Name: development and functional characterization of murine tolerogenic dendritic cells
Uploaded: 2018-05-18T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
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우리가 제공 하는 CDDO-DFPA Reata 제약 감사. 우리는 또한 제인이 Seidman의 자 소아 암 혁신 (John Letterio)의 지원을 인정합니다. 이 작품은 국방부의 [W81XWH-12-1-0452];에 의해 지원 되었다 앤 지 파울러 사춘기와 젊은 성인 암 연구 이니셔티브 경우 종합 암 센터; 그리고 F.J. 칼라 재단에서 Hsi 주 웨이 대 한 칼라 대학원 학술 상.

모든 연구는 케이스 서쪽 예비 대학의과 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 절차에 따라 수행 했다.
1. 골 수 유래 수지상 세포 (BMDCs) 준비
<ol><li>압력가 마로 소독을 통해 모든 수술 기구를 소독 하 고 클래스 II 생물 안전 캐비닛 적절된 한 안전 절차에에서 실험을 수행 합니다.</li>
	<li>CO2 챔버를 사용 하 여 C57BL/6 쥐 나이의 8-10 주를 안락사. 해 보드에 마우스를 놓고 70% 에탄올으로 씻어. 경골 비 골 및 대 퇴 골 뼈 수술가 위를 사용 하 여 삭제할 및 70% 에탄올 10 cm 배양 접시에 그들을 배치.</li>
	<li>외과 블레이드와 집게를 사용 하 여 조직 멀리 해 부 10 cm의 뚜껑에 가능한 만큼 요리 문화와 tibias 및 화관 6 cm 문화 접시에 70% 에탄올을 분리.</li>
	<li>외과 블레이드를 사용 하 여 tibias 화관의 양쪽 끝을 잘라. 23 G 바늘 3 ml 주사기에 3 mL PBS를 사용 하 여 12 ml PBS를 포함 하는 원뿔 튜브에 뼈의 한쪽 끝에서 골 수의 내용을 플러시합니다. 뼈의 양 끝에 대 한 3 배가이 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>5 분 x 300g에 세포 현 탁 액 원심</li>
	<li>상쾌한을 제거 하 고 붉은 혈액 세포를 제거 하려면 5 분 동안 1 ml ACK lysing 버퍼 셀 펠 릿 resuspend.</li>
	<li>9 ml PBS ACK lysing 버퍼 및 5 분에 대 한 300 x g에서 원심 분리기를 희석에 추가 합니다.</li>
	<li>상쾌한을 제거 하 고 10 ml 문화 매체 (RPMI 1640 플러스 L-글루타민, 10 %FBS, 1% 비 필수 아미노산 (100 배), 10 mM HEPES, 50 nM β-mercaptoethanol, 및 5% 페니실린/스) resuspend. 참고: 내 수준 FBS에 EU/ml 미만 0.1을 수 있다.</li>
	<li>세포 현 탁 액 40 μ m 셀 스 트레이너를 통해 전달 하 고 세포 현 탁 액의 20 µ l를 취할 trypan cytometer를 사용 하 여 라이브 셀의 수를 계산 하는 파란색의 80 µ l 믹스.</li>
	<li>1 x 106 셀/ml 15 ng/ml GM-CSF와 10 ng/ml IL-4에 셀 수를 조정 합니다.</li>
	<li>6 잘 플레이트의 각 음에 1 x 106 셀/ml의 3 ml 접시 하 고 37 ° C, 5% CO2, 그리고 CO2 배양 기에서 95% 습도에서 세포를 품 어. 참고: 주위에서 한 마우스 골 수 세포는 3-5 107 셀, 그것 수 있는 수 배치 됨을 나타내는 2에서 3 6 잘 플레이트에 배.</li>
	<li>3 일에 각 음에 2 ml 신선한 PBS를 추가 각 우물에서 모든 3 ml 문화 매체를 제거 하 고 부드럽게 소용돌이 모든 비 부착 한 세포를 제거 수 있도록 접시.</li>
	<li>3 ml 신선한 문화 매체를 15 ng/ml GM-CSF와 10 ng/ml IL-4에 각 잘 바꿉니다. 37 ° C, 5% CO2, 그리고 CO2 배양 기에서 95% 습도에서 세포를 품 어.</li>
	<li>5 일에 직접 각 잘에서 15 ng/ml GM-CSF와 10 ng/ml IL-4 다른 3 ml 신선한 문화 매체를 추가 합니다. 37 ° C, 5% CO2, 그리고 CO2 배양 기에서 95% 습도에서 세포를 품 어. 참고: 각 잘에서 총 볼륨은 이제 6 ml.</li>
	<li>7 일에 10 분 동안 얼음에 전체 접시를 넣어. 부드럽게 플라스틱에 서 스 펜 션에는 느슨하게 부착 BMDCs iDCs로 꺼내 려 각 잘 배양. 참고: 부착 세포는 판에 아직도 붙어있다. 낮은 온도 부드럽게 절차 추가 실험에 영향을 미칠 DC 활성화를 방지 하는.</li>
