Name: defining hsp33's redox-regulated chaperone activity and mapping conformational changes on hsp33 using hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry
Uploaded: 2018-06-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
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저자는 그녀의 도움이 토론에 대 한 Meytal Radzinski에 게 감사 하 고 HDX 분석 플랫폼을 설정 하는 동안 그들의 무제한 지원에 대 한 문서, 그리고 패트릭 그리핀와 그의 실험실 멤버를 읽고 중요 한 있습니다. 저자는 독일-이스라엘 재단 (나-2332-1149.9/2012), Binational 과학 재단 (2015056), 마리 퀴리 통합 그랜트 (618806), 이스라엘 과학 재단 감사 (1765/13 고 2629/16), 그리고 인간 프론티어 과학 그들의 재정 지원 프로그램 (CDA00064/2014).

1. 완벽 하 게 감소 하 고 완벽 하 게 산화 단백질의 준비
<ol><li>
완벽 하 게 감소 된 단백질의 준비 참고: 여기, 우리가 설명 아연 포함 된 단백질 및 단백질 Zn 통합, 감소 된 상태를 복원할 ZnCl2 를 사용 하 여 솔루션의 감소. ZnCl2 솔루션 대체 하거나 삭제 될 수 있습니다. Note 시간과 온도 감소 과정의 단백질 안정성과 기능에 따라 달라 집니다 및 특정 단백질 당 이렇게 이다.<ol>
<li>얼음에 단백질 견본을 해 동 하 고 제거 집계 아래로 회전. 5mm DTT와 37 ° C와 20 µ M ZnCl2 에서 적어도 1.5 h에 대 한 샘플을 품 어 (단백질 농도의 최대 70%). 참고:이 단계에서 온도 단백질 및 단백질 안정성에 조정 되어야 한다.</li>
		<li>DTT 염 열을 사용 하 여 제거 합니다. 참고: 다른 담 열을 사용할 수 있습니다. 프로토콜 아래 특정 염 열 ( 재료의 표참조)를 사용 하 여 프로시저를 설명 합니다. 다른 염 열을 사용 하기 전에 일부 염 열 부분적으로 관심사의 단백질을 흡수 수 있습니다 이후 DTT 제거 및 단백질 복구의 그들의 효율성을 검토 하는 것이 좋습니다.<ol>
<li>해당 버퍼와 함께 열을 완전히 채워 고 개 드립 하는 버퍼에 의해 칼륨 인산 (KPi) 버퍼 (40 m m, pH 7.5)로 열을 equilibrate. 2이이 과정을 반복 하 여 x.</li>
			<li>부드럽게 족집게로 그것을 아래로 밀어 하;을 제거 하 여 열에 백색 디스크 필터 제거 동안 열에 채워집니다 KPi 버퍼를 제거 하는 것이 쉽습니다. KPi 버퍼 열을 리필 하 고 3 분 1000 x g에서 원심.</li>
			<li>깨끗 한 튜브로 열 전송 열의 중간에 천천히 단백질 샘플을 추가 하 고 2 분 1000 x g에서 원심. DTT 무료 단백질 통해 흐름에 지금 있다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>그것의 농도 확인 (예를 들어, UV/Vis 분 광 계를 사용 하 여) 280에서의 흡 광도 측정 하 고 nm. 맥주의 법률을 사용 하 여 단백질 농도 계산 합니다.</li>
		<li>Aliquots에는 단백질의 절반을 배포 합니다. 20 분 산소의 완전 한 제거를 위한 혐 기성 조건 (예를 들어, 혐 기성 챔버를 사용 하 여)에서 aliquots를 품 어. 플라스틱 필름으로 튜브를 봉인 하 고-20 ° C 또는-80 ° C, 단백질에 따라 샘플을 저장 합니다. 참고: 혐 기성 챔버를 사용 하 여 대신 튜브 수 또한 될 번쩍이 아르곤 가스를 산소를 제거.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
완벽 하 게 산화 단백질의 준비 참고:이 좋습니다 완벽 하 게 감소 된 단백질 (앞서 설명한)에서 산화 단백질 샘플 준비 하. 이 시스테인의 산화 상태에서이 질을 줄일 것입니다. 그것은 다른 산화 시 약;를 사용 하 여 여기, 우리는 과산화 수소 (H2O2)에 집중 하 고 있다. 주의: 이상의 산화를 바람직하지 않는 intramolecular 이황화 채권과 시스테인, 메티오닌, 티로신, 등을 포함 한 다른 아미노산의 돌이킬 수 없는 산화를 피하십시오.<ol>
<li>나머지 단백질 샘플 5 m m H2O2 (갓 희석)를 추가 하 고 동요 하는 동안 40 ° C에서 3 시간 그것을 품 어. 참고:이 단계에서 온도 단백질 및 단백질 안정성에 조정 되어야 한다.</li>
		<li>해당 버퍼와 함께 열을 완전히 채워 고 개 드립 하는 버퍼에 의해 KPi 버퍼 (40 m m, pH 7.5)로 열을 equilibrate. 2이이 과정을 반복 하 여 x.</li>
		<li>부드럽게 족집게로 그것을 아래로 밀어 하;을 제거 하 여 열에 백색 디스크 필터 제거 동안 열에 채워집니다 KPi 버퍼를 제거 하는 것이 쉽습니다.</li>
		<li>KPi 버퍼 열을 리필 하 고 3 분 1000 x g에서 원심.</li>
		<li>깨끗 한 튜브로 열을 전송 열의 중간에 천천히 산화 단백질 견본을 추가 하 고 2 분;에 대 한 1000 x g에서 원심 산화 단백질 통해 흐름에 지금 있다.</li>
		<li>1.2.5, 단계에서 단백질 농도 산화 단백질으로 aliquots, 분열과-20 ° C 또는-80 ° C, 단백질-의존에서 그들을 저장 확인 하십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2입니다. 빛 집계 분석 결과 비 산
참고:이 분석 결과에 모든 농도 보호자 및 기판 관련, 고 보정 해야 합니다. 모든 버퍼 버퍼는 어떤 입자의 무료 또는 기포와 큐 벳은 깨끗 하 고 먼지가 매우 중요 0.22 μ m 필터링 되어야 합니다. 석 영 cuvette에 교 반기를 사용 하 여 매우 중요 하다. 다른 활동가 크기와 모양이 바람직하지 않은 기포를 생성 하지 않고 전체 솔루션의 한 효율적인 혼합 수 있도록 확인 하십시오. 또한, 있다 다른 flouorospectrometers 사용할 수 있는 실험실과 시설에서. 여기, 특정 fluorospectrometer는 사용 되었다 ( 재료의 표참조). 다른 악기는 다양 한 감도, 측정 속도, 및 샘플러 매개 변수가 있습니다. 따라서, 정확한 측정 매개 변수 (예를 들어, 방출 및 여기 대역폭, 감도, 및 다른 사람) 알려진된 집계 하기 쉬운 단백질 및 그 해당 조건 사용 하 여 최적화 되어야 합니다. 구 연산 염 synthase (CS) luciferase nanomolar 농도에서 초기 기판으로 이용 하는 것이 좋습니다.
<ol><li>
화학 집계 분석 결과
	<ol>
<li>잠복기 12 µ M CS 하룻밤에 40 mM HEPES (pH 7.5)으로 변성된 기판 준비 및 4.5 M GdnCl. PH를 유지 하기 위해 GdnCl 40 mM HEPES (pH 7.5)에서 해산.</li>
