이 작품은 Krembil 재단 (운영 보조금 CMM)에 의해 자금을. WX 칼튼 마가렛 스미스 학생 상 받는 했다. NL는 온타리오 대학원 장학금을 받았다.

이 프로토콜 토론토 대학에서 동물 관리 위원회에 의해 승인 되었다 하 고 "가이드에는 관리 및 사용의 실험 동물"은 (2차 버전, 동물 관리에 캐나다 위원회 2017).
1. 최소한의 척수 상해 수술
참고: 수술 전에 있는지 확인 하십시오 모든 수술 기구와 자료 (그림 1A)는 적절 한 방법으로 살 균 된다.
<ol><li>거 즈의 4-5 사각형을 고를 거 즈의 고정된 롤 중간에 그들을 함께 찍고 여 흉부 지원 아치를 구축 합니다.</li>
	<li>유도 챔버에 마우스를 놓고 5 %isoflurane 마 취를 시작 합니다. 진행 하기 전에, 뿐만 아니라 절차 전체 발가락 핀치 반사의 부재를 확인 합니다. 으로 수술 완료 하는 데 30 분 이상 걸릴 수 있습니다, 5% (5 분)와 남은 시간 2-3%에서 최소 isoflurane 노출에 대 한 최적화.</li>
	<li>코 콘 2-3 %isoflurane 유지 보수 복용량 마 취 기계에 연결 된 마우스를 전송 합니다. 발기를 사용 하 여 중간 다시 목/귀 수술에 대 한 피부의 넓은 직사각형 영역을 노출 하에서 동물의 등에서 털을 제거 하.</li>
	<li>연결 된 원뿔에 그것의 코를 놓고 귀 바 두개골 안정화 stereotaxic 악기를 마우스를 전송. 마우스 stereotaxic 장치에 고정 되 면 5%에서 isoflurane 귀 바 및 2-3%를 다시 배치 하는 동안 유지 합니다.</li>
	<li>Intraperitoneally 수술 전 진통 약물 관리-Meloxicam (2.0 mg/kg). 아낌없이 눈 윤 활 때 취 각 막 건조 방지 하기 위해 오픈 마우스 눈에 적용 됩니다.</li>
	<li>꼬리의 기지에 가볍게 당겨서 마우스 신체 및 척추 교정 하는 동안 마우스 복 부 아래 흉부 지원 아치를 놓습니다. 실험실 라벨 테이프를 사용 하 여 꼬리와 스타 같은 위치에 모든 확장된 사지. 일단 보안, 흉부 지원 아치 rostrally,에서 밀어 위쪽 흉부 쪽으로 마우스 복 부-소품 흉부 척추 (그림 1B)를 위해.</li>
	<li>Povidone-요오드 뒤 70% 에탄올, 단계 1.3에서에서 준비 모피 잘린 피부 영역을 소독 하 여 무 균 수술 필드를 준비 합니다. 두 번 반복 합니다. 넓은 살 균 분야를 유지 하는 불 임 수술 드 레이프를 적용 합니다.</li>
	<li>#10 메스 블레이드를 사용 하 여, 수직 절 개를 두 어깨에 날개의 중간 지점에서 동물의 종 축에 평행 하 게 흉부 척추의 곡률. 피부 연 조직와 척추 컨투어가 (그림 1C)을 철회.</li>
	<li>(이 정하는 T4/5 척추 수준) suprascapular 지방 패드의 아래쪽 테두리를 식별 합니다. 동일한 #10 블레이드, 신중 하 게 하지만 강제로 잘라 양쪽 열에서 다시 근육 힘 줄을 분리 하려면 척추 뼈 T5-T8/9.</li>
	<li>척추의 양쪽에 절 개 사이트에 견인 기의 치아를 삽입 합니다. 충분히 끌어 넣어진된 근육 층 (그림 1D)에 너무 많은 부담을 주지 않고 척추를 상승 견인 기를 확장 하 여 노출을 조정 합니다.</li>
	<li>수술 현미경 잔여 근육과 척추 뼈 (그림 1E) 노출를 overlying 다른 부드러운 조직 청소 신중 하 게. 이빨된 집게와 척추의 spinous 프로세스 clasping 약간 최대 그것을 이동 하 여 제거 되 고 아래로 척추를 식별 합니다. 참고:이 척추 관절의 id를 허용 하 고 관심의 척추 아래 작은 구멍 (척추 foramina)을 노출 해야 합니다.</li>
	<li>곡선 무딘가 위 한 머리, excised를 척추 lamina에 꼬리 노출된 척추 구멍의 양쪽에 삽입 하 고 양측 연결 척추 관절을 잘라.</li>
	<li>lamina를 위쪽으로 들어올리고 격리 하 고 뼈를 제거 lamina의 위 첨부 파일을 차단 합니다. 참고:이 그대로 듀 럴 색 들어 있는 척수 (그림 1 층)을 노출 합니다. 과도 한 있을 수 있습니다 영향을 받는 지역에 1 cm x 1cm 거 즈 precut를 배치 하 여 통제 될 수 있다 출혈 또는 살 균 PBS로 세척.</li>
	<li>랜드마크 역할 등 중간 정 맥 (바늘 베벨 위쪽으로 향하게)와 30 G 바늘 팁의 45 ° 구부러진된 샤프트는 중간의 어느 한쪽에 약 0.5 m m 측면에서 척수 (대략 1 밀리미터 깊은)의 dorsolateral 표면으로 삽입.</li>
	<li>이동 ~ 2 m m 바늘 꼬리에서 rostral는 중간에 (병렬로) 바늘의 베벨의 전체 길이 코드에 삽입 됩니다. 항목 (그림 1G)의 경로 통해 되돌아 바늘을 제거 합니다. 참고: 아무 출혈 해야 하지만이 단계에서 척추 조직의 붓기를 볼 수 있습니다.</li>
	<li>상처를 닫으려면 견인 기를 제거 하 고 6-0 흡수 봉합 사를 사용 하 여 중간에 함께 상해의 양쪽에 다시 근육을 봉합 합니다. 4-0 살 균 실크 봉합 사를 사용 하 여 이후에 overlying 피부를 닫습니다.</li>
	<li>면봉의 끝을 사용 하 여 수술 후 감염을 방지 하기 위해 표면 sutured 스킨의 상단에 항생제 연 고를 적용 합니다. 0.1 mg/kg 피하 체액 (lactated 벨의 솔루션의 1 mL)을 함께 Buprenorphine의 수술 후 진통제를 관리 합니다.</li>
	<li>Isoflurane 기화 기 및 산소를 해제 합니다. 없는 침구와 깨끗 한 장에 장소와 stereotaxic 장치에서 마우스를 제거 합니다.</li>
	<li>케이지 마 취와 모니터 동작을 보 니 다음에서 복구에 대 한 열 램프에서 약 30 ㎝에에서 마우스를 놓습니다. 마우스 해야 5-10 분 이내 그리고 가능한 paresis 또는 깨어 있는 시 꼬리 약점 뒷 다리-다리 기능.</li>
	<li>앞으로 몇 일 동안 마우스 동작을 모니터링 하 고 적절 한 수술 치료 및 진통제 제공 (즉, 매 시, 벨의 솔루션 유체 피하, 0.1 mg/kg buprenorphine 2 lactated 매일 피하 2-3 일, 그리고 적절 한 무게 모니터링에 대 한 x )에 따라 현지 동물 시설 규정을 개별적으로 복구로 다를 수 있습니다.</li>
</ol>2. Neurosphere 분석 결과 해 부
참고: 적절 한 무 균 조직 문화 프로시저를 따릅니다.
<ol><li>효소 솔루션 준비
	<ol>
<li>알 부 민 ovomucoid 억제제 포함 하 유리 병 및 부드럽게 녹아 때까지 소용돌이를 32 mL의 얼의 균형 소금 솔루션 (EBSS)를 추가 합니다.</li>
		<li>미리 나누어진된 papain 유리 유리병에 EBSS의 5 mL을 추가 하 고 해산 하는 37 ° C 물 목욕에. 솔루션이 될 것 이다 (솔루션 1) 취소.</li>
		<li>EBSS의 500 µ L 고 나 유리 유리병 (솔루션 2) 1 mg/mL의 농도를 미리 나누어진된 DNase를 추가. 유리병을 앞뒤로 기울이기로 아주 부드럽게 혼합 하 고 추가이 혼합물의 250 µ L 솔루션 1. 참고: 모든 솔루션 만든 (솔루션 1과 2) 조직의 두 가지의 처리를 위해 충분 하다. 조직의 처리 하는 경우 더 많은 솔루션 준비와 수용.</li>
	</ol></li>
	<li>조직 준비 및 해 부
	<ol>