	<li>5 분 x 300g에 세포 현 탁 액을 원심 고 추가 실험에 대 한 신선한 문화 매체와 resuspend. 참고: BMDCs cytometry 여 CD11c 항 체 형광 표시로 확인할 수 있습니다 그리고 우리는 그림 1에서 추가 실험에 대 한 BMDCs의 제어 전략을 보였다.</li>
</ol>2. TolDC 유전자와 단백질 프로 파일 특징
<ol><li>37 ° C, 5% CO2 와 CO2 배양 기에서 95% 습도에서 1 h 잠복기에 대 한 100-400 nM CDDO DFPA의 유무에서 문화 매체와 1 x 106 BMDCs/ml 6 잘 플레이트에 잘 당 2 ml 접시. 참고: CDDO-DFPA, 합성 triterpenoid-처럼-2 요소 (Nrf2) 유도 및 핵 요인-κB (NF κB) 억제제 핵 요소 (erythroid 파생 2) 이다. IDCs, IL-10, 비타민 D3, dexamethasone 베이 11-7085, 등에서 TolDCs의 유도 대 한 다른 에이전트를 적용 하 고 각 에이전트에 대 한 최적의 조건으로이 단계를 수정 합니다.</li>
	<li>잠복기 4-24 시간 mDCs (부 화 시간은 다르다 때문에 mRNA 나 단백질 측정)를 유도 하는 것에 대 한 10 또는 100 ng/ml의 LPS 추가 합니다.</li>
	<li>부드럽게 플라스틱 각 잘에서 배양 하 고 세포 현 탁 액 1 ml 피 펫을 사용 하 여 수확. 셀과 상쾌한, 각각 수집 하 5 분에 대 한 300 x g에서 원심.</li>
	<li>Cytometry 같은 물질로 ligands에 의해 셀 펠 릿에서 표면 ligands를 분석: CD40, CD80, CD86, MHC-II, OX40L, ICOSL, 또는 억제 ligands: PD L1, L2 PD, ILT3, ILT4.</li>
	<li>셀 펠 릿에서 RNA를 분리 하 고 RNA와 양적 실시간 PCR (qRT-PCR)와 ELISA, cytokine 프로필 및 유전자와 단백질 수준에 대 한 표면에 뜨는 샘플을 각각 분석. 참고: 예를 들면, 선 동적인 cytokines: TNF-α, IFNγ, EDN-1, 일리노이-6, IL-12, 및 IL-23, 또는 항 염증 성 cytokines: IL-4, IL-10 일-15, TGF-β1, 및 호-1.</li>
</ol>3. TolDCs의 기능 평가 생체 외에서 그리고 Vivo에서
<ol><li>
T-세포 Syngeneic 확산 분석 실험
	<ol>
<li>압력가 마로 소독을 통해 모든 수술 기구를 소독 하 고 클래스 II 생물 안전 캐비닛 적절된 한 안전 절차에에서 실험을 수행 합니다.</li>
		<li>0.5% 소 혈 청 알 부 민 (BSA)와 500 ml PBS 2 mM EDTA 사용 하 여 MAC 버퍼를 준비 합니다. 0.2 µ m 필터를 통해 필터링 하 여 버퍼를 소독. 참고: 다음 실험 기간 동안 얼음에 버퍼를 유지.</li>
		<li>CD4를+ T 세포, CO2 챔버를 사용 하 여 나이의 8-10 주 OT II T 세포 수용 체 (TCR) 유전자 변형 마우스를 안락사. 해 보드에 마우스를 놓고 70% 에탄올으로 씻어. 복 부의 왼쪽에서 비장 수술가 위, 집게를 사용 하 여 격리 합니다.</li>
		<li>6 cm 문화 접시에 2 ml PBS와 함께 비장을 넣고 3 ml 주사기의 푸시 스틱의 뒷면을 사용 하 여 40 μ m 셀 스 트레이너를 전달 하 여 비장을 말하다.</li>
		<li>셀 펜션과 5 분에 대 한 300 x g에서 원심 분리기를 수집 합니다.</li>
		<li>맥에서 버퍼의 400 μ에 셀 펠 릿을 resuspend.</li>
		<li>CD4의 100 μ 추가+ T 셀 비오 틴-항 체 칵테일 5 분 동안 4 ° C에서. 참고: 항 체 칵테일 CD4 제외 하 고 다른 셀 형식에 바인딩+ T 세포, CD8a, CD11b, CD11c, CD19, CD25, CD45R (B220), CD49b (DX5), CD105, 안티-MHC 종류 II, Ter-119, 그리고 TCRγ/δ.</li>
		<li>10 분 4 ° C에서 맥 버퍼의 300 μ와 반대로 Biotin 구슬 (자료 테이블)의 200 μ를 추가 합니다.</li>
		<li>강자성 분야 (자료 테이블)의 열으로 구성 하는 장소 및 사전 분리 필터는 자석에 함께 필드와 맥 버퍼의 3 ml와 함께 그것을 씻어.</li>
		<li>셀에 5 분에 대 한 300 x g에서 원심 분리기 맥 버퍼의 9 ml를 추가 합니다.</li>
		<li>3 ml 맥 버퍼의 셀 펠 릿 resuspend 고 열에 적용 합니다. 수집 흐름-통해 포함 CD4+ T 세포.</li>
		<li>맥에서 버퍼의 또 다른 3 ml 열 세척 하 고 또한 흐름 통해 수집.</li>
		<li>비장 팬 Dc를, 안락사 C57BL/6 쥐 나이의 8-10 주 공동2 챔버를 사용 하 여. 해 보드에 마우스를 놓고 70% 에탄올으로 씻어. 복 부의 왼쪽에서 비장 수술가 위, 집게를 사용 하 여 격리 합니다. 콜라 D 솔루션의 2 개 ml를 포함 하는 6 cm 문화 접시에 비장을 넣어 (2 mg/ml 콜라 D 칼슘, 마그네슘을 포함 하는 HBSS에 용 해).</li>