		<li>Fluorospectrometer 소프트웨어를 열고 시간 과정 측정로 이동 합니다. 매개 변수 설정: 온도: 25 ° C; Λem: 360; Em 대역폭: 5 nm; Λ예: 360; 대역폭 ex: 2.5 nm; 데이터 간격: 0.5 s.</li>
		<li>석 영 cuvette에 40 mm HEPES 1600 µ L을 추가 하 여 샘플을 준비 합니다. 샘플 홀더에는 베트를 삽입 하 고 원하는 온도 도달 하는 샘플을 보자.</li>
		<li>감동 600 rpm을 설정 하 고 초기 계획 설정 될 때까지 측정을 시작. 전체 측정는 교 반 계속.</li>
		<li>120에서 보호자의 부재에서 CS 집계를 측정 하기 위해 측정에 s 추가 (부드럽게, 그러나 신속 하 게) 변성된 CS의 10 µ L (75의 최종 농도 nM). 1200에 대 한 측정을 계속 s.</li>
		<li>60 Hsp33, 존재 CS 집계를 측정 하는 측정으로 s Hsp33 추가 (300의 최종 농도 nM). 후 추가 60 s, 변성된 CS의 10 µ L 추가 (75의 최종 농도 nM). 1200에 대 한 측정을 계속 s. 참고: 추가할 때 기판 또는 보호자, 거품의 삽입을 방지 하기 위해, 10 µ L 피 펫을 사용 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
열 집계 분석 결과 참고: 열 집계 분석 결과 대 한 온도 그리고 단백질 안정성에 따라 조정 되어야 한다 하지 각 단백질에 독립적으로.<ol>
<li>Fluorospectrometer 소프트웨어를 열고 시간 과정 측정로 이동 합니다. 매개 변수를 다음과 같이 설정: 온도: 43 ° C; Λem: 360; 방출 대역폭: 5 nm; Λ예: 360; 여기 대역폭: 2.5 nm; 데이터 간격: 0.5 s.</li>
		<li>석 영 cuvette에 미리 따뜻하게 40 mm HEPES 1600 µ L을 추가 하 여 샘플을 준비 합니다. 샘플 홀더는 베트를 삽입 하 고 샘플 43 ° c.에 도달 하 게</li>
		<li>감동 600 rpm을 설정 하 고 초기 계획 설정 될 때까지 측정을 시작. 전체 측정는 교 반 계속.</li>
		<li>120에서 보호자의 부재에서 CS 집계를 측정 하는 측정으로 s는 부드럽게 CS 추가 (125의 최종 농도 nM) 1200에 대 한 측정을 계속 하 고 s.</li>
		<li>60 Hsp33, 존재 CS 집계를 측정 하는 측정으로 s Hsp33 추가 (600의 최종 농도 nM). 후 추가 60 s, CS 추가 (125의 최종 농도 nM). 1200에 대 한 측정을 계속 s. 참고: 추가할 때 기판 또는 보호자, 거품 삽입을 하지 마십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Kfits 데이터 분석 및 잡음 제거 참고: Kfits 에서 사용할 수 를 사용 하 여 Kfits 의 이전에서 설명 하고있다 Rimon 외. 45<ol>
<li>데이터 파일을 업로드. 참고: 입력 텍스트 쉼표 구분 또는 탭 구분 형식으로 산란 측정에서 원시 결과 이다.</li>
		<li>모든 소음을 제거 하려면 분석 매개 변수를 선택 합니다. 자동 최고의 모델 을 사용 (권장), 잡음은 항상 신호 플래그를 표시 합니다.</li>
		<li>명백한 outliers 녹색과 빨간색 조절 라인;를 사용 하 여 수동으로 제거 이 단계는 녹색 선 위와 아래 빨간색 선 잡음을 필터링 합니다.</li>
		<li>기준선과 맞는 곡선을 설정 합니다. 노이즈 임계값을 적용 한 후 처리 된 데이터를 다운로드 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 수소 중수소 교환 질량 분석
<ol><li>버퍼 및 단백질 샘플 (Hsp33 및 Hsp33 CS 복잡 한)의 준비
	<ol>
<li>25mm Tris HCl 버퍼 pH 7.5에에서 1 mg/mL의 최종 농도에 단백질 샘플을 희석 하 고 1.5 mL 튜브에 그들을 전송.</li>
		<li>43 ° c.에 1:1.5의 비율로 CS와 Hsp33를 배양 하 여 단백질 기질 복잡 한 샘플을 준비<ol>
<li>어떤 빠른 집계를 피하기 위해 하는 Hsp33와 열 펼친된 CS 간의 유익한 바인딩을 단계별 방식에서 CS를 추가 합니다.</li>
			<li>적어도 4 개의 단계를 사용 하 여 (즉, 최종 볼륨의 4 분의 1을 추가 하는 각 시간) 및 Hsp33에 의해 CS 보호 수 있도록 모든 추가 후 15 분에 대 한 샘플을 품 어.</li>
		</ol>
</li>
		<li>모든 집계에서 4 ° c.에서 16000 x g 30 분 원심 분리를 사용 하 여 제거 참고: 새로운 단백질 기질 단지 준비 되어야 한다 신선한. 기판 또한 점차; 여야 한다 그렇지 않으면, 집계 발생 합니다. 온도, 기판, 및 기질 농도 단백질 다릅니다.</li>
		<li>H (25mm Tris HCl, pH 7.5), deuteration 제어 역할, 버퍼와 버퍼 D (25mm Tris DCl, pH 7.09)는 deuteration 버퍼를 준비 합니다. 또한 신선한 냉각 버퍼 (150 m m 3 M GdnCl, TCEP 0.1% 포 름 산)을 준비 합니다. 참고: 냉각 버퍼 최적화 되어야 합니다 관심사의 단백질을 위해 펩 신 소화 후 최대한 시퀀스 범위를 얻기 위하여.</li>
		<li>튜브로 모든 버퍼 및 샘플을 전송 및 적절 한 쟁반에 넣어. 저장할 버퍼 H와 D 25 ° c (트레이 25 ° C); 다른 한편으로, 0-2 ° C (0 ° C 트레이)에서 샘플 및 냉각 버퍼를 개최. 150 µ L 유리 삽입에 샘플을 배치 ( 재료의 표참조) 먼저, 다음 튜브에 그들을 전송.</li>
	</ol></li>
	<li>악기의 준비 참고: 질량 분석기 소프트웨어 프로그램을 동반 2와 함께 제공: 하나 펌프, 제어와 다른 제어 질량 분석기 ( 테이블의 자료를 참조). 이 두 소프트웨어 프로그램을 사용 하 여 다음 단계를 설명 합니다.<ol>
<li>수동으로 모든 냉각 장치를 켭니다. 모든 냉각 시스템의 목표 온도 도달, 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 로드 펌프에 수동으로 전환 합니다. 참고: 우리의 경우,이 2 개의 냉각 목욕 및 냉각 상자 (이 트랩 및 분석 열 포함)의 구성 됩니다. 한 냉각 장치 냉각 0 ° C에서 트레이 다른 25 ° C에서 트레이 유지 하면서 냉각 상자의 온도 1-2 ° C 이다.</li>
		<li>오픈 모두 펌프를 제어 하는 소프트웨어 뿐만 아니라 소프트웨어를 제어 하는 질량 분석기; MS는 대기에 다는 것을 확인 하십시오.</li>
		<li>MS 소스에서 HPLC 출구 밸브를 분리 및 세척 시스템 (1% 포 름 산, 33% 이기, 소 프로 파 놀 33%, 33% 메탄올), "트리플 청소기" 솔루션으로 먼저 다음 버퍼 B (80% 이기, 0.1% 개미 산 성), 그리고 마지막으로와 버퍼 (0.1% 개미의 산 성, pH 2 월 25 일), 펩 신 열 시스템에 삽입. 버퍼를 변경 하는 경우 계속 하기 전에 두 펌프를 제거 해야 합니다.</li>
