Name: in vivo photolabeling of cells in the colon to assess migratory potential of hematopoietic cells in neonatal mice
Uploaded: 2018-08-10T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Photolabeling of Cells in the Colon to Assess Migratory Potential of Hematopoietic Cells in Neonatal Mice at JoVE.com

Nitya 자이나교는 NIH/NIAID 경력 전환 상 1K22AI116661-01에 의해 지원 되었다.

모든 동물 절차 승인 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 매사 추세 츠 종합 병원에서 준수와의 수행 했다.
주의:이 프로토콜 클래스 3b 레이저 (LG3)의 사용을 포함. LG3 레이저 안전 고글이이 레이저를 작동 하는 경우에 항상 사용 해야 합니다. 적절 한 교육 및 안전 지침 부상의 위험을 피하기 위해 따라야 합니다.
1. 디자인 및 레이저
<ol><li>라이트-발광 다이오드 (LED)를 연결 (405 nm, 19.3 mW, 1400 mA, 섬유 결합) 하는 LED 드라이버를 통해 오는 4 핀 M8 커넥터 케이블 LED에 연결. 조심 스럽게 연결 고정 하는 나사를 조입니다.</li>
	<li>Optogenetics 패치 케이블 LED를 연결 하기 전에 커넥터를 잡고 LED의 최대 개방 거기 있도록 빛은 볼 수 없는 장애물. 필요한 경우 이물질을 제거 하 여 optogenetics 패치 케이블을 삽입 구멍에 불어.</li>
	<li>커넥터 슬리브의 한쪽 끝에는 정을 삽입 하 여 섬유 광섬유 정 optogenetics 패치 케이블을 연결 합니다. 패치 케이블을 커넥터 슬리브의 다른 쪽 끝을 연결 합니다.  연결을 보호 하지만 구부리거나 광섬유를 정 맥에 휴식을 조심 하는 충분 한 압력을 적용 합니다. 참고: 연약한 섬유 광섬유 정 맥으로 덮여 있다 보호 모자 때마다 레이저 사용 되지 않습니다.</li>
	<li>0과 1.2 A. 설정 전류 제한에 지속적인 조정 손잡이와 연속파 (CW) 모드를 설정 하는 LED 드라이버</li>
</ol>2입니다. 결 장에서 세포의 Photoconversion
참고: 남성 및 여성 쥐 intracolonic 405 nm 빛에 드러낸 그들의 출생 후 1-2 일 및 나이의 1 주 전에 희생 되었다.
<ol><li>전원 콘센트에 대 한 액세스와 함께 어두운 위치를 확보. LED 드라이버를 콘센트에 꽂습니다. 참고:이 절차에서에서 수행 됩니다 최소한의 하얀 빛으로 주위 빛에 쥐의 긴 노출 셀의 원치 않는 photoconversion를 발생할 수 있습니다. 레드 빛 대신 사용 됩니다. 주의: 다음 단계는 동물 마 취의 사용을 포함 한다. 마 취의 관리 클래스 II 후드에서 또는 다른 적절 한 청소 시스템을 사용 하 여 일어난다. 현기증, 졸음, 또는 심지어 무 의식 흡입 마 취의 발생할 수 있습니다.</li>
	<li>4-5 %isoflurane 유도 상자에 100% o 2에 노출에 의해 마우스를 anesthetize. 단단히 꼬 집는 뒷 발 (응답) 하 여 마 취의 적절 한 깊이 확인 합니다. 약 2 %isoflurane 코 콘을 통해 마 취를 유지 합니다. 적절 한 후드 또는 마 취 청소 장치를 사용 하 여 처리기 isoflurane 노출을 방지 합니다.</li>
	<li>위치 1을 사용 하 여 intracolonic 노출에 대 한 마 취 마우스 손을 아저씨는 검지 손가락과 엄지손가락으로 부드럽게 마우스의 뒷면. 복 부를 노출 하는 마우스를 넘겨. 마우스의 핑크 색상을 잃고 시작 하는 경우 또는 호흡 속도 천천히 시작 하는 경우는 그립을 풉니다. 반지와 작은 손가락 사이의 마우스의 꼬리를 보호 합니다.</li>
	<li>다른 한편으로는 정 맥에서 보호 캡을 제거 합니다. 유지 하면서 정 마우스의 중간에 평행의 긴 축 부드럽게 삽입 항문을 통해 섬유 광섬유 정 콜론으로 광섬유의 모든 5 m m 마우스 안에 있습니다. 참고:이 절차는 천천히, 그리고 신중 하지 저 승 벽 구멍을 수행 됩니다. 분은 정의 왜곡 하 고 방도 에이즈 콜론으로 발전.</li>
	<li>안전 고글을 착용 하 고 최대 값 (모든 방법 시계 방향으로) 현재 레이저를 증가. 마우스의 반투명 복 부에 보고 하 여 UV 빛의 존재를 확인 합니다. 참고: LG3 레이저 안전 고글은 극적으로 가시성을 감소. 동료 (입고 보호 장비) 레이저에서 고글을 donning 및 도움이 있다.</li>
	<li>노출 2 분 철수 정 약 1 m m의 총 빛 레이저에 콜론 모든 30의 빛에 노출 luminal 영역을 최대화 하기 위해. 2 분의 끝에, 해제 레이저.</li>
	<li>천천히 마우스에서은 정을 제거 합니다. 빈 따뜻한 케이지 마 취에서 회복 후, 홈 케이지를 마우스를 반환 합니다.</li>
</ol>3입니다. 창 자 세포의 고립
<ol><li>행 크의 균형 소금 솔루션/송아지 혈 청 (HBSS/CS) 버퍼의 1 L, 상피 스트립 버퍼의 200 mL, 500 mL의 세척 미디어, 그리고 ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) 200 mL를 준비-무료 세척 미디어. 참고: 시 약 볼륨 9의 샘플 크기에 대 한 계산 됩니다.<ol>
