Name: high-resolution imaging and analysis of individual astral microtubule dynamics in budding yeast
Uploaded: 2017-04-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast at JoVE.com

우리는 다양한 FP-TUB1 플라스미드를 공유 케리 블룸 (노스 캐롤라이나 대학), 켱 리 (NCI), 스티븐 마르쿠스 (콜로라도 주립 대학), 그리고 엘마 쉬에벨 (Universität 하이델베르크를) 감사합니다. 우리는 슬라이드 챔버의 제조 방법에서 우리를 훈련에 대한 멜리사 가드너 (미네소타 대학)에 감사하고 있습니다. 이 작품은 국립 보건원 (NIH) (JKM에) R01GM112893-01A1과 (CE에) T32GM008730을 부여에 의해 지원되었다.

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저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.

신진 효모 모델은 시간이 지남에 이미지 하나의 미세 소관의 능력과 효모 유전학의 도구를 사용하여 tubulin의와 미세 소관 규제를 조작 할 수있는 기능을 포함하여, 생체 내 환경에서 미세 소관 역학의 고해상도 측정을 수집하기위한 주요 이점을 제공한다. 콘 카나 발린 A-코팅 챔버 용융 아가 패드를 포함하여 전술 한 장치들상에서 다수의 이점을 제공한다. 챔버와 슬라이드 미리 만들어 장기 보관하거나 즉시 사용 가능 할 수있다. 또한 콘 카나 발린 A-코팅 챔버는 세포가 원래 배양 된 동일한 매체&gt; 6 시간 동안 효모 세포를 배양 할 수있다. 챔버 내의 세포의 수는 챔버 이미지를 만들 수있는 기간을 지시한다는 것을 명심해야한다. 코팅 챔버는 효모 세포의 단일 층 커버 슬립에 부착되도록. 마지막으로, 여러 개의 챔버를 만드는 것은 가능여러 가지 다른 효모 균주는 같은 슬라이드에 몇 군데 있습니다. 상대적으로 낮은 신호 레벨 및 프로세스의 높은 동적 특성을 포함하여 효모를, 신진에서 미세 소관의 역학을 이미징 할 주요 과제가있다. 위드 현미경 표지 된 미세 소관 단일 평가시기 화상 취득에 적합하다. 그러나 위드 현미경 긴 노출 시간과 초점이 ​​맞지 빛 샘플의 폭격으로 인해 photobleaching에 빠르게됩니다. 마찬가지로, 레이저 스캐닝 공 초점 현미경으로 인해 빠른 광표백에 부적절하다. 디스크 공 초점 현미경을 회전하는 효모 신진에서 미세 소관 역학을 이미징 유일하게 적합하다. 여기에 사용되는 회전 디스크 공 초점 현미경 시스템은 마음에 이러한 요구 사항을 설계되었습니다. 현미경 시스템은 높은 속도와 높은 감도 설계되어야한다. 현미경 시스템의 다양한 적합 증명 수 있지만, 여러 구성 요소가 필수적이다. 100X높은 개구 (1.45NA)와 목적은 100 나노 미터 정도의 개별 미세 소관 길이 변화를 해결하는 것이 필요하다. 스피닝 디스크 공 초점 스캐너 포커스 아웃 광을 차단하여, photobleaching에 독성을 최소화하기 위해, 단지 포커스에 광을 수집하여, 해상도와 감도를 극대화시킬 필요가있다. EMCCD 카메라는 시간 경과 수집 각각 90 밀리 초 동안 충분히 GFP-Tub1 신호를 수집하기 위해 신속하고 민감해야합니다. 현재 EMCCD 카메라는이 응용 프로그램을위한 최상의 선택입니다. 현재 CMOS 센서 카메라는 하이 엔드 EMCCDs의 감도 부족; 그러나,이 기술은 크게 개선되고 곧 적합 할 수있다. 마지막으로, 압전 단 네 개의 차원 이미지 획득의 속도 - 제한 단계가 될 수있는 Z 빠르고 정확한 움직임을 위해 필요하다. 유사한 장치가 준비되지 않은 경우,이 프로토콜에 기술 된 특정 현미경 시스템은 장벽을 제공 할 수있다. 변경의 C상이한 이미징 시스템을 수용하도록 이루어질 수 있지만, 이러한 변형은 시간 및 / 또는 공간 해상도를 희생 올 수있다. 스핀들 구동 모터 스테이지 압전 단계 대신에 사용될 수있다. 그러나, 이러한 모터는 속도가 느린 덜 정확하고 표류하는 경향이있다. 취득 후 이미지 안정화 플러그인이 모터 구동 스테이지와 연관된 XY 치수의 편차를 최소화 할 수있다. 또한, 느린 판독 속도로 대체 카메라를 사용할 수 있습니다. 느린 수집 속도를 수용하기 위해, Z 시리즈는 적게 수집 할 수있다 (즉, Z 시리즈 사이의 시간). 그러나, Z 시리즈 사이의 시간을 증가시키는 시점들 사이에서 발생할 수없는 전이 위험. 대안 적으로, Z 평면들 사이의 거리 Z 시리즈마다 수집 된 이미지의 수를 감소시키는 방법으로 향상시킬 수있다. 그러나,이 간격을 증가 시키면 정확도는 할 수있는 실험의 능력을 손상됩니다 평면 사이의 영상 정보를 잃는 위험ately 미세 소관의 끝을 식별합니다. 