우리는 EPR 및 사슴 분석기에 대 한 액세스를 제공 하기 위한 박사 H. Mchaourab와 박사 T. 로젠바움 전장 시스테인-덜 TRPV1 플라스 미드를 제공 하기 위한 매우 감사.

저자는 공개 없다.

표현과 포유류 막 단백질의 정화에 대 한 현재 기술 분 광 연구14,15,,1642단백질의 충분 한 양을 얻을 수 만들었습니다. 여기, 우리 표현, 정화, 다시 구성, TRPV1에 분 광 분석을 수행 하는 이러한 기술을 적응 시켰다.
프로토콜에 중요 한 단계 중 아래는 TRPV1에 대 한 트러블 슈팅을 수행한 우리 하 고는 다른 단백질을 위해 조정 될 수 있습니다. 0.5-1 mg/mL 단백질 세제 정화;의 생성 하는 템플릿을 생성 하려면 DNA 시퀀스 수정 미만 0.5 mg/mL 단백질의 생성 하는 템플릿, 돌연변이 당 해야 할 것 이다 곤충 세포 문화 6 리터 이상 성장 이후 도전적. 단백질 해야 집중 될, 이상 2 mg/mL, 스핀 라벨 효율 증가에 한 TCEP 없이. 낮은 단백질 농도에 또는 TCEP 존재 라벨 흔적 시끄러운 EPR 스펙트럼을 생성 합니다. 단백질 정화 중 4 ° C에 보관 됩니다, 하지만 스핀 효율 향상을 위해 RT에서 라벨을 수행 하기 위해 필수적 이다. 정화 및 라벨, 글리세롤 단백질 안정성 향상 그러나, 그것은 제거 되어야 한다 완전히 재구성, 전에 리에는 단백질의 양이 감소 하 고 시끄러운 EPR 스펙트럼을 생성. 재구성; 중 관행은 CMC 아래 세제 농도 감소 그러나, TRPV1는 리에 통합 하기 전에 침전 경향이 있다. 이 문제를 해결 하려면 TRPV1 단백질 강 수를 방지 하 고 채널 proteoliposome 준비에서의 수량 증가를 CMC에서 정확 하 게 미리 형성 된 리와 하룻밤 incubated 했다. TRPV1이 완전히 기능 asolectin 리28; 따라서,이 프로토콜에 사용 되는 기본 지질 혼합물 이었다. 그러나, 분 광 분석을 진행 하기 전에 특정 단백질 기능 (예:콜레스테롤)은 지질 구성 결정에 필수적 이다.
분 광 접근 같은 선물로 EPR 및 사슴을 포함 한 몇 가지 제한: 생 화 확 적인 안정성을 개선 하는 단백질 템플릿 순서에서 변경 기능26;에 영향을 미칠 수 기본이 아닌 단일 시스테인, 스핀 라벨의 소개 수도 잘 용납 되지; 단백질의 특정 지역에서 얻는 많은 양의 레이블이 단백질; 그리고 제한 된 구조적 변화 세제 micelles에 사슴으로 거리를 결정할 때. 그러나, 후자의 제한 TRPV1 돌연변이 nanodiscs19,43재구성의 Q-밴드 주파수 스펙트럼을 수집 하 여 극복 될 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, 이러한 방법의 장점은 글로벌 역학, 각, 그리고의 주어진된 위치에서 더 이상 거리의 패턴에서 주로 온다.
온도 감도 가장 흥미로운 중 하나 이며 덜 이해 제어 메커니즘; 따라서, 분 광 방법을 사용 하 여, 그것은 가능한 것 막 단백질 막 환경에서 단백질 모션으로 열 에너지를 번역 하는 어떻게 결정 하. 중요 한 것은, 열 게이팅 엑스레이 결정학 또는 곳을 알아내는-EM을 사용 하 여 이러한 기술은 냉동 온도에서 수행 되는 동안 구조 변화를 확인 하기 위해 도전 것입니다. 미래 실험 TRPV1 구조적 변경 열 종속 게이팅 EPR, 사슴, 또는 형광을 사용 하 여 호환 확인으로 이동 합니다. 그래서 우리는 위에서 설명한 프로토콜을 사용해 서, 우리는 약물-바인딩을 사용 하 여 포유류 이온 채널의 활성화의 메커니즘에 대 한 통찰력을 얻게 될 것 이다 기대 EPR 분광학 간결한 이온 채널에 대 한 자세한 기계적 모델을 제공 하고있다 광 접근입니다.