		<li>두 펌프의 유량 0.1 mL/min 이며 압력은 안정 되어 있는 확인 하십시오.</li>
		<li>씻은 후 꾸준한 흐름 및 꾸준한 압력 시스템, MS 소스에 HPLC 콘센트를 삽입 하 고 MS를 켭니다.</li>
	</ol></li>
	<li>질량 분석기 매개 변수
	<ol>
<li>175 ° C, 17, 2, 보조 가스 발광 및 4.5에서 스프레이 전압 칼 집 가스 흐름에서 분무 이온화 (ESI)에 펩 티 드 이온화 설정 kV (보충 그림 1).</li>
		<li>다음과 같이 비 deuterated 샘플에 대 한 매개 변수를 설정 합니다.<ol>
<li>매개 변수 설정: 스캔 범위 m/z 300-1500; 해상도를 70000; 자동 이득 제어 대상 (AGC) 106; 그리고 100 ms에 (그것은) 최대 주입 시간. 참고: + 2와 + 6 사이 충전 상태와 5 가장 강렬한 이온 (1.3 x 10 보다 더 높은 그들의 강도4)에 30의 동적 창 격리 됩니다.</li>
			<li>높은 에너지 collisional 분리 (HCD) 정규화 된 충돌 에너지 (후부 터) 28 크거나 여러 충돌 셀에 의해 이온 조각화를 수행 합니다. 탠덤 MS 10의 35000, AGC 대상의 해상도에 의해 조각 이온을 검출5, 최대 60 ms, 그리고 2.0 m/z의 격리 창에서.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Deuterated 샘플에 대 한 MS1 만 140, 000의 높은 해상도 그렇지 않으면 유사한 매개 변수를 사용 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>실험을 실행
	<ol>
<li>다음과 같은 방식으로 트레이 설정 합니다.<ol>
<li>트레이 25 ° C, H와 D 버퍼 장소 다음 샘플 및 냉각 버퍼 0 ° C 트레이에 놓습니다.</li>
			<li>장소 X 빈 튜브, 두 용지함에 정렬, 어디 X = x 시간 포인트 수 샘플 수. 참고: 25 ° C 트레이에 빈 튜브 역할 반응 튜브, 그리고 그들은 튜브를 냉각 될 트레이 0 ° C에서.</li>
			<li>빈 병의 각 포함 빈 유리 삽입; 삭제 및 바꾸기 말했다 실험 사이 삽입 합니다. 참고: 가장 효율적이 고 최소 시간이 걸리는 방법, 샘플을 동시에 실행할 수 있는 소프트웨어에서에서 HDX 실험을 실행 하려면 (보충 그림 2) 사용 되었다. 이 소프트웨어를 사용 하 여 다음 단계를 설명 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>소프트웨어를 엽니다. 다음을 수행 하는 프로그램 매개 변수를 설정 합니다.<ol>
<li>선택 하는 시간 포인트에 따라 몇 분 동안 버퍼 D의 45 µ L를 각 샘플 (5 µ L)를 품 어 (예, 1, 3, 18, 40, 및 100 분) 25 ° c.에 대신 버퍼 H의 45 µ L와 비 deuterated 샘플을 품 어.</li>
			<li>부 화 후 즉시 차가운 냉각 버퍼의 50 µ L에 deuterated 단백질의 50 µ L를 혼합 하 고 고정된 펩 신 열 (직경에서 2.0 m m, 길이 20 m m)에 그들을 투입 합니다.</li>
			<li>50의 속도로 6 분에 대 한 버퍼 A와 그것을 세척 하 여 펩 신 열에서 모든 펩 티 드를 전 열에 elute µ L/분 계속 버퍼 A에 0 ° c.에 냉각 상자</li>
			<li>C18 분석 열으로 전 열에서 펩 티 드 elute (C18 열, 130 Å, 1.7 µ m, 2.1 m m x 50 m m, 0 ° C에서 보관) 이기 그라데이션 버퍼 B 100% 이기를 사용 하 여 100 µ L/분 실행에 이기의 선형 그라디언트를 적용 하 여 그들을 분리 하 고 : 2%, 10-30%, 30-90%, 90%, 90-8%, 1 분 동안 빠른 그라데이션에 1.5 분에서 2.5 분에서 7 분 7 분 및 마지막으로 2%에서 4 분에 대 한 열을 equilibrate.</li>
		</ol>
</li>
		<li>빌드 실행 시퀀스 (보충 그림 2참조): 모든 시간 포인트, 샘플 및 쟁반, 버퍼 이름에 있는 위치 이름과 위치를 입력 하십시오. 참고: 소프트웨어는 실행 시간을 감소 하는 한 번에, 효율적으로 하는 여러 샘플을 실행 하는 프로그램으로 모든 다른 실행 시간의 맞춤 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>데이터 분석 참고: 협력 펩 티 드 식별 및 HDX 워크 벤치, 시퀀스 범위의 분석에 대 한 프로테옴 발견자 와 MaxQuant (무료 소프트웨어)를 포함 한 데이터 분석 과정에서 여러 가지 소프트웨어 프로그램을 단백질, 중수소 결합의 분석 및 실험의 다른 세트 사이 HDX 속도의 비교를 허용 하는 무료 소프트웨어. 이러한 소프트웨어 프로그램을 사용 하 여 다음 단계를 설명 합니다.<ol>
<li>소프트웨어 (보충 그림 3)를 통해 비 deuterated 제어 샘플을 실행 하 여 샘플의 펩 티 드 범위를 분석 합니다. 다음 매개 변수를 사용 하 여 소프트웨어를 설정 합니다.<ol>
<li>(불특정) 아니 효소 Sequest HT 메서드를 사용 하 여 다니엘. 7 ppm 및 선구자의 이온 및 조각에 대 한 0.5 다의 대량 허용 오차 4-144 아미노산의 펩 티 드에 대 한 검색. 동적 메티오닌 산화에 대 한 허용.</li>
			<li>단백질,이 통해 소프트웨어 펩 티 드 범위를 확인할 수 있습니다에 대 한 데이터베이스를 만듭니다. 텍스트 형식으로 확인 된 펩 티 드를 내보냅니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>HDX 워크 벤치 무료 소프트웨어58을 사용 하 여 deuterated 결과 분석 합니다.<ol>
<li>단백질 편집기 열고 단백질 시퀀스 및 펩 티 드 적용 파일을 삽입 하 여 단백질을 정의 합니다.</li>
			<li>다음, 설치 마법사 실험 편집기를 열고 요청 하는 모든 입력을 입력 합니다. 참고: 샘플 수, 시간 포인트 수, 복제 수, 버퍼, 그리고 온도 pH 값, 프로그램 필요합니다.</li>
			<li>마지막으로, 질량 분석기, 사용 후 프로그램 검색 된 펩 티 드의 목록이 생성 관련 매개 변수를 입력 합니다. 참고: 소프트웨어 "HDX" 펩 티 드를 감지, 동위 원소 클러스터를 검사 하 고 샘플에서 deuteration의 명확한 시각화를 보여 줍니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>데이터 프레 젠 테이 션
	<ol>
<li>PyMol 소프트웨어 또는 다른 시각화 소프트웨어를 사용 하 여 구조체에 경의 표 deuteration 통풍 관으로 영역을 레이블을 지정 합니다.</li>
		<li>B 요소 값 대신 중수소 이해 수준을 소개 합니다. 참고: 기본 자습서 https://pymolwiki.org/index.php/Practical_Pymol_for_Beginners에서 찾을 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
</ol>