분명히, 변경은 대안 영상 시스템을 수용 할 수 있지만, 이러한 변화는 이미지 정보의 손실 가능성에 대해 무게해야합니다. 입체 화상 스택은 2 차원 화상을 투영 변환 될 때,이 프로토콜의 다른 제한은 공간 정보의 손실이다. 미리 anaphase (핵분열 말기) 효모 세포의 개별 랄 미세 소관은 세포질의 3 차원 공간에 걸쳐 길이 프로젝트 전형적으로 0.5 내지 2.0 μm의 것이다. 또한 Z-위치의 일련의 이미지는 개별 미세 소관의 모든 공간 정보를 수집하는 수집하는 것이 중요하다. 시간 경과에 취득이 3000 개 이미지, 총 150 개 개의 시점들 각각에서 20 Z-슬라이스 복잡한 데이터 세트를 생성 할 수있다. 이 문제를 해결하기 위해 이미지 분석을 단순화하기 위해 Z-스택 공간 정보는 분석 중에 압축된다. 이 benef 동안그 분석 결과,이 Z 차원에서 공간 정보의 선정에 온다. 는 Z-차원이 압축 될 때 얼마나 많은 정보가 손실됩니다? 이 손실을 추정하기 위해, 실험 Spc110-GFP 표지 SPB는 높은 신호대 잡음비와 구형 초점을 발휘하기 때문에 측정이 비교적 용이 미리 anaphase (핵분열 말기) 세포에서 SPB는 사이의 거리를 측정하기 위해 실시 하였다. 스핀들 별 소관보다 Z 상이한 변위를 나타낼 수 있지만, 평균 길이 (~ 1.5 μm의) 따라서 유용한 프록시를 제공하는 유사하다. 스핀들 길이가 평균적으로 15 % 이상 동일한 스핀들이 이차원 돌기 (JM, 미발표 결과)로 측정되는 경우보다 전체 입체 화상 스택에서 측정되는 경우. 따라서, 간략화 된 데이터 세트 및 측정의 이점은 삭제 정보 Z의 비용 비교 검토한다. 효모 세포 생물학 커뮤니티는 이미징 미세 소관 networ에 대한 다양한 툴킷을 개발했다KS. 이것은 / Tub1 - 튜 블린을 α 융합 각종 영양 요 구성 마커 표시 형광 단백질의 다양성을 포함한다. 이러한 구조가 포함는 Leu2 :: GFP-TUB1 염색체는 Leu2의 궤적에서 통합 (pSK1050) (11), 및 URA3 :: GFP-TUB1 (pAFS125) (16)를 포함하여 URA3의 궤적에 통합 GFP 및 다른 형광 여러 융합,,, :: URA3 CFP-TUB1 (pAFS125-CFP), 및 :: URA3-pHIS3 mCherry-TUB1 (pAK011) 17. 또한, 다양한 형광 단백질 융합체 Tub1 세트 최근 어느 염색체 URA3 궤적 또는 네이티브 TUB1 궤적 (18)에 인접하는 궤적에 해당 대상 통합을 만들어왔다. 형광 마커의이 넓은 팔레트는 차별적 태그 단백질과 공동 현지화 실험에 매우 유용합니다. GFP의-Tub1 융합 microtu의 시간 경과 이미징을위한 최상의 도구 남아인해 밝기 및 광 안정성에 청이 역학. 송 &amp; 리 (pSK1050) (11)에 의해 생성 된 GFP-Tub1 융합은 α-tubulin의 / Tub1의 아미노 말단에 GFP의 융합을 포함하고 류신 영양 요를 구출하기는 Leu2의 궤적에 통합합니다. 따라서, 상기 융합 단백질은 천연 α-tubulin의 이외에 ectopically 표현 셀 9 ~ 총 α-tubulin의 20 %를 차지한다. 중요한 것은, GFP-Tub1 융합 네이티브 α-tubulin의 / Tub1 (JM, 게시되지 않은 결과)의 기능을 구출하지 않습니다. 이것은 또한 다른 TUB1 융합의 사실이다 (18)를 구성한다. 미세 소관과 결합 단백질을 시각화하기 위해 사용할 수있는 도구로, 효모 신진 것은 tubulin의 다른 미세 소관 규제의 돌연변이를 연구하는 이상적인 시스템입니다. 또한, 튜 불린 유전자의 제한된 수의 돌연변이 튜 불린의 균일 한 풀의 직접 연구 할 수 있습니다. 돌연변이 이외에에서튜 불린 유전자는 효모 신진은 후생 동물 대조 상동이다 미세 소관 - 연관된 단백질 (MAP에)를 갖고있다. 이지도는 직접 연구 할 수 있으며, 돌연변이가 하나의 미세 소관의 필라멘트에 미치는 영향도 조사 할 수있다. 여기에 설명 된 프로토콜은 미세 소관 역학에 영향을 미치는 고유 및 외부 프로세스 모두의 조사를 할 수 있습니다. 요약하면, 미세 소관은 많은 세포 과정 동안 올바르게 작동 할 동적해야합니다. 튜 불린 본질적인 요소 및 미세 소관의 역학을 조절하는 외부 관련된 단백질을 이해하는 것이 필요하다. 효모를 신진 직접적 하나의 미세 소관의 역 동성을 정량화하여 이러한 요인의 효과를 연구 할 수있는 이상적인 시스템입니다. 위에서 설명 된 프로토콜 안정적 효모 게놈 내로 형광 융합 단백질을 통합하는 방법 및 획득 공 촛점 이미지는 생체 내에서 미소 관 역학 스택 정량 분석하는 방법을 설명 </em&gt;. 마지막으로,이 다양한 프로토콜은 관심의 단백질이 적절한 형광 단백질에 융합 될 때 너무 오래, 효모 신진의 모든 단백질의 역학을 연구하기 위해 적용 할 수 있습니다.

