 분자를 구별하기에 충분하기 때문에 불가능합니다. 포스터 공명 에너지 전달 (FRET)는 앙상블 평균 기법 &lt;이다24&gt; SUP, 반드시 에너지 전달 (25)의 근거리의 결과로서 다이머 및 고차 클러스터를 인식하지 않는다. 근접 결찰 분석법 (26)는 실제로는 거리를 측정하지 않으며, 따라서 유사한 단백질 밀도 셀룰러 영역에서, 우연에 의해 검출 된 인접도의 숫자 선도 필연적으로 높은 단백질 농도와 셀룰러 영역을 구별하지만 단백질을 포함 할 수없는 않는다 레이블 사이에 별개의 거리를 나타내는 단지. 단백질 복합체의 성분을 시각화 할 필요는 고해상도 투과 전자 현미경 (TEM)에 의해 달성된다. 그러나, 전체 셀은 종래의 TEM 플라즈마 막 (27), 또는 세포막 리핑 통해 슬라이스 또는 임의로 형성된 막의 작은 조각 (28, 29)의 결과를 깨는 얇은 샘플 / 섹션의 요구에 의해 제한된다. 세포막 따라서 부족으로 이어지는 전체 묘화되지의 가능성이 중요한 세포 상황에 맞는 정보를 제공합니다. 세포 내 단백질의 화학량 다른 실험적 연구 과제인가 단백질 표지로부터 발생한다. 일반적으로 사용되는 immunolabeling 수용체와 레이블 사이에 일대일 화학량 만 가의 프로브로 달성 될 수있는 어려움을지지; 일차 및 이차 항체가 요구되는 경우는 그렇지 않다. 단백질 화학량 론에 대한 정보를 획득하기 위해서는 프로브가 수용체 상에 하나의 에피토프에 결합하고, 고유 형광 프로브 또는 다른 측면에 높은 원자 번호의 나노 입자에 대한 하나의 결합 부위를 갖는 것이 요구된다. 이웃 단일 단백질, 동종이 량체, 또는 더 큰 클러스터 사이의 차별이 가능하지 않을 수 있도록 둘째, 항체 - 라벨에 달성 할 수있는 정밀도는 적어도 EGFR 가족의 수용체를 들어, 30 nm의 그들의 큰 크기 (30)의 계정에 제한됩니다. 훨씬 작은 특정 레이블은 문학과 캘리포니아에 공지되어있다N 세포 내 라벨 (31)에 대해서도 적용 할 수 있지만, 사람들은 일반적으로 사용되지 않습니다. 전체 레이블 (EGF-비오틴 스트렙 타비 딘 - QD)의 길이는 EGFR과 동일한 치수이고, 충분히 작은은 이량 체를 검출 할 수 있도록. 더욱이, 설명 된 두 단계의 절차는 라벨 표지 유도 수용체 클러스터링을 피한다. 우리의 방법은 매우 어려운,별로 표지 단백질의 형광 현미경보다 더하지 않습니다. 단계의 수를 가산하고, 단계 중 하나에서 에러가 실험에서 완전한 실패로 이어질 수 있기 때문에, 실험, 신중을 실시 할 필요가있다. 마이크로 칩을 처리하는 것은 권장 TEM 그리드하지만 일부 교육 빈 칩의 처리보다 더 지루하지 않습니다. 전체 수화 세포의 ESEM-STEM은 아마 가장 어려운 측면, 그리고 양자점을 시각화하기 위해 필요에 따라 3 nm의 주위에 해상도에 도달하기 위해 적어도 숙련 된 작업자과 실천의 몇 일을 필요로한다. 방사선 댐조사에서 표본의 연령은 위험을 선물한다. 압력 및 온도는 조심스럽게 물 층을 유지하기 위해 감시한다. 또한, 수층의 두께는 셀마다 다를 수있다. 다른 곳에서 기술 된 바와 같이도 6 또한, 상기 시료 가스의 전자 검출기를 사용하여 수층의 존재를 모니터링하는 것이 바람직하다. 셀룰러 영역은 손상을 방지하기 위해 한 번 또는 두 번에 이미징되어야한다. 방법의 중요한 한계는 미세 구조에 대한 고해상도 정보가 존재하지 않는 점이다. 다른 기술들은, 예, 크라이 TEM 들어 단백질 구조 및 세포 미세 구조 (15)을 연구하기 위해 필요하다. 둘째, 시간 경과 현미경에 살고있는 세포에서 단백질의 다수의 동적 상호 작용을 연구하는 방사선 손상의 계정에 가능하지 않고, 최첨단 광학 현미경 (23)이 필요합니다. 현재, 우리의 방법은 L 이후 다이머의 절대 레벨을 판정 할 수 없다abeling 효율은 알 수 있지만, 우리는 미래에 같은 데이터를 추가 할 전망이다. 이 이합체가 존재하거나없는 경우 알려 그럼에도 불구하고 할 수있다. 문헌에서 이것은 15 % 주변에도 표지 효율이 충분한 통계적 유의성 32 량체를 검출하기에 충분히 있음을 공지한다. 그것은 특정 항체의 Fab 단편 바이오틴 통해 그들의 리간드 통해 다른 막 결합 수용체를 연구하기 쉽게 할 수있다, 또는 설명한 두 단계 라벨링 프로토콜을 사용하여 다른 작은 링커를 통해 7. 이미 양자점의 두 개의 서로 다른 색 (크기)이 사용될 수 있으며, 금 나노 입자 표지 6 일 이전에 사용한 것을 증명하고 있기 때문에, 동일한 실험의 여러 단백질 종에 라벨을 실현 가능한 것으로 보인다. 여러 단백질 종의 화학 양론의 연구를위한 중요한 과제에 대하여 얻어지는 상대적인 화학량 론의 양 정규화 종 또는 적어도 유사한 표지 효율을 보장한다표지 효율 필자. 그러나, 본 연구에서 사용 된 두 개의 다른 양자점은 (도 2 및 4 참조) 표지 효율 크게 다르지 보이지 않는다. 양자점 두 단계 라벨링 및 상호 형광 현미경 ESEM-STEM 관련된 기재된 방법은 전체 세포의 세포막 손상에 막 단백질의 복잡한 상호 작용을 연구하는 실용적인 방법을 제시한다.

