저자는 기술 지원 및 제공 자료와이 연구에 대 한 장비 및 기술 지원에 대 한 앨런 Kelleher 박사 하 워드 크로포드 (미시간 대학)의 실험실을 감사 하 고 싶습니다.
이 작품은 미시간 Rogel 암 센터 코어 그랜트 CA046592-26S3, NIH K08 CA201335-01A1 (PLP), BCAN YIA (PLP), NIH R01 CA17483601A1 (DMS)의 대학에서 교부 금에 의해 투자 되었다.

1. 성장 암 Spheroids
<ol><li>
셀 라인에서 성장
	<ol>
<li>기존의 점착 아래 문화 인간 방광 암 세포 세포 문화 조건 하 고 5% CO2와 함께 제공 되는 37 ° C 배양 기에서 유지 합니다. 에 셀 유지 < 90 %confluency. 참고: 사용 하는 문화 미디어는 Dulbecco의 최소 필수 미디어 (DMEM) 4.5 g/L D-포도 당, L-글루타민, 110 mg/L 나트륨 pyruvate, 포함 된 수정 하 고 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)이이 프로토콜을 통해 제공.</li>
		<li>실험의 시작에 앞서 1 일 trypsinize (0.25%를 사용 하 여 트립 신-EDTA) 셀 셀 농도 측정 및 1 x 106 셀 6-잘 매우 낮은 부착 판의 각 잘 3 mL 문화 미디어에 배포.</li>
		<li>≥16 h에 대 한 37 ° C에서 낮은 첨부 조건 셀을 품 어. 이 셀에 대 한 충분 한 시간을 허용 해야 대부분 방광 암 세포 라인에 대 한 spheroids로 집계 하. 참고: spheroids의 형성은 거꾸로 밝은 분야 현미경으로 관찰할 수 있습니다. 최적의 크기와 spheroids의 수, 개별 실험에 따라 달라질 수 있습니다 하지만 우리는 50 µ m에서 150 µ m 직경을 가진 spheroids는 일반적으로 렌즈는 20 X를 사용 하 여 시간 경과 영상에 적합 찾을.</li>
		<li>추가 셀 형식, 섬유 아 세포 등 면역 세포는 spheroids로 통합을 원하는 비율로 암 세포를 원하는 세포 혼합 (1:1, 1:10, 등.) 매우 낮은 첨부에 접시와의 형성을 허용 하도록 ≥16 h 37 ° C에서 품 어 혼합된 셀 형식 spheroids입니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
1 차 종양에서 성장 참고: spheroids 또한 기본 방광 종양에서 파생 될 수 있다 종양 종양 발암 물질 유발 방광 종양 모델8개발 같은 소스. 예를 들어 방광 종양 생쥐에서 생성 된 n 먹이-부 틸-N-(4-hydroxybutyl) nitrosamine (BBN)을 수확 하 고 무 균 수술 도구를 사용 하 여 (약 0.5 m m3) 작은 조각으로 다진 수. 기본 샘플 암 또한이 시스템에 공부 될 수 있다 인간 방광의 소화.<ol>
<li>수집 하 고 5 mL 차가운 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)에서 0.5 m m3 종양 조각 씻어. 4 ° c.에서 5 분 동안 200 x g 에서 원심 분리 한 번이 세 단계를 반복 합니다.</li>
		<li>4 ° c.에서 10 분 동안 200 x g 에서 원심 분리에 의해 종양 조각 수집 상쾌한을 제거 하 고 10% 포함 된 DMEM의 5 mL을 추가 FBS. 6 잘 매우 낮은 정판에 종양 회전 타원 체/미디어 혼합물을 전송. ≥16 콜라겐 매트릭스에 포함 하기 전에 h 37 ° C에서 품 어 (단계 2.3 참조).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 3 차원 문화 챔버 준비