저자는 공개 없다.

이 문서에서 우리는 redox 종속 보호자 활동의 분석 및 클라이언트 단백질의 바인딩 따라 구조 변화의 특성에 대 한 프로토콜 제공. 이들은 잠재적인 보호자 기판 단지 정의 하 고 잠재적인 상호 작용 사이트 분석을 보완 방법론입니다.
여기, 우리는 잘 공부 보호자 기판 CS와 redox 규제 보호자 Hsp33 사이 복잡 한 특성에 대 한 이러한 프로토콜을 적용. 우리는 두 가지 유형의 단백?...

셀 자주 발생 하는 반응성 산소 종 (선생님)의 호흡1,2, 단백질 및 지질 산화3,4및 추가 프로세스5, 부산물 생산의 축적 6,7. 선생님 셀룰러 신호8,9 및 면역 응답10등 다양 한 생물학 과정에서 유익한 역할에 불구 하 고 선생님 생산 및 그것의 해독 사이의 불균형이 발생할 수 있습니다, 산화를 선도 7스트레스. 선생님의 생물 목표 단백질, 지질 및 핵 산의 산화가 그들의 구조와 기능에 영향을 미칠 있습니다. 따라서, 셀룰러 oxidants의 축적은 강하게 pathologies 암9,11, 염증12,13, 노화14, 등의 다양 한 범위에 연결 15, 그리고 발병 및 Alzheimer의, 파 킨 슨 병 같은 신경 퇴행 성 질환의 진행, 그리고 루 게 릭 병 질환16,,1718에 관련 된 발견 되었습니다.
모두 새로 합성 하 고 성숙한 단백질 단백질 구조와 기능19,20모양 그들의 사이드 체인의 잠재적으로 유해한 수정으로 인 산화에 매우 민감합니다. 따라서, 산화 스트레스는 일반적으로 광범위 한 단백질 비활성화, misfolding 및 집계, 결국 세포 죽음으로 이어지는 리드. 광범위 한 단백질 집계 misfolded 클라이언트 단백질21와 안정 되어 있는 복합물을 형성 하는 대신 억제 redox 종속 보호자를 활용 하는 단백질 산화의 잠재적인 손상에 대처 하기 위해 우아한 셀룰러 전략 중 하나 ,,2223. 이 첫 번째-라인 방어 보호자 강력한 안티 집계 분자24로 그들을 변환 하는 (보통에 시스테인 잔류물) 사이트별 산화에 의해 급속 하 게 활성화 됩니다. 산화 스트레스 조건25,26 동안 정식 ATP 의존 보호자는 덜 효과적인 산화 스트레스 결과 호흡 억제 및 세포질 ATP 레벨25감소, 이후 27. 따라서, ATP 독립 보호자 redox 활성화 재생 oxidants 박테리아 및 진핵생물의 축적에 따라 단백질 항상성 유지에 중요 한 역할 (예:Hsp3328 , RidA29 박테리아, Get3에에서30 효 모, peroxiredoxins31 진핵생물에서에서). 이러한 보호자의 활동 강하게 소수 지역 misfolded 클라이언트 단백질의 인식에 관련 된 폭로 사이트 산화에 의해 유도 된 가역 구조 구조적 변화에 따라 달라 집니다.
반대로 집계 메커니즘 및 클라이언트 단백질의 인식 보호자에 의해 통치 원리의 연구 보호자 기판 상호 작용32,33의 역동적이 고 heterogenic 특성상 쉽지 않다 34,35,,3637. 그러나, 스트레스 통제 보호자는 그들의 능력 때문 반대로 집계 함수에 대 한 우리의 이해를 전진 하는 기회: 1)는 보호자, (예를 들면, 산화) 활성 및 비활성 (예를 들어, 두 가지 형태를 얻을 감소), 소개 또는 쉽게 전환 (예:산화 제, 환 원제), 그들 2 스트레스 조건 제거)는 광범위 한 기판, 3) 클라이언트 단백질에 의해 평가 될 수 있는 매우 안정적인 단지 형성 다른 구조적 방법론, 및 4) 기판 인식 및 릴리스, 대부분 이러한 보호자의 접는 기능 부족으로 redox-종속 구조적 변화에 의해 중재에 전적으로 초점을.
여기, 우리 세균 redox 규제 보호자 Hsp33의 안티 집계 활동, 산화 유도 단백질 집계28에 대 한 세균 방어 시스템의 중요 한 구성 요소를 분석합니다. Hsp33는 활동 없이 보호자; 밀접 하 게 접힌된 아연-바인딩 단백질 감소, 그러나, 산화 스트레스에 노출 되 면 Hsp33의 기판 바인딩 지역38,39노출 광범위 한 구조적 변화를 겪 습. 산화, 시 C 터미널 도메인의 4 개의 높은 보존된 시스테인 잔류물에 강력 하 게 바인딩된 아연 이온 출시40입니다. 이 결과 C 터미널 도메인 및 인접 한 링커 지역41의 불안의 전개는 두 개의 이황화 결합의 대형에. C-터미널, 링커가 지역은 매우 유연 하며 본질적으로 또는 부분적으로 무질서로 정의 됩니다. 아닌 스트레스 조건에 반환, 시는 시스테인 감소 되 고는 보호자 안티 집계 활동 없이 네이티브 접힌된 상태로 돌아갑니다. 보호자의 refolding 더 전개를 지도 하 고 바인딩된 클라이언트 단백질 트리거 refolding38정식 보호자 시스템, DnaK/J, 그것의 이동의 불안정. Hsp33의 상호 작용 사이트의 분석 제안 Hsp33 사용 하 여 두의 충전 무질서 잡으려고 링커 N 맨끝 도메인에 소수 성 영역 뿐만 아니라 영역 클라이언트 단백질을 misfolded 고 방지 그들의 집계38, 42. 접힌된 상태에서이 지역 접힌된 링커 및 C 터미널 도메인으로 숨겨져 있습니다. 흥미롭게도, 링커 지역 "감지" 그것의 인접 한 C 터미널 도메인34의 접는 상태 Hsp33의 접힌된 비활성 상태의 게이트 키퍼 역할을 합니다. (포인트 돌연변이 또는 전체 순서 섭 동에 의해 중) mutagenesis에 의해 불안정 하 게, 일단 그것의 산화 환 원에 민감한 시스테인43의 산화 환 원 상태 Hsp33 constitutively 활성 보호자 관계 없이로 변환 됩니다.
여기에 제시 된 프로토콜 활성화 시 매핑은 구조적 변화 뿐만 아니라 Hsp33의 redox 종속 보호자 활동 모니터링 클라이언트 단백질의 바인딩을 허용 합니다. 이 방법론은 다른 보호자 클라이언트 인식 모델 뿐만 아니라 비 보호자 단백질-단백질 상호 작용 연구에 적용할 수 있습니다. 또한, 우리는 단백질 활동에 단백질 산화의 잠재적인 역할을 다른 산화 환 원 스위치 단백질의 연구에 사용할 수 있는 완벽 하 게 감소 하 고 산화 보호자의 준비에 대 한 프로토콜을 제시.
우리가 보호자 활동에서 생체 외에서 모니터링 하 고 다른 유형의 단백질 집계 (화학적 또는 열 유도) 산란 (LS)에 의해 측정을 사용 하 여에서 그것의 기질 특이성을 정의 하는 절차를 설명 하는 구체적으로 fluorospectrometer44. 집계, 동안 360 nm 증가 급속 하 게 증가 탁 때문에 분산을 빛. 따라서,이 파장에서 시간에 따른 방식으로 집계를 모니터링할 수 있습니다. LS는 단백질 집계 및 따라서 nanomolar 농도, 활성화 단백질 집계 관련 운동 매개 변수에서 다른 특성을 사용 하 여 관심사의 단백질의 안티 집계 작업 테스트를 위한 신속 하 고 민감한 방법 조건입니다. 또한, 여기에 설명 된 LS 프로토콜 비싼 장비를 요구 하지 않는다 그리고 어떤 실험실에 쉽게 설치 될 수 있다.
그럼에도 불구 하 고, 그것은 "깨끗 한" 운동 곡선을 얻을 수와 같은 빛을 뿌리는 실험, 소음 및 공기 방울 및 큰 집계에 의해 생성 된 outliers의 많은 수에서 단백질의 운동 매개 변수를 파생 하는 매우 도전. 이 장애물을 극복 하기 위해 소설 그래픽 도구, Kfits45, 다른 운동 측정, 특히 단백질 집계 운동 데이터에 대 한 장착에 잡음 레벨을 감소 시키기를 위해 사용 하는 것이 선물이. 이 소프트웨어는 결과의 초기 평가 대 한 예비 운동 매개 변수를 제공 하 고 "깨끗 한" 많은 양의 데이터 신속 하 게 운동 속성을 영향을 주지 않고 사용자 수 있습니다. Kfits 파이썬에서 구현 이며 45오픈 소스에서 사용할 수 있습니다.
필드에 도전적인 질문 중 하나는 보호자와 그들의 클라이언트 단백질 사이 상호 작용 사이트를 매핑 및 보호자 misfolded 기판의 넓은 범위를 인식 하는 방법을 이해 관련이 있습니다. 이 질문은 더 복잡 보호자 및 집계 경향이 기판 무질서 공부 본질적으로 포함 하는 매우 동적인 단백질 복합물. 다행히도, 구조 질량 분석은 극적으로 지난 10 년간 고급 고가 성공적으로 도움이 접근 및 구조상가 소성을 분석 하 고 잔류물 단백질 인식46, 에 지도 하는 도구 47 , 48 , 49. 여기, 선물이 하나 이러한 기술은 수소 중수소 교환 질량 분석 (HDX-MS)-단백질 수정 또는 단백질/Ligand 바인딩35, 구조 형태에 잔류물 수준 변경의 매핑 수 있습니다 50,51,,5253,54,55. HDX MS 중수소, 화학 환경, 접근성, 속도의 영향을 받는 여 백본 hydrogens의 지속적인 교류를 사용 및 공유 및 공유 결합56. HDX MS deuterated 용 매, 일반적으로 중 수 (D2O)를 사용 하 여 이러한 exchange 프로세스를 추적 하 고 측정 수소 중수소 교환에 따라 분자량의 변화에 따라 수 있습니다. 수소 중수소 교환 속도가 느리거나 hydrogens 수소 결합에 참여 또는, 간단 하 게, 구조57에서 로컬 변경 사항을 나타내는 입체 방해에서에서 발생할 수 있습니다. Ligand 바인딩 또는 포스트 번역 상 수정 변경 수소 중수소 교환 (HDX) 요금46,53에 차이에 결과 바인딩을 사용 하 여 수소 환경에 차이 또한 발생할 수 있습니다.
우리는 급속 하 게 산화, Hsp33의 활성화로 이어지는 시 전개 2) 그것의 전체 길이 misfolded 기판, 구 연산 염 synthase (CS)38와 Hsp33의 잠재적인 바인딩 인터페이스 정의 1) 지도 Hsp33 지역에이 기술을 적용.