새로운 접근 방식은 줄기 1-3, 또는 상호 형광 현미경을 사용하여 4-7 줄기 액체 상태 표시 단백질과 이미지 전체 세포에, 최근에 소개되었다. 이 방법론은 막 단백질 및 세포의 전체적인 본래 세포막의 단일 분자 레벨에서 그들의 화학량 포함한 단백질 복합체의 공간 분포를 연구 할 수있다. 여기서는 형광 양자점 (양자점)와 수용체 단백질의 두 단계를 포함하는 특정 프로토콜 라벨 (8)과 상호 광 현미경 ESEM-STEM을 설명한다. 예를 들어, 우리는 EGFR, 단백질 키나제 상과에 속하는 세포막 단백질을 연구 하였다. 리간드가 결합하면, 수용체는 활성화하고 다른 EGFR 활성화와 이합체를 형성한다; 후속 신호 캐스케이드 세포 증식 (9)를 구동한다. 비정상적인 EGFR 발현 또는 활성 선도 돌연변이는 암 (10)의 여러 종류의 중심 역할을 담당한다. 나머지 공부G 전체 세포에서이 막 수용체의 공간 배치는 그 기능과 11-14 이들의 가능한 변화에 대한 중요한 상황에 맞는 정보를 제공합니다. 그러나 종래의 직접 biochemical- 또는 현미경 법 (15) (서브 -) 세포 수준에서 EGFR 모노머, 다이머, 및 클러스터의 분포를 조사하기 어려운 남아있다. 우리의 방법은 복합 단백질의 위치를​​ 판별 할 수 있도록 몇 나노 미터의 공간 해상도로 EGFR을 시각화 할 수있다. 가장 중요하게는, 화학량 론적 분포에 대한 정보를 획득 그대로 세포에서 단백질의 고유의 상황에 관한 것이다. 라벨과 수용체 사이의 짧은 거리를 달성하기 위해, EGFR 직접 QD에 비오틴 - 스트렙 타비 딘을 결합하여, 그 리간드 EGF로 표지 하였다. 이 레이블은 fluorescence- 및 전자 현미경을 모두 검출 할 수있다. 우리는 COS7 세포의 상호 이미지에이 라벨을 사용했다미세 유체 챔버 이전 1,16,17 안에 액체. 그러나, QD 당 분자를 스트렙 타비 딘 복수의 계정에,이 라벨은 낮은 표지 효율 또는 다소 비싼 실험 선도 수용체 클러스터링을 야기 할 수 있으며 조사 중에 단백질의 화학 양론에 체결하는 것은 불가능하다. 라벨 유도 수용체 클러스터링은 단지 하나의 스트렙 타비 딘 - 양자점 (STR-QD)가 결합되는 바이오틴 EGF를 포함하는 조사 결과, 여기에 제시된 두 단계 라벨링 절차를 이용하여 완전히 회피 할 수있다. 세포는 제 바이오틴 EGF와 함께 배양 한 후 고정한다. 정착 단계는 단백질 프로세스 (정착 속도에 따라) 정지하는 시점을 결정한다. STR-QD는 라벨 프로토콜의 두 번째 단계 이후에 적용된다. 단백질이 고정되면 단백질의 동적 막 운동을 방해하기 때문에 클러스터링은 발생하지 않습니다. 또한, STR-QD 용액, 이는실험의 가장 비싼 구성 요소는, 최적화 된 낮은 농도로 적용될 수 있고, 표지의 두 번째 단계, 즉, 몇 분 QD로 결합 될 수 있고, 시간이 중요하지 않다. 전체 세포에 분포로 EGFR의 화학 양론을 연구하기 위해, 세포 샘플은 실리콘 마이크로 칩 (18)에 제조 하였다. 두 단계 QD 표지 및 형광 현미경 화상의 기록을 적용한 후, 세포를 순수로 세정하고, ESEM-STEM (19)를 사용하여 수화 상태에 이미징. 생성 된 이미지는 상호 수화 세포의 자연적인 상황에서 EGFR 세포 분포, 및 화학 양론에 대한 정보를 제공한다. 유사한 방법은 최근 연구 7 유방암 세포에서 HER2 단백질을 연구하기 위해 사용되었다.