<ol><li>
10% 포함 된 DMEM에 타입-1 콜라겐 (쥐 꼬리에서 파생) 희석 FBS 제조업체의 지침에 따라 2 mg/mL의 혼합물을 만들기 위해.
	<ol>
<li>즉, 1 N NaOH 솔루션의 적절 한 양의 콜라겐을 혼합 하 고 부드러운 pipetting으로 DMEM 생리 pH를 달성 하는 제조업체의 지침에 따라.</li>
		<li>콜라겐과 DMEM 혼합 후 신속 하 게 코트 챔버 슬라이드의 우물 (에 대 한 대부분의 응용 프로그램, 숫자 1.5 커버 유리 챔버 슬라이드 최적의) 응고 (200 µ L/잘) 전에 콜라겐 DMEM 혼합. 15 분 동안 실내 온도에 고정 되도록 코팅된 챔버 슬라이드를 수 있습니다. 참고: 콜라겐 기반 매트릭스의 구성을 수정할 수 있습니다 fibronectin 등 laminin, 다른 기질 재료를 추가 하 여 실험의 목적에 따라.</li>
	</ol>
</li>
	<li>부드럽게 피펫으로 500 µ L 빈 1.5 mL microcentrifuge 관으로 6-잘 매우 낮은 정판에서 spheroids (또는 종양, 주 종양 샘플을 사용 하는 경우)를 포함 하는 미디어의. 튜브의 바닥에 침전 하는 spheroids를 2 분 동안 기다립니다.</li>
	<li>튜브에서는 상쾌한을 조심 스럽게 제거. 10% 포함 된 DMEM 혼합 1 형 콜라겐 (2 mg/mL)의 또 다른 튜브 준비 FBS는 spheroids에이 혼합물의 500 µ L를 신속 하 게 추가. 부드럽게 천천히 pipetting으로 spheroids과 콜라겐을 섞는다.</li>
	<li>콜라겐 사전 코팅 챔버 슬라이드의 250 µ L spheroids/콜라겐 혼합의 추가. 콜라겐 매트릭스 완전히 응고를 spheroids 포함 된 (37 ° C에서 약 30 분)을 허용 합니다.</li>
	<li>콜라겐 매트릭스 경화 후 추가 10% 포함 된 DMEM의 1 mL FBS을 각 영역 (그림 1B). 이미징에 대 한 준비까지 5% CO2 와 함께 제공 된 37 ° C 배양 기에서 챔버 슬라이드를 품 어.</li>
</ol>3. 라이브 셀 시간 경과 영상
<ol><li>Confocal 현미경 제조업체의 지침에 따라 켜고 기후 챔버 37 ° C에 도달 하 고 5% CO2와 함께 제공 됩니다. 참고: 우리의 현미경 및 챔버 일반적으로 시스템이 평형에 도달 하는 1 h 필요 합니다.</li>
	<li>신중 하 게 현미경에 부착 된 슬라이드 어댑터 챔버 슬라이드를 전송 합니다.</li>
	<li>낮은 전력 목표 (예를 들어, 5 X)를 사용 하 여 관심사의 spheroids를 찾아서 높은 전력 목표와 이미징 시작 (현재 프로토콜, 20 X 목표는 그것의 더 나은 이미지 품질에 대 한 라이브 셀 이미징의 대부분). 참고: 기본 방광 종양 샘플, 5 X 10 X 목적과 필요할 수 있습니다 큰 이미지 영역을 커버 하기 위하여. 우리의 시간 경과 영상에 대 한 이미징 간격을 30 분으로 설정 하 고 Z 스택 전체 회전 타원 체의 이미지를 사용 된다. 일반적으로 Z 슬라이스 간의 거리 설정 됩니다 4 µ m에 대 한 목표, 및 Z 축의 총 거리 20 약 200 μ m 이미지 DIC를 사용 하 여 얻을 수 있습니다와 형광 세포/조직 항구 형광 단백질 마커.</li>
	<li>24-72 h에 대 한 시간 경과 영상을 수행 합니다. 참고: 기간 셀 종류와 실험의 요구에 의해 결정 됩니다.</li>
</ol>4. 냉동된 조직 단면에 대 한 암 Spheroids를 포함 하는 샘플 블록의 준비