		<li>두 번 1 ml 주사기와 25 G 바늘 비장에 콜라 D 솔루션의 1 ml를 주사. 작은 위 비장을 작은 조각으로 잘라.</li>
		<li>동요 하 고 25 분 동안 실 온에서 품 어.</li>
		<li>5 분 동안 실 온에서 0.5 M EDTA의 500 μ를 추가 합니다. 참고: 3.1.13-3.1.14에서 단계는 Dc의 수율을 높이기 위한 중요 합니다.</li>
		<li>이제 푸시 스틱 3 ml 주사기의 뒷면을 사용 하 여 40 μ m 셀 스 트레이너를 전달 하 여 비장 슬러리를 말하다 centrifuging 5 분에 대 한 300 x g에 의해 세포 현 탁 액을 수집 하.</li>
		<li>맥 버퍼, FcR 차단 시 약의 50 μ와 10 분 동안 4 ° C에서의 팬 수지상 세포 Biotin 항 체 칵테일 100 μ의 350 μ에 셀 펠 릿을 resuspend. 참고: 항 체 DCs에 의해 표현 되지 않는다 항 원에 대 한 칵테일.</li>
		<li>5 분에 대 한 300 x g에서 맥 버퍼 및 원심 분리기의 9 ml를 추가 하 여 셀을 씻어.</li>
		<li>맥 버퍼의 800 μ에 셀 펠 릿을 resuspend 하 고 10 분 4 ° C에서 안티 Biotin 구슬의 200 μ를 추가 합니다.</li>
		<li>Dc를 수집 하는 3.1.9-3.1.11에서 단계를 반복 합니다.</li>
		<li>씻어 맥 버퍼의 또 다른 3 ml와 함께 열 두 번을 통해 흐름 또한 수집 합니다.</li>
		<li>2 x 105 Dc/ml 100-400 nM 37 ° C에서 1 시간 별도로, 라벨은 CD4+ CDDO-DFPA T 세포 (1 x 107/ml)의 유무에 15 분 동안 37 ° C에서 1 μ M CFSE와, PBS로 세척 2 x 106 T 셀/ml에서 최종 농도 얻으려면 볼륨을 조정 하 고.</li>
		<li>다음으로 96 잘 접시에서 공동 CFSE 표시 된 CD4의 동일한 볼륨 처리 수지상 세포의 100 μ 문화+ T 세포, 1시 10분을 위의 단계에서 수집 된 둘 다 비율. 이제 보육의 2-3 일 후 잘 측정 CFSE 강도 cytometry에 의하여 T 세포의 당 100 ng/mL ovalbumin (OVA) 펩 티 드 323-329를 추가 합니다. 참고: 셀 숫자와 비율 Dc와 T의 세포 우리의 이전 작품37에서 최적화 되었습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
수동 유도 BMDCs를 주입 하 여 EAE Myelin Oligodendrocyte 당단백질 (MOG) (35-55)와 펄스
	<ol>
<li>1 시간 잠복기에 대 한 100-400 nM CDDO DFPA의 유무에서 문화 매체와 1 x 106 BMDCs/ml 6 잘 플레이트에 잘 당 2 ml 접시.</li>
		<li>추가 10 ng/ml LPS의 잠복기 24 시간.</li>
		<li>추가 100 μ g/ml 집 고 양이 (35-55)의 잠복기 4 시간.</li>
		<li>셀 펜션과 5 분에 대 한 300 x g에서 원심 분리기를 수확.</li>
		<li>PBS와 셀 펠 릿 resuspend 및 셀.</li>
		<li>피하 주사 200 μ 2 x 106 셀 8 10 주 오래 된 여성 C57BL/6 마우스 (100 μ 각 뒷 다리에).</li>
		<li>BMDC 주입 및 48의 날에 시간. 나중에, 200 주사 각 마우스에 백 일 해 독 소 (PTX)의 ng.</li>
		<li>반복 단계 3.2.6-3.2.7 4 연속적인 주 동안 매주 한 번 합니다.</li>
		<li>표준 기준37 (0.5-다리를 절 며 꼬리 끝, 1-다리를 절 며 꼬리, 2-보통 후방 사지 약점, 3 심각한 후방 사지 약점, 4 완전 한 뒷 다리 마비, 5 사지 또는 죽어가는 상태, 6-죽음)를 사용 하 여 매일 EAE의 임상 증상을 평가 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

이 문서 사용할 수 있습니다. reproducibly iDCs를 생성 하 고 이후에 TolDCs로 그들을 분화 하는 효율적인 프로토콜을 설명 하 고 우리가 제안 하는이 TolDC를 유도 하기 위해 새로운 분자 대상 에이전트의 용량 평가에 적용할 수 있습니다. 표현 형입니다. 이 보고서에 설명 된 대로 우리는 우리가 먼저 표면 ligands의 TolDC 표현에 의해 분석 cytometry qRT-PCR과 ELISA로 측정 된 DC cytokine 프로필의 평가 다음 순서를 따라. 마지막으로, TolDCs의 immunoregulatory 함수는 그들의 용량을 줄이기 위해 T 세포 확산에서 생체 외에서 그리고 vivo에서, MS의 전 임상 murine EAE 모델을 사용 하 여 면역을 억제 하기 위해 그들의 효능을 입증 함으로써 확인 되었다.