<table><tbody><tr><td>Inverted fluorescence microscope</td><td>Leica</td><td>AF6000 + DMI6000B</td><td></td></tr><tr><td>ESEM</td><td>FEI Company</td><td>Quanta 400 FEG</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (1x) + GlutaMax + glucose + pyruvate</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (1x) - Calcium chloride - Magnesium chlorid</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum, Performance Plus (FBS)</td><td>Gibco</td><td>16000-036</td><td></td></tr><tr><td>Cellstripper</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>25-056 Cl</td><td></td></tr><tr><td>Water, chromasolv Plus for HPLC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34877-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>PBS Roti-Stock 10x PBS</td><td>Carl Roth</td><td>1058.1</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol, Rotisolv HPLC grade</td><td>Carl Roth</td><td>P076.2</td><td></td></tr><tr><td>Albumin Fraction V, biotin-free (BSA)</td><td>Carl Roth</td><td>O163.2</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin, from cold water fish skin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7041-500G</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Carl Roth</td><td>T873.1</td><td></td></tr><tr><td>Epidermal Growth Factor</td><td>Molecular Probes</td><td>E3477</td><td>Biotin-XX Conjugate (biotin EGF)</td></tr><tr><td>Sodium teraborate decahydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9640-500G</td><td></td></tr><tr><td>Boric acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6768-500G</td><td></td></tr><tr><td>Qdot 655 streptavidin conjugate</td><td>Molecular Probes</td><td>Q10121MP</td><td></td></tr><tr><td>Qdot 800 streptavidin conjugate</td><td>Molecular Probes</td><td>Q10173MP</td><td></td></tr><tr><td>Silicon microchips with silicon nitride membranes of 50 nm thickness and dimensions of 50 &amp;micro;m x 0.40 mm</td><td>DENS Solutions</td><td>Custom made</td><td></td></tr></tbody></table>

studying the stoichiometry of epidermal growth factor receptor in intact cells using correlative microscopy

이 프로토콜은 COS7 섬유 아세포에서 표피 성장 인자 수용체 (EGFR), 및 후속 상호 형광 현미경 및 수화 상태에서의 전체 셀 환경 주사 전자 현미경 (ESEM)의 표시를 설명한다. 형광 양자 도트 (양자점)이 수용체의 라벨 유도 클러스터링을 회피하면서, 효율적이고 특이 단백질 표지를 제공하는 두 단계 라벨링 프로토콜을 통해 EGFR에 결합 하였다. 형광 현미경은 EGFR의 세포 위치 관련 이미지를 제공 하였다. 주사 투과형 전자 현미경 (STEM) 검출기는 나노 크기 해상도와 QD 라벨을 검출하는데 이용되었다. 생성 된 이미지는 상호 수화 그대로 셀의 자연 컨텍스트에서 단일 분자 수준에서 세포 분포 EGFR, 및 화학 양론의 데이터를 제공한다. ESEM-STEM 이미지는 수용체가 호모 다이머로, 모노머로서 존재할 수, 소규모 클러스터에서 밝혀. 두 개의 서로 다른 양자점과 라벨 붙이기,즉, 하나는 655 nm에서 발광 800에서 유사한 특성 결과를 밝혔다.