<ol><li>조심 스럽게 작은 집게를 사용 하 여 콜라겐 젤과 챔버 슬라이드에서 spheroids의 블록을 들어올립니다. 플라스틱 조직학 형에서 콜라겐 젤 블록을 배치 합니다.</li>
	<li>간단히, 1 x PBS와 콜라겐 젤 린스 하 고 수정 4 %paraformaldehyde (PFA)와 함께 PBS에 실 온에서 30 분. 주의: PFA 잠재적인 발암 물질 이며 신중 하 게 처리 되어야 한다.</li>
	<li>워시 15 분 바꾸기에 대 한 통에 1 x PBS의 1.5 mL와 콜라겐 젤 PBS와 이전 세척 단계 3를 반복.</li>
	<li>최적의 절삭 온도 (10 월) 새로운 플라스틱 조직학 몰드의 하단 커버 화합물의 얇은 층 (약 3 m m)를 적용 합니다. 고정 배치 하 고 콜라겐 젤 OCT 위에 씻어 화합물, 후 신중 하 게 포함 전체 젤 oct OCT에서 모든 공기 거품의 형성을 피하고 있는 동안 복합 금형을 작성 하 여.</li>
	<li>1 시간에 4 ° C에서 금형을 둡니다.</li>
	<li>금형 샘플 및 10 월 복합 액체 질소에 100 mm 페 트리 접시에 놓습니다. 완전히 플래시 동결을 샘플을 수 있습니다.</li>
	<li>나중에 사용-80 ° C에서 냉동된 샘플 블록을 저장 합니다.</li>
</ol>5. 면역 형광 이미징 냉동된 Sectioned 암 Spheroids에 대 한
<ol><li>양도 cryostat의 상공 회의소는-20 ° C-80 ° C 냉장고에서 냉동된 샘플 블록.</li>
	<li>
기존의 냉동 단면 7 µ m 단면도 간격을 설정 하 여 수행 합니다. Sectioned 샘플 주름 없이 유리 슬라이드에 연결 하거나 공기 갇혀.
	<ol>
<li>더 얼룩을 수행 하기 전에-80 ° C에 슬라이드를 저장 합니다. 참고: 다른 간격으로 실험적인 요구에 맞게 사용할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>공기 건조 실 온에서 1 h에 대 한 슬라이드.</li>
	<li>0.5%를 포함 하는 PBS를 가진 샘플 permeabilize 15 분에 대 한 트라이 톤 X-100.</li>
	<li>워시 워시 당 10 분에 대 한 PBS 가진 3 배를 샘플링합니다.</li>
	<li>소수 성 장벽을 펜을 사용 하 여 소수 장벽 슬라이드에 샘플을 둘러싸 자.</li>
	<li>실 온에서 1 h에 대 한 차단 솔루션 (1 x PBS 5% 소 혈 청 알 부 민 (BSA)를 포함), 샘플을 처리 합니다.</li>
	<li>기본 포함 하는 항 체 솔루션 (1 x PBS 포함 하는 1 차적인 항 체의 1: 100 희석와 5 %BSA)의 40 µ L 각 샘플 슬라이드에 적용 됩니다.</li>
	<li>1 차적인 항 체 또는 하룻밤 (보육 시간 및 조건에 따라 다를 1 차적인 항 체) 실 온에서 1 h 동안 37 ° C에서의 슬라이드를 품 어.</li>
	<li>세척 (세척) 당 15 분에 대 한 PBS 가진 3 배를 샘플링합니다.</li>
	<li>2 차 항 체를 포함 하 솔루션 (1:300 이차 항 체 희석 BSA의 5%를 포함 하는 1 x PBS)의 40 µ L 각 샘플 슬라이드에 적용 됩니다.</li>
	<li>세척 (세척) 당 15 분에 대 한 PBS 가진 3 배를 샘플링합니다.</li>
	<li>10 분 동안 실내 온도에 Hoechst 33342 솔루션 (1 µ g/mL, PBS에 희석) 샘플을 얼룩. 다음 샘플 PBS 가진 5 분 동안 세척.</li>
	<li>설치 매체와 함께 샘플을 탑재 하 고 적절 한 크기의 덮개 미 끄 러 짐으로 그들을 커버. 24 h에 대 한 실 온에서 어둠 속에서 슬라이드를 두고 confocal 현미경 검사 법을 수행.</li>
</ol>