우리의 프로토콜 iDCs 생성 하 고 GM-CSF와 IL-4의 조합으로 murine 골 수 선구자에서 분화 했다. 다른 프로토콜 iDCs44생성 하 문화 매체에서 양식 같은 티로신 키 니 아 제 3 ligands (Flt3L)를 사용 했습니다. Flt3L 사용 iDCs의 수확량을 증가 시키지만, 이러한 iDCs 일반적으로 걸릴 2 일 (9 일) 수확, GM-CSF/IL-4 추가 (7 일)44에 비해. 종종 Flt3L에서 생성 하는 iDC 두 cDCs로 분화 하는 더 중요 한 것은, (CD8- 와 CD8+) 및 Pdc45 기능 이었던 phenotypically 및 등가물 정상 dc vivo에서. 그러나, GM-CSF/IL-4 변함없이 유도 하지 cDCs 향해 iDC의 차별화 (CD8-)44 만 성숙 하는 동안 그들은 염증 Dc46의 비슷한 문자를 시연 했다. 그것은 GM-CSF/IL-4 monocytes 또는 CD34에서 Dc를 차별화의 이점 때문에 임상 및 기초 연구에서 자주 사용 됩니다 알고+ 창시자44. 이러한 두 가지 방법에서 생성 된 iDCs 형태학 상으로 다른 세포, 또한 다른 세포 표면 마커를 보유 하 고 그들의 활성화 시 가지 cytokine 단면도 전시 생산으로 표시 되었습니다. 또한, 이러한 방법으로 유도 하는 TolDCs 그들의 능력과 혈 요인에 대 한 응답에서 마이그레이션하는 항 원 특정 T 세포 응답44,45유도 다. 우리는 이해 CD8+ Dc TolDC 유도 cross-tolerance47의 그들의 독특한 능력 때문에 더 많은 잠재력을 전시 수 있습니다. 그러나, 다음 필요한 추가 셀 Flt3L 특정 CD8 조사에 의해 파생 된 BMDCs에서 정렬+ DC 하위 집합. 또한, 이후, GM-CSF/IL-4 유도 BMDCs는 우수한 T 세포 자극 및 염증 성 중재자 LPS 치료44,45다음의 생산에서 우리는이 전략 더 많은 재현성 결과 준 발견 우리의 실험입니다.
BMDCs GM-CSF/IL-4 시작 하루 4 CD11c 표현 하 고 하루 648후 식을 풍부 하 게에서 파생. 문화 이렇게 하루 10-12의 골 수 세포와 낮은 낮은 도금 밀도와 복용량 GMC SF의 하루에 8-1049때까지 지속 될 수 있습니다. 이 프로토콜에서 CDDO-DFPA (합성 triterpenoid)와 LPS 추가 되었다에 각각 DC 허용 오차 및 성숙 유도 요원으로. 우리는 최근 iDCs BMDC 세대의이 방법을 활용 하 여 문화에서 수확 때 CDDO DFPA37와 청소용 기능 TolDC 형을 전시 했다. 그것은 CDDO-DFPA에 추가 되었다 문화 iDC (주 7)37, 에이전트에 추가 되어야 합니다 문화 여러 번 iDC 차별화 (일 2, 4, 6)50중 비타민 D3 같은 달리 수확 후 주목 된다. 또한, 비타민 d 3에 의해 TolDCs의이 유도 중 고 iDC 차별화51후 시작 해야 하는 다양 한 메커니즘에 달려 있습니다. 우리의 데이터 제안는 CD11c + Dc의 순수성에 아무런 영향을 미치지 했다 iDC 차별화 중 CDDO-DFPA를 추가 하지만 날 7 iDCs의 수익률 (데이터 표시 되지 않음) 낮은 복용량 의존 했다. 우리의 분석 또한 iDC CDDO DFPA37의이 농도 가진 정상적인 생존 했다 하더라도 이러한 실험에 사용 되는 CDDO DFPA의 높은 농도 골 조상 세포 독성이 있을 수 있습니다 것이 좋습니다. 그것은 TolDC 유도 타이밍의 영향 및 CDDO DFPA와 같은 대리인에 노출의 길이의 주의 깊은 분석 하 여 최적화 될 수 있습니다 예상.
그것은 다른 방법 및 메커니즘을 통해 iDCs 유도 될 수 있다 mDCs에 LPS, CD40L, TNF-α와 IFN-γ52보다 다른 사람에 의해 고려 하는 것이 중요. DC 성숙 수용 체 통행세 같이 통해 LPS에 의해 4(TLR4) 지도 핵 요인-κB (NF κB), p38 물질 활성화 한 단백질 키 니 아 제 (p38 MAPK), c 6 월 N 맨끝 키 니 아 제 (설립)를 포함 하 여 여러 가지 녹음 방송 요인의 활성화 및 세포 외 신호 통제 단백질 키 (ERK1/2) CD40 및 TNF 수용 체를 통해 CD40L와 TNF-α에 의해 Dc의 성숙은 각각 NF κB 통로 유도합니다. 반면, IFN-γ Janus 키 니 아 제 (JAK), 티로신 키 니 아 제 (TYK), 및 신호 변환기의 활성화 및 전사 단백질 (통계)의 활성 제를 포함 하 여 다른 통로 자극 하 고 이러한 다운스트림 효과 또한 활성화에 의해 보충 된다 NF-κB 통로52의. 또한, CD40L/TNF-α-기반 DC 성숙의 유전자 식 프로필이이 Dc T 세포 Th2 세포 응답53으로 분극, 제안 하는 동안 DC 성숙 IFN-γ에 의해 강하게 Th1 세포 응답54쪽으로 치우친 다. 따라서, 이러한 DC 성숙의 다른 inducers T 세포 특정 하위 집합으로 차별화에 연결 된이 프로토콜에 고용 하지 됩니다.