그림 1과 2는 그대로, 완벽하게 수화 COS-7 세포에서 시각 QD655 표시, 막 결합 EGFR의 대표 이미지를 보여줍니다. 도 1에 DIC 이미지는 세포막 지형의 인상을주고,도 1b에 대응하는 형광 이미지는 EGF-비오틴 인큐베이션.도 1a의 3 분 후에 EGFR의 분포를 도시하고 B는 각각 두에서 함께 스티칭 40X 공기 목적으로 촬영 한 이미지. EGF 활성화 된 EGFR은 전체 세포 표면에 분포되어있다. 대부분의 세포에서 형광 (도 1b)의 약간의 향상은 EGFR (20)의 발생을 국부적으로 증가 나타내는 셀 에지에서 볼 수있다. 유사한 프로토콜을 이용하여 수행 대조 실험 (데이터는 제시하지 않음) 특정 EGFR 라벨링 검증. 이 컨트롤이 포함 : CE 이전 배양없이 1) 제어 표시비 바이오틴 EGF 및 STR-양자점과 EGF-비오틴, 즉, STR-양자점 만 배양하고, 2) 배양으로 재편. 사각형으로 표시된 3 개의 셀이 더 ESEM-STEM으로 조사 하였다. 그림 1C에 묘사 된 ESEM-STEM 이미지 - E는 이러한 세포의 낮은 배율 개요를 보여줍니다. 이러한 영상 전송 질화 실리콘 (SiN) 뷰잉 윈도우와 실리콘 마이크로 칩 상에 배치 셀 위에 상주 물의 박층 수화 상태에서의 전체 세포를 반영한​​다. 현미경 함유 수증기의 진공 챔버 및 샘플 온도와 압력의 균형은 세포 위에 액체의 얇은 층을 유지하도록 조절 하였다. 개별 셀을 용이하게 죄 막 창에 자신의 형상 및 위치의 계정 인식 할 수있다. 낮은 배율 ESEM-STEM 이미지는 이웃하는 셀쪽으로 셀 에지로부터 연장 filopodia 같은 미세 구조를 보여, 어떤 구조얇은 셀 영역 내부. 샘플을 통한 전송은 사용되는 에너지 (30 keV로)의 전자에 대한 수 없기 때문에 핵을 포함하여 세포질 두꺼운 중앙 영역이 하얗게. 고해상도 ESEM-STEM 이미지는 얇고, 주변 지역에서 기록되었다. 얇은 액체 층에있는 세포의 얇은 영역에서 나노 입자의 ESEM-STEM의 공간 해상도는 3 nm의 금액에 대한 이전 연구 (6)에서 산출 된 것입니다. 도 2a에 도시 된 네 개의 고해상도 이미지 - D가도 1C에 작은 사각형의 위치에 기록 된 - E. 배율만큼 밝은 포탄 형 봉 나타나는 개개의 양자점을 식별하기에 충분한 사용 하였다, 각각 개별 바인딩 EGFR. QD655는 6 × 14 nm의 2의 일반적인 크기를 가지고있다. 직사각형 영역에 대응하는도 2A는 (Figu에서 셀에 표시된1C 재) 막에 QD 라벨 이미지를 건너 대각선으로 접어 보여줍니다. 이 막 구조물은 주변 막 영역보다 더 높은 EGFR 밀도를 갖는다. 여러 위치에서, 두 개의 레이블은 가까이에 있었다. 20 및 24 나노 미터의 거리와 두 가지 예는 화살촉으로 표시됩니다. 레이블이 쌍 EGFR의 이량 체에 속하는 것으로 해석된다. 그림 2B 셀 (그림 1D, 왼쪽 사각형)의 가장자리에서 예를 보여주고, EGFR 단량체 및 이량 체뿐만 아니라 볼 수 있습니다. 그림 (c) (그림 1C 오른쪽 사각형) 낮은 형광 신호, 즉, 하부 EGFR 밀도 영역으로 기록 하였다. 그럼에도 불구하고, EGFR은 또한뿐만 아니라 이량 여기에서 발견되었다. 또한, 10 또는 11의 EGFR을 두 개의 클러스터가 존재 하였다 (타원 참조).도 2D 여러 단량체 이외에, 5-6 EGFR을 포함한 더 작은 클러스터를 가진 멤브레인 배 (도 1E)의 다른 예를 도시및 이량 체. 도 2의 모든 라벨을 위치 결정하고,이 데이터 쌍 상관 함수 21g (X)로부터 획득 될 수있는 정보의 종류의 예로서. 이러한 분석은이 프로토콜의 일부가 아닌 상기 프로 시저가 기술되었다 유의 다른 곳에서 6,7. g (X)는 기준 입자로부터 일정한 반경 방향 거리 (X) 내에서 발견되는 입자의 가능성의 척도이다. g (X) = 1 랜덤 분포를 나타내며, 더 큰 값은 클러스터링의 증거이다. 210 라벨의 총의 위치는 자동으로도 2A-D의 4 개의 이미지에서 검출하고, g (X)는 5 nm의 빈 크기 10 nm의 대역폭을 갖는 평활화 필터를 사용하여 계산 하였다. g (x)는 곡선 (도 3)은 25 ㎚의 바람직한 중심 간 QD 거리를 나타낸다. EGFR을 따라서 무작위로 지향하지만 그들 중 상당 부분이 선호하는 거리에 존재하지 않습니다. approximat에서전자 분자 모델 6 (도 3 인셋) 우리 QD와 EGF 결합 포켓 사이의 중심 간 거리가 금액 것으로 추정하기 ~에게 EGFR 이합체 부착 개의 양자점 사이에 14 nm의, 및 중심 대 중심 거리 ~ 27 nm의 (이 값이 때문에 링커의 유연성에 몇 나노 미터에 따라 다를 것입니다)을합니다. 바람직한 라벨의 거리에있어서의 정밀도 내에서 EGFR 다이머 라벨의 예상 거리에 따라서 일치한다. g (x)의 곡선과 일치하는 데이터 클러스터의 존재를 나타내는, 최대 300 nm의 거리의 1보다 크다. 이 분석은 EGFR의 화학 양론이 우리의 방법으로 연구 할 수 있음을 보여줍니다. 도 4는 라벨이 EGF-QD800 수행하고, 63X 오일 침지 목적은 형광 이미지를 사용한 것을 제외하고,도 2와 비슷한 결과를 나타낸다. 이 데이터는 이러한 전형적인 결과도 때 발견되는 것을 확인EGFR 라벨링 가까운 적색 스펙트럼에서 발광 양자점으로 수행된다.도 4a는 대표적인 세포의 형광 화상은,도 4b는 ESEM-STEM 개요 모드에서 동일한 셀을 도시하고도 4C는 기록 150,000 X 배율 이미지이며 셀 멤브레인의 상부 테두리에 (도 4b에 사각형을 참조). (2A)와 D를 그림과 같은 이미지가 막 배에 QD 표지 EGFR을 캡처하고, 단량체 이량 체 및 클러스터 수용체를 보여줍니다. 전자 밀도 QD 코어 ~ 5 nm의 자신의 작은 코어 크기 (22)과 일치하는 655 nm에서 발광 양자점의 코어보다 약간 작고 라운드를 표시합니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53186/53186fig1.jpg" /> 그림 1. 상호 DIC, EGF-QD655의 형광 및 ESEM-STEM은 완전히 수화 COS-7 세포에 EGFR을 표시 </st룽&gt;. 원형질막의 인상을주는 지형의 SiN 막 윈도우 영역에 성장 된 세포의 (A) DIC 이미지. 중앙에 위치 된 SiN 막에 창을 나타내는 세포 (B) 형광 화상 (점선 사각형으로 표시). (C - E) A와 B의 사각형으로 표시 세포에서 세 ESEM-STEM 낮은 배율 이미지. 이들 세포 관련 이미지는이어서 기록 된 고해상도 이미지의 정확한 위치를 결정하는 역할을한다. (그림 2A-D 참조) 네 개의 고해상도 이미지의 위치는 흰색 사각형으로 표시됩니다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53186/53186fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53186/53186fig2.jpg" /> <stroNG&gt; 그림 2. 고해상도 ESEM-STEM 이미지가 막 결합 된 EGFR을 묘사. 그림 1B에 표시된 지역의 75,000X 배율에서 (A) 현미경. 많은 단량체를 볼 수 있습니다. 여러 이량 체는 화살촉으로 표시됩니다. (B)과 왼쪽의 50,000 배의 배율에서 획득 한 (C)의 이미지를 각각 오른쪽, 멤브레인 영역은도 1C에 표시했다. 된 EGFR의 클러스터가 설명되어 있습니다. 그림 1D에 표시된 위치에서 50,000 배 배율로 촬영 (D) 이미지. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53186/53186fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/53186/53186fig3.jpg" /> 반경 방향 거리의 함수로서도 3의 쌍의 상관 함수 g (X)는 인터 - 이상적 상대 x를 결정<html> 도 2A-D에서 검출 된 모든 210 라벨 CLE 거리. 중심 간 QD 거리는 AG는 (X) = 1 랜덤 확률을 나타내고있다 랜덤 이상 발생의 훨씬 더 높은 가능성을 가지고 있음을 나타낸다 내지 25에서 피크. 점선은 임의의 분포의 눈 나타내는 g (X)에 대한 가이드이다. 삽입이 결합 된 EGF와 비오틴를 통해 연결된 스트렙 타비 딘 코팅 된 양자점과 EGFR 이합체의 대략적인 분자 모델을 보여줍니다. 스트렙 타비 딘의 모델은 EGF 및 EGFR은 1stp (스트렙 타비 딘), 1EGF (EGF)의 CPK 모델에서 얻어, 1NQL, 2JWA, 1M17, 1IVO 및 2GS6 (EGFR) Jmol 버전​​에 의해 생성 된 RCSB 단백질 단백질 데이터뱅크에 구조 12.2.15. RCSB 리간드 Explorer 버전 1.0에서 그린으로 비오틴 모델입니다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53186/53186fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> /53186/53186fig4.jpg &quot;/&gt; 그림 4. 실시 COS-7 세포 EGF-QD800으로 표시하고 상호 형광 및 ESEM-줄기 군데. (A) 형광 이미지, (B) 낮은 배율 개요 ESEM-STEM 이미지입니다. (C) 150,000X 배율 B 사각형의 위치에 기록 된 고해상도 이미지. , 단량체 이량 체 및 클러스터 된 EGFR이 EGF-QD655와 라벨 유사 검색됩니다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53186/53186fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative light- and electron microscopy of whole cells in hydrated state. The label contained fluorescent quantum dots. The protocol can be used to study the stoichiometry of EGFR at the single molecule level.