<li>실험실 정리 마우스 케이지에 isoflurane에 배어 장소와 완전히 마우스 anesthetize에 증기에 대 한 2-3 분을 허용. 다음 녹아웃, 케이지에서 마우스를 제거 하 고 발가락 핀치 반사의 부재를 확인.</li>
		<li>자 궁 경부 전위 무딘 금속 개체 (즉, 금속 케이지 카드) 동물 안락사를 수행 합니다. 스프레이 70% 에탄올과 넉넉한 중반 뒤로 그것의 목에서 안락사 동물.</li>
		<li>두개골의 기지에서가 위를 사용 하 여 머리를 잘라와 바이오 가방에 삭제. 다시 근육과 척추 뼈 윤곽 (그림 2A) 노출의 전체 길이 따라 피부에 절 개를 중간 선을 확인 합니다.</li>
		<li>각 견 갑 골의 중간 부분을 리프트 (즉., 어깨 블레이드-지방 패드를 overlying 식별)가 위를 사용 하 여 부드러운 조직 (견과 척추) 사이 버려야 하 고. 기본 척추 열을 노출 하는 완전히 별도.</li>
		<li>척추의 곡률에 따라 상부 흉부 조리개가 위의 동일한 쌍을 삽입 하 고 연결 된 늑 골, 근육, 및 내부 장기 (그림 2B) 멀리 절단 하 여 척추 열을 격리.</li>
		<li>꼬리 척추 구멍/오프닝으로가 위를 삽입 하 고 하기 (등 쪽 표면)의 양쪽에 척추 관절을 잘라. 그대로 코드를 손상 하지을 특정 주의 분리 했습니다. 원하는 수준까지이 과정을 계속 하거나 코드의 길이 노출 합니다.</li>
		<li>조심 스럽게 잘라 옆으로 척수 조직 일반 인공 척수와 페 트리 접시에 전송 하기 전에 코드에서 확장 하는 spinal nerve(s). 얼음 (그림 2C)에 샘플을 유지.</li>
		<li>해 부 현미경 척수 조직 포함 ~ 2 mm rostral와 부상 사이트에 꼬리를 잘라. 집게의 두 쌍을 사용 하 여 부드럽게 경도 등 쪽과 복 부 균열을 따라 2 반으로 코드를 분리 (그림 2C').</li>
		<li>Microscissors, 부상된 dorsolateral 백색 질 밖으로 잘라. 15 mL 원뿔 튜브에 조각을 넣으십시오.</li>
		<li>들고 겸,으로 아래로 척수의 절반 애타게 하 고 원하는 뇌 영역을 분리 하는 척수의 rostrocaudal 범위에 따라 미세 집게의 다른 쌍을 사용 하는 백색 물질을 제거. 척수의 나머지 절반에 대 한 반복 합니다.</li>
		<li>별도 15 mL 원뿔 튜브로 뇌 조직의 조각을 놓으십시오. Microscissors를 사용 하 고 조심 스럽게 말하다 원뿔 관의 벽에 대 한 조직. 참고: 조직 분리 수정 Papain 분리 시스템 프로토콜23 , 앞에서 설명한 조직 준비 절차24에서 있습니다.</li>
		<li>조직 샘플을 새로운 솔루션 1 (2.1.3 단계)의 2.5 mL을 추가 하 고 30 분 동안 37 ° C에서 로커에.</li>
		<li>부드럽게 1000 µ L 피 펫 팁 솔루션에서 조직 triturate. 실시간에서 5 분에 대 한 300 x g 에서 흐린 세포 현 탁 액을 원심</li>
		<li>얼의 균형 소금 솔루션, ovomucoid 억제제 솔루션 (2.1.1 단계)의 300 µ L의 2.7 mL 솔루션 3 준비와 DNase의 150 µ L 내가 솔루션 (2.1.3 단계).</li>
		<li>단계 (단계 2.2.13)에서 상쾌한 삭제 하 고 이전 단계 (단계 2.2.14)에서 솔루션 3의 1.5 ml resuspend.</li>
		<li>이 새로운 세포 현 탁 액 (단계 2.2.15) 불연속 밀도 그라디언트를 만들 새로운 15 mL 원뿔 튜브에 ovoimucoid 억제제 솔루션 (2.1.1 단계)의 5 mL 위에 레이어. 실시간에서 5 분에 대 한 300 x g 에서 원심 분리기</li>
		<li>상쾌한 삭제 하 고 neurobasal 미디어의 2 mL에 resuspend. 실시간에서 3 분에 대 한 300 x g 에서 원심 분리기</li>
		<li>상쾌한 삭제 하 고 neurobasal 미디어의 1 mL에 resuspend. 서 스 펜 션 뒤에 5 mL의 전체 볼륨에 대 한 미디어의 4 mL 20 µ m 셀 스 트레이너를 사용 하 여 필터링 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>도금
	<ol>
<li>표 피 성장 인자 (20 ng/mL)와 neurobasal 미디어를 보완 하 여 문화 미디어 neurosphere 성장을 위한 준비 / 섬유 아 세포 성장 인자 (20 ng/mL) / 헤 파 린 (2 µ g/mL) [대 한 확실 한 NSCs] 또는 [기본 NSCs]에 대 한 leukemina 억제 요소 (10 ng/mL). 25 mL 조직 배양 플라스 크에 10 mL의 어느 미디어를 추가 합니다.</li>
		<li>Hemocytometer 고 Trypan blue 염료를 사용 하 여 (단계 2.2.18)25에 셀의 수를 계산 하. 일단 계산 하 고, 조직 배양 플라스 크 (2.3.1 단계)에서 준비에 셀을 추가 (37 ° C, 습도 95%, 5% CO2) 24 h에 대 한 인큐베이터에 추가 셀 10 셀 / µ L 및 장소 조직 문화 술병의 클론 밀도. 참고: 계산 방법의 예는 다음과 같습니다: 10 µ L Trypan blue 염료와 세포 현 탁 액 및 혼합의 받아 10 µ L. hemocytometer로이 혼합물의 10 µ L를 추가 합니다. 가벼운 현미경 X 10에서 라이브 셀의 숫자를 계산 하 고 모든 셀 4 x 4 사분면의 4에서 계산 합계 합니다. 수식을 사용 하 여: 100000/2 x 10 x 1000 x [(X cells/4)] 클론 밀도 (10 셀 / µ L) 되도록 각 25 mL 조직 배양 플라스 크에 도금을 셀 서 스 펜 션의 볼륨 주고.</li>
		<li>24 h 후 부드럽게 플라스 크를 소용돌이 고 15 mL 원뿔 튜브에 내용을 붓는 다. 실시간에서 5 분에 대 한 300 x g 에서 원심 분리기</li>
		<li>상쾌한 삭제 하 고 다시 1-2 ml 신선한 neurobasal 미디어의 세포를 중단.</li>
		<li>2.3.2 펜션과 플레이트 세포 클론 밀도 500 µ L 각 그들의 각각 물질 보충 미디어 (확실 한 NSC 성장 위한 EFH) 및 기본 NSC 성장 위한 LIF의를 포함 하는 24-잘 조직 문화 접시에서에 있는 셀의 수를 세 단계를 반복 합니다. 참고: 2 x 10 x 1000 x 적응된 수식을 (5000 / [셀/4 X) 사용 하 여) 계산 잘 포함 하는 미디어의 500 µ L 각 도금을 셀 서 스 펜 션의 볼륨을.</li>
		<li>7 일 동안 인큐베이터 (37 ° C, 습도 95%, 5% CO2) 성장에 세포를 포함 하는 접시를 놓습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>계산
	<ol>
<li>7 일 문화에서 다음 접시를 제거 하 고 가벼운 현미경 아래를 볼. Neurospheres는 구형 식민지를 계산 하 여 계량 > dNSCs 문화에 대 한 직경 80 µ m 및 > 50 µ m 직경 pNSCs 문화에 대 한. 참고: 원하는 경우 neurospheres passaged26 추가 될 수 또는 분화. 셀은 더 이상 필요한 경우, 매체의 색깔 노란색을 20 분 대 한 웰 스 (약 1 mL)을 가속된 과산화 수소를 추가 하 여 삭제 합니다. 다음 삭제 합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
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저자는 공개 없다.