미세 소관은 αβ-tubulin의 단백질 서브 유니트로 이루어지는 골격 중합체이며, 세포 내 운반, 세포 분열, 형태 형성 및 세포 운동성 포함 콘텍스트의 다양한 사용된다. 언제 어디서 미세 소관 양식이 다양한 역할에 대한 미세 소관 네트워크를 구축하기 위해 세포는 신중하게 조절해야합니다. 이 규정은 무료 하부 단위로 미세 소관 폴리머 또는 분해 미세 소관에 αβ-tubulin의 서브 유닛을 조립하거나하는 반응을 제어하여 수행됩니다; 이것은 미세 소관 역학로 알려져 있습니다. 미세 소관 분야의 주요 목표는 튜 불린 및 / 또는 미세 소관에 결합하는 αβ-tubulin의 서브 유닛 및 외부 규제 기관의 연구를 포함하여 미세 소관 역학을 조절하는 분자 메커니즘을 규명하는 것입니다. 잘 확립 된 실험 방법은 COM 종종 정제 αβ-tubulin의 단백질을 사용하여 시험 관내에서 이러한 시스템을 재구성하는정제 된 외부 레귤레이터 환 경의. 이 유용한 방법이지만, 재구성 된 시스템의 미세 소관의 역 동성이 살아있는 세포에서 관찰 된 것과 크게 다른 것은 분명하다. 예를 들어, 미세 소관은 빠르게 성장하고 체외에 비해 생체 내에서 느리게 수축. 이러한 차이는 세포의 알려진 외부 조절기 (1)의 유용성뿐만 아니라, 아직까지 정의되지 않은 요인에 기인 할 수있다. 따라서 미세 소관 규제 및 네이티브 셀룰러 맥락에서 역 동성을 방해 돌연변이의 활동을 결정하는 것이 중요합니다. 후생 동물 모델은 미세 소관 기능과 고차원 조직을 조사하는 일반적인 시스템적일 수 있지만, 몇 가지 실제적인 문제는 심각하게 미세 소관 역학의 정확한 측정을 위해이 모델의 유틸리티를 제한 할 수 있습니다. 첫째, 셀 당 수천 수십 이르기까지 미세 소관의 높은 수는, 자신에 어렵게 만든다시간이 지남에 따라 개별 미세 소관을 추적 할 수 있습니다. 많은 연구는 선택적 같은 최종 결합 (EB) 계열의 단백질과 같은 미세 소관 단부에 지역화 단백질을 묘화함으로써이 문제를 다룬다. 그러나, 이러한 단백질은 후생 동물 2 미세 소관 성장의 끝을 지역화하는 것으로 알려져있다. 따라서, 이들 단백질의 효용은 간접적 재앙 주파수와 역학의 다른 측면을, 직접 측정하면서, 성장 속도를 측정하기 위해 제한된다. 둘째, 게놈 편집 기술의 발전에도 불구하고 안정적으로 형광 표지 튜 불린 또는 선택적으로 튜 불린 또는 미세 소관 규제를 조작하는 돌연변이를 도입을 발현하는 세포를 만드는 것이 중요한 과제로 남아. 또한, 후생 동물의 많은 튜 불린 아이소 타입의 존재는 돌연변이가 개별 튜 불린 유전자에 미치는 영향을 연구를 혼동. 신진 효모 시스템은 생체 microtubu에서 측정하기위한 몇 가지 중요한 이점을 제공르 역학. 효모는 개별 미세 소관의 시각화를 허용 간략화 미세 소관의 네트워크를 가지고있다. 효모에서 미세 소관은 핵 봉투 3에 포함 된 스핀들 극 기관 (SPB는)으로 알려진 센터를 조직에서 발산. SPB는 미세 소관은 4, 5 핵 γ-tubulin의 작은 착물에 대한 지지체로 작용한다. SPB는 미세 소관은, 스핀들 미세 소관과 별 미세 소관의 두 개의 클래스를 핵. 핵질로 스핀들 미세 소관 프로젝트 및 동원체의 미 세관을 통해 염색체에 부착 및 극간 소관 6 겹치는 스핀들 비아를 안정화시키는 것이 중요하다. 대조적으로, 미세 소관 별의 바깥 세포질 내로 돌출하고는 스핀들 미세 소관의 밀집 네트워크 비교적 드문 비교된다. 유사 분열하는 동안, 사전 anaphase (핵분열 말기) 세포는 SPB 중 하나에서 나오는 1-2 별 미세 소관이있다; 이 내가로 존재오히려 7 번들로보다 미세 소관 ndividual. 유사 분열 동안 별 미세 소관의 역할은 꽃 봉오리 목으로 알려진 어머니와 새싹 구획 사이의 접합에 핵 스핀들을 이동하는 것입니다. 이 운동으로 결국 꽃 봉오리 목 8로 핵 스핀들을 당겨 별 미세 소관에 힘을 생성하는 잘 정의 된 경로를 포함한다. 효모 시스템의 또 다른 장점은 비할 데없는 정밀 미세 소관 규제 및 튜 불린 서브 유닛을 조사하는 데 사용할 수있는 자사의 유전학의 유틸리티입니다. 단일 β-tubulin의 유전자 (TUB2)와 두 개의 α-tubulin의 유전자 (TUB1 및 TUB3) 효모는 또한 튜 불린 동형의 간략화 레퍼토리를 갖는다. 돌연변이 용이 유전자로 도입시켜 균질 튜 불린 인구 (9) (10)에 조사 될 수있다. 널리 여러 가지가 있습니다가능한 라벨 미세 소관에 대한 구조, 이들은 안정적인 표현 염색체 유전자좌에서 통합의 대상이 될 수있다 (토론 참조). 이 방법의 전반적인 목적은 미소 관 역학 고분해능 측정을위한 네 개의 차원 (X, Y, Z, 및 T) 효모 살아있는 세포에서 단일 이미지 소관이다. 효모 세포의 형광 표지 된 튜 불린의 구성 적, 낮은 수준의 발현 구성체의 통합을위한 방법들이 설명된다. 촬상 전에, 살아있는 세포는 장기 이미징 세포를 안정화 렉틴 콘 카나 발린 A의 코팅 된 슬라이드 챔버에 장착된다. 화상 취득을위한 최적의 파라미터뿐만 아니라, 데이터 분석을위한 플로도 기재되어있다.