상호 현미경을 사용하여 본래 세포의 표피 성장 인자 수용체의 화학 양론을 공부

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.3K 조회수.  INM-Leibniz Institute for New Materials. This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative light- and electron microscopy of whole cells in hydrated state. The label contained fluorescent quantum dots. The protocol can be used to study the stoichiometry of EGFR at the single molecule level. 

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Examining the Dynamics of Cellular Adhesion and Spreading of Epithelial Cells on Fibronectin During Oxidative Stress

The adhesion and spreading of cells onto the extracellular matrix (ECM) are essential cellular processes during organismal development and for the homeostasis of adult tissues. Interestingly, oxidative stress can alter these processes, thus contributing to the pathophysiology of diseases such as metastatic cancer. Therefore, understanding the mechanism(s) of how cells attach and spread on the ECM during perturbations in redox status can provide insight into normal and disease states. Described below is a step-wise protocol that utilizes an immunofluorescence-based assay to specifically quantify cell adhesion and spreading of immortalized fibroblast cells on fibronectin (FN) in vitro. Briefly, anchorage-dependent cells are held in suspension and exposed to the ATM kinase inhibitor Ku55933 to induce oxidative stress. Cells are then plated on FN-coated surface and allowed to attach for predetermined periods of time. Cells that remain attached are fixed and labeled with fluorescence-based antibody markers of adhesion (e.g., paxillin) and spreading (e.g., F-actin). Data acquisition and analysis are performed using commonly available laboratory equipment, including an epifluorescence microscope and freely available Fiji software. This procedure is highly versatile and can be modified for a variety of cell lines, ECM proteins, or inhibitors in order to examine a broad range of biological questions.

This method is useful for quantifying the early dynamics of cellular adhesion and spreading of anchorage-dependent cells onto the fibronectin. Furthermore, this assay can be used to investigate the effects of altered redox homeostasis on cell spreading and/or cell adhesion-related intracellular signaling pathways.

세포 부착의 역학 을 검사 하 고 산화 스트레스 동안 Fibronectin에 상피 세포의 확산

The adhesion and spreading of cells onto the extracellular matrix (ECM) are essential cellular processes during organismal development and for the ...

연구

생화학

An Optimized Single-Molecule Pull-Down Assay for Quantification of Protein Phosphorylation

Phosphorylation is a necessary posttranslational modification that regulates protein function and directs cell signaling outcomes. Current methods to measure protein phosphorylation cannot preserve the heterogeneity in phosphorylation across individual proteins. The single-molecule pull-down (SiMPull) assay was developed to investigate the composition of macromolecular complexes via immunoprecipitation of proteins on a glass coverslip followed by single-molecule imaging. The current technique is an adaptation of SiMPull that provides robust quantification of the phosphorylation state of full-length membrane receptors at the single-molecule level. Imaging thousands of individual receptors in this way allows for quantifying protein phosphorylation patterns. The present protocol details the optimized SiMPull procedure, from sample preparation to imaging. Optimization of glass preparation and antibody fixation protocols further enhances data quality. The current protocol provides code for the single-molecule data analysis that calculates the fraction of receptors phosphorylated within a sample. While this work focuses on phosphorylation of the epidermal growth factor receptor (EGFR), the protocol can be generalized to other membrane receptors and cytosolic signaling molecules.