<ol>
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저자 아무 경쟁 금융 관심사를 선언합니다.

여기는 방광 암은 암 진행과 전이 대 한 중요 한 침입의 실시간 관찰을 허용 하는 3 차원 종양 회전 타원 체 모델에 설명 합니다. 이 시스템은 다양 한 기질과 세포 구성 요소 있도록 더 나은 정리를 조사 조직 microenvironment 방광 암 침공 수행의 의무가 있습니다. 방광 암 spheroids (를 포함 하 여 유전자 변형된 세포 선을 침공 프로세스에 영향을 주는 경로 신호의 검사에 유용), 셀 라인 등 다양 한 소스...

침략은 암 진행, 전이, 필요한 이며 낮은 생존 및 환자에 있는 빈약한 예 지와 관련 있는 중요 한 단계 이다. 인간의 방광 암, 요로 전세계 연간 약 165000 사망 원인의 가장 일반적인 악성 암 단계, 치료 및 예 후는 직접 관련이 침공1의 유무. 방광 암의 경우 약 75%는 비 근육 침략과 관리 지역 절제와 함께. 반면, 근육 침 윤 성 방광 암 (모든 경우의 약 25%) 높은 전이성 속도 공격적인 종양 이며 적극적인 multimodality 치료2,3와 함께 처리 됩니다. 따라서, 이해 하는 분자 경로 침략을 방 아 쇠를 침략 적 진행을 방지할 수 있는 치료 내정간섭을 개발 하 고 더 침략 적 진행의 위험 특성을 필수적 이다.
종양 침 습 진행 복잡 한 3 차원 (3 차원) 환경에서 발생 하 고 다른 종양 세포, 기질, 지하실 멤브레인와 다른 종류의 세포 면역 세포, 섬유 아 세포, 근육 세포를 포함 하 여 종양 세포 상호 작용을 포함 하 고 혈관 내 피 세포입니다. 그들은 실시간으로 침공 과정의 미세한 모니터링을 허용 하지 않습니다 때문에 침투성 지원 (예, Transwell) 분석 결과 시스템은 일반적으로 암 세포 침공4, 하지만이 시스템을 quantitate를 고용 제한 됩니다 및 검색 더 얼룩 및 분자 분석에 대 한 샘플의 도전 이다. 체 외에 시스템의 편의 함께 정의 된 microenvironmental 구성 요소의 설립을 허용 하기 때문에 침공을 공부 하는 3 차원 방광 종양 회전 타원 체 시스템 개발이 바람직합니다.
이 프로토콜에서 세포 운동 성 모니터링 조사 관 수 있도록 콜라겐 기반 젤 매트릭스와 confocal 현미경 검사 법 통합 3 차원 회전 타원 체 침공 분석 결과 사용 하 여 인간의 방광 암 세포의 침입 과정을 심문 하는 시스템을 설명 하 고 실시간으로 (그림 1A)에 침공. 이 시스템은 다양 한 고가 다양 한 stromal 종양 설정을 수정할 수 있습니다. 그것은 암 관련 된 섬유 아 세포 및 면역 세포5,,67와 같은 대부분의 방광 암 세포 선 또는 기본 방광 종양와 추가 stromal 세포 통합할 수 있습니다. 이 프로토콜 타입-1 콜라겐으로 구성 된 행렬을 설명 하지만 fibronectin, laminin, 또는 다른 콜라겐 단백질 등 다른 분자를 포함 하도록 수정할 수 있습니다. 현미경을 사용 하는 시스템의 기능에 따라 72 h 이상 침입 프로세스를 다음 수 있습니다. 고정 및 이전, 도중, 그리고 침략 후 3 차원 매트릭스에 포함 된 종양의 면역 형광 얼룩 수 단백질 upregulated 침입 세포에 따라서 일반적으로 결 석 또는 수집 하기 어려운 중요 한 정보를 제공의 심문 다른 3 차원 문화 모델을 사용 하 여. 이 시스템 신호 경로 같은 화합물에 의해 영향을 나타냅니다 하 고 침입을 차단 하는 스크린 화합물에도 활용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Human bladder cancer cell lines UM-UC9, UM-UC13, UM-UC14, UM-UC18, 253J</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM cell culture medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic-Antimycotic (100x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3803</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Costar Ultral-low attachment 6-well cluster&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>Conventional inverted microscope&amp;nbsp;</td><td>Carl Zeiss</td><td>491206-0001-000</td><td>General use for cell culture and checking spheroids</td></tr><tr><td>Collagen type 1 from rat tail, high concentration&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>354249</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>155382</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope&amp;nbsp;</td><td>Carl Zeiss</td><td>LSM800</td><td>A confocal miscoscope with climate chamber, multi-location imaging, and Z-stack scanning function&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Cryostat micromtome</td><td>Leica Biosystems</td><td>CM3050 S</td><td></td></tr><tr><td>Zen 2 Image processing software&amp;nbsp;</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde solution</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen</td><td>Vector Laboratories&amp;nbsp;</td><td>H4000</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T compound&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23730571</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342 solution&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>Anti-ATDC (Trim29) antibody</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HPA020053</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Cytokeratin 14 antibody</td><td>Abcam</td><td>ab7800</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Vimentin antibody</td><td>Abcam</td><td>ab24525</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Diamond&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>Mounting medium</td></tr></tbody></table>

3-d cell culture system for studying invasion and evaluating therapeutics in bladder cancer