<table><tbody><tr><td>DOB (dropout bases)</td><td>Sunrise science&amp;nbsp;</td><td>1650</td><td></td></tr><tr><td>CSM-Leu</td><td>Sunrise science&amp;nbsp;</td><td>1005</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Ameresco</td><td>N833</td><td></td></tr><tr><td>100 mm polystyrene plates</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>ssDNA (Samon Sperm)&amp;nbsp; in sterile DiH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;D7656</td><td>resuspend at 10 mg/mL in DiH2O. Store aliquots at -20 &amp;ordm;C</td></tr><tr><td>Synthetic Complete Media&amp;nbsp;</td><td>Sunrise science&amp;nbsp;</td><td>1459-100</td><td></td></tr><tr><td>Concanavalin A</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>L7647</td><td>resuspend at 2 mg/mL in DiH2O. Store aliquots at -20 &amp;ordm;C</td></tr><tr><td>Microscope slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-1</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Coverslips</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-541-B</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-374-12</td><td>paraffin film</td></tr><tr><td>VALAP (Equal parts of Vaseline, lanolin and paraffin)</td><td></td><td></td><td>melt at 75 &amp;ordm;C before use</td></tr><tr><td>forceps&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-100-106</td><td></td></tr><tr><td>Poyethylene glycol (PEG) 3350</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>202444</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Microscope&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ti E inverted Perfect Focus microscope</td><td>Nikon Instruments</td><td>MEA53100</td><td></td></tr><tr><td>1.45 NA 100X CFI Plan Apo objective</td><td>Nikon Instruments</td><td>MRD01905</td><td></td></tr><tr><td>Piezo electric stage&amp;nbsp;</td><td>Physik Instrumente</td><td>P-736</td><td></td></tr><tr><td>Spinning disk scanner</td><td>Yokogawa</td><td>CSU10</td><td></td></tr><tr><td>Laser combiner module</td><td>Agilent Technologies</td><td>MCL400B</td><td></td></tr><tr><td>EMCCD camera</td><td>Andor Technology</td><td>iXon Ultra 897&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Software&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NIS Elements software</td><td>Nikon Instruments</td><td>MQS31100</td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel software</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB software</td><td>MathWorks, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ64</td><td>NIH</td><td></td><td>Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, http://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016.</td></tr><tr><td>Bio-Formats Importer plug-in</td><td>Open Microscopy Environment</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Plasmids&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pUC19-LEU2::GFP-TUB1</td><td></td><td>pSK1050</td><td>reference: Song, S. and Lee, K. S. A novel function of Saccharomyces cerevisiae CDC5 in cytokinesis. J Cell Biol. 152 (3), 451-469 (2001)</td></tr></tbody></table>

high-resolution imaging and analysis of individual astral microtubule dynamics in budding yeast