The present protocol describes sample preparation and data analysis to quantify protein phosphorylation using an improved single-molecule pull-down (SiMPull) assay.

단백질 인산화의 정량화를 위한 최적화된 단일 분자 풀다운 분석

Phosphorylation is a necessary posttranslational modification that regulates protein function and directs cell signaling outcomes. Current methods to ...

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

The study of protein interactions in living cells is an important area of research because the information accumulated both benefits industrial applications as well as increases basic fundamental biological knowledge. F&ouml;rster (Fluorescence) Resonance Energy Transfer (FRET) between a donor molecule in an electronically excited state and a nearby acceptor molecule has been frequently utilized for studies of protein-protein interactions in living cells. The proteins of interest are tagged with two different types of fluorescent probes and expressed in biological cells. The fluorescent probes are then excited, typically using laser light, and the spectral properties of the fluorescence emission emanating from the fluorescent probes is collected and analyzed. Information regarding the degree of the protein interactions is embedded in the spectral emission data. Typically, the cell must be scanned a number of times in order to accumulate enough spectral information to accurately quantify the extent of the protein interactions for each region of interest within the cell. However, the molecular composition of these regions may change during the course of the acquisition process, limiting the spatial determination of the quantitative values of the apparent FRET efficiencies to an average over entire cells. By means of a spectrally resolved two-photon microscope, we are able to obtain a full set of spectrally resolved images after only one complete excitation scan of the sample of interest. From this pixel-level spectral data, a map of FRET efficiencies throughout the cell is calculated. By applying a simple theory of FRET in oligomeric complexes to the experimentally obtained distribution of FRET efficiencies throughout the cell, a single spectrally resolved scan reveals stoichiometric and structural information about the oligomer complex under study. Here we describe the procedure of preparing biological cells (the yeast Saccharomyces cerevisiae) expressing membrane receptors (sterile 2 &alpha;-factor receptors) tagged with two different types of fluorescent probes. Furthermore, we illustrate critical factors involved in collecting fluorescence data using the spectrally resolved two-photon microscopy imaging system. The use of this protocol may be extended to study any type of protein which can be expressed in a living cell with a fluorescent marker attached to it.

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

By employing a spectrally resolved two-photon microscopy imaging system, pixel-level maps of F&ouml;rster Resonance Energy Transfer (FRET) efficiencies are obtained for cells expressing membrane receptors hypothesized to form homo-oligomeric complexes. From the FRET efficiency maps, we are able to estimate stoichiometric information about the oligomer complex under study.

Spectrally 해결된 두 광자 현미경을 사용하여 G 단백질 결합 수용체 상호 작용의 생체내 부량에서

The study of protein interactions in living cells is an important area of research because the information accumulated both benefits industrial ...

생물학

An Analytical Tool that Quantifies Cellular Morphology Changes from Three-dimensional Fluorescence Images

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for inclusion and exclusion of data points, and computer-aided pattern recognition to support the interpretation and findings of the analysis. It has become increasingly important to be able to measure fluorescence images constructed from three-dimensional (3D) datasets in order to be able to capture the complexity of cellular dynamics and understand the basis of cellular plasticity within biological systems. Sophisticated microscopy instruments have permitted the visualization of 3D fluorescence images through the acquisition of multispectral fluorescence images and powerful analytical software that reconstructs the images from confocal stacks that then provide a 3D representation of the collected 2D images. Advanced design-based stereology methods have progressed from the approximation and assumptions of the original model-based stereology1 even in complex tissue sections2. Despite these scientific advances in microscopy, a need remains for an automated analytic method that fully exploits the intrinsic 3D data to allow for the analysis and quantification of the complex changes in cell morphology, protein localization and receptor trafficking. 
Current techniques available to quantify fluorescence images include Meta-Morph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) and Image J (NIH) which provide manual analysis. Imaris (Andor Technology, Belfast, Northern Ireland) software provides the feature MeasurementPro, which allows the manual creation of measurement points that can be placed in a volume image or drawn on a series of 2D slices to create a 3D object. This method is useful for single-click point measurements to measure a line distance between two objects or to create a polygon that encloses a region of interest, but it is difficult to apply to complex cellular network structures. Filament Tracer (Andor) allows automatic detection of the 3D neuronal filament-like however, this module has been developed to measure defined structures such as neurons, which are comprised of dendrites, axons and spines (tree-like structure). This module has been ingeniously utilized to make morphological measurements to non-neuronal cells3, however, the output data provide information of an extended cellular network by using a software that depends on a defined cell shape rather than being an amorphous-shaped cellular model. To overcome the issue of analyzing amorphous-shaped cells and making the software more suitable to a biological application, Imaris developed Imaris Cell. This was a scientific project with the Eidgen&ouml;ssische Technische Hochschule, which has been developed to calculate the relationship between cells and organelles. While the software enables the detection of biological constraints, by forcing one nucleus per cell and using cell membranes to segment cells, it cannot be utilized to analyze fluorescence data that are not continuous because ideally it builds cell surface without void spaces. To our knowledge, at present no user-modifiable automated approach that provides morphometric information from 3D fluorescence images has been developed that achieves cellular spatial information of an undefined shape (Figure 1). 
We have developed an analytical platform using the Imaris core software module and Imaris XT interfaced to MATLAB (Mat Works, Inc.). These tools allow the 3D measurement of cells without a pre-defined shape and with inconsistent fluorescence network components. Furthermore, this method will allow researchers who have extended expertise in biological systems, but not familiarity to computer applications, to perform quantification of morphological changes in cell dynamics.