방광 암은 중요 한 건강 문제 이다. 그것은 추정 이상 16000 사람들 방광 암에서 미국에서 올해를 죽을 것 이다. 방광 암의 75%는 비 침 습과 전이 가능성, 약 25%는 침략 적인 성장 패턴을 진행 합니다. 침 윤 성 암 환자의 절반 최대 치명적인 전이성 재발을 개발할 것입니다. 따라서, 환자 결과 예측 하 고 치명적인 전이 방지 하는 중요 한 이다 방광 암에 침략 적 진행의 메커니즘을 이해. 이 문서에서는, 우리는 종양 세포 및 기질 구성 요소 vivo에서 발생 하는 조건에서 방광 종양 microenvironment 모방의 설립을 허용 하는 3 차원 암 침공 모델 제시. 이 모델에는 시간 경과 화상 진 찰을 사용 하 여 실시간으로에서 침입 과정을 관찰, 블록 침공 가능성 confocal immunofluorescent 이미징 및 화면 화합물을 사용 하 여 관련 된 분자 경로 심문 하 기회를 제공 한다. 이 프로토콜은 방광 암에 초점을 맞추고, 그것은 유사한 방법 침공과 운동 성 뿐만 아니라 다른 종양 유형에서 검사 사용 될 수 가능성이 높습니다.

침 윤 성 방광 암 종양 회전 타원 체의 성공적인 창조 적절 한 크기의 종양 세포 선 또는 1 차 종양에서 spheroids의 형성을 필요합니다. 그림 2 A 4 인간의 방광 암 세포 선 (UM UC9, UM UC13, UM UC14, 253J, 및 UM UC18)에서 개발 하는 적절 한 크기의 spheroids를 보여 줍니다. 그림 2 B 콜라겐 매트릭스에 포함 된 BBN 생성 ?...

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3-D Cell Culture System for Studying Invasion and Evaluating Therapeutics in Bladder Cancer

침공을 공부 하 고 방광 암에서 치료제를 평가 하기 위한 3 차원 셀 문화 시스템

방광 암 침공을 관리 하는 프로세스는 바이오 마커 및 치료 개발을 위한 기회를 나타냅니다. 여기 우리는 종양 spheroids 시간 경과 화상 진 찰, confocal 현미경 검사 법의 3 차원 문화를 통합 하는 방광 암 침공 모델 제시. 이 기술은 침략 과정의 기능을 정의 하 고 치료제 심사에 대 한 유용 합니다.

Bladder cancer is a significant health problem. It is estimated that more than 16,000 people will die this year in the United States from bladder cancer. ...

3-d-cell-culture-system-for-studying-invasion-evaluating-therapeutics

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Cancer Research

8.9K 조회수.  University of Michigan Medical Center. 방광 암 침공을 관리 하는 프로세스는 바이오 마커 및 치료 개발을 위한 기회를 나타냅니다. 여기 우리는 종양 spheroids 시간 경과 화상 진 찰, confocal 현미경 검사 법의 3 차원 문화를 통합 하는 방광 암 침공 모델 제시. 이 기술은 침략 과정의 기능을 정의 하 고 치료제 심사에 대 한 유용 합니다.

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Spheroid Assay to Measure TGF-&#946;-induced Invasion

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis at later stage1,2. Moreover, TGF-&beta; is frequently overexpressed in breast cancer and its expression correlates with poor prognosis and metastasis 3,4. The mechanisms by which TGF-&beta; induces invasion are not well understood.
TGF-&beta; elicits its cellular responses via TGF-&beta; type II (T&beta;RII) and type I (T&beta;RI) receptors. Upon TGF-&beta;-induced heteromeric complex formation, T&beta;RII phosphorylates the T&beta;RI. The activated T&beta;RI initiates its intracellular canonical signaling pathway by phosphorylating receptor Smads (R-Smads), i.e. Smad2 and Smad3. These activated R-Smads form heteromeric complexes with Smad4, which accumulate in the nucleus and regulate the transcription of target genes5. In addition to the previously described Smad pathway, receptor activation results in activation of several other non-Smad signaling pathways, for example Mitogen Activated Protein Kinase (MAPK) pathways6.
To study the role of TGF-&beta; in different stages of breast cancer, we made use of the MCF10A cell system. This system consists of spontaneously immortalized MCF10A1 (M1) breast epithelial cells7, the H-RAS transformed M1-derivative MCF10AneoT (M2), which produces premalignant lesions in mice8, and the M2-derivative MCF10CA1a (M4), which was established from M2 xenografts and forms high grade carcinomas with the ability to metastasize to the lung9. This MCF10A series offers the possibility to study the responses of cells with different grades of malignancy that are not biased by a different genetic background.
For the analysis of TGF-&beta;-induced invasion, we generated homotypic MCF10A spheroid cell cultures embedded in a 3D collagen matrix in vitro (Fig 1). Such models closely resemble human tumors in vivo by establishing a gradient of oxygen and nutrients, resulting in active and invasive cells on the outside and quiescent or even necrotic cells in the inside of the spheroid10. Spheroid based assays have also been shown to better recapitulate drug resistance than monolayer cultures11. This MCF10 3D model system allowed us to investigate the impact of TGF-&beta; signaling on the invasive properties of breast cells in different stages of malignancy.