동적 미세 소관은 많은 세포 과정의 기초이며, 미세 소관 역학의 정확한 측정은 세포가 이러한 과정을 조절하는 방법에 대한 방법과 유전자 돌연변이에 미치는 영향 규정 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 후생 동물 모델에서 미세 소관 역학의 정량화는 유전자 조작에 높은 미세 소관 밀도 및 제한 사항을 포함하여 관련 문제의 번호가 있습니다. 반면, 신진 효모 모델은 이러한 문제를 극복 이점을 제공한다. 이 프로토콜은 효모 살아있는 세포에서 단일 미세 소관의 역학을 측정하는 방법을 설명합니다. 형광 태그 튜 불린을 발현하는 세포는 안정한 저속 화상 획득을 가능하게 조립 슬라이드 챔버에 부착되어있다. 고속 대한 상세한 가이드의 4 차원 이미지 획득은 공 초점 화상 스택 동적 미세 소관의 속성을 정량화하는 프로토콜뿐만 아니라, 제공된다. 이 방법은, 종래의 효모 유전자와 결합 잠정량적 튜 불린 소단위의 활성을 변경하는 레귤레이터 미세 소관 또는 돌연변이의 영향을 평가하기위한 유일하게 적합한 접근법을 IDES.

효모 살아있는 세포에서 미세 소관의 역학을 측정하는 것은 미세 소관 규제 또는 튜 불린를 코딩하는 유전자의 돌연변이가 영향을 중합 및 해중합 속도뿐만 아니라, 이러한 상태 간의 전환의 주파수를 소단위 방법을 평가하기위한 강력한 도구를 제공합니다. 그림 1 표시 야생형 세포에서 별 미세 소관 역학의 시간 시리즈 (430Δ tub2-) β-tubulin에 돌연변이와 돌연변이 세포. 미세 소관은 미세 소관의 길이를 시각화하는 GFP - 태그 α-tubulin에 함께 표시되어 있습니다. 빨간 화살표는 각 화상 (Figure1A 1 C)의 별 미세 소관의 길이를 추적. 미세 소관의 길이가 8 분 동안 각각의 시간 지점에서 측정하고,이 길이는 컴파일 수명 플롯 (도 1b 및 1 D)에 도시되어있다. 이 데이터는 중합 속도, 해중합 속도, 중합 durati를 결정하는 데 사용되었다해중합 기간, 구조 주파수, 재해 빈도, 역 동성,에. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/55610/55610fig1.jpg" /> GFP 표지 미세 소관과 별이 미세 소관 역학의 측정 그림 1. 시간 경과 영상. (A 및 C) 야생형과 돌연변이 tub2 -430Δ 세포 타임 랩스 영상의 처음 다섯 개 순차 이미지. 미세 소관은 GFP-Tub1 표지 및 세포주기의 전 anaphase (핵분열 말기)에 이미징된다. 각각의 이미지는 촛점 Z 시리즈의 최대 강도의 투영이다. 스케일 바 : 1 ㎛. 타임 스탬프는 각각의 프레임에서 획득 한 총 시간을 나타낸다. 빨간 화살표는 화살촉이 플러스 단부를 나타내는 더불어, 별의 미세 소관의 전체 길이를 따라. (B와 D) 미세 소관 삶의 플롯은 시간이 지남에 따라 하나의 별이 미세 소관의 길이를 표시합니다. 녹색 점의 중합을 나타내며 분홍색 점은 해중합을 나타낸다. 화살촉은 재앙 이벤트를 가리 킵니다. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55610/55610fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 도 1은 야생형 균주와 C 말단에 β-tubulin에의 27 아미노산이 결여 변이주 이전보다 안정한 미세 소관 (15)을 갖는 도시 된 돌연변이와 변형 된 미소 관 역학을 보여준다. 미세 소관 수명 그래프에 표시된 바와 같이, tub2의 -430Δ 변이체의 미세 소관은 이상과 야생형보다 미세 소관 나타낸다 적은 재해 (도 1b 및 D 화살촉 표 1). 또한, 중합, 탈 중합 속도는 상승 및 하강 기울기의 미세 소관 LENG 결정THS은 야생형 (표 1도 1B 및 1D)와 비교하여 돌연변이 감소된다. 마지막 tub2 -430Δ 돌연변이 세포에서 미세 소관 중합 및 해중합의 상태에서 더 많은 시간을 소비하고, 야생형 (표 1)에 비해 동성을 감소. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 변형 </td><td> 동성 (서브 유닛 / S) </td><td> 중합 속도 (μm의 / 분) </td><td> % 중합의 시간 </td><td> Depolym 속도 (μm의 / 분) </td><td> Depoly-에서 %의 시간 merization </td><td> % 일시 정지의 시간 </td><td> 구조 주파수 (이벤트 / 분) </td><td> 재해 주파수 (EV엔트 / 분) </td></tr><tr><td> 야생형 N = 1 </td><td> (54) </td><td> 1.8 ± 0.5 </td><td> (48) </td><td> 3.0 ± 0.3 </td><td> (29) </td><td> 삼 </td><td> 1.8 </td><td> 1.4 </td></tr><tr><td> tub2-430Δ N = 1 </td><td> (40) </td><td> 1.4 ± 0.1 </td><td> (41) </td><td> 1.5 ± 0.2 </td><td> (32) </td><td> 0 </td><td> 0.8 </td><td> 0.7 </td></tr><tr><td colspan="9"> 다음 약어는 : μm의 마이크론; 분 분; S, 초; N, 미세 소관 수명 플롯 (Fig1B, D)로부터 단일 분석 미세 소관. 값은 평균 ±에게 평균의 표준 오차이다. </td></tr></tbody></table> 표 1 :도 1의 셀에 대한 미세 소관 역학 측정 값은도 1에 도시 된 단일 미세 소관의 측정에서, 평균의 표준 오차 평균 ±이다.