이 원고에 설명 된 방법은 redox 종속 기능 단백질에 체 외에, 안티 집계 활동 및 정의 구조 변경의 역할 (있을 경우) 단백질 기능 연구에 적용할 수 있습니다. 이러한 방법론을 쉽게 다양 한 생물 학적 시스템에 적응 하 고 실험실에서 적용 될 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Chemicals, Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile HPLC plus</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34998-2.5L</td><td>solvent</td></tr><tr><td>Formic acid Optima LC/MS</td><td>Fisher Chemicals</td><td>A117-50</td><td>solvent supplement</td></tr><tr><td>Isopropyl alcohol, HPLC grade</td><td>Fisher Chemicals</td><td>P750717</td><td>solvent</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Chemicals</td><td>A456-212</td><td>solvent</td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>252859</td><td>buffer</td></tr><tr><td>Trifluoroacetic acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>76-05-1</td><td>solvent</td></tr><tr><td>Water for HPLC</td><td>Sigma Aldrich</td><td>270733-2.5L-M</td><td>solvent</td></tr><tr><td>ZnCl2, Zinc Chloride</td><td>Merck</td><td>B0755416 308</td><td>reagent</td></tr><tr><td>DTT</td><td>goldbio</td><td>27565-41-9</td><td>reducing agent</td></tr><tr><td>PD mini trap G-25 columns GE healthcare</td><td>GE healthcare</td><td>29-9180-07</td><td>desalting column</td></tr><tr><td>Potassium Phosphate</td><td>United states Biochemical Corporation</td><td>20274</td><td>buffer</td></tr><tr><td>Hydrogen peroxide 30%</td><td>Merck</td><td>K46809910526</td><td>oxidizing agent</td></tr><tr><td>citrate synthase</td><td>sigma aldrich</td><td>C3260</td><td>substrate</td></tr><tr><td>HEPES acid free</td><td>sigma aldrich</td><td>7365-45-9</td><td>buffer</td></tr><tr><td>Gndcl</td><td>sigma aldrich</td><td>G3272-500G</td><td>denaturant</td></tr><tr><td>Deuterium Chloride Solution</td><td>sigma aldrich</td><td>543047-10G</td><td>buffer</td></tr><tr><td>Deuterium Oxide 99%</td><td>sigma aldrich</td><td>151882-100G</td><td>solvent</td></tr><tr><td>TCEP</td><td>bioworld</td><td>42000058-2</td><td>reducing agent</td></tr><tr><td>150uL Micro-Insert with Mandrel Interior &amp;amp; Polymer Feet, 29*5mm</td><td>La-Pha-Pack -Thermo Fischer Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5mL Clear Short Thread Vial 9mm Thread, 11.6*32mm</td><td>La-Pha-Pack -Thermo Fischer Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>quartz cuvette</td><td>Hellma 101-QS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Instruments&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jasco FP-8500 Fluorospectrometer</td><td>Jasco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer Comfort</td><td>Eppendorf</td><td>13058/0</td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Megafuge 16R, bench topCentrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH meter , PB-11 sartorius</td><td>Sartorius</td><td>13119/0</td><td></td></tr><tr><td>AffiPro Immobilized Pepsin column (20mm length, 2.0mm diameter).</td><td>AffiPro</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Waters Pre-column (ACQUITY UPLC BEH C18 VanGuard 130 &amp;Aring;, 1.7um, 2.1mmx5mm)</td><td>Waters</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C18 analytical column (ACQUITY UPLC Peptide BEH c18 Column, 130 &amp;Aring;, 1.7um, 2.1mmx50mm)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vinyl Anaerobic chamber with Airlock door</td><td>COY</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Q-exactive-orbitrap mass spectrometer</td><td>Thermo-Fischer Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PAL system LHX - robotic system for handling HDX samples</td><td>PAL system</td><td>https://www.palsystem.com/index.php?id=840</td><td></td></tr><tr><td>Dionex Ultimate 3000, XRS pump</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dionex AXP-MS auxiliary pump</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Software, Software Tools, Database search&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kfits: Fit aggregation Data</td><td>http://kfits.reichmannlab.com/fitter/</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Xcalibur software</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/OPTON-30487</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Q Exactive MS Series Tune Interface (Tune)</td><td>https://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/WS-MS-Q-Exactive-Calibration-Maintenance-iQuan2016-EN.pdf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chronos software (Axel Semrau)</td><td>http://www.axel-semrau.de/en/Software/Software+Solutions/Chronos-p-966.html</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Proteome Discoverer V1.4 software</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/OPTON-30795</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HDX workbench software</td><td>http://hdx.florida.scripps.edu/hdx_workbench/Home.html</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

defining hsp33's redox-regulated chaperone activity and mapping conformational changes on hsp33 using hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry

생명체는 온도, pH, 반응 산소 종의 축적 등에서 변화를 포함 하 여 그들의 수명 주기 동안 환경 변동에 대처 하기 위해 정기적으로 필요 합니다. 이러한 변동 광범위 한 단백질 전개, 집계,으로 이어질 수 있으며 세포 죽음. 따라서, 세포 스트레스 조건 중 "건강 한" 프로테옴을 유지 하는 분자 보호자의 역동적이 고 스트레스 관련 네트워크를 진화 했다. ATP-독립 보호자 일선 방위 분자, 스트레스-종속 방식에서 단백질 집계에 대 한 보호로 봉사 하는 분자 보호자의 1 개의 주요 클래스를 구성 합니다. 한 이러한 보호자 공통점 기능은 그들의 스트레스 관련 활성화, 인식 및 misfolded 클라이언트의 버전에 대 한 구조적인가 소성을 활용 하는 능력.
이 문서에서 우리는 한 그러한 본질적으로 무질서 보호자, 단백질 산화 스트레스 동안 집계에 대 한 보호는 세균성 산화 규제 Hsp33의 기능 및 구조 분석에 집중 한다. 여기, 선물이, 보호자의 구조적 변화를 매핑 뿐만 아니라 보호자 redox 규제 활동, 공부에 대 한 다양 한 기술의 도구 상자 밑에 그것의 활동. 특히, 우리는 보호자 안티 집계 활동에서 생체 외에서 빛 산란을 사용 하 여의 정도에 초점을 맞추고의 분석 이어서 완전히 감소 하 고 완벽 하 게 산화 단백질의 준비를 포함 하는 워크플로 설명 합니다 반대로 집계 활동과 그 활동입니다. 극복 하기 위해 자주 outliers 집계 분석 하는 동안 축적 된, Kfits, 운동 측정의 쉬운 처리를 수 있는 새로운 그래픽 도구 사용을 설명 합니다. 이 도구는 쉽게 다른 유형의 outliers를 제거 및 운동 매개 변수 피팅 운동 측정에 적용할 수 있습니다. 단백질 구조와 기능을 연결할 설치 및 워크플로 구조 질량 분석 기술, 수소 중수소 교환 질량 분석, 구조적 변화의 매핑은 보호자 수의 설명 및 Hsp33 활동의 다른 단계 동안 있는 기질 다른 단백질-리간드 및 단백질-단백질 상호 작용에는 동일한 방법론을 적용할 수 있습니다.

제시 하는 두 가지 방법 운동 활동과 보호자와의 기판 간의 단백질 상호 작용의 역동성에 따라 가능 하 게. 또한, 감소-산화 프로토콜 redox 의존 무질서 보호자의 활성화 메커니즘의 더 심도 있는 이해를 주는 완전히 감소 하 고 완벽 하 게 산화 보호자의 준비를 수 있습니다.
첫째, 우리는 보호자의 redox 종속 활동 검사 산란 사?...

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Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry

Hsp33의 Redox 규제 보호자 활동을 정의 하 고 수소 중수소 교환 질량 분석을 사용 하 여 Hsp33에 구조적 변화를 매핑

유기 체는 그들의 일생 동안 발생 하는 가장 어려운 스트레스 조건 중 하나에 oxidants의 축적을 포함 한다. 산화 스트레스, 동안 셀 무 겁 게 의존 분자 보호자. 여기, 우리는 HDX MS를 사용 하 여 보호자 기능을 경 세 하는 구조적인 변화를 모니터링으로 redox 규제 안티 집단 활동, 또한 조사 하는 데 사용 하는 방법 제시.

Living organisms regularly need to cope with fluctuating environments during their life cycle, including changes in temperature, pH, the accumulation of ...

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8.6K 조회수.  The Hebrew University of Jerusalem. 유기 체는 그들의 일생 동안 발생 하는 가장 어려운 스트레스 조건 중 하나에 oxidants의 축적을 포함 한다. 산화 스트레스, 동안 셀 무 겁 게 의존 분자 보호자. 여기, 우리는 HDX MS를 사용 하 여 보호자 기능을 경 세 하는 구조적인 변화를 모니터링으로 redox 규제 안티 집단 활동, 또한 조사 하는 데 사용 하는 방법 제시.

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Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many of these conditions cause protein unfolding in the cell and have detrimental impact on the survival of the organism. A group of unrelated, stress-specific molecular chaperones have been shown to play essential roles in the survival of these stress conditions. While fully folded and chaperone-inactive before stress, these proteins rapidly unfold and become chaperone-active under specific stress conditions. Once activated, these conditionally disordered chaperones bind to a large number of different aggregation-prone proteins, prevent their aggregation and either directly or indirectly facilitate protein refolding upon return to non-stress conditions. The primary approach for gaining a more detailed understanding about the mechanism of their activation and client recognition involves the purification and subsequent characterization of these proteins using in vitro chaperone assays. Follow-up in vivo stress assays are absolutely essential to independently confirm the obtained in vitro results.
This protocol describes in vitro and in vivo methods to characterize the chaperone activity of E. coli HdeB, an acid-activated chaperone. Light scattering measurements were used as a convenient read-out for HdeB&#39;s capacity to prevent acid-induced aggregation of an established model client protein, MDH, in vitro. Analytical ultracentrifugation experiments were applied to reveal complex formation between HdeB and its client protein LDH, to shed light into the fate of client proteins upon their return to non-stress conditions. Enzymatic activity assays of the client proteins were conducted to monitor the effects of HdeB on pH-induced client inactivation and reactivation. Finally, survival studies were used to monitor the influence of HdeB&#39;s chaperone function in vivo.

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

This study describes biophysical, biochemical and molecular techniques to characterize the chaperone activity of Escherichia coli HdeB under acidic pH conditions. These methods have been successfully applied for other acid-protective chaperones such as HdeA and can be modified to work for other chaperones and stress conditions.

의 pH에 ​​의존 활동의 검출<em&gt; 대장균</em&gt; 보호자 HdeB<em&gt; 체외</em&gt; 및<em&gt; 생체</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

연구

생화학

Analyzing Protein Dynamics Using Hydrogen Exchange Mass Spectrometry

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique amino acid sequence, it is only realized by the folding of the polypeptide chain into a single defined three-dimensional arrangement or more commonly into an ensemble of interconverting conformations. Investigating the connection between protein conformation and its function is therefore essential for a complete understanding of how proteins are able to fulfill their great variety of tasks. One possibility to study conformational changes a protein undergoes while progressing through its functional cycle is hydrogen-1H/2H-exchange in combination with high-resolution mass spectrometry (HX-MS). HX-MS is a versatile and robust method that adds a new dimension to structural information obtained by e.g. crystallography. It is used to study protein folding and unfolding, binding of small molecule ligands, protein-protein interactions, conformational changes linked to enzyme catalysis, and allostery. In addition, HX-MS is often used when the amount of protein is very limited or crystallization of the protein is not feasible. Here we provide a general protocol for studying protein dynamics with HX-MS and describe as an example how to reveal the interaction interface of two proteins in a complex. &#160;&#160;

Protein conformation and dynamics are key to understanding the relationship between protein structure and function. Hydrogen exchange coupled with high-resolution mass spectrometry is a versatile method to study the conformational dynamics of proteins as well as characterizing protein-ligand and protein-protein interactions, including contact interfaces and allosteric effects.