몇몇 보고는 ex vivo보여주었다-차별화 된 Dc EAE 임상 증상 및 병 리 쥐55에서 전체 스펙트럼을 유도 할 수 있다. 다른 실험실에 의해 다양 한 수정 전 비보 활성화 DCs에 의해 수동 EAE 유도의 방법 채택 되었다. BMDCs, 7 일 전에 집 고 양이와 예방 접종을 준비 하는 집 고 양이의 행정에 의해 수동 및 활성 EAE 유도의 조합 하 고 완전 한 Freund의 보조 제 (CFA) 높은 임상 증상 점수 (피크 임상 점수: 3.5) 수동 EAE에 비해 집 고 양이의 행정에 의해 유도 됐다는 혼자 BMDCs (피크 임상 점수: 2)56. 집 고 양이 결합 하는이 방법으로 결과 액 BMDCs MOG 면역 그 질병 발병 하루 9 집 고 양이 CFA56와 예방 접종 후에 일어나 나왔다. 그러나, CFA 관리57의 사이트에 중요 한 염증 발생 알려져, 이후 우리는 활용 수동 EAE 유도 우리의 프로토콜에 혼자 Dc의 행정에 의해 효과적으로 EAE 동안 TolDCs의 효과 분석 하기 위하여. 더 TolDCs의 기능 형 확인, 하나 또한 활성 EAE 쥐의 임상 증상 억제에 그들 테스트 해야 합니다. Dc의 관리 경로 또한 EAE 증상58의 유도에 중대 하다. 우리의 실험실과 다른 사람에 의해 보고, 일주일에 한 번 3-4 주사의 총에 대 한 C57BL/6 마우스의 측면 지역에 BMDCs의 피하 주입 유도 주위 EAE의 피크 임상 점수 2-2.5 일 11-1237 에 재현 질병 발병 58. 우리는 능동 및 수동 EAE 유도 (비디오 1) 사이의 서로 다른 임상 증상을 설명 하는 짧은 클립을 제공 합니다.
우리의 프로토콜의 인식된 한계 포함 고용 하는 방법에 필요한 시간과 BMDC 차별화 아닌 순수 관련 microenvironment에 의존 합니다. 그러나, 항 체 농축 Dc에 대 한 컬렉션의 열 분리 방법 murine 비장에서 T 세포는 더 많은 시간 효율적인 있을 수 있습니다 하는 동안에, 그것은 원하는 DC 인구의 낮은 수확량에서 겪고 있다. 따라서, 골 파생 DC 개발의 방법의 장점은 DC 인구 전체 비장 항 체 열 분리에 비교 될 때의 로그 규모 높은 수익률 이다. Dc 생성 된 위에서 설명한 체 외에서 이 방법으로는 순수 microenvironment59 비보에 DCs 관련 이며 또한 장기 보장 하지 않습니다 cytokine 보충의 높은 농도 필요 DC의의 지속 가능성 GM-CSF 우리의 프로토콜에 사용 하지 일반 DC 차별화 vivo에서60에 대 한 필수적인 cytokine 이기도 합니다. 그럼에도 불구 하 고, 제안 된 BMDC 세대 프로토콜 reproducibly 기능 TolDCs의 높은 부분을 생성 하 고 tolerogenic 속성 기능 Dc를 생성 하기 위한 매우 안정적이 고 재현 가능한 방법으로 간주 되어야 한다.
끝으로, 여기에 설명 된 프로토콜에서 생성 된 TolDCs 특징 수 있습니다 효과적으로 그들의 유전자와 단백질 표정 단면도 평가 하 여, T 세포-종속 면역 응답에 생체 외에서변조 하는 것 그들의 용량 결정 및 EAE 유도 vivo에서억제 하는 입양 세포 치료로 그들의 기능을 평가. 우리의 프로토콜 어떤 새로운 에이전트의 능력을가지고 생각 TolDCs를 유도 하 고 더 가속 치료 개발 과정 TolDCs에 대 한 벤치에서 병원 평가 위한 프레임 워크를 제공 합니다.

모 수석 세포 (DCs)은 타고 난 면역 시스템의 필수적인 부분 및 처음 발견 되었고 기본 전문 항 원 제시 세포1로 1973 년에 랄 프 Steinman와 Zanvil Cohn에 의해 특징. Dc 링크 타고 난 및 적응형 면역 시스템22 차 림프 기관에 T 세포와 B 세포 중요 한 조직 적합성 복합물 (MHC) 통해 처리 항을 제시 하 여 면역 활성화에 중요 한 역할을 재생 표시 되었습니다. 포유류 면역 시스템에서 Dc 골수성 Dc 및 plasmacytoid Dc (Pdc)3설명의 적어도 두 종류 있습니다. 기존의 DCs (cDCs)는 CD11c 표현의 특징이 며 골 조상 세포 또는 말 초 혈액 monocytes 사용 미 숙 Dc (iDCs) 체 외 로 분화 될 수 있다로 알려져 골수성 Dc granulocyte 대 식 세포 콜로 니 자극 인자 (GM-CSF) 고 murine 또는 인간 종에서 각각4일 4.