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High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

효모 신진 인해 강력한 유전학과 미세 소관 세포 골격의 단순함에 생체 내 미세 소관 역학 연구를위한 유리한 모델입니다. 다음 프로토콜 변환 및 문화 효모 세포, 공 초점 현미경 이미지를 수집하고, 정량적으로 효모 살아있는 세포에서 미세 소관 역학을 분석하는 방법에 대해 설명합니다.

고해상도 이미징 및 개인 별이 미세 소관 역학의 분석 신진 효모에서

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

9.2K 조회수.  University of Colorado School of Medicine.  효모 신진 인해 강력한 유전학과 미세 소관 세포 골격의 단순함에 생체 내 미세 소관 역학 연구를위한 유리한 모델입니다. 다음 프로토콜 변환 및 문화 효모 세포, 공 초점 현미경 이미지를 수집하고, 정량적으로 효모 살아있는 세포에서 미세 소관 역학을 분석하는 방법에 대해 설명합니다. 

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Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae. Although this protocol is based on the overexpression of a protein, it can easily be adapted for morphological phenotypes dependent on suppression of protein expression. Our lab is interested in studying the signaling properties of the endocytic adaptor protein epsin. To that purpose we used a dominant negative approach in which we over-expressed the conserved Epsin N-Terminal Homology (ENTH) domain in order to interfere with the functions of endogenous epsin-2 (Ent2 or YLR206W). We observed that overexpression of the ENTH domain of Ent2 (ENTH2) in wild type cells led to a cell division defect that is dependent on the mislocalization of a family of scaffolding proteins, septins.

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae.

버딩 효모에서 단백질 농도의 함수로 형태학의 표현형의 발전 분석

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

연구

생물학

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

Microtubules are polymers of &#945;&#946;-tubulin heterodimers that organize into distinct structures in cells. Microtubule-based architectures and networks often contain subsets of microtubule arrays that differ in their dynamic properties. For example, in dividing cells, stable bundles of crosslinked microtubules coexist in close proximity to dynamic non-crosslinked microtubules. TIRF-microscopy-based in vitro reconstitution studies enable the simultaneous visualization of the dynamics of these different microtubule arrays. In this assay, an imaging chamber is assembled with surface-immobilized microtubules, which are either present as single filaments or organized into crosslinked&#160;bundles. Introduction of tubulin, nucleotides, and protein regulators allows direct visualization of associated proteins and of dynamic properties of single and crosslinked microtubules. Furthermore, changes that occur as dynamic single microtubules organize into bundles can be monitored in real-time. The method described here allows for a systematic evaluation of the activity and localization of individual proteins, as well as synergistic effects of protein regulators on two different microtubule subsets under identical experimental conditions, thereby providing mechanistic insights that are inaccessible by other methods.

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

Here, a TIRF microscopy-based in vitro reconstitution assay is presented to simultaneously quantify and compare the dynamics of two microtubule populations. A method is described to simultaneously view the collective activity of multiple microtubule-associated proteins on crosslinked microtubule bundles and single microtubules.

TIRF 현미경에 의한 시험관 내에서 가교 및 단일 미세 소 관 의 역학의 동시 시각화

Microtubules are polymers of &#945;&#946;-tubulin heterodimers that organize into distinct structures in cells. Microtubule-based architectures and ...