외과 절차 동안 어디 연구원 동물 사이 가변성을 최소화 하 고 최적의 결과 얻기에 특히 주의 기울여야 한다 몇 가지 중요 한 단계가 있다. 해야 합니다 주의 (isoflurane) 흡입된 마 취와 수술 중 마 취 장기간된 노출27와 신경 보호 효과를 표시 되었습니다로. 따라서, 부상에 따라 척수의 재생 능력, 공부를 할 때 신속 하 고 혼란 변수를 방지 하기 위해 가능한 한 효율적으로 수술을 수행 하기 위해 노력을 확인 합니다. 마우스 당 동일한 isoflurane 노출 시간 유지 가변성을 줄일 것입니다. 마우스의 호흡 속도 수술 내내 모니터링 해야 하 고 너무 느린 해서는 안됩니다 (1 호흡 매 2-3 s) 또는 무 겁 게 보람 (즉, 허 걱). 마 취의 유지 보수 복용량은 낮은 주입 받은 쥐의 메모와 함께 장시간된 마 취 때문에 죽음을 방지 하기 위해 2-3%에서 낮출 수 있습니다.
수술 중 주의 추가 척추 칼럼의 양쪽에 근육 절 개를 수행할 때. 상처는 깊은, 근육 절 개 하는 동안 뼈 척추에 대하여 휴식 하는 잎의 가장자리는 칼 날 medially 각도입니다 확인 합니다. 잎은 바깥쪽으로 직각 경우 과도 한 혈관 상처에서 출혈의 가능성이 있다. 연구원 한다 또한 주의 여분의 깊은 낚시 척수를 손상 것 이다가 위를 피하기 위해 laminectomy 수행할 때 원치 않는 조직 손상과 기능 적자 발생. 이러한 실험에 대 한 적절 한 제어 "laminectomy만" 그룹 (상해 없음), 그 반대로 laminectomy에서 발생할 수 있는 바늘 트랙 부상에 기인 하는 NSCs의 활성화의 비교 있도록 이다. 우리는 병 변21의 수준에서 뇌 영역에서 neurosphere 숫자의 증가 의해 밝혀 그 laminectomy 혼자 NSC 정품 인증에서 이라도 하 찮은 작은 증가가 발생할 수 있습니다 나타났습니다. Laminectomy 혼자 않습니다 하지 증가 neurosphere 숫자에서 뇌 영역 rostral 또는 꼬리에서 laminectomy에 원인과 아무 neurospheres 화이트 문제는 laminectomy의 수준에서 고립의 문화에서 찾을 수 있습니다. 또한,는 laminectomy 수행할 때 알아서 한 조각 코드의 넓은 노출 허용 등 lamina를 제거. 이것은 (1) 수행 dorsolateral 척수의 최소한의 바늘 트랙 부상에 대 한 충분 한 액세스를 허용 하 고 (2) 남겨진 되 고 폐쇄 하 고 복구 후 마우스의 움직임에 따라 보조 손상에서 뼈의 세그먼트 방지 합니다. 경우 전체 lamina 한 조각으로 촬영 되지 않습니다 또는 세그먼트는 laminectomy의 양쪽에 날카로운 뼈 돌기의 관찰, 악기 (이빨된 집게 곡선된가 위 등)를 사용 하 여 봉합 전에 이러한 조각을 제거.
연구원은 외과 폐쇄 동안 봉합 근육 레이어를 적용할 때 매우 조심 해야 한다. (더블 매듭) 한 봉합 봉합 그대로 척추 뼈의 위에 속 인 다 그래서 꼬리 laminectomy/상해의 수준에 배치 되어야 합니다. 이것은 복구 후 마우스를 이동 하면 노출된 코드 접촉 되 고 근육 봉합에서 발생할 수 있는 어떤 이차 손상을 방지 하기 위해. 또한, 근육 봉합 laminectomy/부상에 꼬리는 SCI 분석에 대 한 척수를 분리 하는 때를 수행 했다 랜드마크 역할을 합니다. 한다 주의 때 부상된 척수 영역을 해 부 해 현미경 미세 절 개 하는 동안 인식할 수 있는 유지 수 있도록 부상 영역의 구조를 손상 시 키 지 않으려면. Neurosphere 분석 결과 관해서는 그것은 세포 죽음을 증가 시킬 수 있는 기포의 생산을 방지 하려면 부드럽게 펠 릿 세포의 기계적 분쇄를 수행 하는 것이 중요. pNSC에서 파생 된 neurospheres 파편 무거운, 성장 조건에 더욱 민감합니다-과도 한 분쇄 및 효소 솔루션에 장기간된 노출-dNSC 문화를 기준으로. 파생 하는 pNSC 분야는 더 콤팩트 하 고 dNSCs 보다 작은. PNSCs의 희귀 한을 감안할 때, 샘플 당 240000 이상 세포를 고립 시키기 좋습니다.
최소한의 문화 모델은 셀룰러 이벤트 (예: 생 NSCs의 활성화) 상해 다음 공부 하지만 기능 장애의 연구를 허용 하지 않습니다. 앞에서 설명 했 듯이, 바늘 트랙 부상에서 재기 하는 쥐 없는 주목할 만한 행동 적자 지속 경험과 같은 기능적인 결과 개선 하도록 하는 치료 내정간섭의 효과 대 한 쥐를 평가할 수 없습니다. 재생 의학의 한 가지 중요 한 측면은 치료만 조직 복구 (neurosphere 분석 결과, 계보 추적 및 immunohistochemistry/면역 형광 검사와 함께이 모델을 사용 하 여 평가 될 수 있다)는 홍보 하지 해야 하지만 해당 되는 행동 패러다임을 사용 하 여 관련 기능 개선 또한 보여주어야 합니다. 다양 한 기능 성과 발 오류 테스트 등 바소, 비 티, Breshnan (BBB) 오픈 필드 운동 규모28, 상해의 흉부 모델에서 테스트 하는 데 사용 하는 행동 작업 우리의 최소한의 측정 적자를 검출 하기 위하여 충분히 구분 하지 않습니다. SCI 모델입니다. 이 단점을 극복 하기 위해 하나를 만들 수 있는 총 및 뒷 다리 사지 운동의 매개 변수는 최소한의 검출할 수 있는 걸음 걸이 분석을 포함 한 여러 매개 변수를 측정 하는 더 민감한 디지털 채 점 시스템 (예를 들어, CatWalk)의 사용 최소한의 상해 모델29인 적자.
이 방법은 자 궁 경부 척수 상해의 모델에 잠재적인 치료로 내 생 NSC 활성화 연구 또한 적응 수 있습니다. 자 궁 경부 SCI 가장 임상적으로 관련 모델 이며 우리가 더 높은 척추 세그먼트에이 부상 모델 적응 여부에 대 한 통찰력을 제공할 것 이라고 제안 NSCs (속도 론, 마이그레이션, 그들의 자손의 응답에 있는 지역 변이가 있다 차별화) 병 변 더 심 오 하 고 측정 가능한 기능적인 적자 발생 여부와. (Transection, 클립 압축 타 박상 등) 현재 사용 된 murine 경부 부상 모델 필요가 수동으로 방광을 표현 하 고 끊임없이 마우스의 호흡을 모니터링을 포함 하 여 집중적인 수술 치료를 필요 합니다. 경부 척수에 최소한의 부상 모델을 적응 수 있습니다 사망률, 병 적 상태와 연관 된 다른 자 궁 경부 SCI 모델 수술 치료를 줄일 뿐 아니라 약물/작은 분자 및 재활의 효과 검사 한 허용 신경 회복에 대 한 결과 우리의 부상 모델 코드 (즉, 등 쪽 또는 측면 열) 깊은 침투와 더 큰 상해의 다른 부분 또는 더 큰 크기의 바늘 (작은 게이지)를 사용 하 여 최소한의 상해를 만들에 맞게 수 있습니다. 제어/조작 유형 및 병 변의 크기 및 따라서 세포 및 기능/행동 복구를 따라 평가 연구원 수 있습니다.
최소한의 부상 모델 쥐에 유전자 변형 동물 모델의 사용을 허용합니다. 마우스 모델 생 줄기 세포는 부상 이전 창시자의 라벨을 사용 합니다. 부상에 따라 이러한 미리 표시 셀의 운명을 추적 하 고 평가 하는 신경 선구자 세포 증식, 마이그레이션, 부상에 따라 차별화 하 연구원 수-잠재적으로 신경 복구에 기여.