We developed a software platform that utilizes Imaris Neuroscience, ImarisXT and MATLAB to measure the changes in morphology of an undefined shape taken from three-dimensional confocal fluorescence of single cells. This novel approach can be used to quantify changes in cell shape following receptor activation and therefore represents a possible additional tool for drug discovery.

3 차원 형광 이미지에서 세포 형태학의 변경 사항 단정 지을 분석 도구

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and functions despite the intense interorganelle molecular traffic. The techniques described in this paper are powerful means of studying protein and lipid mobility and trafficking in vivo and in their physiological environment. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) and fluorescence loss in photobleaching (FLIP) are widely used live-cell imaging techniques for studying intracellular trafficking through the exo-endocytic pathway, the continuity between organelles or subcompartments, the formation of protein complexes, and protein localization in lipid microdomains, all of which can be observed under physiological and pathological conditions. The limitations of these approaches are mainly due to the use of fluorescent fusion proteins, and their potential drawbacks include artifactual over-expression in cells and the possibility of differences in the folding and localization of tagged and native proteins. Finally, as the limit of resolution of optical microscopy (about 200 nm) does not allow investigation of the fine structure of the ER or the specific subcompartments that can originate in cells under stress (i.e. hypoxia, drug administration, the over-expression of transmembrane ER resident proteins) or under pathological conditions, we combine live-cell imaging of cultured transfected cells with ultrastructural analyses based on transmission electron microscopy.

We describe the imaging approaches we use to investigate the distribution and mobility of the transfected fluorescent proteins resident in the endoplasmic reticulum (ER) by means of the confocal imaging of living cells. We also ultrastructurally analyze the effect of their expression on the architecture of this subcellular compartment.

배양 된 세포의 소포체 하위 도메인의 시각화

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and ...

Confocal Microscopy Reveals Cell Surface Receptor Aggregation Through Image Correlation Spectroscopy

Confocal microscopy provides an accessible methodology to capture sub-cellular interactions critical for the characterization and further development of pre-clinical agents labeled with fluorescent probes. With recent advancements in antibody based cytotoxic drug delivery systems, understanding the alterations induced by these agents within the realm of receptor aggregation and internalization is of critical importance. This protocol leverages the well-established methodology of fluorescent immunocytochemistry and the open source FIJI distribution of ImageJ, with its inbuilt autocorrelation and image mathematical functions, to perform spatial image correlation spectroscopy (ICS). This protocol quantitates the fluorescent intensity of labeled receptors as a function of the beam area of the confocal microscope. This provides a quantitative measure of the state of target molecule aggregation on the cell surface. This methodology is focused on the characterization of static cells with potential to expand into temporal investigations of receptor aggregation. This protocol presents an accessible methodology to provide quantification of clustering events occurring at the cell surface, utilizing well established techniques and non-specialized imaging apparatus.

Antibodies that bind to target receptors on the cell surface can confer conformation and clustering alterations. These dynamic changes have implications for characterizing drug development in target cells. This protocol utilizes confocal microscopy and image correlation spectroscopy through ImageJ/FIJI to quantify the extent of receptor clustering on the cell surface.

Confocal 현미경 검사 법 밝혀 세포 표면 수용 체 이미지 상관 분광학을 통해 집계

Confocal microscopy provides an accessible methodology to capture sub-cellular interactions critical for the characterization and further development of ...

Measuring Proliferation of Vascular Smooth Muscle Cells Using Click Chemistry

The ability of a cell to proliferate is integral to the normal function of most cells, and dysregulation of proliferation is at the heart of many disease processes. For these reasons, measuring proliferation is a common tool used to assess cell function. Cell proliferation can be measured simply by counting; however, this is an indirect means of measuring proliferation. One common means of directly detecting cells preparing to divide is by incorporation of labeled nucleoside analogs. These include the radioactive nucleoside analog 3H-thymidine plus non-radioactive nucleoside analogs such as 5-bromo-2&#8217; deoxyuridine (BrdU) and 5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine (EdU). Incorporation of EdU is detected by click chemistry, which has several advantages when compared to BrdU. In this report, we provide a protocol for measuring proliferation by the incorporation of EdU. This protocol includes options for various readouts, along with the advantages and disadvantages of each. We also discuss places where the protocol can be optimized or altered to meet the specific needs of the experiment planned. Finally, we touch on the ways that this basic protocol can be modified for measuring other cell metabolites.

Proliferation is a critical part of cellular function, and a common readout used to assess potential toxicity of new drugs. Measuring proliferation is, therefore, a frequently used assay in cell biology. Here we present a simple, versatile method of measuring proliferation that can be used in adherent and non-adherent cells.

클릭 화학을 사용하여 혈관 평활근 세포의 증식 측정

The ability of a cell to proliferate is integral to the normal function of most cells, and dysregulation of proliferation is at the heart of many disease ...