단일 입자 cryo 전자 현미경 검사 법 (cryo-EM)의 최근 발전, 포유류 이온 채널 구조는 특별 한 속도로 얻은 되었습니다. 특히, 일시적인 수용 체 잠재력 vanilloid 1 (TRPV1) 같은 polymodal 이온 채널의 구조 연구를 제공 추가 활성화 메커니즘1,2,3, 의 이해 4 , 그러나 5., 막 환경에 포함 된 이온 채널에 대 한 동적 정보는 그들의 polymodal 제어 및 약물-바인딩 메커니즘을 이해 하는 데 필요한.
전자 상자성 공명 (EPR) 및 이중 전자-전자 공명 (사슴) spectroscopies 이온 채널6,7,,89 에 대 한 가장 확실 한 기계적 모델의 일부를 제공합니다 , 10 , 11 , 12 , 13. 이러한 접근의 간결한 검사에 주로 제한 되었습니다 및 archeal 이온 채널을 때 박테리아에 overexpressed 세제 정화 단백질 많은 양의 얻을. 곤충과 포유류 세포 기능 및 구조 특성화14,,1516진 핵 막 단백질 생산의 개발, 그것은 지금 생화학 얻을 수 분 광 연구에 대 한 세제 정화 단백질의 금액.
EPR 및 사슴 신호 단백질에서 단일-시스테인 잔류물에 연결 된 paramagneticspin 레이블 (SL) (즉, methanethiosulfonate)에서 발생 한다. 스핀-레이블을 보고 세 가지 유형의 구조 정보: 모션, 각, 및 거리. 이 정보는 잔류물 단백질 내 매장 하거나 막 또는 apo에 ligand 바인딩 상태13,17,,1819수성 환경에 노출 되는 수 있습니다. 고해상도 구조 (사용 가능한 경우)의 맥락에서 EPR 및 사슴 데이터 제공 가역 제어 전환 (즉, 폐쇄, 오픈, 모니터링 하는 동안 그들의 네이티브 환경에서 동적 모델을 파생에 대 한 제약 조건의 컬렉션 응, 그리고 desensitized). 또한, 엑스레이 결정학 또는 곳을 알아내는-그들 확인 하기 어려울 수 있습니다 유연한 지역 2 차 구조는 단백질20내의 위치 할당을 이러한 환경 데이터 집합을 사용 하 여 얻을 수 수 있습니다. 이온의 게이팅에 대 한 귀중 한 정보 채널3,,2122,,2324, 를 제공 하는 곳을 알아내는-EM 구조 지질 nanodiscs에서 25; 그러나, 분 광 방법 구조적 하는 상태에서 (예를 들어, 열 변경) 곳을 알아내는-그들을 사용 하 여 결정 하기 어려울 수 있습니다 동적 정보를 제공할 수 있습니다.
EPR와 사슴, 단백질 기능의 부족을 포함 하 여 모든 시스테인 잔류물 (특히 풍부한 포유류 채널에서), 낮은 단백질 수확량, 단백질 불안정성을 제거 하는 정화 동안 고 스핀 라벨링 후 구현 하 많은 어려움을 극복 한다 그리고 단백질 집계 세제 또는 리. 여기, 우리는 이러한 중요 한 장벽을 극복 하 여 포유류 감각 수용 체에 대 한 사슴 및 EPR 스펙트럼 정보를 얻은 프로토콜 설계. 여기 목적은 식, 정화, 라벨, 및 기능 최소화 시스테인-덜 쥐 TRPV1의 재구성 (eTRPV1) 분 광 분석에 대 한 구성에 대 한 방법론을 설명 하는 것입니다. 이 방법론은 그 막 단백질 이황화 결합을 형성 하는 시스테인을 포함 하는 또는 시스테인 잔류물의 제거에도 불구 하 고 그들의 기능을 유지 하는 것에 적합 합니다. 프로토콜의이 컬렉션은 다른 포유류 이온 채널의 분 광 분석에 대 한 적응 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>QuikChange Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>210519-5</td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol (Isopropanol)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A416</td><td></td></tr><tr><td>Albumin Bovine Serum (BSA)</td><td>GoldBio.com</td><td>A-420-10</td><td></td></tr><tr><td>Amylose resin</td><td>NEB</td><td>E8021L</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>GoldBio.com</td><td>A-655-25</td><td></td></tr><tr><td>Asolectin from Soybean</td><td>Sigma</td><td>11145</td><td></td></tr><tr><td>Bac-to-Bac Baculovirus Expression System</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>10359016</td><td></td></tr><tr><td>Biobeads SM-2 Adsorbents&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>152-3920</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate glass pipettes (3.5&#039;&#039;) (oocyte inyection)</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-203 G/X</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate glass pipettes (oocyte recordings)</td><td>Sutter Instrument</td><td>B150-110-10HP</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 2H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicillin (Disodium)</td><td>GoldBio.com</td><td>C-103-5</td><td></td></tr><tr><td>Cellfectin Reagent</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>10362-010</td><td></td></tr><tr><td>cellSens</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fisher Scientific</td><td>C606SK</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase Type 1</td><td>Worthington-Biochem</td><td>LS004196</td><td></td></tr><tr><td>Critiseal</td><td>VWR</td><td>18000-299</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Maltose Monohydrate</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP684</td><td></td></tr><tr><td>DDM (n-Docecyl-B-D-Maltopyranoside)</td><td>Anatrace</td><td>D310S</td><td></td></tr><tr><td>High glucose medium (Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle&amp;rsquo;s Medium)</td><td>Sigma</td><td>D0572&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Disposable PD-10 Desalting Columns</td><td>GE Healthcare</td><td>45-000-148</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>O2783</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>Life Technologies</td><td>F-14201</td><td></td></tr><tr><td>GenCatch Plus Plasmid DNA Mini-Prep Kit</td><td>Epoch Life Science, Inc</td><td>2160250</td><td></td></tr><tr><td>GenCatch PCR Cleanup Kit</td><td>Epoch Life Science, Inc</td><td>2360050</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin Sulfate</td><td>Lonza</td><td>17-518Z</td><td></td></tr><tr><td>Glass capillary (25 &amp;micro;l)</td><td>VWR</td><td>53432-761</td><td></td></tr><tr><td>Glass Flask 2800 mL</td><td>Pyrex USA</td><td>4423-2XL</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP229</td><td></td></tr><tr><td>HEK293S GnTl-</td><td>ATCC</td><td>CRL-3022</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>IPTG (isopropyl-thio-B-galactoside)</td><td>GoldBio.com</td><td>I2481C25</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin Sulfate</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP906-5</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Chemical</td><td>P217</td><td></td></tr><tr><td>LB Broth, Miller</td><td>Fisher bioReagents</td><td>BP1426</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin Hemisulfate</td><td>GoldBio.com</td><td>L-010-5</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 6H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP214</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4 7H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP213</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE T7 Kit</td><td>Ambion</td><td>AM1344</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Fisher bioReagents</td><td>BP2936</td><td></td></tr><tr><td>MTSL (1-Oxyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidin-3-yl) Methyl Methanethiosulfonate</td><td>Toronto Research Chemicals, Inc</td><td>O873900</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Chemical</td><td>S271</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Life Technologies</td><td>31985-062</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatin A</td><td>GoldBio.com</td><td>P-020-5</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic Acid F-127 (20%)</td><td>PromoKine&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>CA707-59004</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>GoldBio.com</td><td>P4170</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lysine Solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Sealed capillary</td><td>VitroCom</td><td>special order</td><td></td></tr><tr><td>SF-900 II SFM (insect cell medium)</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>10902-088</td><td></td></tr><tr><td>Sf9 Cells (SFM Adapted)</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>11496-015</td><td></td></tr><tr><td>Soybean Polar Lipid Extract</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc</td><td>541602C</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Fisher Scientific</td><td>S25590</td><td></td></tr><tr><td>Superose 6 Increase 10/300 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>29091596</td><td></td></tr><tr><td>TCEP HCl</td><td>GoldBio.com</td><td>TCEP1</td><td></td></tr><tr><td>Tetracyclin Hydrochloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP912-100</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP152</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Difco</td><td>0123-01</td><td></td></tr><tr><td>X-gal</td><td>GoldBio.com</td><td>X4281C</td><td></td></tr><tr><td>Xenopus oocytes</td><td>Nasco</td><td>LM00935M</td><td></td></tr><tr><td>XL1 - Blue Competent Cells</td><td>Agilent Technologies, Inc</td><td>200249</td><td></td></tr><tr><td>Yeast Extract</td><td>Difco</td><td>0127-01-7</td><td></td></tr><tr><td>Econo-Pack chromatography column</td><td>Bio-Rad</td><td>7321010</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN TGX Stain-Free Precast Gels</td><td>Bio-Rad</td><td>17000436</td><td></td></tr><tr><td>pFastBac1 Expression Vector</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>10360-014</td><td></td></tr><tr><td>DH10Bac Competent Cells</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>10361-012</td><td></td></tr><tr><td>Critiseal capillary tube sealant</td><td>Leica Microsystems</td><td>02-676-20</td><td></td></tr><tr><td>ABI Model 3130XL Genetic Analyzers</td><td>Applied Biosystems</td><td>4359571</td><td></td></tr><tr><td>Transfer pipete</td><td>Fishebrand</td><td>13-711-9AM</td><td></td></tr><tr><td>Nanoject II</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-204</td><td></td></tr></tbody></table>