<li>HBSS 950 mL에 CS의 50 mL를 추가 하 여 (HBSS; 5 %CS) HBSS/CS 버퍼를 확인 합니다. 얼음에 그것을 저장 합니다.</li>
		<li>CS, 1 M DTT, 0.5 M EDTA의 2 mL 및 1 M HEPES 버퍼의 3 mL 200 µ L의 10ml 185 mL을 추가 하 여 상피 스트립 버퍼 [HBSS, 5 %CS, 1 m m dithiothreitol (DTT); 5 mM EDTA, 15 mM 4-(2-Hydroxyethyl) piperazine-1-ethanesulfonic 산 (HEPES) (pH 7.2-7.5)]를 준비 HBSS의. 37 ° C 물 욕조에 상피 스트립 버퍼를 놓습니다.</li>
		<li>HBSS 494 mL에 CS의 5 mL 및 0.5 M EDTA의 1 mL을 추가 하 여 세척 미디어 (HBSS; 1% CS 1 mM EDTA)를 확인 합니다. 실 온에서 보관 합니다.</li>
		<li>HBSS 195 mL에 2 mL의 CS와 1 m HEPES 3 mL를 추가 하 여 EDTA 무료 세척 미디어 (HBSS; 1% CS 15 mM HEPES)를 준비 합니다. 실 온에서 보관 합니다.</li>
		<li>FACS 버퍼 만들기 [버퍼링 하는 인산 염 (PBS) x 1 (pH 7.2 =); 2 %CS] CS의 10 mL PBS의 490 mL에 추가 하 여. 얼음에 그것을 저장 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>60 x 10 m m 문화 접시 안에 70 µ m 셀 스 트레이너를 배치 하 여 조직 컬렉션 접시를 준비 합니다. 접시에 HBSS/CS 버퍼 (HBSS; 5 %CS 버퍼 단계 3.1.1에서에서 만든 및 얼음에 저장 된)의 10 mL를 추가 하 고 얼음에 그것을 배치.</li>
	<li>마우스를 통해 적절 한 마 취의 청소를 사용 하 여 흡입된 isoflurane의 과다를 안락사 (에 약 3 분 노출 > 4% isoflurane 100% O2또는 방 공기에서). 호흡의 명백한 중단 후 반사 운동, 뒷 발을 확고 하 게 곤란 하 여 깊은 고통의 부재를 확인 (집게를 사용 하는 것이 좋습니다). 수술가 위 또는 새로운 면도칼을 사용 하 여 잘린 통해 안락사 확인 합니다. 참고: 자 궁 경부 전위 크기와 동물의 나이 때문에이 단계에 대 한 권장 하지 않습니다. 이러한 방법은 안락사에 AVMA 지침을 2013와 일치 되며 MGH IACUC에 의해 승인.</li>
	<li>복 부를 열고 깨끗 한 집게와가 위를 사용 하 여 콜론을 수확. 마우스의 복 부를 노출 콜론의 1 측에 내장을 반영 합니다. 먼저 그것은 단지 (항문)으로 원심 transecting에 의해 전체 콜론 제거 맹 하. 그런 다음 집게와 콜론을 단단히 잡고, 항문에 요도 통해 잘라가 위를 사용 합니다. 최대한 항문 주변으로 콜론을 잘라. 콜론을 제거 후 비장 수확 (4.1-4.2 아래 단계를 참조). 참고: photoconversion 프로토콜만 신생아의 콜론 (섬유 광섬유 정 5 m m)의 25%를 대상으로, 하는 동안 전체 콜론 셀 격리에 도움이 수확 이다.</li>
	<li>결 장 그리고 건조 종이 타월에 내용을 밀어 집게를 사용 하 여 콜론을 청소. 조직 문화 접시의 커버에 붙여넣기 콜론 잘게 잘라를 다음 페 트리 접시에 셀 스 트레이너를이 붙여넣기를 전송 면도날을 사용 하 여 균질.</li>
	<li>깨끗 한 8 m m 긴 자기 저 어 바는 여과기를 추가 하 고 9 위치 자력 접시에 접시를 놓고. 800 rpm에 자석 볶음 바 속도 설정 하 고 실 온에서 5 분에 대 한 셀을 품 어. 버퍼를 삭제 하 고 HBSS/cs (는 HBSS; 5 %CS 버퍼 단계 3.1.1에서에서 만든 및 얼음에 저장 된) 10 mL를 사용 하 여 세척을 반복 합니다. 세척 후에 버퍼를 삭제 합니다.</li>
	<li>셀 스 트레이너를 prewarmed 상피 스트립 버퍼 (는 HBSS, 5 %CS, 1mm DTT; 5 mM EDTA, 15 mM HEPES [pH 7.2-7.5] 버퍼 하 단계 3.1.2에서 37 ° C 물 욕조에 저장)의 10 mL를 추가 하 여 상피 세포를 분리 하 고 800 rpm는 3에서 30 분 저 어 7 ° C 인큐베이터입니다. 보육의 끝에, 깨끗 한 15 mL 튜브에 상피 분수에서 풍성 하 게 하는 버퍼를 전송 합니다. 참고: 상피와 관련 된 셀 (장 상피 세포 및 장 상피 세포)는 발표는 버퍼에 그대로 lamina propria 에 셀11단계 동안 셀 스 트레이너에서 남아 있는 동안.<ol>
<li>실 온에서 5 분 동안 700 x g에서 농축된 장 상피 분수 (IELs) 원심 삭제는 상쾌한 고 FACS 버퍼의 1 mL에 셀 펠 릿 resuspend. 3.15 단계에서 사용 하기 위해 얼음에 그것을 저장 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>셀 스 트레이너 2 내 lamina propria 분수를 씻어 HBSS/CS와 x. 이렇게 하려면 셀 스 트레이너를 HBSS/CS 솔루션 (HBSS, 얼음에 저장 된 단계 3.1.1에서에서 만들어진 5 %CS 버퍼) 10 mL를 추가 하 고 37 ° C 배양 기에서 5 분 800 rpm에서 그것을 저 어. 각 세척 후 버퍼를 삭제.</li>
	<li>샘플 2 세척 세척 미디어에 x. 셀 스 트레이너를 세척 미디어 (HBSS; 1% CS 1 mM EDTA 버퍼를 단계 3.1.3에서 실내 온도에 저장) 10 mL를 추가 하 고 37 ° C 배양 기에서 15 분 800 rpm에서 그것을 저 어. 각 세척 후 버퍼를 삭제.<ol>
