이 방법은 꽃 봉오리가 제대로 꽃을 피우기 위해 겨울 동안 추위를 축적해야하는 이유와 같은 우디 식물의 휴면에 대한 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 꽃 원시의 매우 작은 샘플에서 전분의 정량화를 허용합니다. 이러한 접근법은 휴면 기간 동안 꽃 프라이모르의 생리적 활성을 검출하는 데 매우 유용하며 살구 나 매화와 같은 다른 나무 종에도 적용 될 수 있습니다.
이 방법은 휴면 꽃 봉오리에 대한 통찰력을 제공 할 수 있지만, 그것은 또한 과일의 발병에 수분에서 생식 단계와 같은 다른 과정에 적용 할 수 있습니다. 시작하려면 필드에서 5개의 슈팅을 수집합니다. 그런 다음 무게와 4섭씨에서 적어도 24 시간 동안 고정 용액10 밀리리터 유리 튜브에 꽃 봉오리 10 개.
그 후 고정을 버리고 샘플을 덮을 수 있는 75%에탄올을 충분히 추가합니다. 길이 15~30cm, 직경 5mm, 꽃봉오리 10개씩 3개의 싹을 얻습니다. 그런 다음 물에 젖은 꽃집의 거품에 싹을 성장 챔버에 놓습니다.
성장 챔버에서 10 일 후, 싹에서 꽃 봉오리를 제거하고 무게. 가을 초초부터 봄의 꽃봉오리버스트까지 매주 꽃봉오리의 성장을 평가합니다. 각 샘플에서 외부 새싹 스케일을 제거한 다음 각 새싹을 75%에탄올이 들어 있는 워치메이커 유리에 놓습니다.
정밀 집게와 안과 메스를 사용하여 싹을 해부하고 각 싹에서 적어도 하나의 꽃 프리모디움을 얻습니다. 파라핀 왁스에 개별적으로 샘플을 포함하여 블록을 형성하고 회전 마이크로톤에 시료를 섹션화합니다. 샘플을 단면한 후 한 방울의 신선한 루골 요오드를 한 섹션에 발라주세요.
5분 후, 얼룩진 종이로 과도한 얼룩을 제거합니다. 다음으로 합성 마운팅 미디어의 작은 방울을 적용, 샘플 위에 작은 커버 유리를 배치하고 열심히 눌러. 마운팅 미디어가 건조되면 밝은 필드 현미경으로 얼룩진 부분을 관찰하십시오.
먼저 텍스트 프로토콜에 따라 조리개 다이어프램과 밝기 제어를 조정합니다. 그런 다음 필터 홀더에 필터가 없는지 확인하고 현미경에서 밝은 필드 상태를 선택하십시오. 그 후, 조직없이 염색 된 준비에 대한 카메라 설정을 조정합니다.
50%에서 밝기를 수정한 다음 과다 노출/노출 부족 기능을 활성화하고 과다 노출 제한시 노출 시간을 조정합니다. 화이트 밸런스 기능과 차도 보정을 적용합니다. 조직없이 염색 된 준비의 결과 흑백 이미지의 회색 수준을 측정합니다.
그런 다음 4N 필터를 적용하고 준비의 또 다른 흑백 이미지를 획득하고 회색 레벨을 측정합니다. 다음으로 빛없이 동일한 준비의 이미지를 획득하고 결과 이미지의 회색 수준을 측정하고 보정합니다. 그 후, 최소 300 dpi의 해상도와 TIFF 형식으로 샘플 섹션의 색상 이미지를 획득한다.
스테인드 영역에 해당하는 이진 이미지를 만든 다음 이진 이미지가 스테인드 전분 과립을 정확하게 반영할 때까지 세 가지 색상 임계값을 설정합니다. 이 프로세스를 다른 준비 및 조직과 함께 반복하여 최종 검색 수준을 미세 조정합니다. 이미지 분석 시스템을 사용하여 마스크 아래의 모든 픽셀의 광학 밀도합계를 측정하여 현장의 전분 함량을 정량화합니다.
본 프로토콜에서 꽃봉오리 의 성장과 휴면 상태는 적합한 조건에서 10일 후에 싹 무게증가를 측정하여 평가하였다. 휴면 기간 동안, 적절한 조건에서 10 일 후에 아무 변화도 관찰되지 않았습니다. 휴면이 극복되면, 싹이 부풀어 와서 성장 챔버에서 파열.
난소 프리마디움내의 전분 함량은 각 미세토메드 섹션에서 이미지 분석을 통해 정량화되었다. 일관되게, 초겨울에 전분의 양은 40, 000 미만의 광학 밀도 값을 제시하고 최대 양은 연구의 두 년 동안 120, 000 과 140, 000 사이의 값에 도달했다. 휴면 상태인 경우, 전분의 최대 량은 두 년 동안 의기양양하게 일어났습니다.
이미지 분석기에서 사용하는 검출 수준은 시스템의 교정에 직접적으로 의존한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 여기에는 현미경의 광 상태, 얼룩 강도 및 배율을 포함합니다. 이 조건은 모든 준비를 위해 수정되어야 합니다.
이미지 분석과 히스토케미컬 기술의 조합은 휴면의 다른 단계 동안 꽃 원시어의 탄수화물 예비를 검사하는 데 매우 유용하게 귀착되었다. 그것은 또한 다른 종 및 조직에 적용 될 수 있습니다. 이 방법의 사용에 의해 공개 된 난소 원시디아의 휴면 방출과 전분 축적 사이의 관계는 휴면 및 냉각 요구 사항의 생물학적 기초를 이해하는 건전한 기초를 제공합니다.
미래의 노력은 나무의 휴면 상태를 쉽게 나타낼 수있는 신뢰할 수있는 생물학적 지표를 연구하는 데 초점을 맞추어야합니다. 한편, 휴면성을 따라 전분 변이의 패턴은 더 생리적 및 유전 적 연구를 프레임하는 데 사용할 수 있습니다.