purification and reconstitution of trpv1 for spectroscopic analysis

Polymodal 이온 채널 transduce 다른 성격의 여러 자극에 allosteric 변화; 이러한 동적 conformations 확인 하 고 크게 불명 하 게 남아 도전입니다. 주 작동 근 바인딩 사이트의 구조적 특징 및 여러 이온 채널의 활성화 메커니즘에 단일 입자 cryo 전자 현미경 검사 법 (cryo-EM) 발산 빛의 최근 발전, 무대는 그들의 게이팅의 깊이 있는 동적 분석에 대 한 설정 분 광 방법을 사용 하 여 기계 장치입니다. 이중 전자-전자 공명 (사슴)와 전자 상자성 공명 (EPR) 분 광 기술을 대량으로 순화 될 수 있는 간결한 이온 채널 연구에 주로 제한 되었습니다. 대량의 기능과 안정적인 막 단백질에 대 한 요구 사항을 이러한 방법을 사용 하 여 포유류 이온 채널 연구를 방해 했다. EPR 및 사슴 이기는 하지만 낮은 해상도에서 엑스레이 결정학 또는 곳을 알아내는-EM 얻으려면 어려울 수 있습니다, 구조 결정 및 모바일 단백질 영역의 동적 변화를 포함 하 여 및 가역 게이팅 모니터링 많은 장점을 제공합니다 (즉, 폐쇄, 오픈, 응, 그리고 desensitized) 전환. 여기, 우리는 기능성 세제 solubilized 일시적 수용 체 잠재적인 양이온 채널 인도의 V 회원 1 (TRPV1) 사슴 및 EPR 분광학에 대 한 분류 수 밀리 그램을 얻기 위한 프로토콜을 제공 합니다.