<li>사용 후 세척 미디어, 단계 3.14에서에서 사용에 대 한 얼음에 저장 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>샘플 2 세척 HBSS x/CS. 셀 스 트레이너를 HBSS/CS 버퍼 (HBSS; 5 %CS 버퍼 단계 3.1.1에서에서 만든 얼음에 저장 되어 있는)의 10 mL를 추가 하 고 37 ° C 배양 기에서 5 분 800 rpm에서 그것을 저 어. 각 세척 후 버퍼를 삭제.</li>
	<li>EDTA 무료 워시 버퍼에서 조직 품 어. 셀 스 트레이너를 EDTA 무료 워시 버퍼 (HBSS; 1% CS 15 mM HEPES 버퍼를 단계 3.1.4에서 실내 온도에 저장)의 10 mL를 추가 하 고 교 반 하지 않고 실 온에서 10 분 동안 접시를 품 어. 이 단계의 끝에 버퍼를 삭제 합니다.</li>
	<li>워시 샘플 2 x HBSS/CS 효소 솔루션을 준비 하 고. HBSS/cs (HBSS; 5 %CS 버퍼 단계 3.1.1 얼음에 저장 된에서) 10 mL를 추가할 셀 스 트레이너를 버퍼링 하 고 37 ° C 배양 기에서 10 분 800 rpm에서 그것을 저 어. 각 세척 후 버퍼를 삭제.<ol>
<li>효소 솔루션 준비 (씻고 EDTA 무료 버퍼; 0.1 mg/mL DNase 나; 167 mg/mL 콜라) 두 번째 세척 기간 동안: 9 밀리 그램을 추가 DNase의 나, EDTA 무료의 90 mL을 동결 건조 된 콜라의 15 mg 세척 버퍼. 실 온에서 솔루션을 저장 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>Lamina propria 분수 lamina propria 림프 톨 (LPLs)을 얻기 위해 셀 여과기에 포함 된 소화. 효소 솔루션의 10 mL를 추가 (EDTA 무료 워시 버퍼; 0.1 mg/mL DNase I; 167 mg/mL 콜라 버퍼 3.12.1 단계에서 만든 및 실내 온도에 저장) 셀 스 트레이너를 37 ° C 배양 기에서 45 분 800 rpm에서 그것을 저 어. 참고: LPLs 효소 소화 후 솔루션으로 해제 됩니다.<ol>
<li>셀을 포함 하는 효소 솔루션을 수집 하 고 50 mL 원뿔 관으로 새로운 셀 스 트레이너를 통해 필터링.</li>
	</ol></li>
	<li>효소 솔루션에서 콜라 활동을 차단 하는 필터링 된 셀에 차가운 세척 미디어 (는 HBSS; 1% CS 1 mM EDTA 버퍼링 단계 3.1.3에서에서 만들어지고 저장 단계 3.9.1에서에서 얼음에) 20 mL를 추가 합니다. 실 온에서 6 분 700 x g에서 튜브 원심 삭제는 상쾌한 고 resuspend FACS 버퍼의 1 mL에 LPLs를 포함 하는 펠 릿.</li>
	<li>(3.7.1 단계)에서 IEL과 (3.14 단계)에서 LPL 분수 결합 하 고 흐름 cytometric 분석에 대 한 형광 활용 된 항 체와 그들을 얼룩 (단계 5 참조). 참고: IEL와 LPL 분수 수 있습니다 얼룩이 질 별도로 구획 정보를 원하는 경우.</li>
</ol>4입니다. 비장에서 세포의 고립
<ol><li>Microcentrifuge 튜브에 FACS 버퍼의 500 µ L을 추가 하 여 컬렉션 튜브를 준비 합니다. 얼음에 그것을 저장 합니다.</li>
	<li>콜론 (3.4 단계)를 제거한 후 전체 비장을 수확 하 고 컬렉션 튜브에 배치 합니다. 얼음에 조직을 저장 합니다.</li>
	<li>실내 온도 상쾌한 떨어져 aspirate에서 5 분에 대 한 300 x g [마이크로 원심 분리기]에서 샘플 약 1 분 원심 분리기에 대 한 microcentrifuge 튜브에 비장 균질 전기 조직 균질 화기를 사용 하 여.</li>
	<li>삼투성 세포에 의해 세포 죽음을 시작 하려면 염화 염화 칼륨 (ACK) 세포의 용 해 버퍼의 500 µ L에서 샘플을 resuspending 하 여 적혈구 세포를 수행 합니다. 실 온에서 1-2 분을 품 어 다음 FACS 버퍼의 725 µ L에서 resuspend을 샘플을 수 있습니다.</li>
	<li>실내 온도 상쾌한 떨어져 aspirate에서 5 분에 대 한 300 x g [마이크로 원심 분리기]에서 샘플 원심 FACS 버퍼의 500 µ L에 펠 릿을 resuspend 하 고 새로운 microcentrifuge 튜브로 40 µ m 셀 스 트레이너를 통해 필터링. 새로운 microcentrifuge 튜브 전체 샘플 전송 및 흐름 cytometric 분석에 대 한 형광 활용 된 항 체와 얼룩 (단계 5 참조).</li>
</ol>5. Dendra-r+ 세포를 사용 하 여 흐름 Cytometry 식별
<ol><li>실내 온도 상쾌한 떨어져 aspirate에서 5 분에 대 한 300 x g [마이크로 원심 분리기]에서 IEL/LPL, 비장 샘플 원심</li>
	<li>믹스를 얼룩이 지는 항 체의 100 µ L에 산 탄을 resuspend. 샘플 당 FACS 버퍼의 100 µ L를 붙일 활용 된 안티 CD45 항 체의 1 µ L을 추가 하 여 혼합을 얼룩이 지는 항 체를 준비 합니다. 참고: 적정 항 체 사용 실험 전에 cytometry 최적 농도 결정 하기 위해 채도 바인딩 발생 합니다 중요 하다.</li>
	<li>(어두운 곳)에 얼음에 35 분 샘플을 품 어.</li>
	<li>FACS 버퍼의 300 µ L에서 샘플을 resuspend 하 고 실 온에서 5 분에 대 한 300 x g [마이크로 원심 분리기]에서 원심. 발음은 상쾌한 고 FACS 버퍼의 325 µ L에서 샘플을 resuspend. 교류 cytometer에 샘플을 분석 합니다.</li>
</ol>