중앙 신 경계 모든 다른 성숙한 신경 세포 유형1,2,,34를 수 있는 자체 갱신, multipotent 줄기 세포의 부분 모집단을 포함 되어 있습니다. 이러한 신경 줄기 세포 (NSCs) 뇌와 척수에서 전문된 틈새에 있으며 증식, 마이그레이션, 성숙한 신경 세포로 분화 하는 부상에 따라 활성화 될 수 있다. NSCs 및 그들의 자손 대뇌 피 질의 부상 모델5,6부상 사이트로 마이그레이션할 표시 되었습니다. 두뇌에 있는 NSCs 측면 심에서 그들은 이다 glial 흉터 대형7을에 분화 상해의 사이트에 마이그레이션할 표시 되었습니다. 그러나 척수,, 몇 가지 연구 수행 되었습니다 다음 척수 상해 회복을 촉진 하이 같은 생 NSCs를 다룰 수 있습니다 경우에 게. 실제로, 현재 논쟁이 있다 활성화는 척수에 줄기 세포 수영장의 중앙 운하8 안 감 뇌 틈새의 직접적인 물리적 손상에 필요한 지 여부 또는 경우는 척추에 손상을 코드 실질 (줄기를 떠나 그대로 셀 틈새)은 생 NSCs9활성화 충분 합니다.
척수 상해 (SCI) 모델의 수는 급성과 만성 부상의 병 태 생리학을 공부 하 이용 되었다. 이 모델 또한 neuroprotection, immunomodulation, 개발 세포 이식/대체 전략10,,1113를 통해 SCI를 치료에 잠재적인 치료를 테스트에 사용 되었습니다. 현재 모델에는 코드14,15에서 대규모 기능적인 적자 뿐 아니라 광범위 한 병 변 및 현상을 일으킬 압축 및 타 박상 부상 포함 됩니다. 결과 glial 흉터는 대부분 척수16의 너비/둘레의 함께 여러 척추 세그먼트를 확장할 수 있습니다. 따라서, 이러한 모델은 임상 관련, 그들은 줄 부상 다음 생 NSCs의 응답을 공부 하 고 중요 한 과제. 중앙 채널17을 마련할 수 있는 상해의 온화한 형태를 적용할 수 있습니다 부상의 화학 모델을 확인 하 고 있습니다. 그러나, 이러한 유형의 부상 demyelination SCI와 관련 된에 초점을 하 고 하지 임상 관련 모델 외상 문화와 관련 된 물리적 또는 기계적 손상에 대 한
현재 부상 모델의 한계를 해결 하기 위해 우리는 바늘 트랙 최소한의 과학 모델, 원래는 쥐9, 성인 마우스 모델에서 응용 프로그램에 대 한 개발을 적응 시켰다. 우리의 적응된 부상 모델 마우스 척수의 dorsolateral 지역의 일관 된 병 변을 만들 수 있으며 상해의 수준에 중앙 운하 예비. 이 모델의 장점은 NSC 속도 론 연구 허가 상해 및 그들의 잠재적인 방사형 마이그레이션 상해의 사이트에 다음. 마우스 모델의 사용 또한 생 NSCs와 부상에 따라 그들의 자손의 혈통 추적을 허용 하는 유전자 변형 마우스의 사용을 허용 합니다. 생체 외에서 neurosphere 분석 결과이 프로토콜에 도입의 수정 된 양식을 사용 하 여 NSCs의 속성 평가 추가 수 있습니다.
Neurosphere 분석 결과 생체 외에서 식민지 형성 분석 결과 mitogens 존재 NSCs의 격리를 허용 하는. 클론 도금 밀도에서 개별 NSCs NSCs의 작은 부분 모집단 및 창시자18,19의 대부분의 구성 하는 셀의 부동성 구형 식민지를 확산. 우리의 프로토콜에서 척수의 뇌 영역에서 두 개의 별개, 직계 관련 NSCs의 설명-초기 조건 하에서 그리고 우리의 최소한의 과학 모델에 따라. 확실 한 신경 줄기 세포 (dNSCs) 익스프레스 nestin 및 폐해 fibrillary 산 성 단백질 (GFAP)와 표 피 성장 인자 (EGF), 섬유 아 세포 성장 인자 (FGF) 및 헤 파 린 (함께 불리 EFH)20의 성장 된다. 이러한 dNSCs 거의 neurospheres에 시험관에게 상승을 주는 순진한 척수에 드물다. 그러나, 우리는 dNSCs 다음 최소한의 과학, 뇌 지역21에서 분리 된 neurospheres의 숫자를 확대 활성화 됩니다 보여줍니다. 기본 신경 줄기 세포 (pNSCs)은 신경 줄기 세포 계보에서 dNSCs의 업스트림. pNSCs의 pluripotency 마커 Oct4, 상당히 드문, 익스프레스 저급 고 백혈병 금지 요인 (LiF) 응답22. pNSCs neurospheres 주 문화;에 있는 myelin 기본적인 단백질 (MBP)의 존재로 인해 성인 마우스 척수에서 격리 때 형성 하지 않는다 그러나, pNSC neurospheres MBP 결핍 생쥐에서 격리 될 수 있습니다 및 그들의 숫자는 확장된 다음 부상-dNSCs21비슷합니다. 마지막으로, 우리 보여 dNSC에서 파생 된 neurospheres 일찍 최소한의 영향은 다음 번에 상해에의 사이트에서 고립 될 수 있다 이러한 결과 우리의 부상 모델 및 분석 실험 그들의 능력을 확산 하 고 부상에 대 한 응답에서 마이그레이션할 같은 뇌 NSCs의 활성화 특성을 평가할 수 있습니다 보여 줍니다.