최소한의 시스테인-덜 TRPV1 구성 (eTRPV1) 및 단일-시스테인 돌연변이의 기능 특성
분 광 연구 향한 첫 번째 단계 엔지니어 및 시스테인-덜 단백질 구조 (그림 2A) 기능 및 단백질의 생 화 확 적인 금액을 산출 하는 특성입니다. eTRPV1는 Ca2 + 이미징 및 TEVC (그림 2B-C)에 의해 결정 된 대로 작동 합니다. 또한, eTRPV1 EPR 및 사슴 실험 (0.5-1 mg Sf9 셀의 리터 당)에 대 한 세제 정화 단백질의 충분 한 양을 제공 한다26. 소개 하는 특정 단백질 영역에서 단일 시스테인 그들의 기능에 영향을 수 있습니다. 그림 2B HEK293 포함 하는 eTRPV1에 TRPV1 길 항 제 (예, capsaicin) 추가 될 때 그들의 형광 강도 증가 때문에 야생 유형 (WT) 처럼 동작 하는 eTRPV1에 단일-시스테인 돌연변이 (E651C 및 A702C)의 몇 가지 예를 보여 줍니다. 셀, 캘리포니아2 + 26영상에서 같이. 다른 한편으로, A680C로 형광은 배경에서 구별할 수 비 기능 시스테인 돌연변이의 전형적인 예입니다. A680C 돌연변이 추가 분석을 위해 제외 되었다. 후 Ca2 + 이미징 실험, 단일-시스테인 돌연변이 기능 그들의 생물 속성을 평가 하기 위해 TEVC 또는 패치 클램프를 사용 하 여 테스트 됩니다. 그림 2C 돌연변이 바깥쪽 정류 TRPV1 TEVC26정한 ph 5, 도전 때의 특성을 정리를 보여 줍니다. 단일-시스테인 돌연변이의 기능 분석 식 및 정화 프로토콜을 착수 하기 전에 첫 번째 검사점입니다.
ETRPV1 단일-시스테인 돌연변이의 생 화 확 적인 특성
위에서 설명한 정화 프로토콜 TRPV1 순서를 따라 시스테인 화학식 수정 (예:fluorophores, 회전 표시 [SL] 메 틸-methanethiolsulfonate)를 통해 표시 될 수 있다 세제 solubilized 단백질 생성 분 광 분석입니다. 최소 TRPV1 시스테인 잔류물을 포함 하는 채널 안정 및 단 분산 종족으로 마이그레이션 (~ 13.6 mL), 크기 배제 크로마토그래피 (그림 3)에 의해 결정. eTRPV1 및 단일-시스테인 스핀 표시 된 돌연변이 (E651C-SL와 SL A702C) 최소한의 TRPV1 구조 (그림 3)26여 보안과 차입 프로필 정리. 차입 프로필 단일 시스테인 단백질 안정성에 영향을 미칠 수 있습니다. 다른 뮤턴트 들 다 수 있습니다. 어떤 경우에 돌연변이 형성 집계; 그리고 샘플의 분수 수 열 (8-9.5 mL), (그림 3, 빨간색 아래쪽 화살표) tetramer로 마이그레이션합니다 단백질의 양을 감소의 무효 볼륨에 elute. 이 경우에, 셀 문화 볼륨 집계 분수 또는 하나에 단백질 추가 분석에서이 돌연변이 제외 하 고 이웃 잔류물 테스트 진행 수에 대 한 보상 확장할 수 있습니다. 다른 예로 tetramer에 해당 하는 피크의 확대. 그들은 멀티 포함 주요 봉우리 3 mL 보다 넓은 분 광 분석에 대 한 권장 하지 않습니다-종 분산. 스핀 표시 된 단일-시스테인 돌연변이의 생 화 확 적인 특성화 사업 재구성 및 분 광 분석 하기 전에 두 번째 검사점입니다.
기능 특성의 재구성 회전 표시 된 eTRPV1 단일-시스테인 돌연변이
EPR 및 사슴 신호 시스테인 잔류물을 상자성 스핀 라벨 부착에 의존 하기 때문에 그건 스핀-라벨의 위치 단백질 기능 변경 여부를 확인 하는 것이 중요. 회전 표시 된 단백질, 평면 지질 bilayer 실험, 패치 클램프, 및 TEVC를 포함 하 여 재구성 후 기능에 대 한 테스트 하는 방법은 여러 가지가 있습니다. TEVC는 거시적인 전류를 기록 하는 동안 회전 표시 된 채널의 다 수의 평가 허용 한다. 회전 표시 된 단일-시스테인 돌연변이의 기능을 평가 하기 위해 채널은 미리 형성 된 asolectin 리에서 재구성 된다. 이 단계는 정화를 통해 글리세롤 리로 단백질 재구성의 효율성 감소 이후 10% 글리세롤을 제외 하는 것이 중요입니다. 그림 4 는 대표 A702C SL TRPV1의 결과 asolectin 리 재구성 및 Xenopus oocytes에 microinjected. 예상 했던 대로, pH 5 elicits 강력한 겉으로 정류 전류37 TRPV1 길 항 제 (CPZ, 블루 추적) capsazepine26의 공동 응용 프로그램에 의해 차단 되는. 스핀 라벨 및 재구성 후 기능을 유지 하지 않는 돌연변이 추가 분석에서 제외 해야 합니다. 재구성된 스핀 표시 된 단일-시스테인 돌연변이의 기능 특성화 사업 분 광 분석 전에 세 번째 검사점입니다.
구조 역학의 회전 표시 된 eTRPV1 돌연변이 의해 모니터링 CW EPR과 사슴
Nitroxide 스핀 라벨은 주변 환경에 민감한 고 라벨은 단백질 백본의 유연성 첨부17. 따라서, CW-EPR 수 주어진된 회전 표시 된 시스테인;의 동적 처방의 결정 즉, 위치 수성 미디어 나 막에 노출 되는 단백질 단백질 상호 작용17제한 보다 더 역동적인. 그림 5A TRPV1 이동성 매개 변수를 모니터링 하도록 선택의 Glu651, Ile679, 및 Ala702 위치를 보여줍니다. 스핀 레이블 프로브의 이동성 매개 변수를 계산 하려면 하나 (그림 5B, 검은 선 ΔHo−1) 첫 번째 파생 흡수 스펙트럼의 중앙 선 두께의 역을 계산 합니다. 예를 들어, E651C-SL (그림 5B)는 괴기 한 선 모양 및 이동성 값을 표시 (0.24) 막 인터페이스26동적 위치에 일반적으로 발견 합니다. 다른 한편으로, I679C-SL와 SL A702C (점선 참조) 스펙트럼과 이동성 값 감소의 확장을 전시 (0.16 및 0.18, 각각; 그림 5B) 26 곳을 알아내는-EM 구조1에 따르면 그들의 제한 된 주변 환경 (단백질)와 일치 하는.
그림 5C asolectin 리에서 재구성 후 회전 표시 TRPV1 돌연변이의 스펙트럼을 보여준다. 예상 했던 대로, 그들의 모양 및 이동성 값은 막 환경26에서 솔루션에 동일 E651C SL와 SL A702C에 대 한 스펙트럼의 동적 기능 재구성, 후 변화 하지 않았다. 다른 한편으로, I679C-SL 보여줍니다 시끄러운 스펙트럼을; 따라서, (파란색 화살표)과 높은 (빨간 화살표) 필드 구성 요소 덜 분명 되었다. 시끄러운 스펙트럼은 하지 일반적으로 원하는, 그들은 회전 표시 위치 이동성을 과소 평가 하는 경향이. 강력한 솔루션에서 I679C SL 신호 이므로 이와 같은 스펙트럼에서-라벨, 보다는 오히려 비효율적인 단백질 재구성의 제품 수 있습니다.
사슴 데이터 합계 진동, 정현파 신호 부패 한다 상호 작용 스핀 레이블38,39의 거리 배포에 대 한 정보를 포함 하는. 기간 및 복잡 한 감퇴의 직접 기본 거리 분포를 반영 한다. 거리 유통 구조 부품 샘플 및 그들의 장애에 수 구성 됩니다. 시간 영역 신호는 배위에서 파생 하는 따라서, 일반적으로 배경 지 수 감퇴 원인이 솔루션에 고정 되지 않은, 먼 스핀 레이블 사이의 커플링, andrigidly 결합 같은 단백질19,40내 스핀. 특히, 사슴 스핀 표시 된 잔류물19사이 내 단백 장거리 거리 (20-70 Å)의 결정을 허용 한다. 그림 6 신호 감퇴 E651C SL의 해당 거리 배포를 보여 줍니다. Glu651의 분포는 24, 36, 및 58 Å26에 해당 하는 3 개의 봉우리를 보여줍니다. 닫힌된 TRPV1 구조와 일치 하는 두 개의 짧은 거리 (23, 32 Å Cβ Cβ 거리, 각각)1, 반면 3 58 Å 피크 단백질 집계 일치 수도 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57796/57796fig1.jpg"> 그림 1입니다. 실험 개요. 표현, 정화, 및 EPR 및 사슴에 대 한 eTRPV1를 다시 구성 하는 데 필요한 실험 개요의 도표. <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57796/57796fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57796/57796fig2.jpg"> 그림 2입니다. ETRPV1 및 단일-시스테인 돌연변이의 기능 특성. (A)의 분 광 분석에 사용 되는 TRPV1 구문 도식 표현 (eTRPV1: 시스테인-덜 TRPV1 110-603/627-764). (B) HEK293 세포 표현 WT TRPV1, eTRPV1, 및 돌연변이 (Ca2 +로드-민감한 Fluo-4-오전) capsaicin (10 µ M)에 대 한 분석 했다-형광 캘리포니아2 + 이미지를 사용 하 여 응답을 불러 일으켰다. 색상 막대 형광 강도, 블루와 레드 최저 / 최고를 나타내는 상대적 변화를 나타냅니다 세포질 캘리포니아2 +, 각각. 흰색 바 100 µ m. (C) 왼쪽, TRPV1 tetramer 구조 단일-시스테인 잔류물 (노란색 구체) 채널 시퀀스에 따라 도입 강조의 1 개의 소 단위 (S5, 기 공 나선, S6 및 TRP 도메인)를 나타냅니다. 오른쪽, 전류-전압 관계 Xenopus oocytes WT TRPV1, eTRPV1, 및 단일-시스테인 돌연변이 ph 5 도전 표현에서 TEVC 기록에 의해 결정 됩니다. 백그라운드 전류 (bkgrd)입니다. 원래 그림26에서 수정. <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57796/57796fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57796/57796fig3.jpg"> 그림 3입니다. ETRPV1 및 단일-시스테인 돌연변이의 생 화 확 적인 특성화 크기 배제 크로마토그래피 DDM solubilized eTRPV1 및 단일-시스테인 스핀 표시 된 돌연변이 식 및 Sf9 세포에서 정화 후의 프로 파일. 삽입: SDS 페이지 젤 (원래 그림26에서 수정) 단위체 eTRPV1 MBP 융합 단백질을 보여주는. <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57796/57796fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57796/57796fig4.jpg"> 그림 4입니다. 회전 표시 eTRPV1 돌연변이의 기능 특성화 A702C ph 5 (레드) 도전 및 capsazepine에 의해 차단 전류-전압 관계 Xenopus oocytes 스핀 표시 된 포함 하는 proteoliposomes와 microinjected에서 TEVC에 의해 결정 (CPZ, 블루: 40 µ M). 백그라운드 전류 (bkgrd)입니다. 원래 그림26에서 수정. <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57796/57796fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57796/57796fig5.jpg"> 그림 5입니다. CW-EPR에 의해 결정 하는 회전 표시 eTRPV1 돌연변이의 mobilities. 스핀 라벨 spectroscopies 사이트 감독을 통해 조사 하 여 아미노산 잔류물 (노란색 구체)를 강조 하는 TRPV1 tetramer 구조 (A) 2 subunits (S5, 기 공 나선, S6 및 TRP 도메인) DDM-솔루션에 스핀 표시 된 시스테인 돌연변이의 CW EPR 스펙트럼의 (B) 첫 번째 파생. (C) 회전 표시 된 시스테인 돌연변이 asolectin 리 재구성의 CW EPR 스펙트럼의 첫 파생. 스펙트럼은 pH 7.4 (닫힌된 상태)에서 얻은 했다. ΔHo−1 는 이동성 매개 변수의 크기를 나타냅니다. 검은 점선은 스펙트럼의 확대를 강조 표시 합니다. 파란색과 빨간색 화살표는 스펙트럼의 낮고 높은 필드 구성 요소를 각각 나타냅니다. EPR 스펙트럼 스핀 라벨의 총 수를 정상화 했다. 원래 그림26에서 수정. <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57796/57796fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57796/57796fig6.jpg"> 그림 6입니다. 세제에는 eTRPV1 돌연변이의 거리 분포입니다. 사슴 에코 (A)와 거리 배포 (B) 스핀 표시 된 돌연변이 E651C; 가우시안의 합계는 사슴 데이터에 장착 했다. P(r) 스핀 쌍41의 거리 배포를 나타냅니다. 스펙트럼은 pH 7.4 (닫힌된 상태)에서 얻은 했다. 원래 그림26에서 수정. <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57796/57796fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