<ol>
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저자는 공개 없다.

상호 작용 하 고 결 장에서 microbiota에 의해 영향을 하는 셀의 특성을 확인 하 고 중요 하 고 어떻게 막 microenvironment에서 정보는 시체의 나머지 부분에 릴레이의 이해를 촉진 한다. 창 자 관련 셀 마이그레이션 공부에 대 한 한 가지 방법은 그들의 조직을 추적 패턴12,13함수를 받는 쥐로 입양 전송 다음 창 자 관련 된 세포의 필요 합니다. 이 접근은 제한으로 전송 된 특정 셀 종류만을 추적할 수 있습니다. 또한, 조직 및 정화 과정에서 세포의 고립에서 발생 하는 아티팩트 vivo에서 철새 프로세스를 방해 수 있습니다. 더 많은 최근 내 시경 photoconversion 프로토콜 창 자 세포가 마우스를 사용 하 여 라벨을 보고14이었다. 이 연구는 성인 쥐에 백혈구는 소장에서의 광범위 한 매매 발견.
우리의 보고서 레이블 셀 신생아 쥐의 콜론에 메서드를 설명 하 고 비장 등 장 외 사이트에 그들의 이동 추적. 팜과excised 마우스 photoconvertible 그린 형광 Dendra2 단백질은 돌이킬 전환 정품 인증 시 빨간색 형광 UV 빛에 의해 표현 하는 편. 신생아 쥐의 콜론의 405 nm 빛에 노출 표시 모두 CD45+ 조 혈 및 CD45neg 비 조 혈 세포. CD45++ Dendra2-레드 셀 비장에 발견 된 photoconversion, 조 혈 모 세포의 여분 장 마이그레이션 나타내는 후 3 ~ 5 일.
이 분석 결과 대 한 속도 제한 단계는 저 승 지역 405 nm 빛에 노출 되는의 일부분 이다. 신생아 콜론의 취약성 및의 자의 존재 임에도 불구 하 고 최소한의이 이른 나이에 삽입할 수 있는 섬유 광섬유 정 맥의 길이 제한 합니다. 이전 실험에서 더 이상 정 수 없습니다 성공적으로 삽입 5 m m 이상.  윤활제는 레이저 광선의 변수 빛 굴절 될 위험이 피할 했다. 정 맥의 바깥쪽 움직임 모든 30의 레이저 빛에 노출 저 승 영역을 극대화 하는 데 도움이. 중요 한 것은, 큰 나 값으로 정 (NA = 0.5) 콜론에 빛의 넓은 콘을 생성 하는 데 사용 되었다.
이 프로토콜 신생아 (주 0-2)에 대 한 표준화는 팜과excised 새끼. 콘텐츠 및 쥐의 결 장의 길이에 변화를 주어, 기술 이전 새끼를 사용 하는 경우 그에 따라 최적화 되어야 할 것 이다. 주로, 섬유 광섬유 정 맥의 삽입 길이 photoconversion의 총 기간을 수정 해야 합니다.
결 장에서 세포의 철새 행동 이해에이 접근은 흐름 cytometric 분석에 의해 촉진 된다. 멀티 파라미터 cytometry를 더 사용할 수 있습니다 식별 하 고 형 이주 면역 세포는 CD45 내+ 세포 부분 집합. Dendra2-r+ 세포 유전자 식 프로 파일링 또는 proteomics 분석 같은 다운스트림 응용 프로그램에 대 한 FACS에 의해 정렬할 수 있습니다. 이 연구에서는 콜론 하위 집합 조 혈 세포의 이해로 이동 하는 동안 메서드는 두뇌와 피부를 포함 하 여 추가 조직 사이트에서 세포 이동 공부에 적응 수 있습니다.