<table><tbody><tr><td>Agricola Retractor</td><td>Fine Science Tools</td><td>17005-04</td><td></td></tr><tr><td>Moria Vannas-Wolff Spring Scissors (Curved)</td><td>Fine Science Tools</td><td>15370-50</td><td>Customize when ordering to get blunted tips</td></tr><tr><td>Graefe Forceps (Straight, 1 x 2 Teeth)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11053-10</td><td></td></tr><tr><td>Extra Fine Graefe Forceps (Curved, Serrated)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11152-10</td><td>Or any other forceps for suturing</td></tr><tr><td>Hartman Hemostats (Straight)</td><td>Fine Science Tools</td><td>13002-10</td><td>Or any other appropriate for suturing</td></tr><tr><td>Scalpel Handle #3</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td>Or any other appropriate</td></tr><tr><td>Hair clippers</td><td>amazon.ca</td><td>https://www.amazon.ca/Wahl-Professional-8685-Classic-Clipper/dp/B00011K2BA</td><td>or any other appropriate</td></tr><tr><td>Stereotaxic instrument</td><td>Stoeling</td><td>51500</td><td>or any other appropriate</td></tr><tr><td>Buprenorphine</td><td></td><td></td><td>or any appropirate sanctioned my animal care facility</td></tr><tr><td>Meloxicam</td><td></td><td></td><td>or any appropriate sanctioned by animal care facility</td></tr><tr><td>Tears Naturale P.M.</td><td>Alcon</td><td>https://www.amazon.ca/Alcon-Tear-Gel-Liquid-Eye-Gel/dp/B00HHXGUXE</td><td>or any other appropriate</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Baxter International Inc</td><td>DIN 02225875</td><td>or any other appropriate for anesthesia</td></tr><tr><td>Q-tips Cottom Swabs</td><td>amazon.ca</td><td>https://www.amazon.ca/Q-Tips-Cotton-Swabs-500-Count/dp/B003M5UO6U/ref=pd_lpo_vtph_194_bs_tr_img_1/140-7113119-8364127?_encoding=UTF8&amp;amp;psc=1&amp;amp;refRID=JC16N542KVRF2N62N3DS</td><td></td></tr><tr><td>Cotton Gauze</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-761-52</td><td></td></tr><tr><td>30 G Needles</td><td>Becton Dickinson</td><td>305106</td><td>For Injury</td></tr><tr><td>25 G Needles</td><td>Becton Dickinson</td><td>305122</td><td>For Drug injections</td></tr><tr><td>1 mL Syringes</td><td>Becton Dickinson</td><td>3090659</td><td>for drug injections</td></tr><tr><td>3 mL Syringes</td><td>Becton Dickinson</td><td>309657</td><td>for fluid injections</td></tr><tr><td>4-0 Suture</td><td>uoftmedstore.com</td><td>2297-VS881</td><td>for skin suturing</td></tr><tr><td>6-0 Suture</td><td>uoftmedstore.com</td><td>VS889</td><td>for muscle suturing</td></tr><tr><td>Polysporin ointment</td><td>amazon.ca</td><td>102051</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane Vaporizer</td><td>VetEquip</td><td>901806</td><td></td></tr><tr><td>15 mL conical tubes</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td>Any appropriate</td></tr><tr><td>Petri Dishes</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td>any appropriate</td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td>Any</td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td>Any appropriate</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td>Any appropriate</td></tr><tr><td>Standard Dissection Tools</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissection Microscope</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000</td><td></td></tr><tr><td>Counting Microscope</td><td>Olympus</td><td>CKX41</td><td></td></tr><tr><td>Neural Basal-A Medium</td><td>Invitrogen</td><td>10888-022</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Invitrogen</td><td>17404-044</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin- Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15070</td><td></td></tr><tr><td>L- Glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>12100046</td><td></td></tr><tr><td>F12</td><td>Invitrogen</td><td>12700075</td><td></td></tr><tr><td>30% Glucose</td><td>Sigma</td><td>G6152</td><td>1 M, 9.01 g in 100 mL dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>1 M Glucose</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>7.5% NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td>155 mM, 1.30 g in 100 mL dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>155 mM NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td>23.83 g in 100 mL dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Apo-Transferrin</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>3188-AT</td><td></td></tr><tr><td>Putrescine&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P7505</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma</td><td>I5500</td><td></td></tr><tr><td>Selenium</td><td>Sigma</td><td>S9133</td><td></td></tr><tr><td>Progesterone</td><td>Sigma</td><td>P6149</td><td></td></tr><tr><td>Papain Dissociation System&amp;nbsp;</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>PDS</td><td>1 vial of papain can be used for 2 samples</td></tr><tr><td>Epidermal Growth Factor</td><td>Invitrogen</td><td>PMG8041</td><td>Powder reconstituted with 1mL Hormone Mix and aliquoted into 20uL vials to be stored in freezer</td></tr><tr><td>Fibroblast Growth Factor</td><td>Invitrogen</td><td>PHG0226</td><td>Powder reconstituted with 0.5 mL Hormone Mix and aliquoted into 20 &amp;mu;L vials to be stored in freezer</td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>Leukemia Inhibitory Factor</td><td>In House</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>24 well Plates</td><td>NUNC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 M NaCl</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td>11.69 g in 100 mL dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>1 M KCL</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td>7.46 g in 100 mL dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>1 M MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>M2393</td><td>20.33 g in 100 mL dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>108 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>C7902</td><td>1.59 g in 100 mL dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr></tbody></table>

a neurosphere assay to evaluate endogenous neural stem cell activation in a mouse model of minimal spinal cord injury