정화 및 분 광 분석에 대 한 TRPV1의 재구성

이 문서에는 분 광 분석에 대 한 세제 solubilized TRPV1의 생 화 확 적인 수량을 얻기 위해 특정 방법을 설명 합니다. 결합 된 프로토콜 막 제어 환경에서 포유류 이온 채널에 대 한 구조 및 기능 연구를 촉진 하기 위하여 적응 시킬 수 있다 생 화 확 및 생물 도구를 제공 합니다.

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

purification-and-reconstitution-of-trpv1-for-spectroscopic-analysis

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

7.9K 조회수.  University of Tennessee Health Science Center. 이 문서에는 분 광 분석에 대 한 세제 solubilized TRPV1의 생 화 확 적인 수량을 얻기 위해 특정 방법을 설명 합니다. 결합 된 프로토콜 막 제어 환경에서 포유류 이온 채널에 대 한 구조 및 기능 연구를 촉진 하기 위하여 적응 시킬 수 있다 생 화 확 및 생물 도구를 제공 합니다.

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Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be investigated through electrophysiological analysis, biochemical characterization, mutational studies, and their effects on cellular processes. Transient transfections offer a simple protocol in which the protein becomes available for analysis within a few hours to days. Although this method presents a relatively straightforward and time efficient protocol, one of the critical components is calibrating the expression of the gene of interest to physiological relevant levels or levels that are suitable for analysis. To this end, many different approaches that offer the ability to control the expression of the gene of interest have emerged. Several stable cell transfection protocols provide a way to permanently introduce a gene of interest into the cellular genome under the regulation of a tetracycline-controlled transcriptional activation. While this technique produces reliable expression levels, each gene of interest requires a few weeks of skilled work including calibration of a killing curve, selection of cell colonies, and overall more resources. Here we present a protocol that uses transient transfection of the Transient Receptor Potential cation channel subfamily V member 1 (TRPV1) gene in an inducible system as an efficient way to express a protein in a controlled manner which is essential in ion channel analysis. We demonstrate that using this technique, we are able to perform calcium imaging, whole cell, and single channel analysis with controlled channel levels required for each type of data collection with a single transfection. Overall, this provides a replicable technique that can be used to study ion channels structure and function.