An assay to quantitatively measure Transforming Growth Factor (TGF)-&#x03B2;-induced invasion in 3-dimensional collagen gels is described. This assay takes advantage of the MCF10A series of cell lines, which represent different stages of breast cancer development. This method can be adopted to be used with other cell lines and might be used to investigate other potential activators or inhibitors of invasion.

TGF - β - 유발 침략을 측정하는 회전 타원체 분석

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis ...

연구

의학

Modeling and Imaging 3-Dimensional Collective Cell Invasion

A defining characteristic of cancer malignancy is invasion and metastasis 1. In some cancers (e.g. glioma 2), local invasion into surrounding healthy tissue is the root cause of disease and death. For other cancers (e.g. breast, lung, etc.), it is the process of metastasis, in which tumor cells move from a primary tumor mass, colonize distal sites and ultimately contribute to organ failure, that eventually leads to morbidity and mortality 3. It has been estimated that invasion and metastasis are responsible for 90&#37; of cancer deaths 4. As a result, there has been intense interest in identifying the molecular processes and critical protein mediators of invasion and metastasis for the purposes of improving diagnosis and treatment 5.
A challenge for cancer scientists is to develop invasion assays that sufficiently resemble the in vivo situation to enable accurate disease modeling 6. Two-dimensional cell motility assays are only informative about one aspect of invasion and do not take into account extracellular matrix (ECM) protein remodeling which is also a critical element. Recently, research has refined our understanding of tumor cell invasion and revealed that individual cells may move by elongated or rounded modes 7. In addition, there has been greater appreciation of the contribution of collective invasion, in which cells invade in strands, sheets and clusters, particularly in highly differentiated tumors that maintain epithelial characteristics, to the spread of cancer 8.
We present a refined method 9 for examining the contributions of candidate proteins to collective invasion 10. In particular, by engineering separate pools of cells to express different fluorescent proteins, it is possible to molecularly dissect the activities and proteins required in leading cells versus those required in following cells. The use of RNAi provides the molecular tool to experimentally disassemble the processes involved in individual cell invasion as well as in different positions of collective invasion. In this procedure, mixtures of fluorescently-labeled cells are plated on the bottom of a Transwell insert previously filled with Matrigel ECM protein, then allowed to invade "upwards" through the filter and into the Matrigel. Reconstruction of z-series image stacks, obtained by confocal imaging, into three-dimensional representations allows for visualization of collectively invading strands and analysis of the representation of fluorescently-labeled cells in leading versus following positions.

Models of tumor cell invasion into three-dimensional extracellular matrix better reflect the in vivo situation than two-dimensional motility assays. Using matrix invasion assays combined with confocal imaging of fluorescently-labeled cells, detailed information on invasion modes and the distinct contributions of leading versus following cells can be obtained.

모델링 및 3 차원 이미징 단체 셀 침략

A defining characteristic of cancer malignancy is invasion and metastasis 1. In some cancers (e.g. glioma 2), local invasion into surrounding healthy ...

Culture, Manipulation, and Orthotopic Transplantation of Mouse Bladder Tumor Organoids

The development of advanced tumor models has long been encouraged because current cancer models have shown limitations such as lack of three-dimensional (3D) tumor architecture and low relevance to human cancer. Researchers have recently developed a 3D in vitro cancer model referred to as tumor organoids that can mimic the characteristics of a native tumor in a culture dish. Here, experimental procedures are described in detail for the establishment of bladder tumor organoids from a carcinogen-induced murine bladder tumor, including culture, passage, and maintenance of the resulting 3D tumor organoids in vitro. In addition, protocols to manipulate the established bladder tumor organoid lines for genetic engineering using lentivirus-mediated transduction are described, including optimized conditions for the efficient introduction of new genetic elements into tumor organoids. Finally, the procedure for orthotopic transplantation of bladder tumor organoids into the wall of the murine bladder for further analysis is laid out. The methods described in this article can facilitate the establishment of an in vitro model for bladder cancer for the development of better therapeutic options.

This protocol provides detailed experimental steps to establish a three-dimensional in vitro culture of bladder tumor organoids derived from carcinogen-induced murine bladder cancer. Culture methods including passaging, genetic engineering, and orthotopic transplantation of tumor organoids are described.