성인 포유류 척수에서 신경 줄기 세포 (NSCs)는 공부 생체 외에서 neurosphere 분석 결과 사용 하 여 될 수 있는 뇌 세포의 상대적으로 mitotically 무부하 인구. 이 식민지 형성 분석 결과 접시;에 외 인 요인 NSCs의 반응을 하는 강력한 도구 그러나,이 또한 힘의 적당 한 이해 및 분석 결과의 한계 vivo에서 조작의 효과 연구를 사용할 수 있습니다. 임상 관심의 한 조작 생 NSC 활성화에 상해의 영향 이다. 척수 상해의 현재 모델 제공이 줄기 세포가 있는 상해의 사이트에 NSC 틈새의 파괴를 일으킬 하는 일반적인 타 박상, 압축, 및 transection 모델의 심각도 공부에 대 한 도전. 여기, 우리는 성인 마우스 척수의 낮은 흉부 수준 (t 7/8)의 표면 dorsolateral 표면에 지역화 된 손상을 초래 하는 최소한의 부상 모델을 설명 합니다. 이 부상 모델 상해의 수준에서 중앙 운하를 예비 하 고 부상에 따라 다양 한 시간 지점에서 병 변의 수준에 있는 NSCs의 분석 합니다. 여기, 우리가 어떻게 neurosphere 분석 결과 척수 뇌 영역-기본 및 최종 NSCs에 있는 NSCs의 두 개의 별개, 직계-관련, 인구의 활성화 연구에 이용 될 수 있다 표시 (pNSCs와 dNSCs, 각각). 상해 및 백색 질 부상 사이트의 수준에서 뇌 영역에서 이러한 NSCs 문화를 격리 하는 방법을 보여 줍니다. 수술 후 척수 해 우리의 pNSC 및 부상된 코드 컨트롤, 상해를 통해 그들의 활성화를 말하기에 비해 뇌 영역에서 dNSC에서 파생 된 neurospheres의 증가 수 보여줍니다. 또한, 부상, 다음 dNSC에서 파생 된 neurospheres 격리 될 수 있습니다 부상 사이트에서-상해의 사이트에 그들의 뇌 틈새에서 마이그레이션할 NSCs의 능력을 보여주는.

수술, 다음 쥐 꼬리와 최대 24 h에 대 한 가능한 뒷 다리 사지 paresis 포함할 수 있는 최소 모터 적자를 경험 한다. 이 시간 후 쥐 뒷 다리 사지 마비 또는 paresis 없고 걸음 걸이에서 최소한의 변화를 경험 한다.
그림 3 에서 5 일 최소한의 척수 상해 neurosphere 분석 결과에서 대표적인 결과 보여줍니다. DNSC에서 파생 된 neurospheres (EFH 성장)의 완전 한 숫자 보다 크면 pNSC에서 파생 된 neurospheres (LIF 성장)의 숫자 부상 후 (그림 3A 와 3B, 각각). 결정적인 neurosphere (그림 3C)와 기본 neurosphere (그림 3D)의 높은 전원 이미지 하 고 더 큰 직경 (≥80 µ m)에서 일반적으로 확실 한 neurospheres와 이러한 독특한 식민지의 모양이 다른 공개 데 큰 어두운 센터. 기본 neurospheres는 더 작은 크기 (50 µ m)에 고 셀 더 긴밀 하 게 포장 된다. 부상된 코드의 다른 부분에서 발생 하는 neurospheres의 대표 번호 그림 3E (definitives) 및 3 층 (기본)에서 볼 수 있습니다. 최소한의 과학 neurospheres 상해의 수준에서 중앙 운하에서 성장에 크게 증가 하면 그림 3E 쇼 rostral 아닌 부상 코드에서 상대적으로 겸손 한 증가에 비해.
흥미롭게도, 확실 한 neurospheres 병 변, laminectomy 혼자 쥐에서 neurosphere 형성 세포를 포함 하지 않는 지역의 사이트에서 생성할 수 있습니다. 그림 3 층 pNSCs pNSC neurospheres 병 변 사이트에서 제외한 후 부상에 유사한 증가 보여 줍니다. 따라서, dNSCs만이 시간 과정 후 상해에 상해의 사이트로 마이그레이션할 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57727/57727fig1v2.jpg"> 그림 1: 수술. (A) 모든 레이아웃 필요한 참조 번호. 곧은 몸, 척추와 사지 stereotaxic 장치에서 마우스의 (B) 그림 밖으로 확산 하 고 흉부 지원 아치 아래 배치 함께 녹화. 근육 층과 척추 컨투어가 노출 수직 피부 절 개를 가진 마우스의 (C) 그림. (D) A 마우스 몸 근육 절 개 및 노출 및 척추 견인 기를 분리 후의 사진입니다. 찢 어의 부족으로 긴장 된 근육 층 note (E) A (3 세그먼트) 척추 골의 뼈 표면 보여주는 근육 레이어 제거, 격리 된 마우스 척추의 그림. 이 또한 spinous 프로세스와 아마도 척추 관절 및 제거할 중간 척추의 lamina를 보여줍니다. (F) A 표시 척수 후 laminectomy의 그림. 라는 등 중간 정 맥이 이다. (G) A 등 중간 정 맥의 양쪽에 양국 바늘 트랙 부상으로 마우스의 사진. 30g 바늘의 45 ° 구부러진된 샤프트의 근접 삽입이 있다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57727/57727fig1v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57727/57727fig2v2.jpg"> 그림 2: 척수 해 부. 다시 근육과 척추 뼈 윤곽 (B) 그림 rostral와 꼬리 방향을 보여주는 격리 된 척추 칼럼의 폭로 중간 피부 절 개를 가진 잘린된 쥐의 (A) A 그림. 두 번째 사진은 보여줍니다 코드 격리 하 고 세 번째 페 트리 접시에 격리 된 척수를 보여줍니다. (C) A 척수, 다른 세그먼트 (뇌, 상해 지역)은 제거 하 고 경작에 대 한 분리의 미세 해 부의 그래픽 표현입니다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57727/57727fig2v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57727/57727fig3v3.jpg"> 그림 3: 대표 neurosphere 분석 결과 다음과 같은 최소한의 척수 상해에서에서 유래한. (A) dNSC에서 파생 된 neurospheres (EFH 성장) 부상된 척수에서 경작의 숫자 보다 크면 (B) pNSC에서 파생 된 neurospheres (에서 재배 LIF)의 수 동일 밀도에서 도금 할 때. (C, D) (C) dNSC 문화 및 (D) pNSC 문화에서 "일반적인" neurospheres의 높은 전원 이미지. (E) 최소한의 바늘으로 부상 dNSC에서 파생 된 neurospheres 상해의 수준에서 중앙 운하 뿐만 아니라, 부상을 rostral 중앙 운하와 부상 사이트의 숫자에 있는 상당한 증가 발생합니다. (F) pNSC에서 파생 된 neurospheres 손상 되지 않은 코드에서 격리 된 될 수 없습니다 하지만 (수준에서 상해의 rostral 중앙 운하에서) 중앙 운하에서 상해 다음 격리 될 수 있습니다. 오차 막대는 뜻의 표준 오류를 나타냅니다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57727/57727fig3v3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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A Neurosphere Assay to Evaluate Endogenous Neural Stem Cell Activation in a Mouse Model of Minimal Spinal Cord Injury

최소한의 척수 상해의 마우스 모델에서 내 인 성 신경 줄기 세포 활성화 평가 Neurosphere 분석 결과

여기, 예비 중앙 운하 틈새 주택 내 인 성 신경 줄기 세포 (NSCs) 성인 마우스에서 최소한의 척수 상해 모델의 성능을 보여 줍니다. 우리는 활성화 및 마이그레이션 고 원시적인 NSCs 부상 다음의 척도를 neurosphere 분석 실험을 사용 하는 방법을 보여줍니다.

Neural stem cells (NSCs) in the adult mammalian spinal cord are a relatively mitotically quiescent population of periventricular cells that can be studied ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.8K 조회수.  University of Toronto. 여기, 예비 중앙 운하 틈새 주택 내 인 성 신경 줄기 세포 (NSCs) 성인 마우스에서 최소한의 척수 상해 모델의 성능을 보여 줍니다. 우리는 활성화 및 마이그레이션 고 원시적인 NSCs 부상 다음의 척도를 neurosphere 분석 실험을 사용 하는 방법을 보여줍니다.