Studying ion channels through a heterologously expressing system has become a core technique in biomedical research. In this manuscript, we present a time efficient method to achieve tightly controlled ion channel expression by performing transient transfection under the control of an inducible promoter.

유도 성 과도 형질을 통해 제어 이온 채널 식

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

연구

유전학

Proton Transfer and Protein Conformation Dynamics in Photosensitive Proteins by Time-resolved Step-scan Fourier-transform Infrared Spectroscopy

Monitoring the dynamics of protonation and protein backbone conformation changes during the function of a protein is an essential step towards understanding its mechanism. Protonation and conformational changes affect the vibration pattern of amino acid side chains and of the peptide bond, respectively, both of which can be probed by infrared (IR) difference spectroscopy. For proteins whose function can be repetitively and reproducibly triggered by light, it is possible to obtain infrared difference spectra with (sub)microsecond resolution over a broad spectral range using the step-scan Fourier transform infrared technique. With ~102-103 repetitions of the photoreaction, the minimum number to complete a scan at reasonable spectral resolution and bandwidth, the noise level in the absorption difference spectra can be as low as ~10-4, sufficient to follow the kinetics of protonation changes from a single amino acid. Lower noise levels can be accomplished by more data averaging and/or mathematical processing. The amount of protein required for optimal results is between 5-100 &#181;g, depending on the sampling technique used. Regarding additional requirements, the protein needs to be first concentrated in a low ionic strength buffer and then dried to form a film. The protein film is hydrated prior to the experiment, either with little droplets of water or under controlled atmospheric humidity. The attained hydration level (g of water / g of protein) is gauged from an IR absorption spectrum. To showcase the technique, we studied the photocycle of the light-driven proton-pump bacteriorhodopsin in its native purple membrane environment, and of the light-gated ion channel channelrhodopsin-2 solubilized in detergent.

Key steps of protein function, in particular backbone conformational changes and proton transfer reactions, often take place in the microsecond to millisecond time scale. These dynamical processes can be studied by time-resolved step-scan Fourier-transform infrared spectroscopy, in particular for proteins whose function is triggered by light.

에 의해 감광성​​ 단백질의 양성자 이동과 단백질 입체 구조 역학 시간 분해 적외선 분광학에게 푸리에 변환 단계 - 스캔

Monitoring the dynamics of protonation and protein backbone conformation changes during the function of a protein is an essential step towards ...

공학

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium homeostasis, particularly store-operated calcium entry, which is critical to maintaining proper function of synaptic vesicle release and intracellular signaling pathways. Accordingly, TRPC channels have been implicated in a variety of human diseases including cardiovascular disorders such as cardiac hypertrophy, neurodegenerative disorders such as Parkinson&#39;s disease, and neurologic disorders such as spinocerebellar ataxia. Therefore, TRPC channels represent a potential pharmacologic target in human diseases. However, the molecular mechanisms of gating in these channels are still unclear. The difficulty in obtaining large quantities of stable, homogeneous, and purified protein has been a limiting factor in structure determination studies, particularly for mammalian membrane proteins such as the TRPC ion channels. Here, we present a protocol for the large-scale expression of mammalian ion channel membrane proteins using a modified baculovirus gene transfer system and the purification of these proteins by affinity and size-exclusion chromatography. We further present a protocol to collect single-particle cryo-electron microscopy images from purified protein and to use these images to determine the protein structure. Structure determination is a powerful method for understanding the mechanisms of gating and function in ion channels.

This protocol describes techniques used to determine ion channel structures by cryo-electron microscopy, including a baculovirus system used to efficiently express genes in mammalian cells with minimum effort and toxicity, protein extraction, purification, and quality checking, sample grid preparation and screening, as well as data collection and processing.

식 및 단일 입자 Cryo 전자 현미경 검사 법에 의하여 구조 결심에 대 한 인간의 지질 민감한 양이온 채널 TRPC3의 정화

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

생화학

Proteomics to Identify Proteins Interacting with P2X2 Ligand-Gated Cation Channels

Ligand-gated ion channels underlie synaptic communication in the nervous system1. In mammals there are three families of ligand-gated channels: the cys loop, the glutamate-gated and the P2X receptor channels2. In each case binding of transmitter leads to the opening of a pore through which ions flow down their electrochemical gradients. Many ligand-gated channels are also permeable to calcium ions3, 4, which have downstream signaling roles5 (e.g. gene regulation) that may exceed the duration of channel opening. Thus ligand-gated channels can signal over broad time scales ranging from a few milliseconds to days. Given these important roles it is necessary to understand how ligand-gated ion channels themselves are regulated by proteins, and how these proteins may tune signaling. Recent studies suggest that many, if not all, channels may be part of protein signaling complexes6. In this article we explain how to identify the proteins that bind to the C-terminal aspects of the P2X2 receptor cytosolic domain.
P2X receptors are ATP-gated cation channels and consist of seven subunits (P2X1-P2X7). P2X receptors are widely expressed in the brain, where they mediate excitatory synaptic transmission and presynaptic facilitation of neurotransmitter release7. P2X receptors are found in excitable and non-excitable cells and mediate key roles in neuronal signaling, inflammation and cardiovascular function8. P2X2 receptors are abundant in the nervous system9 and are the focus of this study. Each P2X subunit is thought to possess two membrane spanning segments (TM1 &amp; TM2) separated by an extracellular region7 and intracellular N and C termini (Fig 1a)7. P2X subunits10 (P2X1-P2X7) show 30-50% sequence homology at the amino acid level11. P2X receptors contain only three subunits, which is the simplest stoichiometry among ionotropic receptors. The P2X2 C-terminus consists of 120 amino acids (Fig 1b) and contains several protein docking consensus sites, supporting the hypothesis that P2X2 receptor may be part of signaling complexes. However, although several functions have been attributed to the C-terminus of P2X2 receptors9 no study has described the molecular partners that couple to the intracellular side of this protein via the full length C-terminus. In this methods paper we describe a proteomic approach to identify the proteins which interact with the full length C-terminus of P2X2 receptors.