마우스 방광 종양 오르가노이드의 문화, 조작 및 정형 외과 이식

The development of advanced tumor models has long been encouraged because current cancer models have shown limitations such as lack of three-dimensional ...

암 연구학

Monitoring Cancer Cell Invasion and T-Cell Cytotoxicity in 3D Culture

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited number of assays allow for direct monitoring and mechanistic insights into the interactions between tumor and immune cells, amongst which, T-cells play a significant role in executing the cytotoxic response of the adaptive immune system to cancer cells. Most assays are based on two-dimensional (2D) co-culture of cells due to the relative ease of use but with limited representation of the invasive growth phenotype, one of the hallmarks of cancer cells. Current three-dimensional (3D) co-culture systems either require special equipment or separate monitoring for invasion of co-cultured cancer cells and interacting T-cells.
Here we describe an approach to simultaneously monitor the invasive behavior in 3D of cancer cell spheroids and T-cell cytotoxicity in co-culture. Spheroid formation is driven by enhanced cell-cell interactions in scaffold-free agarose microwell casts with U-shaped bottoms. Both T-cell co-culture and cancer cell invasion into type I collagen matrix are performed within the microwells of the agarose casts without the need to transfer the cells, thus maintaining an intact 3D co-culture system throughout the assay. The collagen matrix can be separated from the agarose cast, allowing for immunofluorescence (IF) staining and for confocal imaging of cells. Also, cells can be isolated for further growth or subjected to analyses such as for gene expression or fluorescence activated cell sorting (FACS). Finally, the 3D co-culture can be analyzed by immunohistochemistry (IHC) after embedding and sectioning. Possible modifications of the assay include altered compositions of the extracellular matrix (ECM) as well as the inclusion of different stromal or immune cells with the cancer cells.

The presented approach simultaneously evaluates cancer cell invasion in 3D spheroid assays and T-cell cytotoxicity. Spheroids are generated in a scaffold-free agarose multi-microwell cast. Co-culture and embedding in type I collagen matrix are performed within the same device which allows to monitor cancer cell invasion and T-cell mediated cytotoxicity.

3D 배양에서 암 세포 침략 및 T 세포 세포 독성 을 감시

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited ...

Culture of Bladder Cancer Organoids as Precision Medicine Tools

Current in vitro therapeutic testing platforms lack relevance to tumor pathophysiology, typically employing cancer cell lines established as two-dimensional (2D) cultures on tissue culture plastic. There is a critical need for more representative models of tumor complexity that can accurately predict therapeutic response and sensitivity. The development of three-dimensional (3D) ex vivo culture of patient-derived organoids (PDOs), derived from fresh tumor tissues, aims to address these shortcomings. Organoid cultures can be used as tumor surrogates in parallel to routine clinical management to inform therapeutic decisions by identifying potential effective interventions and indicating therapies that may be futile. Here, this procedure aims to describe strategies and a detailed step-by-step protocol to establish bladder cancer PDOs from fresh, viable clinical tissue. Our well-established, optimized protocols are practical to set up 3D cultures for experiments using limited and diverse starting material directly from patients or patient-derived xenograft (PDX) tumor material. This procedure can also be employed by most laboratories equipped with standard tissue culture equipment. The organoids generated using this protocol can be used as ex vivo surrogates to understand both the molecular mechanisms underpinning urological cancer pathology and to evaluate treatments to inform clinical management.

Patient-derived organoids (PDOs) are a powerful tool in translational cancer research, reflecting both the genetic and phenotypic heterogeneity of the disease and response to personalized anti-cancer therapies. Here, a consolidated protocol to generate human primary bladder cancer PDOs in preparation for the evaluation of phenotypic analyses and drug responses is detailed.

정밀 의학 도구로서의 방광암 오가노이드의 문화

Current in vitro therapeutic testing platforms lack relevance to tumor pathophysiology, typically employing cancer cell lines established as ...

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional (3D) Model

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the extracellular matrix (ECM) has been demonstrated to be a critical regulator of cell behavior in culture and homeostasis in vivo. The current approach of culturing cells on two-dimensional (2D), plastic surfaces results in the disturbance and loss of complex interactions between cells and their microenvironment. Through the use of three-dimensional (3D) culture assays, the conditions for cell-microenvironment interaction are established resembling the in vivo microenvironment. This article provides a detailed methodology to grow breast cancer cells in a 3D basement membrane protein matrix, exemplifying the potential of 3D culture in the assessment of cell invasion into the surrounding environment. In addition, we discuss how these 3D assays have the potential to examine the loss of signaling molecules that regulate epithelial morphology by immunostaining procedures. These studies aid to identify important mechanistic details into the processes regulating invasion, required for the spread of breast cancer.