포유류 위장 항만 호스트1과 공생 관계에 존재 하는 박테리아의 종의 수백. 면역 세포 로컬 환경에 이러한 미생물과 평화공존을 적용 하 고 병원 체 침입에 대 한 보호벽을 설치. 따라서, 면역 세포와는 microbiota 간의 양방향 상호 작용은 숙주 면역 체계를 교육 하 고 병원 체를 면역 반응에 대 한 임계값을 설정 하는 공생 공동체 확립을 중요 합니다. 미생물 또는 dysbiosis, 구성, 수에서 변경 면역 항상성 교란 및 면역 중재 질병 타입-1 당뇨병 및 IBD2,3 로 이어지는 장 염증을 억제 하는 규제 회로 교란 .
기간 출생은 장내 미생물 지역 사회 동시에 면역 체계를 구축 하기 시작 하는 독특한 발달 창 후에 즉시4성숙. 출생 후 microbiota 안정, 자연스럽 게 발생 하는 지역 사회 구성 및 자주5의 변화 되지 않습니다. 면역 세포는 microbiota와 상호 작용 하는 두 가지 해 부 위치 내장-에서 lamina propria 와6장 상피에서 상주 합니다. 수많은 종류의 면역 세포 (수지상 세포, monocytes, 대 식 세포 등) 골수성 세포 뿐만 아니라 림프 톨 (T 세포, B 세포, 타고 난 림프 세포 등)을 포함 한 소장에 있습니다. 이러한 세포, 조 혈 모 세포로 알려진 다양 한 장 벽을 유지 하 고 항상성 유지 기능을 수행 합니다.
그들의 규정 하는 기능 장의 사이트에서 뿐만 아니라 점 막의 면역 세포 조직의 면역7,,89규제 미생물 메시지 여분 장 사이트를 반입할 수 있습니다. 성장 연구 관심 분야 이며 그들의 기능을 조사 하기 위해 장 조직을 마이그레이션할 면역 세포를 식별 하는 방법에 대 한 필요성을 강조. 여기 보고 프로토콜 레이블 셀에 photoconvertible 형광 단백질은 악용 상용 마우스 모델을 이용 한다. 팜과excised 쥐 편은 레스터 전환 활성화 시 빨간색 형광 자외선 (UV) 빛10녹색 형광 Dendra2 단백질을 표현 한다. 섬유 광섬유 정을 사용 하 여 신생아 쥐의 콜론에 405 nm 빛을 제공 하는에서 유래 했거나 콜론 통해 통과할 photoconverted 조 혈 모 세포는 비장에서 찾을 수 있습니다 설명 합니다.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Laser&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Light Emitting Diode (LED)</td><td>THORLABS</td><td>M405FP1</td><td>CAUTION: this is a Class 3b laser. Safety goggles must be worn when using the laser. It emits a 405 nm wavelength with a current of 1400 mA. It is fiber-coupled. It accepts SMA connector. https://www.thorlabs.com/thorproduct.cfm?partnumber=M405FP1</td></tr><tr><td>LED driver</td><td>THORLABS</td><td>LEDD1B</td><td>Drives a constant current of 1200 mA through the laser. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=2616</td></tr><tr><td>Optogenetics patch cable</td><td>THORLABS</td><td>M87L01</td><td>1 m long cable with an SMA connector. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=11405&amp;amp;pn=M87L01#11454</td></tr><tr><td>Fiber optic cannula</td><td>Doric lenses&amp;nbsp;</td><td>MFC_480/500-0.5_5mm_ZF1.25_C45</td><td>5 mm long cannula with an outer diameter of 500 &amp;micro;m and an inner diameter of 480 &amp;micro;m. The NA value is 0.5. The ferrule is zirconia, 1.25 mm OD. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=6036</td></tr><tr><td>Power supply</td><td>THORLABS</td><td>KPS101</td><td>Supplies 15 V with a current of 2.4 A https://www.thorlabs.com/search/thorsearch.cfm?search=KPS101</td></tr><tr><td>LG3 laser safety goggles&amp;nbsp;</td><td>THORLABS</td><td>LG3</td><td>Orange lenses with 47% visible light transmission https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=762&amp;amp;pn=LG3#2523</td></tr><tr><td>Red light&amp;nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>74327-10</td><td>15 W lamp https://us.vwr.com/store/product/12360027/paterson-safelight-electron-microscopy-sciences</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Intestinal cell isolation&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-893-1389</td><td>CAUTION: inhalation of this anesthetic may cause dizziness, drowsiness, or even unconsciousness. This anesthetic should be used in a Class II hood.&amp;nbsp; https://www.pattersonvet.com/Supplies/ProductFamilyDetails/PIF_762328?carouselPageNumber=3</td></tr><tr><td>1X HBSS</td><td>Gibco</td><td>14025076</td><td>Ca/Mg free https://www.fishersci.com/shop/products/gibco-hbss-calcium-magnesium-no-phenol-red-4/14025076?searchHijack=true&amp;amp;searchTerm=14025076&amp;amp;searchType=RAPID&amp;amp;matchedCatNo=14025076</td></tr><tr><td>Calf Serum</td><td>Hyclone AZM</td><td>197696</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575020</td><td>0.5 M concentration https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15575020?SID=srch-srp-15575020</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>10197777001</td><td>CAUTION: harmful if swallowed and causes skin irritation. 1 M concentration https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/dttro?lang=en&amp;amp;region=US</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td>1 M concentration https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15630080?SID=srch-hj-15630080</td></tr><tr><td>Petri dish</td><td>Corning</td><td>353004</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-easy-grip-tissue-culture-dishes-2/08772f?searchHijack=true&amp;amp;searchTerm=08772F&amp;amp;searchType=RAPID&amp;amp;matchedCatNo=08772F</td></tr><tr><td>70 micron cell strainer</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087712</td></tr><tr><td>Micro magnetic stir bar</td><td>Fisherbrand</td><td>1451364</td><td>Rinse in 70% ethanol after each use. Rinse several times in distilled water prior to each use. The bar is 8 mm long with an octagonal shape. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-octagonal-magnetic-stir-bars-12/1451364#?keyword=1451364</td></tr><tr><td>Magnetic stir plate</td><td>Corning Laboratory Stirrers</td><td>440826</td><td>https://www.coleparmer.com/i/corning-440826-nine-position-stirrer-120-vac-60-hz/8430420?PubID=UX&amp;amp;persist=true&amp;amp;ip=no&amp;amp;gclid=CjwKCAiAqbvTBRAPEiwANEkyCLPLrWABXmOUI0QE53NLV0Owxlcs2V1K6rWbRPOwlcVVDq000FBiQxoCqQAQAvD_BwE</td></tr><tr><td>Collagenase</td><td>Roche</td><td>5401020001</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/05401020001?lang=en&amp;amp;region=US&amp;amp;gclid=CjwKCAiAjuPRBRBxEiwAeQ2QPhE44qlvxjmo1PYu3zCas3w-_d6P9gKjXW82-c1EOm6NjPHCc5WuixoC_0IQAvD_BwE</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma</td><td>10104159001</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/10104159001?lang=en&amp;amp;region=US</td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Gibco</td><td>20012-027</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/20012027?SID=srch-hj-20012-027</td></tr><tr><td>Pipet aid</td><td>Thermo Scientific</td><td>14387165</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/s1-pipette-fillers/14387165#?keyword=14387165</td></tr><tr><td>10 mL serological pipet</td><td>Falcon</td><td>357530</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659</td></tr><tr><td>25 mL serological pipet</td><td>Falcon</td><td>357515</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659</td></tr><tr><td>15 mL conical centrifuge tube</td><td>Thermo Scientific</td><td>339651</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650</td></tr><tr><td>50 mL conical centrifuge tube</td><td>Thermo Scientific</td><td>339653</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Single cell suspension&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf tubes</td><td>Seal-Rite</td><td>1615-5500</td><td>Holds 1.5 mL. https://www.usascientific.com/Seal-Rite-1.5-ml-tube.aspx</td></tr><tr><td>Tissue homogenizer&amp;nbsp;</td><td>Kimble</td><td>K7495400000</td><td>Requires 2 AA batteries. https://www.fishersci.com/shop/products/kontes-pellet-pestle-cordless-motor-cordless-motor/k7495400000</td></tr><tr><td>Homogenizer tips&amp;nbsp;</td><td>Kimble</td><td>7495210590</td><td>Plastic, 0.5 mL tips https://www.fishersci.com/shop/products/kimble-chase-kontes-pellet-pestle-14/k7495210590#?keyword=7495210590</td></tr><tr><td>ACK lysing buffer</td><td>Gibco</td><td>A10492-01</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1049201?SID=srch-hj-A10492-01</td></tr><tr><td>40 micron cell strainer</td><td>Falcon</td><td>08-771-1</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087711</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Antibodies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BV786 anti-mouse CD45&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>564225</td><td>Clone 3O-F11 https://www.bdbiosciences.com/us/reagents/research/antibodies-buffers/immunology-reagents/anti-mouse-antibodies/cell-surface-antigens/bv786-rat-anti-mouse-cd45-30-f11/p/564225</td></tr><tr><td>Live/Dead</td><td>Invitrogen</td><td>L34962</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/L34962</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Other&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Razor blades</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td>Use for decapitation. https://us.vwr.com/store/product/4548306/vwr-razor-blades</td></tr></tbody></table>

in vivo photolabeling of cells in the colon to assess migratory potential of hematopoietic cells in neonatal mice

장의 세균 지역 사회는 인생에서 일찍 고 면역 전지 개발 및 기능에 영향을 미칠. 신생아 microbiota 항생제 사용과 다이어트, 면역 및 염증 성 질병에 자화 율에 미치는 영향을 포함 하 여 수많은 외부 영향을 받기 쉽습니다. 장애 선 동적인 장 질병 (IBD) 등 내장에 면역 세포의 대규모 유입에 의해 특징. 그러나, 면역 세포는 microbiota에 의해 조절 또한 여분 장 사이트에 면역 반응에 영향을 창 자에서 이주 수 있습니다. 따라서, 식별 하 고 원심 사이트에 창 자에서 미생물 메시지를 전달 수 있습니다 셀을 특성화 하는 필요가 있다. 여기, 우리 신생아 쥐에 vivo에서 마이그레이션 후 장 외 사이트에 그들의 식별을 가능 하 게의 콜론에 레이블 셀 하는 방법을 설명 합니다.