생화학

Microscopy of Fission Yeast Sexual Lifecycle

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the mechanics of cell division and cell polarity. Furthermore, classical experiments on its sexual reproduction have yielded results pivotal to current understanding of DNA recombination and meiosis. More recent analysis of fission yeast mating has raised interesting questions on extrinsic stimuli response mechanisms, polarized cell growth and cell-cell fusion. To study these topics in detail we have developed a simple protocol for microscopy of the entire sexual lifecycle. The method described here is easily adjusted to study specific mating stages. Briefly, after being grown to exponential phase in a nitrogen-rich medium, cell cultures are shifted to a nitrogen-deprived medium for periods of time suited to the stage of the sexual lifecycle that will be explored. Cells are then mounted on custom, easily built agarose pad chambers for imaging. This approach allows cells to be monitored from the onset of mating to the final formation of spores.

We provide a reproducible basic method for the long-term microscopy of the fission yeast sexual lifecycle. With minor adjustments described, the presented protocol allows research focus on different steps of the reproductive process.

분열 효모 성적 라이프 사이클의 현미경

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

고해상도 시간 경과 이미징 및 생활 인간 제대 정맥 내피 세포의 미세 소관 역학의 자동 분석

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Reconstitution of Basic Mitotic Spindles in Spherical Emulsion Droplets

Mitotic spindle assembly, positioning and orientation depend on the combined forces generated by microtubule dynamics, microtubule motor proteins and cross-linkers. Growing microtubules can generate pushing forces, while depolymerizing microtubules can convert the energy from microtubule shrinkage into pulling forces, when attached, for example, to cortical dynein or chromosomes. In addition, motor proteins and diffusible cross-linkers within the spindle contribute to spindle architecture by connecting and sliding anti-parallel microtubules. In vivo, it has proven difficult to unravel the relative contribution of individual players to the overall balance of forces. Here we present the methods that we recently developed in our efforts to reconstitute basic mitotic spindles bottom-up in vitro. Using microfluidic techniques, centrosomes and tubulin are encapsulated in water-in-oil emulsion droplets, leading to the formation of geometrically confined (double) microtubule asters. By additionally introducing cortically anchored dynein, plus-end directed microtubule motors and diffusible cross-linkers, this system is used to reconstitute spindle-like structures. The methods presented here provide a starting point for reconstitution of more complete mitotic spindles, allowing for a detailed study of the contribution of each individual component, and for obtaining an integrated quantitative view of the force-balance within the mitotic spindle.

The assembly and positioning of the mitotic spindle depend on the combined forces generated by microtubule dynamics, motor proteins and cross-linkers. Here we present our recently developed methods in which the geometrical confinement of spherical emulsion droplets is used for the bottom-up reconstitution of basic mitotic spindles.

구형 에멀젼 방울의 기본 유사 분열 스핀들의 재구성

Mitotic spindle assembly, positioning and orientation depend on the combined forces generated by microtubule dynamics, microtubule motor proteins and ...

Spatiotemporal Analysis of Cytokinetic Events in Fission Yeast

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and development. Cytokinesis involves a series of events that are well coordinated in time and space. Cytokinesis involves the formation of an actomyosin ring at the division site, followed by ring constriction, membrane furrow formation and extra cellular matrix remodeling. The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe (S.&#160;pombe)&#160;is a well-studied model system that has revealed with substantial clarity the initial events in cytokinesis. However, we do not understand clearly how different cytokinetic events are coordinated spatiotemporally. To determine this, one needs to analyze the different cytokinetic events in great details in both time and in space. Here we describe a microscopy approach to examine different cytokinetic events in live cells. With this approach it is possible to time different cytokinetic events and determine the time of recruitment of different proteins during cytokinesis. In addition, we describe protocols to compare protein localization, and distribution at the site of cell division. This is a basic protocol to study cytokinesis in fission yeast and can also be used for other yeasts and fungal systems.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe&#160;is an excellent model system to study cytokinesis, the final stage in cell division. Here we describe a microscopy approach to analyze different cytokinetic events in live fission yeast cells.

분열 효모의 Cytokinetic 이벤트의 시공간 분석

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and ...

4D Microscopy of Yeast

The goal of this protocol is to characterize how membrane compartments form and transform in live cells of budding yeast. Many intracellular compartments in yeast are dynamic, and a full understanding of their properties requires time-lapse imaging. Multi-color 4D confocal fluorescence microscopy is a powerful method for tracking the behavior and composition of an intracellular compartment on a time scale of 5-15 min. Rigorous analysis of compartment dynamics requires the capture of thousands of optical sections. To achieve this aim, photobleaching and phototoxicity are minimized by scanning rapidly at very low laser power, and the pixel dimensions and Z-step intervals are set to the largest values that are compatible with sampling the image at full resolution. The resulting 4D data sets are noisy but can be smoothed by deconvolution. Even with high quality data, the analysis phase is challenging because intracellular structures are often numerous, heterogeneous, and mobile. To meet this need, custom ImageJ plugins were written to array 4D data on a computer screen, identify structures of interest, edit the data to isolate individual structures, quantify the fluorescence time courses, and make movies of the projected Z-stacks. 4D movies are particularly useful for distinguishing stable compartments from transient compartments that turn over by maturation. Such movies can also be used to characterize events such as compartment fusion, and to test the effects of specific mutations or other perturbations.