'위험'을 활성화 신호, 병원 체 관련 된 분자 패턴 (PAMP) 또는 손상에 관련 된 분자 패턴 (습기), 다양 한 패턴 인식 수용 체 바인딩를 통해 성숙한 Dc (mDCs)으로 면역성 Dc 향해 iDCs 성숙 드라이브 것 이다와 같은 DC 표면5. 면역성 Dc 더 프라임 naïve T 세포 확산 및 MHCII2, costimulatory ligands (CD80, CD86, CD40)6, cytokines, 및 다른 수용 성 중재자7의 upregulation 통해 감 별 법. 면역성 Dc에서 프로-염증 성 중재자 생산의 T 세포 중재 하는 cytokine 분화에 대 한 필수적입니다. 예를 들어 IFN-γ와 IL-12은 Th1 차별화8 및 일리노이-1, 필요 일리노이-6, 및 IL-23가 순진한 Th17 세포9으로 T 세포 양극 화 합니다. 성숙한 Dc 외국 항 원에 반응, 비록 자기 항 원에 의해 통제 DC 활성화 수 있습니다 허용 오차 제거 원인과 그 활성화 조직 파괴10 리드 autoreactive T 세포를 생성 하 여 자가 면역 질환의 개발 육성 .
최근 보고서 그들의 능력과 그들의 조직 microenvironment 내에서 다른 큐와 상호 작용 하는 다른 이펙터/억압 DC 하위 집합으로 구분 하 여 exemplified 하는 DC가 소성의 분명 한 증거 제공. 안티-염증 성 중재자, IL-1011, TGF-β12,13 호-1 등 tolerogenic Dc (TolDCs)를 유도 하 여 면역 억제에 중요 한 역할을 재생 표시 되었습니다. 이 TolDCs는 규정 하는 기능을 취득 하 고 T 세포 확산14억제. 또한, DCs에 의해 공동 자극의 부족 TolDCs에서 안티-염증 성 중재자의 생산 모두 규제 T 세포 (Tregs)의 감 응 작용을 하 고도 효과적으로 억제 하는 Th1과 Th17 차별화 및 확장15. 과거 2 년간, TolDCs의 치료 잠재력 보고 되었습니다 여러 수 사관. 이러한 연구에서 전 비보 의 자가 면역 질환16 의 다른 전 임상 모델에서 TolDCs 뿐만 아니라 ameliorated 병 적인 증상을 생성 하지만 환자17 면역 관용의 개발을 ,18. 흥미롭게도, 오늘 TolDCs 치료는 되었습니다 간주 대체 또는 대체 접근 방식으로 자가 면역 질환 등 여러 가지 임상 실험에 타입 1 당뇨병 mellitus19, 류 마티스 관절염20, 21, 다 발성 경화 증 (MS)22,,2324, 그리고 Crohn의 질병25.
다양 한 프로토콜을 TolDCs를 개발 하기 위해 고용 되어 있으며 여러 실험실 생성 및 TolDCs의 phenotypic 특성에 대 한 방법을 보고 있다. Reproducibly 조 혈 창시자에서 생체 외에서 TolDCs 생성 하 고 안정적으로는 tolerogenic 상태 vivo에서26,,2728,29에서 그들을 유지 하기 위해이 메서드를 사용할 수 있습니다. iDCs 다양 한 immunomodulatory 약리학 대리인 또는 항 염증 성 cytokines에 노출에 의해 TolDCs로 변환할 수 있습니다. 예를 들어 비타민 d 3는 IL-10 생산을 증강 하 고 Dc에서 IL-12 분 비를 억제 하 고 그로 인하여 그들의 면역 기능30높일 수 알려져 유명한 약리 에이전트. 또한, Dc lipopolysaccharides (LPS) 등 강력한 염증 성 자극에 노출 되 면 dexamethasone31, rapamycin32, 코르 티 코 스테로이드33 등 여러 가지 약리 에이전트 표시 되었습니다 유도 하는 CD40, CD80 그리고 CD86, MHCII34의 DC 표면 식 줄여 TolDC 표현 형. IL-10과 TGF-β는 DC 내성35 와 이러한 cytokines의 둘 다에 수 반하는 노출 유도를 대부분 공부 항 염증 성 cytokines Dc36에서 tolerogenic 표현 형을 유도 하기 위해 표시 되었습니다.
DC phenotypic 표식으로 있다 보다는 기능적 특성에 의해 정의 됩니다 tolerogenic 이후 큰 TolDCs의 세포 및 기능 특성에 대 한 일관 된 방법을 개발 해야 합니다. 또한, 엄격 하 고 일관 된 프로토콜을 설정 해야 합니다 일관 된 평가 및 tolerogenic DC 형의 특성에 대 한 만약 우리가 효과적으로 그리고 reproducibly에서 TolDC 표현 형을 유도 하기 위해 새로운 에이전트의 능력을 비교 하는 실험실입니다. 여기 우리가 제공 상세한 프로토콜 단계별 방법 iDCs 마우스의 조 혈 창시자에서 분리 하 고 이후 TolDCs로 iDCs를 변환 하는 그들의 능력에 대 한 평가에서 새로운 에이전트의 효능을 분석 하는 강력한를 제공 하 TolDCs의 기능 그리고 phenotypic 특성 모두 생체 외에서 그리고 vivo에서. 이 설명에는 그들의 표면 ligands, cytokine 단면도, 및 면역 기능에 생체 외에서TolDCs 하는 정교한 메서드가 포함 됩니다. 우리는 또한 MS, 실험적인 자기 면역 뇌 (EAE)의 전 임상 모델에서 이러한 TolDCs의 잠재적인 치료 응용 프로그램을 탐색 하는 방법의 예를 제공 합니다. 이 설립된 프로토콜 조사 TolDCs의 유도 홍보 하기 위해 새로운 에이전트의 용량을 평가 하는 데 도움이 됩니다 그리고 TolDC 치료 개발의 범위를 확대 하기 위해 노력을 촉진 한다.