광섬유 케이블은 2 일 오래 된 팜과excised 쥐의 콜론에 405 nm 빛을 전달 하기 위해 사용 되었다. 이전 실험에서 30 s 노출 최소 세포 (그림 1A) 독성 결 장 세포의 최대 photoconversion에 게 결정 했다. 따라서, 콜론의 다른 세그먼트의 순차 30 s 노출 프로토콜에 설명 된 대로 실시 했다. 레이저 노출에 따라 쥐 즉시 안락사 했다, 그리고 셀의 photoconversion 결정 했다. 총 결 장 조직의 단일 셀 준비 했다 형광 활용 된 안티 CD45 항 체로 얼룩진 고 흐름 cytometric 분석 photoconversion를 검출 하기 위하여 수행 되었다. 비전향 Dendra2-그린 (Dendra-g) 각각 490 553 nm에서 여기 및 방출 맥시 마는 단백질과 photoconverted Dendra2-레드 (Dendra-r) 단백질 507 573 nm에서 여기 및 방출 맥시 마는 반면 FITC 채널에서 검출 될 수 있다 각각의 교류 cytometer PE 채널에 검출 될 수 있습니다. 레스터 빨간 형태로 전환, 일단 Dendra2은 높은 photostable 및 장기 추적 응용 프로그램에 유용.
Dendra-r+ 셀 unlasered 마우스 (그림 1B 왼쪽)에서 발견 되었다. 그러나, 405 nm 빛 노출 귀착되 었 다 CD45neg CD45에 뚜렷한 Dendra-r+ 세포 인구+ 세포 구획 (그림 1B 오른쪽). 저 승 photoconversion 프로토콜 장 외 사이트에서 셀의 배경 라벨에 한 경우, 우리가 수확 spleens 새로 photoconverted 쥐에서 확인 하려면 (T = 0) cytometry에 의해 Dendra-r+ 세포에 대 한 분석 및. Dendra-r+ 셀 CD45neg 또는 CD45에서 발견 된+ 세포 구획그림 1(C), 내 저 승 레이저 빔 photolabel 셀 비장에 충분히 침투 하지 않았다 제안. 따라서, 비장에는 마이그레이션에 대 한 시간 후 감지 Dendra-r+ 셀 (T = 3d, 5d) 콜론에서 유래 한다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57929/57929fig1.jpg"> 그림 1 : Vivo에서 저 승 조직 photoconversion. 2 일 오래 된 팜과excised 새끼에서 콜론의 세포 30에 대 한 내 저 승 405 nm 빛에 드러낸 s 설명. photoconversion와 셀 라벨 절차 후 즉시 결정 되었다 (T = 0) 저 승 조직과 비장의 단일 셀 준비의 흐름 cytometric 분석에 의해. (A)이 대표적인 흐름 cytometric 점 줄거리의 CD45 식을 보여 줍니다 (x-축) 살고 죽은 염료의 얼룩이 지 고 (y-축) 제어와 레이저 마우스의 콜론에서 단일 셀 준비에. 패널 B 와 C 는 Dendra2-그린 단백질의 표현을 표시 하는 대표적인 흐름 cytometric 점 플롯 오버레이 (Dendra2-g, 수평 축)와 Dendra2-레드 단백질 (Dendra2-r, 수직 축) 제어 unexposed에 CD45 노출+ (조 혈) 및 CD45neg (조 혈 비) 셀 (B)에 결 장 및 (C)는 비장. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57929/57929fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
비장에 철새 셀을 식별 하는 전형적인 photoconversion 실험에서 데이터는 그림 2에 표시 됩니다. 2 일 오래 된 팜과excised 쥐의 콜론에 셀의 photoconversion는 그림 1과 같이 수행 되었다. 마우스는 노출 후 3 ~ 5 일 안락사 했다 고 비장에 Dendra-r+ 세포의 존재는 cytometry에 의해 결정 되었다. CD45neg 셀 하위 집합, CD45neg 셀은 주로 상피 보기과 일치에 Dendra-r+ 셀 및 내장의 다른 구조 세포가 있었습니다. 일부 CD45+ 조 혈 모 세포 표현 Dendra-r, 그들은 결에 photoconverted 되어 졌고 비장을 마이그레이션 제안.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57929/57929fig2.jpg"> 그림 2 : CD45+ 조 혈 모 세포는 비장에 결에서 마이그레이션할. 신생아 (주 0-2) 팜과excised 쥐 내 저 승 노출 photoconvert Dendra2 단백질에 405 nm 빛에 노출 되었다. 대표적인 교류 cytometry 플롯 표시 Dendra2-그린 단백질의 표현 (Dendra2-g, 수평 축)와 Dendra2-레드 단백질 (Dendra2-r, 수직 축) CD45neg 에 CD45+ unexposed 5 일 된 쥐의 비장 세포와 3 ~ 5 일에서 분석 하는 쥐를 노출 (T = 3d, 5d)는 photoconversion 후. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57929/57929fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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In Vivo Photolabeling of Cells in the Colon to Assess Migratory Potential of Hematopoietic Cells in Neonatal Mice

여기에 설명 된 프로토콜 여분 장 사이트에 결에서 이주 하는 면역 세포를 특별히 식별 하 신생아 쥐에 photolabeling 접근을 사용 합니다. 이 전략은 초기 생활에 호스트-미생물 상호작용 연구에 유용할 것 이다.

Vivo에서 Photolabeling 신생아 쥐에 있는 조 혈 모 세포의 이동성 잠재력을 평가 하는 콜론에 셀의

Enteric bacterial communities are established early in life and influence immune cell development and function. The neonatal microbiota is susceptible to ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Medicine

In Vivo Photolabeling of Cells in the Colon to Assess Migratory Potential of Hematopoietic Cells in Neonatal Mice

5.7K 조회수.  Massachusetts General Hospital. 여기에 설명 된 프로토콜 여분 장 사이트에 결에서 이주 하는 면역 세포를 특별히 식별 하 신생아 쥐에 photolabeling 접근을 사용 합니다. 이 전략은 초기 생활에 호스트-미생물 상호작용 연구에 유용할 것 이다.

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A Method for Lineage Tracing of Corneal Cells Using Multi-color Fluorescent Reporter Mice

Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied for many decades, revealing seminal findings in developmental biology. More recently, it was adopted by stem cell biologists to identify and track different stem cell populations with minimal experimental intervention. The recent developments in mouse genetics, the availability of a large number of mouse strains, and the advancements in fluorescent microscopy allow the straightforward design of powerful lineage tracing systems for various tissues with basic expertise, using commercially available tools. We have recently taken advantage of this powerful methodology to explore the origin and fate of stem cells at the ocular surface using R26R-Confetti mouse. This model offers a multi-color genetic system, for the expression of 4 fluorescent genes in a random manner. Here we describe the principles of this methodology and provide an adaptable protocol for designing lineage tracing experiments; specifically for the corneal epithelium as well as for other tissues.