This protocol describes the analysis of fluorescently labeled intracellular compartments in budding yeast using multi-color 4D (time-lapse 3D) confocal microscopy. The imaging parameters are chosen to capture adequate signals while limiting photodamage. Custom ImageJ plugins allow labeled structures to be tracked and quantitatively analyzed.

효모의 4D 현미경 검사법

The goal of this protocol is to characterize how membrane compartments form and transform in live cells of budding yeast. Many intracellular compartments ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does not interfere with cell physiology, and requires minimal experimental handling. The low levels of technical interference enable researchers to study cells across multiple cycles of mitosis and to observe meiosis from beginning to end. Using fluorescent tags such as Green Fluorescent Protein (GFP) and Red Fluorescent Protein (RFP), researchers can analyze different factors whose functions are important for processes like transcription, DNA replication, cohesion, and segregation. Coupled with data analysis using Fiji (a free, optimized ImageJ version), live-cell imaging offers various ways of assessing protein movement, localization, stability, and timing, as well as nuclear dynamics and chromosome segregation. However, as is the case with other microscopy methods, live-cell imaging is limited by the intrinsic properties of light, which put a limit to the resolution power at high magnifications, and is also sensitive to photobleaching or phototoxicity at high wavelength frequencies. However, with some care, investigators can bypass these physical limitations by carefully choosing the right conditions, strains, and fluorescent markers to allow for the appropriate visualization of mitotic and meiotic events.

Here, we present live-cell imaging which is a non-toxic microscopy method that allows researchers to study protein behavior and nuclear dynamics in living fission yeast cells during mitosis and meiosis.

형광 라이브 세포 현미경 검사법에 의한 미토틱 및 Meiotic 핵분열 효모 핵 역학의 검사

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...

Measurement of Microtubule Dynamics by Spinning Disk Microscopy in Monopolar Mitotic Spindles

We describe a modification of an established method to determine microtubule dynamics in living cells. The protocol is based on the expression of a genetically encoded marker for the positive ends of microtubules (EB3 labelled with tdTomato fluorescent protein) and high-speed, high-resolution, live-cell imaging using spinning disk confocal microscopy. Cell cycle synchronization and increased density of microtubules are achieved by inhibiting centrosomal separation in mitotic cells, and analysis of growth is performed using open-source U-Track software. The use of a bright and red-shifted fluorescent protein, in combination with the lower laser power and reduced exposure time required for spinning disk microscopy reduce phototoxicity and the probability of light-induced artifacts. This allows for imaging a larger number of cells in the same preparation while maintaining the cells in a growth medium under standard culture conditions. Because the analysis is performed in a supervised automatic fashion, the results are statistically robust and reproducible.

Here we present a robust and detailed method of microtubule dynamics analysis in cells synchronized in prometaphase using live-cell spinning disk confocal microscopy and MATLAB-based image processing.

단극성 미토틱 스핀들에서 디스크 현미경 검사법에 의한 미세소관 역학 측정

We describe a modification of an established method to determine microtubule dynamics in living cells. The protocol is based on the expression of a ...

Super-Resolution Live Cell Imaging of Subcellular Structures

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally been restricted to be used only on fixed samples or live cells outside of tissue labeled with strong fluorescent signal. Current super-resolution live cell imaging techniques require the use of special fluorescence probes, high illumination, multiple image acquisitions with post-acquisition processing, or often a combination of these processes. These prerequisites significantly limit the biological samples and contexts that this technique can be applied to.
Here we describe a method to perform super-resolution (~140 nm XY-resolution) time-lapse fluorescence live cell imaging in situ. This technique is also compatible with low fluorescent intensity, for example, EGFP or mCherry endogenously tagged at lowly expressed genes. As a proof-of-principle, we have used this method to visualize multiple subcellular structures in the Drosophila testis. During tissue preparation, both the cellular structure and tissue morphology are maintained within the dissected testis. Here, we use this technique to image microtubule dynamics, the interactions between microtubules and the nuclear membrane, as well as the attachment of microtubules to centromeres.
This technique requires special procedures in sample preparation, sample mounting and immobilizing of specimens. Additionally, the specimens must be maintained for several hours after dissection without compromising cellular function and activity. While we have optimized the conditions for live super-resolution imaging specifically in Drosophila male germline stem cells (GSCs) and progenitor germ cells in dissected testis tissue, this technique is broadly applicable to a variety of different cell types. The ability to observe cells under their physiological conditions without sacrificing either spatial or temporal resolution will serve as an invaluable tool to researchers seeking to address crucial questions in cell biology.

Presented here is a protocol for super-resolution live-cell imaging in intact tissue. We have standardized the conditions for imaging a highly sensitive adult stem cell population in its native tissue environment. This technique involves balancing temporal and spatial resolution to allow for the direct observation of biological phenomena in live tissue.

세포 전 형 구조의 슈퍼 해상도 라이브 세포 이미징

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally ...