이 방법은 C.elegans에 있는 세포 주기 및 세균 선 줄기 세포 인구 역학에 관하여 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 트랜스유전자가 필요하지 않으며, 면역 형광 염색과 호환되며, 많은 다른 조건하에서 세포를 연구하도록 수정될 수 있다는 것입니다. 나는 처음 Scheda 실험실에서 사용되는이 방법을 보았을 때 매우 흥분했다.
이 방법은 C.elegans 세포 주기에 대한 통찰력을 제공 할 수 있지만, 그것은 또한 노화에 대한 광범위한 질문에 적용 될 수있다, 영양, 또는 변경 된 유전자형. 일반적으로 이 방법에 새로운 실험실은 초기 절제 또는 C.elegans 헤마톡시린 염색으로 어려움을 겪을 수 있습니다. 멸균 기술을 사용하여 10 밀리미터 EdU의 200 마이크로리터를 M9 버퍼 100 밀리리터에 추가하고 하룻밤 MG 1693 E.coli 배양4 밀리리터에 적절한 보충제를 추가하십시오.
특이하게 만드는 것은 EdU와 티미딘 보충 사이의 섬세한 균형이 필요합니다. 티미딘의 양이 E 대장균이 잘 자라기에는 충분해야 하며, EdU의 양은 레벨링에 대한 견고한 쉴드에 충분해야 합니다. 섭씨 37도 및 RPM 200에서 24시간 이상 후 멸균 기술을 사용하여 원심분리를 위해 멸균 50밀리리터 원간 튜브 2~4개 사이를 배양합니다.
신선한 M9 버퍼의 펠라틴 4 밀리리터를 다시 중단하고 개별 실온 60 밀리리터 M9 가드 페트리 접시의 중심에 E Coli MG1693 용액의 약 8 방울을 적용하기 위해 동일한 파이펫을 사용합니다. EdU 라벨이 부착된 박테리아를 선충에 먹이려면 신선한 PBS를 사용하여 선충 성장 중형 식기에서 C.Elegans를 1.5 밀리리터 튜브로 세척하고 동물이 중력에 의해 잠시 정착할 수 있도록 합니다. PBS의 1 밀리리터로 동물을 1~2회 씻고 유리 파스퇴기 파이펫을 사용하여 선충을 EDU 잔디 의 중앙으로 옮기는 작은 PBS 한 방울을 사용하십시오.
실험 프로토콜에 따라 액체가 흡수되고 20°C에서 적어도 30분 동안 배양할 때까지 몇 분 정도 기다립니다. 인큐베이션이 끝나면 PBS 의 밀리리터 2개를 사용하여 EdU 배양 판에서 유리 해부 접시에 벌레를 플러시합니다. 앞서 설명한 바와 같이 선충 고나드의 해부 및 고정 후, 0.1%tween 20으로 보충된 PBS를 사용한 작은 1밀리리터 보로실리케이트 유리 튜브와 긴 유리 파스퇴르 파이펫을 헹구고 파이펫을 사용하여 고정 된 조나드를 소량의 PBS tween으로 튜브로 전송합니다.
원심분리로 조나드를 수집하고 길고 그려진 유리 목초지 파이펫을 사용하여 고나드 펠릿을 방해하지 않고 가능한 한 많은 슈퍼나텐트를 제거합니다. EdU 감지를 위해 100 마이크로리터의 클릭 EdU 칵테일을 조나드에 추가하고 실온에서 30~60분 동안 실험실 필름으로 튜브를 덮습니다. 인큐베이션이 끝나면 gonads를 100 마이크로리터의 반응 헹구기 버퍼로 한 번, PBS 트위엔 1밀리리터로 4회 세척합니다.
마지막 세척 후, 샘플에 DAPI로 보충 된 페이드 장착 방지 배지의 25 마이크로 리터를 추가합니다. 매체가 곤나위에 정착하는 동안, 표준 유리 현미경 슬라이드에 큰 2.5 %의 아가로즈 패드를 놓습니다. 그런 다음 두 번째 슬라이드로 평평하게 합니다.
다음으로, 긴 유리 파스퇴기 파이펫을 사용하고 조나들을 패드로 옮길 때 시료 손실을 최소화하기 위해 파이펫의 좁은 끝에 액체와 조나들을 모두 보관한다. 이쑤시개에 붙은 속눈썹을 사용하여 아가로즈 패드 위에 곤드를 분배하고 먼지 입자를 제거합니다. 그런 다음 직사각형 유리 커버를 천천히 낮추어 곤나드에 미끄러져 기포를 피하고 실험실 조직으로 과도한 용액을 제거합니다.
셀을 3차원으로 계산하는 것은 몇 가지 연습을 안정적으로 수행합니다. 피지의 셀 카운터 플러그인및 같은 스크립트를 사용하여 중복을 제거하기 위해 세포를 표시하면 카운트가 재현 가능하게됩니다. 커버 슬립이 하룻밤 사이에 정착할 수 있도록 허용한 후, 셀 카운터 플러그인과 피지를 사용하여 각 핵을 수동으로 계산하여 인포이스톤 3EdU 또는 프리제너터 존 세포 라벨링의 존재 또는 부재에 따라 각 개별 핵에 라벨을 부착합니다.
EdU 신호는 DAPI 신호와 공동 지역화됩니다. 일부 핵에서, EdU 신호는 염색체의 모든 것을 커버하고, 다른 핵에서는, EdU 신호는 S-phase에서 늦게 복제하는 X 염색체에 확률이 높은 1-2개의 밝은 punkta로 국소화합니다. 성공적인 30분 라벨링으로부터의 EdU 신호는 프리제너터 영역에서 핵의 약 절반으로 국소화한다.
이 기술은 야생 형 젊은 성인 동물에서 일관되게 작동하지만, 짝짓기 5 일 된 hermaphrodites의 상당 부분은 30 분 EdU 펄스에 레이블을 지정하지 못합니다. G2의 지속 시간은 시간 과정 동안 EdU 양성인 M-phase에서 핵의 백분율을 분석하여 추정할 수 있어 G2의 중앙값 및 최대 지속 시간을 계산할 수 있습니다. G2 및 G1의 지속 시간은 EdU 양성인 모든 전유전자 종구 핵의 백분율로부터 추정될 수 있으며, 결합된 단계의 최대 지속 시간을 계산할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 동일한 EdU 접시 배치를 사용하여 실험 간 가변성을 최소화하는 것이 중요합니다.
이 절차에 따라, 추가 항체로 염색과 같은 그밖 방법은 세포 주기, 세포 운명, 또는 신호 경로에 관하여 추가 질문에 수행하거나 대답할 수 있습니다. 핵제거 유사체와 파라페멜다히드를 사용하면 위험할 수 있으며, 니트롤 장갑착용과 같은 예방 조치는 이 절차를 수행하는 동안 항상 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.