In this article we describe the principles for designing and performing a multi-color lineage tracing experiment using R26R-Confetti mice. We provide a specific protocol for tracking corneal epithelial cells which can be modified for other tissues of interest.

멀티 컬러 형광 기자 마우스를 사용하여 각막 세포의 리니지 추적하는 방법

Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied ...

연구

발생학

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.

분석<em&gt; 생체</em&gt; 셀 마이그레이션 Zebrafish의 배아에서 세포 이식 및 시간 경과 이미징을 사용하여

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo labeling of stem cells with a fluorescent dye, subsequent intravenous injection of the labeled cells and visualization of their accumulation in specific target organs or pathologies. The presented technique demonstrates how we label human mesenchymal stem cells (hMSC) by simple incubation with the lipophilic fluorescent dye DiD (C67H103CIN2O3S) and how we label human embryonic stem cells (hESC) with the FDA approved fluorescent dye Indocyanine Green (ICG). The uptake mechanism is via adherence and diffusion of the lypophilic dye across the phospholipid cell membrane bilayer. The labeling efficiency is usually improved if the cells are incubated with the dye in serum-free media as opposed to incubation in serum-containing media. Furthermore, the addition of the transfection agent Protamine Sulfate significantly improves contrast agent uptake.

This video shows techniques for labeling of human embryonic stem cells and mesenchymal stem cells with fluorescent dyes. This technique can be used for an in vivo tracking of transplanted stem cells with optical imaging and for histopathological correlations with fluorescence microscopy.

광학 이미징과 비침습 감지를위한 형광 염료와 함께 줄기 세포를 라벨링

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

생물학

Use of In vivo Imaging to Monitor the Progression of Experimental Mouse Cytomegalovirus Infection in Neonates

Human Cytomegalovirus (HCMV or HHV-5) is a life-threatening pathogen in immune-compromised individuals. Upon congenital or neonatal infection, the virus can infect and replicate in the developing brain, which may induce severe neurological damage, including deafness and mental retardation. Despite the potential severity of the symptoms, the therapeutic options are limited by the unavailability of a vaccine and the absence of a specific antiviral therapy. Furthermore, a precise description of the molecular events occurring during infection of the central nervous system (CNS) is still lacking since observations mostly derive from the autopsy of infected children. Several animal models, such as rhesus macaque CMV, have been developed and provided important insights into CMV pathogenesis in the CNS. However, despite its evolutionary proximity with humans, this model was limited by the intracranial inoculation procedure used to infect the animals and consistently induce CNS infection. Furthermore, ethical considerations have promoted the development of alternative models, among which neonatal infection of newborn mice with mouse cytomegalovirus (MCMV) has recently led to significant advances. For instance, it was reported that intraperitoneal injection of MCMV to Balb/c neonates leads to infection of neurons and glial cells in specific areas of the brain. These findings suggested that experimental inoculation of mice might recapitulate the deficits induced by HCMV infection in children. Nevertheless, a dynamic analysis of MCMV infection of neonates is difficult to perform because classical methodology requires the sacrifice of a significant number of animals at different time points to analyze the viral burden and/or immune-related parameters. To circumvent this bottleneck and to enable future investigations of rare mutant animals, we applied in vivo imaging technology to perform a time-course analysis of the viral dissemination in the brain upon peripheral injection of a recombinant MCMV expressing luciferase to C57Bl/6 neonates.

Use of In vivo Imaging to Monitor the Progression of Experimental Mouse Cytomegalovirus Infection in Neonates

Human Cytomegalovirus (HCMV) infection of neonates represents an important cause of mental retardation, yet the molecular events leading to virus-induced pathogenesis are still poorly understood. To investigate the dynamics of brain infection, we adapted whole-animal in vivo imaging to perform time-course analysis of neonates infected with a luciferase-recombinant virus.

사용<em&gt; 생체 내</em&gt; 이미징 신생아의 실험 쥐 거대 세포 바이러스 감염의 진행 상황을 모니터링 할 수

Human Cytomegalovirus (HCMV or HHV-5) is a life-threatening  pathogen in immune-compromised individuals. Upon congenital or neonatal  infection, the virus ...

면역학 및 감염병학

Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or pathogenic effects depending on the inflammatory milieu. Nonetheless, despite the indispensable role of neutrophils in immunity, detailed understanding of the molecular factors that mediate neutrophils' effector and immunopathogenic effects in different infectious diseases and inflammatory conditions is still lacking, partly because of their short half life, the difficulties with handling of these cells and the lack of reliable experimental protocols for obtaining sufficient numbers of neutrophils for downstream functional studies and adoptive transfer experiments. Therefore, simple, fast, economical and reliable methods are highly desirable for harvesting sufficient numbers of mouse neutrophils for assessing functions such as phagocytosis, killing, cytokine production, degranulation and trafficking. To that end, we present a reproducible density gradient centrifugation-based protocol, which can be adapted in any laboratory to isolate large numbers of neutrophils from the bone marrow of mice with high purity and viability. Moreover, we present a simple protocol that uses CellTracker dyes to label the isolated neutrophils, which can then be adoptively transferred into recipient mice and tracked in several tissues for at least 4 hr post-transfer using flow cytometry. Using this approach, differential labeling of neutrophils from wild-type and gene-deficient mice with different CellTracker dyes can be successfully employed to perform competitive repopulation studies for evaluating the direct role of specific genes in trafficking of neutrophils from the blood into target tissues in vivo.

We describe a protocol for isolation and purification of neutrophils from mouse bone marrow by density gradient centrifugation and for neutrophil labeling using CellTracker dyes. This represents a simple, fast, reproducible and economical method for obtaining large numbers of neutrophils for downstream functional studies or adoptive transfer and tracking experiments.

분리, 정제 및 기능 연구 및 입양 전송 실험 쥐의 골수 호중구의 라벨링

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or ...

A Label-Free Segmentation Approach for Intravital Imaging of Mammary Tumor Microenvironment

The ability to visualize complex and dynamic physiological interactions between numerous cell types and the extracellular matrix (ECM) within a live tumor microenvironment is an important step toward understanding mechanisms that regulate tumor progression. While this can be accomplished through current intravital imaging techniques, it remains challenging due to the heterogeneous nature of tissues and the need for spatial context within the experimental observation. To this end, we have developed an intravital imaging workflow that pairs collagen second harmonic generation imaging, endogenous fluorescence from the metabolic co-factor NAD(P)H, and fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) as a means to non-invasively compartmentalize the tumor microenvironment into basic domains of the tumor nest, the surrounding stroma or ECM, and the vasculature. This non-invasive protocol details the step-by-step process ranging from the acquisition of time-lapse images of mammary tumor models to post-processing analysis and image segmentation. The primary advantage of this workflow is that it exploits metabolic signatures to contextualize the dynamically changing live tumor microenvironment without the use of exogenous fluorescent labels, making it advantageous for human patient-derived xenograft (PDX) models and future clinical use where extrinsic fluorophores are not readily applicable.