수소 환율 질량 분석을 사용하여 단백질의 역학 분석

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique ...

화학

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. Hydrogen-Deuterium Exchange (HDX) measured at rapid time scales is uniquely suited to detect structures and hydrogen bonding networks that are briefly populated, allowing for the characterization of transient conformers in native ensembles. Coupling of HDX to mass spectrometry offers several key advantages, including high sensitivity, low sample consumption and no restriction on protein size. This technique has advanced greatly in the last several decades, including the ability to monitor HDX labeling times on the millisecond time scale. In addition, by incorporating the HDX workflow onto a microfluidic platform housing an acidic protease microreactor, we are able to localize dynamic properties at the peptide level. In this study, Time-Resolved ElectroSpray Ionization Mass Spectrometry (TRESI-MS) coupled to HDX was used to provide a detailed picture of residual structure in the tau protein, as well as the conformational shifts induced upon hyperphosphorylation.

Conformational flexibility plays a critical role in protein function. Herein, we describe the use of time-resolved electrospray ionization mass spectrometry coupled to hydrogen-deuterium exchange for probing the rapid structural changes that drive function in ordered and disordered proteins.

시간 해결 전기 분무 이온화 수소 - 중수소 교환 질량 분석 단백질 구조와 역학 연구를위한

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological processes. Affinity purification coupled to mass spectrometry (AP-MS) has become the method of choice for identifying protein-protein interactions. However, conventional AP-MS studies provide information on protein interactions, but the organizational information is lost. To address this issue, we developed a strategy to unravel the distinct functional assemblies a protein might be involved in, by resolving affinity-purified protein complexes prior to their characterization by mass spectrometry. Protein complexes isolated through affinity purification of a bait protein using an epitope tag and competitive elution are separated through blue native electrophoresis. Comparison of protein migration profiles through correlation profiling using quantitative mass spectrometry allows assignment of interacting proteins to distinct molecular entities. This method is able to resolve protein complexes of close molecular weights that might not be resolved by traditional chromatographic techniques such as gel filtration. With little more work than conventional AP-geLC-MS/MS, we demonstrate this strategy may in many cases be adequate for obtaining protein complex topological information concomitantly to identifying protein interactions.

Here we present protocols for affinity purification of protein complexes and their separation by blue native PAGE, followed by protein correlation profiling using label free quantitative mass spectrometry. This method is useful to resolve interactomes into distinct protein complexes.

블루 기본 페이지와 단백질 상관 관계 프로파일 링에 의한 선호도 정제 단백질 복합체 해결

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of virion morphogenesis. Quantitative lipid droplet proteome analysis can be used to identify proteins that localize to or are displaced from lipid droplets under conditions such as virus infections. Here, we describe a protocol that has been successfully used to characterize the changes in the lipid droplet proteome following infection with HCV. We use Stable Isotope Labeling with Amino Acids in Cell Culture (SILAC) and thus label the complete proteome of one population of cells with &#34;heavy&#34; amino acids to quantitate the proteins by mass spectrometry. For lipid droplet isolation, the two cell populations (i.e.&#160;HCV-infected/&#34;light&#34; amino acids and uninfected control/&#34;heavy&#34; amino acids) are mixed 1:1 and lysed mechanically in hypotonic buffer. After removing the nuclei and cell debris by low speed centrifugation, lipid droplet-associated proteins are enriched by two subsequent ultracentrifugation steps followed by three washing steps in isotonic buffer. The purity of the lipid droplet fractions is analyzed by western blotting with antibodies recognizing different subcellular compartments. Lipid droplet-associated proteins are then separated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) followed by Coomassie staining. After tryptic digest, the peptides are quantified by liquid chromatography-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). Using this method, we identified proteins recruited to lipid droplets upon HCV infection that might represent pro- or antiviral host factors. Our method can be applied to a variety of different cells and culture conditions, such as infection with pathogens, environmental stress, or drug treatment.

Lipid droplets are important organelles for the replication of several pathogens, including the Hepatitis C Virus (HCV). We describe a method to isolate lipid droplets for quantitative mass spectrometry of associated proteins; it can be used under a variety of conditions, such as virus infection, environmental stress, or drug treatment.

양적 질량 분광법 분석을위한 지질 물방울 절연

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For many molecular machines in a cell proteins have to act together&#160;with interaction partners in a functional cycle to fulfill their task. The extension of two-color to multi-color smFRET makes it possible to simultaneously probe more than one interaction or conformational change. This not only adds a new dimension to smFRET experiments but it also offers the unique possibility to directly study the sequence of events and to detect correlated interactions when using an immobilized sample and a total internal reflection fluorescence microscope (TIRFM). Therefore, multi-color smFRET is a versatile tool for studying biomolecular complexes in a quantitative manner and in a previously unachievable detail.
Here, we demonstrate how to overcome the special challenges of multi-color smFRET experiments on proteins. We present detailed protocols for obtaining the data and for extracting kinetic information. This includes trace selection criteria, state separation, and the recovery of state trajectories from the noisy data using a 3D ensemble Hidden Markov Model (HMM). Compared to other methods, the kinetic information is not recovered from dwell time histograms but directly from the HMM. The maximum likelihood framework allows us to critically evaluate the kinetic model and to provide meaningful uncertainties for the rates.
By applying our method to the heat shock protein 90 (Hsp90), we are able to disentangle the nucleotide binding and the global conformational changes of the protein. This allows us to directly observe the cooperativity between the two nucleotide binding pockets of the Hsp90 dimer.

Here, we present a protocol to obtain three-color smFRET data and its analysis with a 3D ensemble Hidden Markov Model. With this approach, scientists can extract kinetic information from complex protein systems, including cooperativity or correlated interactions.

3 색 단일 분자 무서 워를 사용 하 여 단백질 상호 작용의 상관 관계를 연구 하

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

A Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry (HDX-MS) Platform for Investigating Peptide Biosynthetic Enzymes

Hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry (HDX-MS) is a powerful method for the biophysical characterization of enzyme conformational changes and enzyme-substrate interactions. Among its many benefits, HDX-MS consumes only small amounts of material, can be performed under near native conditions without the need for enzyme/substrate labeling, and can provide spatially resolved information on enzyme conformational dynamics&#8722;even for large enzymes and multiprotein complexes. The method is initiated by the dilution of the enzyme of interest into buffer prepared in D2O. This triggers the exchange of protium in peptide bond amides (N-H) with deuterium (N-D). At the desired exchange time points, reaction aliquots are quenched, the enzyme is proteolyzed into peptides, the peptides are separated by ultra-performance liquid chromatography (UPLC), and the change in mass of each peptide (due to the exchange of hydrogen for deuterium) is recorded by MS. The amount of deuterium uptake by each peptide is strongly dependent on the local hydrogen bonding environment of that peptide. Peptides present in very dynamic regions of the enzyme exchange deuterium very rapidly, whereas peptides derived from well-ordered regions undergo exchange much more slowly. In this manner, the HDX rate reports on local enzyme conformational dynamics. Perturbations to deuterium uptake levels in the presence of different ligands can then be used to map ligand binding sites, identify allosteric networks, and to understand the role of conformational dynamics in enzyme function. Here, we illustrate how we have used HDX-MS to better understand the biosynthesis of a type of peptide natural products called lanthipeptides. Lanthipeptides are genetically encoded peptides that are post-translationally modified by large, multifunctional, conformationally dynamic enzymes that are difficult to study with traditional structural biology approaches. HDX-MS provides an ideal and adaptable platform for investigating the mechanistic properties of these types of enzymes.

A Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry HDX-MS Platform for Investigating Peptide Biosynthetic Enzymes

Lanthipeptide synthetases catalyze multistep reactions during the biosynthesis of peptide natural products. Here, we describe a continuous, bottom-up, hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry (HDX-MS) workflow that can be employed to study the conformational dynamics of lanthipeptide synthetases, as well as other similar enzymes involved in peptide natural product biosynthesis.

펩타이드 생합성 효소를 조사하기 위한 수소-신투륨 교환 질량 분광법(HDX-MS) 플랫폼

Hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry (HDX-MS) is a powerful method for the biophysical characterization of enzyme conformational changes and ...

Studies of Chaperone-Cochaperone Interactions using Homogenous Bead-Based Assay

Targeting the heat shock protein 90 (Hsp90)-cochaperone interactions provides the possibility to specifically regulate Hsp90-dependent intracellular processes. The conserved MEEVD pentapeptide at the C-terminus of Hsp90 is responsible for the interaction with the tetratricopeptide repeat (TPR) motif of co-chaperones. FK506-binding protein (FKBP) 51 and FKBP52 are two similar TPR-motif co-chaperones involved in steroid hormone-dependent diseases with different functions. Therefore, identifying molecules specifically blocking interactions between Hsp90 and FKBP51 or FKBP52 provides a promising therapeutic potential for several human diseases. Here, we describe the protocol for an amplified luminescent proximity homogenous assay to probe interactions between Hsp90 and its partner co-chaperones FKBP51 and FKBP52. First, we have purified the TPR motif-containing proteins FKBP51 and FKBP52 in glutathione S-transferase (GST)-tagged form. Using the glutathione-linked donor beads with GST-fused TPR-motif proteins and the acceptor beads coupled with a 10-mer C-terminal peptide of Hsp90, we have probed protein-protein interactions in a homogeneous environment. We have used this assay to screen small molecules to disrupt Hsp90-FKBP51 or Hsp90-FKBP52 interactions and identified potent and selective Hsp90-FKBP51 interaction inhibitors.

This protocol presents a technique for probing protein-protein interactions using glutathione-linked donor beads with GST-fused TPR-motif co-chaperones and acceptor beads coupled with an Hsp90-derived peptide. We have used this technique to screen small molecules to disrupt Hsp90-FKBP51 or Hsp90-FKBP52 interactions and identified potent and selective Hsp90-FKBP51 interaction inhibitors.

동질적인 구드 기반 분석체를 사용하여 샤페론 - 코카페론 상호 작용의 연구

Targeting the heat shock protein 90 (Hsp90)-cochaperone interactions provides the possibility to specifically regulate Hsp90-dependent intracellular ...

Capillary Electrophoresis-based Hydrogen/Deuterium Exchange for Conformational Characterization of Proteins with Top-down Mass Spectrometry

Resolving conformational heterogeneity of multiple protein states that coexist in solution remains one of the main obstacles in the characterization of protein therapeutics and the determination of the conformational transition pathways critical for biological functions, ranging from molecular recognition to enzymatic catalysis. Hydrogen/deuterium exchange (HDX) reaction coupled with top-down mass spectrometric (MS) analysis provides a means to characterize protein higher-order structures and dynamics in a conformer-specific manner. The conformational resolving power of this technique is highly dependent on the efficiencies of separating protein states at the intact protein level and minimizing the residual non-deuterated protic content during the HDX reactions. 
Here we describe a capillary electrophoresis (CE)-based variant of the HDX MS approach that aims to improve the conformational resolution. In this approach, proteins undergo HDX reactions while migrating through a deuterated background electrolyte solution (BGE) during the capillary electrophoretic separation. Different protein states or proteoforms that coexist in solution can be efficiently separated based on their differing charge-to-size ratios. The difference in electrophoretic mobility between proteins and protic solvent molecules minimizes the residual non-deuterated solvent, resulting in a nearly complete deuterating environment during the HDX process. The flow-through microvial CE-MS interface allows efficient electrospray ionization of the eluted protein species following a rapid mixing with the quenching and denaturing modifier solution at the outlet of the sprayer. The online top-down MS analysis measures the global deuteration level of the eluted intact protein species, and subsequently, the deuteration of their gas-phase fragments. This paper demonstrates this approach in differential HDX for systems, including the natural protein variants coexisting in milk.

Presented here is a protocol for a capillary electrophoresis-based hydrogen/deuterium exchange (HDX) approach coupled with top-down mass spectrometry. This approach characterizes the difference in higher-order structures between different protein species, including proteins in different states and different proteoforms, by conducting concurrent differential HDX and electrophoretic separation.

Resolving conformational heterogeneity of multiple protein states that coexist in solution remains one of the main obstacles in the characterization of ...

Millisecond Hydrogen/Deuterium-Exchange Mass Spectrometry for the Study of Alpha-Synuclein Structural Dynamics Under Physiological Conditions

Alpha-synuclein (aSyn) is an intrinsically disordered protein whose fibrillar aggregates are abundant in Lewy bodies and neurites, which are the hallmarks of Parkinson's disease. Yet, much of its biological activity, as well as its aggregation, centrally involves the soluble monomer form of the protein. Elucidation of the molecular mechanisms of aSyn biology and pathophysiology requires structurally highly resolved methods and is sensitive to biological conditions. Its natively unfolded, meta-stable structures make monomeric aSyn intractable to many structural biology techniques. Here, the application of one such approach is described: hydrogen/deuterium-exchange mass spectrometry (HDX-MS) on the millisecond timescale for the study of proteins with low thermodynamic stability and weak protection factors, such as aSyn. At the millisecond timescale, HDX-MS data contain information on the solvent accessibility and hydrogen-bonded structure of aSyn, which are lost at longer labeling times, ultimately yielding structural resolution up to the amino acid level. Therefore, HDX-MS can provide information at high structural and temporal resolutions on conformational dynamics and thermodynamics, intra- and inter-molecular interactions, and the structural impact of mutations or alterations to environmental conditions. While broadly applicable, it is demonstrated how to acquire, analyze, and interpret millisecond HDX-MS measurements in monomeric aSyn.

The structural ensemble of monomeric alpha-synuclein affects its physiological function and physicochemical properties. The present protocol describes how to perform millisecond hydrogen/deuterium-exchange mass spectrometry and subsequent data analyses to determine conformational information on the monomer of this intrinsically disordered protein under physiological conditions.

생리학적 조건하에서의 알파-시뉴클레인 구조역학 연구를 위한 밀리초 수소/중수소-교환 질량 분광법

Alpha-synuclein (aSyn) is an intrinsically disordered protein whose fibrillar aggregates are abundant in Lewy bodies and neurites, which are the hallmarks ...

Hsp33의 Redox 규제 보호자 활동을 정의 하 고 수소 중수소 교환 질량 분석을 사용 하 여 Hsp33에 구조적 변화를 매핑

요약

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블루 기본 페이지와 단백질 상관 관계 프로파일 링에 의한 선호도 정제 단백질 복합체 해결

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동질적인 구드 기반 분석체를 사용하여 샤페론 - 코카페론 상호 작용의 연구

Capillary Electrophoresis-based Hydrogen/Deuterium Exchange for Conformational Characterization of Proteins with Top-down Mass Spectrometry

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