We describe a simple protocol to identify brain proteins that bind to the full length C terminus of ATP-gated P2X2 receptors. The extension and systematic application of this approach to all P2X receptors is expected to lead to a better understanding of P2X receptor signaling.

P2X2 리간드 - 게이 티드 양이온 채널과 상호 작용하는 단백질을 확인하는 Proteomics

Ligand-gated ion channels underlie synaptic communication in the nervous system1. In mammals there are three families of ligand-gated channels: the cys ...

생물학

Strategic Screening and Characterization of the Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex for Successful Crystallization

The key to determining crystal structures of membrane protein complexes is the quality of the sample prior to crystallization. In particular, the choice of detergent is critical, because it affects both the stability and monodispersity of the complex. We recently determined the crystal structure of an active state of bovine rhodopsin coupled to an engineered G protein, mini-Go, at 3.1 &#197; resolution. Here, we detail the procedure for optimizing the preparation of the rhodopsin&#8211;mini-Go complex. Dark-state rhodopsin was prepared in classical and neopentyl glycol (NPG) detergents, followed by complex formation with mini-Go under light exposure. The stability of the rhodopsin was assessed by ultraviolet-visible (UV-VIS) spectroscopy, which monitors the reconstitution into rhodopsin of the light-sensitive ligand, 9-cis retinal. Automated size-exclusion chromatography (SEC) was used to characterize the monodispersity of rhodopsin and the rhodopsin&#8211;mini-Go complex. SDS-polyacrylamide electrophoresis (SDS-PAGE) confirmed the formation of the complex by identifying a 1:1 molar ratio between rhodopsin and mini-Go after staining the gel with Coomassie blue. After cross-validating all this analytical data, we eliminated unsuitable detergents and continued with the best candidate detergent for large-scale preparation and crystallization. An additional problem arose from the heterogeneity of N-glycosylation. Heterologously-expressed rhodopsin was observed on SDS-PAGE to have two different N-glycosylated populations, which would probably have hindered crystallogenesis. Therefore, different deglycosylation enzymes were tested, and endoglycosidase F1 (EndoF1) produced rhodopsin with a single species of N-glycosylation. With this strategic pipeline for characterizing protein quality, preparation of the rhodopsin&#8211;mini-Go complex was optimized to deliver the crystal structure. This was only the third crystal structure of a GPCR&#8211;G protein signaling complex. This approach can also be generalized for other membrane proteins and their complexes to facilitate sample preparation and structure determination.

This report describes screening of different detergents for preparing the visual GPCR, rhodopsin, and its complex with mini-Go. Biochemical methods characterizing the quality of the complex at different stages during purification are demonstrated. This protocol can be generalized to other membrane protein complexes for their future structural studies.

성공적인 결정화를 위한 시각적 GPCR-mini-G 단백질 신호 복합체의 전략적 스크리닝 및 특성화

The key to determining crystal structures of membrane protein complexes is the quality of the sample prior to crystallization. In particular, the choice ...

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen Presenting Cells (APCs). This is despite T-cell antigen receptors (TCRs) exerting usually a moderate affinity (&#181;M range) to antigen when binding is measured in vitro1. In view of the molecular and cellular parameters contributing to T-cell antigen sensitivity, a microscopy-based methodology has been developed as a means to monitor TCR-pMHC binding in situ, as it occurs within the synapse of a live T-cell and an artificial and functionalized glass-supported planar lipid bilayer (SLB), which mimics the cell membrane of an Antigen presenting Cell (APC) 2. Measurements are based on F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) between a blue- and red-shifted fluorescent dye attached to the TCR and the pMHC. Because the efficiency of FRET is inversely proportional to the sixth power of the inter-dye distance, one can employ FRET signals to visualize synaptic TCR-pMHC binding. The sensitive of the microscopy approach supports detection of single molecule FRET events. This allows to determine the affinity and off-rate of synaptic TCR-pMHC interactions and in turn to interpolate the on-rate of binding. Analogous assays could be applied to measure other receptor-ligand interactions in their native environment.

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

This manuscript describes how to conduct (single molecule) F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)- based assays to measure the binding dynamics between T-cell antigen receptor (TCR) and antigenic peptide-loaded MHC molecules as they occur within the immunological synapse of a T-cell in contact with a functionalized planar supported lipid bilayer.

TCR-pMHC 바인딩 측정<em&gt; 현장에서</em&gt; FRET 기반의 현미경 분석을 사용하여

T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen ...

생체공학

Purification of Endogenous Drosophila Transient Receptor Potential Channels

Drosophila phototransduction is one of the fastest known G protein-coupled signaling pathways. To ensure the specificity and efficiency of this cascade, the calcium (Ca2+)-permeable cation channel, transient receptor potential (TRP), binds tightly to the scaffold protein, inactivation-no-after-potential D (INAD), and forms a large signaling protein complex with eye-specific protein kinase C (ePKC) and phospholipase C&#946;/No receptor potential A (PLC&#946;/NORPA). However, the biochemical properties of the Drosophila TRP channel remain unclear. Based on the assembling mechanism of INAD protein complex, a modified affinity purification plus competition strategy was developed to purify the endogenous TRP channel. First, the purified histidine (His)-tagged NORPA 863-1095 fragment was bound to Ni-beads and used as bait to pull down the endogenous INAD protein complex from Drosophila head homogenates. Then, excessive purified glutathione S-transferase (GST)-tagged TRP 1261-1275 fragment was added to the Ni-beads to compete with the TRP channel. Finally, the TRP channel in the supernatant was separated from the excessive TRP 1261-1275 peptide by size-exclusion chromatography. This method makes it possible to study the gating mechanism of the Drosophila TRP channel from both biochemical and structural angles. The electrophysiology properties of purified Drosophila TRP channels can also be measured in the future.

Purification of Endogenous Drosophila Transient Receptor Potential Channels

Based on the assembling mechanism of the INAD protein complex, in this protocol, a modified affinity purification plus competition strategy was developed to purify the endogenous Drosophila TRP channel.

내인성 초파리 일시적인 수용체 잠재적 채널의 정제

Drosophila phototransduction is one of the fastest known G protein-coupled signaling pathways. To ensure the specificity and efficiency of this cascade, ...