<table><tbody><tr><td>CDDO-DFPA (RTA-408)</td><td>Reata Pharmaceuticals</td><td>in house synthesis</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>Mouse GM-CSF</td><td>Peprotech Inc.</td><td>315-03</td><td>BMDC differentiation</td></tr><tr><td>Mouse IL-4</td><td>Peprotech Inc.</td><td>214-14</td><td>BMDC differentiation</td></tr><tr><td>Lipopolysaccharides (LPS)</td><td>Sigma Aldrich Inc.</td><td>L2880</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>&amp;beta;-mercaptoethanol</td><td>Sigma Aldrich Inc.</td><td>516732</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>Pertussis toxin (PTX)</td><td>R&amp;amp;D systems</td><td>3097</td><td>EAE induction</td></tr><tr><td>MOG (35&amp;ndash;55) peptide</td><td>21stCentury Biochemicals</td><td>in house synthesis</td><td>EAE induction</td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>15250-061</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>RPMI-1640 plus L-glutamine</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11875-093</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>Non-essential amino acid (100X)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11140050</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15630080</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>penicillin/streptomycin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140122</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>40 &amp;#956;m cell strainer</td><td>Corning</td><td>352340</td><td>Cell isolation</td></tr><tr><td>PE-conjugated CD80</td><td>BD Biosciences</td><td>557227</td><td>Flow cytometry</td></tr><tr><td>PE-conjugated CD86</td><td>BD Biosciences</td><td>555665</td><td>Flow cytometry</td></tr><tr><td>PE-conjugated PD-L1</td><td>BioLegend</td><td>124307</td><td>Flow cytometry</td></tr><tr><td>APC-conjugated MHCII</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-112-388</td><td>Flow cytometry</td></tr><tr><td>APC-conjugated CD11c</td><td>BD Biosciences</td><td>340544</td><td>Flow cytometry</td></tr><tr><td>Isotype matched PE</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-091-835</td><td>Flow cytometry</td></tr><tr><td>Isotype matched APC</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-091-836</td><td>Flow cytometry</td></tr><tr><td>CFSE</td><td>BioLegend</td><td>423801</td><td>T cell proliferation assay</td></tr><tr><td>Pan dendritic cell isolation kit</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-100-875</td><td>T cell proliferation assay</td></tr><tr><td>FcR Blocking Reagent</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-100-875</td><td>T cell proliferation assay</td></tr><tr><td>Pan Dendritic Cell Biotin-Antibody Cocktail</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-100-875</td><td>T cell proliferation assay</td></tr><tr><td>Anti-Biotin MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-100-875</td><td>T cell proliferation assay</td></tr><tr><td>CD4+ T cell isolation kit</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-104-454</td><td>T cell proliferation assay</td></tr><tr><td>CD4+ T cell Biotin-Antibody Cocktail</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-104-454</td><td>T cell proliferation assay</td></tr><tr><td>Anti-Biotin MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-104-454</td><td>T cell proliferation assay</td></tr><tr><td>ACK lysing buffer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1049201</td><td>BMDC differentiation</td></tr><tr><td>1 ml syringe</td><td>BD Biosciences</td><td>309626</td><td>T cell proliferation assay</td></tr><tr><td>3 ml syringe</td><td>BD Biosciences</td><td>309588</td><td>BMDC differentiation</td></tr><tr><td>25G needle</td><td>BD Biosciences</td><td>309626</td><td>T cell proliferation assay</td></tr><tr><td>23G needle</td><td>BD Biosciences</td><td>309588</td><td>BMDC differentiation</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich Inc.</td><td>A2058</td><td>T cell proliferation assay</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15575020</td><td>T cell proliferation assay</td></tr><tr><td>LS Column</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-042-401</td><td>T cell proliferation assay</td></tr><tr><td>Pre-Separation Filter</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-095-823</td><td>T cell proliferation assay</td></tr><tr><td>collagenase D</td><td>Sigma Aldrich Inc.