비디오: A Neurosphere Assay to Evaluate Endogenous Neural Stem Cell Activation in a Mouse Model of Minimal Spinal Cord Injury

Isolation of Neural Stem/Progenitor Cells from the Periventricular Region of the Adult Rat and Human Spinal Cord

Adult rat and human spinal cord neural stem/progenitor cells (NSPCs) cultured in growth factor-enriched medium allows for the proliferation of multipotent, self-renewing, and expandable neural stem cells. In serum conditions, these multipotent NSPCs will differentiate, generating neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. The harvested tissue is enzymatically dissociated in a papain-EDTA solution and then mechanically dissociated and separated through a discontinuous density gradient to yield a single cell suspension which is plated in neurobasal medium supplemented with epidermal growth factor (EGF), basic fibroblast growth factor (bFGF), and heparin. Adult rat spinal cord NSPCs are cultured as free-floating neurospheres and adult human spinal cord NSPCs are grown as adherent cultures. Under these conditions, adult spinal cord NSPCs proliferate, express markers of precursor cells, and can be continuously expanded upon passage. These cells can be studied in vitro in response to various stimuli, and exogenous factors may be used to promote lineage restriction to examine neural stem cell differentiation. Multipotent NSPCs or their progeny can also be transplanted into various animal models to assess regenerative repair.

The adult mammalian spinal cord contains neural stem/progenitor cells (NSPCs) that can be isolated and expanded in culture. This protocol describes the harvesting, isolation, culture, and passaging of NSPCs generated from the periventricular region of the adult spinal cord from the rat and from human organ transplant donors.

뇌실 주위 백질 성인 쥐의 지역 및 인간의 척수에서 신경 줄기 / 전구 세포의 분리

Adult rat and human spinal cord neural stem/progenitor cells (NSPCs) cultured in growth factor-enriched medium allows for the proliferation of ...

연구

발생학

Stable and Efficient Genetic Modification of Cells in the Adult Mouse V-SVZ for the Analysis of Neural Stem Cell Autonomous and Non-autonomous Effects

Relatively quiescent somatic stem cells support life-long cell renewal in most adult tissues. Neural stem cells in the adult mammalian brain are restricted to two specific neurogenic niches: the subgranular zone of the dentate gyrus in the hippocampus and the ventricular-subventricular zone (V-SVZ; also called subependymal zone or SEZ) in the walls of the lateral ventricles. The development of in vivo gene transfer strategies for adult stem cell populations (i.e. those of the mammalian brain) resulting in long-term expression of desired transgenes in the stem cells and their derived progeny is a crucial tool in current biomedical and biotechnological research. Here, a direct in vivo method is presented for the stable genetic modification of adult mouse V-SVZ cells that takes advantage of the cell cycle-independent infection by LVs and the highly specialized cytoarchitecture of the V-SVZ niche. Specifically, the current protocol involves the injection of empty LVs (control) or LVs encoding specific transgene expression cassettes into either the V-SVZ itself, for the in vivo targeting of all types of cells in the niche, or into the lateral ventricle lumen, for the targeting of ependymal cells only. Expression cassettes are then integrated into the genome of the transduced cells and fluorescent proteins, also encoded by the LVs, allow the detection of the transduced cells for the analysis of cell autonomous and non-autonomous, niche-dependent effects in the labeled cells and their progeny.

Here we describe a procedure based on the use of lentiviral particles for the long-term genetic modification of neural stem cells and/or their adjacent ependymal cells in the adult ventricular-subventricular neurogenic niche which allows the separate analysis of cell autonomous and non-autonomous, niche-dependent effects on neural stem cells.

신경의 분석을위한 성인 마우스 V-SVZ에서 세포의 안정적이고 효율적인 유전자 변형 줄기 세포 자율 및 비 자치 효과

Relatively quiescent somatic stem cells support life-long cell renewal in most adult tissues. Neural stem cells in the adult mammalian brain are ...

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a chemically defined serum-free culture system known as the neurosphere assay (NSA). In this assay, the majority of differentiated cell types die within a few days of culture but a small population of growth factor responsive precursor cells undergo active proliferation in the presence of epidermal growth factor (EGF) and/ basic fibroblastic growth factor (bFGF). These cells form colonies of undifferentiated cells called neurospheres, which in turn can be subcultured to expand the pool of neural stem cells. Moreover, the cells can be induced to differentiate, generating the three major cell types of the CNS i.e. neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. This assay provides an invaluable tool to supply a consistent, renewable source of undifferentiated CNS precursors, which could be used for in vitro studies and also for therapeutic purposes.
This video demonstrates the NSA method to generate and expand NSCs from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting the brain from the adult mouse, micro-dissection of the periventricular region, tissue preparation and culture in the NSA. The harvested tissue is first chemically digested using trypsin-EDTA and then mechanically dissociated in NSC medium to achieve a single cell suspension and finally plated in the NSA. After 7-10 days in culture, the resulting primary neurospheres are ready for subculture to reach the amount of cells required for future experiments.

This video protocol demonstrates the neurosphere assay method to generate and expand neural stem cells from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures.

절연 및 Neurosphere 어세를 사용하여 성인 마우스 신경 줄기 세포의 확장

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

신경과학

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life span of the animal. They can potentially replace cells that are lost in the aging process or in the process of injury and disease. The existence of neural stem cells (NSCs) was first described by Reynolds and Weiss (1992) in the adult mammalian central nervous system (CNS) using a novel serum&#8208;free culture system, the neurosphere assay (NSA). Using this assay, it is also feasible to isolate and expand NSCs from different regions of the embryonic CNS. These in vitro expanded NSCs are multipotent and can give rise to the three major cell types of the CNS. While the NSA seems relatively simple to perform, attention to the procedures demonstrated here is required in order to achieve reliable and consistent results. This video practically demonstrates NSA to generate and expand NSCs from embryonic day 14-mouse brain tissue and provides technical details so one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting E14 mouse embryos, brain microdissection to harvest the ganglionic eminences, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in NSA culture. After 5-7 days in culture, the resulting primary neurospheres are passaged to further expand the number of the NSCs for future experiments.

This video protocol demonstrates the application of the neurosphere assay for the isolation and expansion of neural stem cells from the ganglionic eminences of embryonic day 14-mouse brain.

Neurosphere 분석을 사용하여 마우스 배아 신경 줄기 세포 문화 구축

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Promotion of Survival and Differentiation of Neural Stem Cells with Fibrin and Growth Factor Cocktails after Severe Spinal Cord Injury

Neural stem cells (NSCs) can self-renew and differentiate into neurons and glia. Transplanted NSCs can replace lost neurons and glia after spinal cord injury (SCI), and can form functional relays to re-connect spinal cord segments above and below a lesion. Previous studies grafting neural stem cells have been limited by incomplete graft survival within the spinal cord lesion cavity. Further, tracking of graft cell survival, differentiation, and process extension had not been optimized. Finally, in previous studies, cultured rat NSCs were typically reported to differentiate into glia when grafted to the injured spinal cord, rather than neurons, unless fate was driven to a specific cell type. To address these issues, we developed new methods to improve the survival, integration and differentiation of NSCs to sites of even severe SCI. NSCs were freshly isolated from embryonic day 14 spinal cord (E14) from a stable transgenic Fischer 344 rat line expressing green fluorescent protein (GFP) and were embedded into a fibrin matrix containing growth factors; this formulation aimed to retain grafted cells in the lesion cavity and support cell survival. NSCs in the fibrin/growth factor cocktail were implanted two weeks after thoracic level-3 (T3) complete spinal cord transections, thereby avoiding peak periods of inflammation. Resulting grafts completely filled the lesion cavity and differentiated into both neurons, which extended axons into the host spinal cord over remarkably long distances, and glia. Grafts of cultured human NSCs expressing GFP resulted in similar findings. Thus, methods are defined for improving neural stem cell grafting, survival and analysis of in vivo findings.

Fibrin matrices containing growth factors were used to retain grafted neural stem cells into sites of complete spinal cord transection. Grafted cells completely filled the lesion cavity and differentiated into multiple neural cell types, including neurons that extended axons into host spinal cord over long distances.

중증 척수 손상 후 섬유소 및 성장 인자 칵테일 신경 줄기 세포의 생존 및 분화 촉진

Neural stem cells (NSCs) can self-renew and differentiate into neurons and glia. Transplanted NSCs can replace lost neurons and glia after spinal cord ...

Neural Stem Cell Transplantation in Experimental Contusive Model of Spinal Cord Injury

Spinal cord injury is a devastating clinical condition, characterized by a complex of neurological dysfunctions. Animal models of spinal cord injury can be used both to investigate the biological responses to injury and to test potential therapies. Contusion or compression injury delivered to the surgically exposed spinal cord are the most widely used models of the pathology. In this report the experimental contusion is performed by using the Infinite Horizon (IH) Impactor device, which allows the creation of a reproducible injury animal model through definition of specific injury parameters. Stem cell transplantation is commonly considered a potentially useful strategy for curing this debilitating condition. Numerous studies have evaluated the effects of transplanting a variety of stem cells. Here we demonstrate an adapted method for spinal cord injury followed by tail vein injection of cells in CD1 mice. In short, we provide procedures for: i) cell labeling with a vital tracer, ii) pre-operative care of mice, iii) execution of a contusive spinal cord injury, and iv) intravenous administration of post mortem neural precursors. This contusion model can be utilized to evaluate the efficacy and safety of stem cell transplantation in a regenerative medicine approach.

Spinal cord injury is a traumatic condition that causes severe morbidity and high mortality. In this work we describe in detail a contusion model of spinal cord injury in mice followed by a transplantation of neural stem cells.

척수 손상의 실험 Contusive 모델에서 신경 줄기 세포 이식

Spinal cord injury is a devastating clinical condition, characterized by a complex of neurological dysfunctions. Animal models of spinal cord injury can ...

의학

A Neonatal Mouse Spinal Cord Compression Injury Model

Spinal cord injury (SCI) typically causes devastating neurological deficits, particularly through damage to fibers descending from the brain to the spinal cord. A major current area of research is focused on the mechanisms of adaptive plasticity that underlie spontaneous or induced functional recovery following SCI. Spontaneous functional recovery is reported to be greater early in life, raising interesting questions about how adaptive plasticity changes as the spinal cord develops. To facilitate investigation of this dynamic, we have developed a SCI model in the neonatal mouse. The model has relevance for pediatric SCI, which is too little studied. Because neural plasticity in the adult involves some of the same mechanisms as neural plasticity in early life1, this model may potentially have some relevance also for adult SCI. Here we describe the entire procedure for generating a reproducible spinal cord compression (SCC) injury in the neonatal mouse as early as postnatal (P) day 1. SCC is achieved by performing a laminectomy at a given spinal level (here described at thoracic levels 9-11) and then using a modified Yasargil aneurysm mini-clip to rapidly compress and decompress the spinal cord. As previously described, the injured neonatal mice can be tested for behavioral deficits or sacrificed for ex vivo physiological analysis of synaptic connectivity using electrophysiological and high-throughput optical recording techniques1. Earlier and ongoing studies using behavioral and physiological assessment have demonstrated a dramatic, acute impairment of hindlimb motility followed by a complete functional recovery within 2 weeks, and the first evidence of changes in functional circuitry at the level of identified descending synaptic connections1.

This article describes a method for generating a reproducible spinal cord compression injury (SCI) in the neonatal mouse. The model provides an advantageous platform for studying mechanisms of adaptive plasticity that underlie spontaneous functional recovery.

신생아 마우스 척수 압축 부상 모델

Spinal cord injury (SCI) typically causes devastating neurological deficits, particularly through damage to fibers descending from the brain to the spinal ...

Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and expansion of NSCs provide a suitable source of cells for neuroscientists to study the function of neurons and glial cells along with their interactions. There are several reported techniques for the isolation of neural stem cells from adult or embryo mammalian brains. During the microsurgical operation to isolate NSCs from different regions of the embryonic CNS, it is very important to reduce the damage to the brain cells to obtain the highest ratio of live and expandable stem cells. A possible technique for stress reduction during isolation of these cells from the mouse embryo brain is the reduction of surgical time. Here, we demonstrate a developed technique for rapid isolation of these cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence. Surgical procedures include harvesting E13 mouse embryos from the uterus, cutting the frontal fontanelle of the embryo with a bent needle tip, extracting the brain from the skull, microdissection of the isolated brain to harvest the ganglionic eminence, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in suspension culture to generate neurospheres.

Here, we introduce a novel microsurgical technique for the isolation of neural stem cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence.

절연 및 마우스 배아 신경 줄기 세포의 문화

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to intracranial delivery, intra-arterial administration of NSCs is less invasive and produces a more diffuse distribution of NSCs within the brain parenchyma. Further, intra-arterial delivery allows the first-pass effect in the brain circulation, lessening the potential for trapping of cells in peripheral organs, such as liver and spleen, a complication associated with peripheral injections. Here, we detail the methodology, in both mice and rats, for delivery of NSCs through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) to the ipsilateral hemisphere after an ischemic stroke. Using GFP-labeled NSCs, we illustrate the widespread distribution achieved throughout the rodent ipsilateral hemisphere at 1 d, 1 week and 4 weeks after postischemic delivery, with a higher density in or near the ischemic injury site. In addition to long-term survival, we show evidence of differentiation of GFP-labeled cells at 4 weeks. The intra-arterial delivery approach described here for NSCs can also be used for administration of therapeutic compounds, and thus has broad applicability to varied CNS injury and disease models across multiple species.

A method for delivering neural stem cells, adaptable for injecting solutions or suspensions, through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) after ischemic stroke is reported. Injected cells are distributed broadly throughout the brain parenchyma and can be detected up to 30 d after delivery.

쥐와 마우스 두뇌에 신경 줄기 세포의 동맥 내 납품: 대뇌 허혈에 응용 프로그램

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...

 A Minimal Spinal Cord Injury Model to Study Neural Stem Cell Activation and Migration

<a href='https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/57727/a-neurosphere-assay-to-evaluate-endogenous-neural-stem-cell'>Source: Lakshman, N., et al. A Neurosphere Assay to Evaluate Endogenous Neural Stem Cell Activation in a Mouse Model of Minimal Spinal Cord Injury.&#160;J. Vis. Exp. (2018).</a>This video demonstrates the activation and migration of neural stem cells (NSCs) in a mouse spinal cord injury model. To expose the spinal cord, a vertebra from the thoracic region of the spine is removed from an anesthetized mouse. A superficial injury is then created in the white matter of the spinal cord using a bent needle, which preserves the central canal. Following the injury, NSCs surrounding the canal are activated and migrate to the injury site to assist tissue repair.