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional 3D Model

This article provides detailed methodologies for the use of three-dimensional (3D) assays to quantify breast cancer cell invasion. Specifically, we discuss the procedures required to set up such assays, quantification, and data analysis, as well as methods to examine the loss of membrane integrity that occurs when cells invade.

3 차원 (3D) 모델을 사용하여 유방암 세포 침윤의 정량화

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the ...

암 생물학의 3D 모델: 헤테로스페로이드의 침입 역학

Alternative Strategy to Analyze In Vitro Cell Invasion of 3D Cultures

Spheroid culture is a 3D model that provides an improved replication of the in vivo microenvironment compared to traditional two-dimensional (2D) cultures. Invasion is a cellular outcome of utmost interest in cancer biology. In this protocol, we have devised an alternative strategy for evaluating cancer cell invasion in vitro, employing heterospheroids comprised of oral squamous cell carcinoma (OSCC), cancer-associated fibroblasts (CAF), and monocytes. These heterospheroids aim to mimic the tumor microenvironment (TME), including two relevant non-neoplastic cell types alongside the cancer cells. Each cell type was labeled with vital fluorescent markers emitting in distinct wavelengths before spheroid formation. Once formed, heterospheroids were seeded onto a layer of human leiomyoma-derived extracellular matrix in the upper compartment of a microporous membrane. Invasion was assessed in the z-axis using confocal microscopy. Digital images were obtained in the corresponding fluorescent channels at 10 &#181;m intervals, covering a depth of 90 &#181;m in the z-axis. Analysis was performed using freeware image software by calculating the integrated fluorescence intensity in each image and fluorescence channel. This approach enables a more dynamic analysis of cell invasion patterns in a multilayered context, as well as the examination of spatial co-localization of different cell types during invasion.

저자 스포트라이트: 두경부암 진행 중 암과 면역 세포 사이의 누화 해독

Invasion is a major biological phenomenon in the development and progression of cancer. This process is influenced by non-neoplastic cells and components of the tumor microenvironment. The purpose of this study is to describe an alternative method for analyzing tumor cell invasion in vitro using three-dimensional (3D) cultures.

3D 배양의 In vitro 세포 침입을 분석하기 위한 대안 전략

Spheroid culture is a 3D model that provides an improved replication of the in vivo microenvironment compared to traditional two-dimensional (2D) ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in particular (e.g., brain tumors such as glioblastoma multiforme and squamous cell carcinoma of the head and neck &#8211; SCCHN) it is a cause of severe morbidity and can be life-threatening even in the absence of distant metastases. In addition, cancers which have relapsed following treatment unfortunately often present with a more aggressive phenotype. Therefore, there is an opportunity to target the process of invasion to provide novel therapies that could be complementary to standard anti-proliferative agents. Until now, this strategy has been hampered by the lack of robust, reproducible assays suitable for a detailed analysis of invasion and for drug screening. Here we provide a simple micro-plate method (based on uniform, self-assembling 3D tumor spheroids) which has great potential for such studies. We exemplify the assay platform using a human glioblastoma cell line and also an SCCHN model where the development of resistance against targeted epidermal growth factor receptor (EGFR) inhibitors is associated with enhanced matrix-invasive potential. We also provide two alternative methods of semi-automated quantification: one using an imaging cytometer and a second which simply requires standard microscopy and image capture with digital image analysis.

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.

3 차원 (3D) 종양 회전 타원체 침공 분석

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

침공을 공부 하 고 방광 암에서 치료제를 평가 하기 위한 3 차원 셀 문화 시스템

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TGF - β - 유발 침략을 측정하는 회전 타원체 분석

모델링 및 3 차원 이미징 단체 셀 침략

마우스 방광 종양 오르가노이드의 문화, 조작 및 정형 외과 이식

3D 배양에서 암 세포 침략 및 T 세포 세포 독성 을 감시

정밀 의학 도구로서의 방광암 오가노이드의 문화

3 차원 (3D) 모델을 사용하여 유방암 세포 침윤의 정량화

3D 배양의 In vitro 세포 침입을 분석하기 위한 대안 전략

3D 배양의 In vitro 세포 침입을 분석하기 위한 대안 전략

3D 배양의 In vitro 세포 침입을 분석하기 위한 대안 전략

3 차원 (3D) 종양 회전 타원체 침공 분석