Mass-Sensitive Particle Tracking to Characterize Membrane-Associated Macromolecule Dynamics

Short-lived or transient interactions of macromolecules at and with lipid membranes, an interface where a multitude of essential biological reactions take place, are inherently difficult to assess with standard biophysical methods. The introduction of mass-sensitive particle tracking (MSPT) constitutes an important step toward a thorough quantitative characterization of such processes. Technically, this was made possible through the advent of interferometric scattering microscopy (iSCAT)-based mass photometry (MP). When the background removal strategy is optimized to reveal the two-dimensional motion of membrane-associated particles, this technique allows the real-time analysis of both diffusion and molecular mass of unlabeled macromolecules on biological membranes. Here, a detailed protocol to perform and analyze mass-sensitive particle tracking of membrane-associated systems is described. Measurements performed on a commercial mass photometer achieve time resolution in the millisecond regime and, depending on the MP system, a mass detection limit down to 50 kDa. To showcase the potential of MSPT for the in-depth analysis of membrane-catalyzed macromolecule dynamics in general, results obtained for exemplary protein systems such as the native membrane interactor annexin V are presented.

This protocol describes an iSCAT-based image processing and single-particle tracking approach that enables the simultaneous investigation of the molecular mass and the diffusive behavior of macromolecules interacting with lipid membranes. Step-by-step instructions for sample preparation, mass-to-contrast conversion, movie acquisition, and post-processing are provided alongside directions to prevent potential pitfalls.

막과 관련된 거대분자 역학을 특성화하기 위한 질량 민감성 입자 추적

Short-lived or transient interactions of macromolecules at and with lipid membranes, an interface where a multitude of essential biological reactions take ...

Single-Molecule Imaging of Lateral Mobility and Ion Channel Activity in Lipid Bilayers using Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy

High-resolution imaging techniques have shown that many ion channels are not static, but subject to highly dynamic processes, including the transient association of pore-forming and auxiliary subunits, lateral diffusion, and clustering with other proteins. However, the relationship between lateral diffusion and function is poorly understood. To approach this problem, we describe how lateral mobility and activity of individual channels in supported lipid membranes can be monitored and correlated using total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Membranes are fabricated on an ultrathin hydrogel substrate using the droplet interface bilayer (DIB) technique. Compared to other types of model membranes, these membranes have the advantage of being mechanically robust and suitable for highly sensitive analytical techniques. This protocol measures Ca2+ ion flux through single channels by observing the fluorescence emission of a Ca2+-sensitive dye in close proximity to the membrane. In contrast to classical single-molecule tracking approaches, no fluorescent fusion proteins or labels, which can interfere with lateral movement and function in the membrane, are required. Possible changes in ion flux associated with conformational changes of the protein are only due to protein lateral motion in the membrane. Representative results are shown using the mitochondrial protein translocation channel TOM-CC and the bacterial channel OmpF. In contrast to OmpF, the gating of TOM-CC is very sensitive to molecular confinement and the nature of lateral diffusion. Hence, supported droplet-interface bilayers are a powerful tool to characterize the link between lateral diffusion and the function of ion channels.

Single-Molecule Imaging of Lateral Mobility and Ion Channel Activity in Lipid Bilayers using Total Internal Reflection Fluorescence TIRF Microscopy

This protocol describes how to use TIRF microscopy to track individual ion channels and determine their activity in supported lipid membranes, thereby defining the interplay between lateral membrane movement and channel function. It describes how to prepare the membranes, record the data, and analyze the results.

TIRF(Total Internal Reflection Fluorescence) 현미경을 사용한 지질 이중층의 측면 이동성 및 이온 채널 활성에 대한 단일 분자 이미징

High-resolution imaging techniques have shown that many ion channels are not static, but subject to highly dynamic processes, including the transient ...

Yeast Luminometric and Xenopus Oocyte Electrophysiological Examinations of the Molecular Mechanosensitivity of TRPV4

TRPV4 (Transient Receptor Potentials, vanilloid family, type 4) is widely expressed in vertebrate tissues and is activated by several stimuli, including by mechanical forces. Certain TRPV4 mutations cause complex hereditary bone or neuronal pathologies in human. Wild-type or mutant TRPV4 transgenes are commonly expressed in cultured mammalian cells and examined by Fura-2 fluorometry and by electrodes. In terms of the mechanism of mechanosensitivity and the molecular bases of the diseases, the current literature is confusing and controversial. To complement existing methods, we describe two additional methods to examine the molecular properties of TRPV4. (1) Rat TRPV4 and an aequorin transgene are transformed into budding yeast. A hypo-osmtic shock of the transformant population yields a luminometric signal due to the combination of aequorin with Ca2+, released through the TRPV4 channel. Here TRPV4 is isolated from its usual mammalian partner proteins and reveals its own mechanosensitivity. (2) cRNA of TRPV4 is injected into Xenopus oocytes. After a suitable period of incubation, the macroscopic TRPV4 current is examined with a two-electrode voltage clamp. The current rise upon removal of inert osmoticum from the oocyte bath is indicative of mechanosensitivity. The microAmpere (10-6 to 10-4 A) currents from oocytes are much larger than the subnano- to nanoAmpere (10-10 to 10-9 A) currents from cultured cells, yielding clearer quantifications and more confident assessments. Microscopic currents reflecting the activities of individual channel proteins can also be directly registered under a patch clamp, in on-cell or excised mode. The same oocyte provides multiple patch samples, allowing better data replication. Suctions applied to the patches can activate TRPV4 to directly assess mechanosensitivity. These methods should also be useful in the study of other types of TRP channels.

Yeast Luminometric and Xenopus Oocyte Electrophysiological Examinations of the Molecular Mechanosensitivity of TRPV4

To complement commonly used methods to study TRPV4&#8217;s, two methods are described: Its mechanosensitivity can be studied by Ca2+-aequorin luminometry in transgenic yeast upon hypo-osmotic challenge. It can also be examined in TRPV4-RNA injected Xenopus oocytes by whole-cell two-electrode voltage clamp or patch clamp in on-cell or excised mode.

효모 Luminometric 및<em&gt; Xenopus의</emTRPV4의 분자 Mechanosensitivity의&gt; 난자 전기 생리 시험

TRPV4 (Transient Receptor Potentials, vanilloid family, type 4) is widely expressed in vertebrate tissues and is activated by several stimuli, including ...

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