The intravital imaging method described here utilizes collagen second harmonic generation and endogenous fluorescence from the metabolic co-factor NAD(P)H to non-invasively segment an unlabeled tumor microenvironment into tumor, stromal, and vascular compartments for in-depth analysis of 4D intravital images.

유방 종양 미세환경의 생체 내 이미징을 위한 라벨 없는 세분화 접근법

The ability to visualize complex and dynamic physiological interactions between numerous cell types and the extracellular matrix (ECM) within a live tumor ...

암 연구학

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal environment. Biological activities of immune cells mainly rely on their motility capacities. Blood monocytes have short half-life in the bloodstream; they originate in the bone marrow and are constitutively released from it. In inflammatory condition, this process is enhanced, leading to blood monocytosis and subsequent infiltration of the peripheral inflammatory tissues. Identifying the biomechanical events controlling monocyte trafficking from the bone marrow towards the vascular network is an important step to understand monocyte physiopathological relevance. We performed in vivo time-lapse imaging by two-photon microscopy of the skull bone marrow of the Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP (MacBlue) mouse. The MacBlue mouse expresses the fluorescent reporters enhanced cyan fluorescent protein (ECFP) under the control of a myeloid specific promoter 1, in combination with vascular network labelling. We describe how this approach enables the tracking of individual medullar monocytes in real time to further quantify the migratory behaviour within the bone marrow parenchyma and the vasculature, as well as cell-to-cell interactions. This approach provides novel insights into the biology of the bone marrow monocyte subsets and allows to further address how these cells can be influenced in specific pathological conditions.

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Monocytes are key regulators of innate immunity and play a critical role in the renewal of the peripheral mononuclear phagocytic system and in case of inflammation. This manuscript describes the procedure of real time imaging of the mouse calvaria bone marrow to study the monocyte mobilisation mechanism.

마우스 골수 단핵구를 추적<em&gt; 생체</em

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal ...

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and temporal specificity2. Chemotaxis is a critical function of lymphocytes and other immune cells that can be quantitatively assessed in vitro. This manuscript describes methods that permit the evaluation of chemotaxis, both in vitro and in vivo, for diverse cell types including cell lines and native cells. The in vitro, plate-based format permits the comparison of several conditions simultaneously in real-time, and can be completed within 1-4 h. In vitro assay conditions can be manipulated to introduce agonists and antagonists, as well as differentiate chemotaxis from chemokinesis, which is random movement. For in vivo trafficking assessments, immune cells can be labeled with multiple fluorescent dyes and used for adoptive transfer. The differential labeling of cells allows for mixed cell populations to be introduced into the same animal, thereby decreasing variance and reducing the number of animals required for an adequately powered experiment. Migration into lymphoid tissue occurs in as little as 1 h, and multiple tissue compartments can be sampled. Flow cytometry following tissue harvest allows for a rapid and quantitative analysis of the migratory patterns of multiple cell types.

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Protocols for quantitative assessment of lymphocyte chemotaxis and migration are important tools for immunology research. Here, an in vitro protocol is described that permits real-time, multiplexed evaluation of cell migration, as well as a complementary in vivo technique enabling tracking of native cells to spleen.

인간 Monocyte Chemotaxis에서 생체 외에서 그리고 Vivo에서 인신 매매 Murine 림프 구 측정

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and ...

Fluorescent Dye Labeling of Erythrocytes and Leukocytes for Studying the Flow Dynamics in Mouse Retinal Circulation

The retinal and choroidal blood flow dynamics may provide insight into the pathophysiology and sequelae of various ocular diseases, such as glaucoma, diabetic retinopathy, age-related macular degeneration (AMD) and other ocular inflammatory conditions. It may also help to monitor the therapeutic responses in the eye. The proper labeling of the blood cells, coupled with live-cell imaging of the labeled cells, allows for the investigation of the flow dynamics in the retinal and choroidal circulation. Here, we describe the standardized protocols of 1.5% indocyanine green (ICG) and 1% sodium fluorescein labeling of mice erythrocytes and leukocytes, respectively. Scanning laser ophthalmoscopy (SLO) was applied to visualize the labeled cells in the retinal circulation of C57BL/6J mice (wild type). Both methods demonstrated distinct fluorescently labeled cells in the mouse retinal circulation. These labeling methods can have wider applications in various ocular disease models.

Live-cell imaging of the labeled blood cells in ocular circulation can provide information about inflammation and ischemia in diabetic retinopathy and age-related macular degeneration. A protocol to label blood cells and image the labeled cells in the retinal circulation is described.

마우스 망막 순환에서 유동 역학을 연구하기위한 적혈구 및 백혈구의 형광 염료 표지

The retinal and choroidal blood flow dynamics may provide insight into the pathophysiology and sequelae of various ocular diseases, such as glaucoma, ...

의학

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and temporal resolution to study in vivo hematopoiesis using the murine bone marrow transplant experimental model. Genetic combinatorial marking using lentiviral vectors encoding fluorescent proteins (FPs) enabled cell fate mapping through advanced microscopy imaging. Vectors encoding five different FPs: Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato, and mCherry were used to concurrently transduce HSPCs, creating a diverse palette of color marked cells. Imaging using confocal/two-photon hybrid microscopy enables simultaneous high resolution assessment of uniquely marked cells and their progeny in conjunction with structural components of the tissues. Volumetric analyses over large areas reveal that spectrally coded HSPC-derived cells can be detected non-invasively in various intact tissues, including the bone marrow (BM), for extensive periods of time following transplantation. Live studies combining video-rate multiphoton and confocal time-lapse imaging in 4D demonstrate the possibility of dynamic cellular and clonal tracking in a quantitative manner.

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Combinatorial 5 fluorescent proteins marking of hematopoietic stem and progenitor cells allows in vivo clonal tracking via confocal and two-photon microscopy, providing insights into bone marrow hematopoietic architecture during regeneration. This method allows non-invasive fate mapping of spectrally-coded HSPCs-derived cells in intact tissues for extensive periods of time following transplantation.

공 초점 및 다중 광자 현미경을 사용하여 다섯 형광 단백질에 의해 표시됨 조혈 줄기 및 전구 세포의 생체 내 클론 추적에서

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...