Oligomerization Dynamics of Cell Surface Receptors in Living Cells by Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy Combined with Number and Brightness Analysis

Despite the importance and ubiquity of receptor oligomerization, few methods are applicable for detecting clustering events and measuring the degree of clustering. Here, we describe an imaging approach to determine the average oligomeric state of mEGFP-tagged-receptor homocomplexes in the membrane of living cells. The protocol is based on Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy combined with Number and Brightness (N&#38;B) analysis. N&#38;B is a method similar to fluorescence-correlation spectroscopy (FCS) and photon counting histogram (PCH), which are based on the statistical analysis of the fluctuations of the fluorescence intensity of fluorophores diffusing in and out of an illumination volume during an observation time. In particular, N&#38;B is a simplification of PCH to obtain information on the average number of proteins in oligomeric mixtures. The intensity fluctuation amplitudes are described by the molecular brightness of the fluorophore and the average number of fluorophores within the illumination volume. Thus, N&#38;B considers only the first and second moments of the amplitude distribution, namely, the mean intensity and the variance. This is, at the same time, the strength and the weakness of the method. Because only two moments are considered, N&#38;B cannot determine the molar fraction of unknown oligomers in a mixture, but it only estimates the average oligomerization state of the mixture. Nevertheless, it can be applied to relatively small time series (compared to other moment methods) of images of live cells on a pixel-by-pixel basis, simply by monitoring the time fluctuations of the fluorescence intensity. It reduces the effective time-per-pixel to a few microseconds, allowing acquisition in the time range of seconds to milliseconds, which is necessary for fast oligomerization kinetics. Finally, large cell areas as well as sub-cellular compartments can be explored.

We describe an imaging approach for the determination of the average oligomeric state of mEGFP-tagged-receptor oligomers induced by ligand binding in the plasma membrane of living cells. The protocol is based on Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy combined with Number and Brightness (N&#38;B) analysis.

총 내부 반사 형광 현미경 검사법에 의해 살아있는 세포에 있는 세포 표면 수용체의 올리고머화 역학 은 수 및 밝기 분석과 결합됩니다

Despite the importance and ubiquity of receptor oligomerization, few methods are applicable for detecting clustering events and measuring the degree of ...

Graphene Enclosure of Chemically Fixed Mammalian Cells for Liquid-Phase Electron Microscopy

A protocol is described for investigating the human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) in the intact plasma membrane of breast cancer cells using scanning transmission electron microscopy (STEM). Cells of the mammalian breast cancer cell line SKBR3 were grown on silicon microchips with silicon nitride (SiN) windows. Cells were chemically fixed, and HER2 proteins were labeled with quantum dot nanoparticles (QDs), using a two-step biotin-streptavidin binding protocol. The cells were coated with multilayer graphene to maintain a hydrated state, and to protect them from electron beam damage during STEM. To examine the stability of the samples under electron beam irradiation, a dose series experiment was performed. Graphene-coated and non-coated samples were compared. Beam induced damage, in the form of bright artifacts, appeared for some non-coated samples at increased electron dose D, while no artifacts appeared on coated samples.

Presented here is a protocol for labeling membrane proteins in mammalian cells and coating the sample with graphene for liquid-phase scanning transmission electron microscopy. The stability of the samples against the damage caused by radiation can also studied with this protocol.

액체 상 전자 현미경 검사를 위한 화학적으로 고정된 포유류 세포의 그래핀 인클로저

A protocol is described for investigating the human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) in the intact plasma membrane of breast cancer cells using ...

Tension Gauge Tether Probes for Quantifying Growth Factor Mediated Integrin Mechanics and Adhesion

Multicellular organisms rely on interactions between membrane receptors and cognate ligands in the surrounding extracellular matrix (ECM) to orchestrate multiple functions, including adhesion, proliferation, migration, and differentiation. Mechanical forces can be transmitted from the cell via the adhesion receptor integrin to ligands in the ECM. The amount and spatial organization of these cell-generated forces can be modulated by growth factor receptors, including epidermal growth factor receptor (EGFR). The tools currently available to quantify crosstalk-mediated changes in cell mechanics and relate them to&#160;focal adhesions, cellular morphology, and signaling are limited. DNA-based molecular force sensors known as tension gauge tethers (TGTs) have been employed to quantify these changes. TGT probes are unique in their ability to both modulate the underlying force threshold and report piconewton scale receptor forces across the entire adherent cell surface at diffraction-limited spatial resolution. The TGT probes used here rely on the irreversible dissociation of a DNA duplex by receptor-ligand forces that generate a fluorescent signal. This allows quantification of the cumulative integrin tension (force history) of the cell. This article describes a protocol employing TGTs to study the impact of EGFR on integrin mechanics and adhesion formation. The assembly of&#160;the TGT mechanical sensing platform is systematically detailed and the procedure to image forces, focal adhesions, and cell spreading is outlined. Overall, the ability to modulate the underlying force threshold of the probe, the adhesion ligand, and the type and concentration of growth factor employed for stimulation make this a robust platform for studying the interplay of diverse membrane receptors in regulating integrin-mediated forces.

TGT surface is an innovative platform to study growth factor-integrin crosstalk. The flexible probe design, specificity of the adhesion ligand, and precise modulation of stimulation conditions allow robust quantitative assessments of EGFR-integrin interplay. The results highlight EGFR as a 'mechano-organizer' tuning integrin mechanics, influencing focal adhesion assembly and cell spreading.

성장 인자 매개 인테그린 역학 및 접착력을 정량화하기 위한 장력 게이지 테더 프로브

Multicellular organisms rely on interactions between membrane receptors and cognate ligands in the surrounding extracellular matrix (ECM) to orchestrate ...