</td><td>11088858001</td><td>T cell proliferation assay</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14025076</td><td>T cell proliferation assay</td></tr><tr><td>ovalbumin (OVA) peptide 323&amp;ndash;329</td><td>Sigma Aldrich Inc.</td><td>O1641</td><td>T cell proliferation assay</td></tr><tr><td>Mouse IFN-&amp;gamma; TaqMan probe</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Mm01168134_m1</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>Mouse IL-12a TaqMan probe</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Mm00434165</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>Mouse IL-12 p70 DuoSet ELISA</td><td>R&amp;amp;D systems</td><td>DY419-05</td><td>ELISA</td></tr><tr><td>Mouse EDN-1 ELISA</td><td>RayBiotech</td><td>ELM-EDN1-1</td><td>ELISA</td></tr><tr><td>TNF-&amp;alpha; TaqMan probe</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Mm00443258</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>Mouse TNF-&amp;alpha; Quantikine ELISA Kit</td><td>R&amp;amp;D systems</td><td>MTA00B</td><td>ELISA</td></tr><tr><td>IL-6 TaqMan probe</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Mm00446190</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>Mouse IL-6 Quantikine ELISA Kit</td><td>R&amp;amp;D systems</td><td>M6000B</td><td>ELISA</td></tr><tr><td>IL-23a TaqMan probe</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Mm01160011</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>Mouse IL-23 DuoSet ELISA</td><td>R&amp;amp;D systems</td><td>DY1887-05</td><td>ELISA</td></tr><tr><td>IL-4 TaqMan probe</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Mm99999154_m1</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>IL-10 TaqMan probe</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Mm01288386_m1</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>TGF-&amp;beta; TaqMan probe</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Mm01178820_m1</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>Anti-Heme Oxygenase 1 antibody</td><td>Abcam</td><td>ab13248</td><td>Western blotting</td></tr><tr><td>Anti-&amp;beta;-actin antibody</td><td>Abcam</td><td>ab8226</td><td>Western blotting</td></tr><tr><td>CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System</td><td>Bio-Rad Inc.</td><td></td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>BD FACSCalibur Cell Analyzer</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Flow cytometry</td></tr></tbody></table>

development and functional characterization of murine tolerogenic dendritic cells

면역 체계는 외국 항 원에 대 한 조정 응답 사이 단단한 균형을 유지 하 여 운영 하 고 공생 생물에서 파생 된 항 원 뿐 아니라 자기 항 원에 대 한 응답 상태를 유지 하. 이 면역 항상성 장애 만성 염증 및 면역의 개발에 발생할 수 있습니다. 모 수석 세포 (DCs) 외국 항 원에 대 한 면역 반응 시작 naïve T 세포 활성화에 관련 된 타고 난 면역 계통의 전문 항 원 제시 세포 이다. 그러나, Dc T 세포 허용을 추진 하 고 유지 하 고 어느 면역 또는 만성 염증의 발전에 기여 하는 효과 기 세포를 억제 하는 TolDCs에 또한 분화 될 수 있습니다. TolDCs의 우리의 이해에 있는 최근 전진 그들의 분화 상태를 변조 하 여 DC 허용 오차를 얻을 수 있습니다 나왔다. 이 현상을 면역 관용에 휴식을 인해 발생 하는 수많은 면역 장애에 대 한 TolDC 요법 개발에 엄청난 성장을 주도하 고 있다. 전 임상 면역 murine 모델에서 성공적인 연구 자가 면역 질환의 치료에 TolDCs의 immunotherapeutic 유틸리티 유효성 검사 추가 있다. 오늘, TolDCs는 보호 면역을 그대로 하면서 병원 성 면역 응답을 대상으로 다양 한 면역 질환에서 면역 관용을 복원에 대 한 클리닉에서 유망한 immunotherapeutic 도구 되고있다. 전략의 배열을 TolDCs를 유도 하기 위해 여러 연구소에 의해 제안 되었습니다, 이러한 세포의 세포 고 기능 형 특성화에 없음 일관성. 이 프로토콜은 골 파생 Dc 큰 숫자, 합성 triterpenoid 2-cyano-3,12-dioxooleana-1,9-dien-28-oic와 TolDCs로 그들을 차별화 하는 데 사용 되는 독특한 방법의 개발에 대 한 단계별 가이드를 제공 합니다. 산 성-difluoro-틸-아 미드 (CDDO-DFPA), 그리고 TolDCs의 필수 분자 서명의 분석을 포함 하 여 그들의 표현 형을 확인 하는 데 사용 하는 기술. 마지막으로, 우리는 그들의 면역 반응에서 생체 외에서 그리고 vivo에서 다 발성 경화 증의 전 임상 모델에서 테스트 하 여 TolDC 기능을 평가 하는 방법을 보여줍니다.

차별화와 BMDCs의 선택:
골 조상 세포는 7 일 (그림 1A)로 iDCs 분화 GM-CSF와 IL-4의 완전 한 RPMI 매체에 경작 했다. 하루에 1, 셀 크기에 작은 되었고 구형 형태를 보였다. 3 일에 신선한 매체의 교체 형태 클러스터 셀을 도움이 CD11c의 인구 증가 하기 전에 PBS로 세척+ 세포. 하루에 4, BMDCs 크기에서 확대 됐다 하 고 클러스터 형성을 시작. 준수 세포 또한 변환 하 고 길쭉한 모양으로 접시의 아래쪽에서 관찰 했다. 5 일에 BMDCs의 대형 크기의 클러스터 형성 된다. 6 일에 반 부착 및 부동 BMDCs의 많은 또한 관찰 되었다. BMDCs 제 7 일에 수확 되었고 cytometry murine Dc의 특정 마커로 CD11c 식에 대 한 분석. 그림 1B에서 대표적인 교류 cytometry 음모 같이 약 CD11c 표현 하는 BMDCs의 83.6%가이 방법에 의해 얻은 했다.
유도 및 TolDCs의 유전 특성:
TolDCs, 비타민 D338 및 dexamethasone39, 등 유도 알려진 에이전트의 일부 다운 규제 등 MHC II와 costimulatory 분자, CD40, CD80, CD86 DC 표면 ligands의 표현으로 알려져 있습니다. 대조적으로, 중 LPS의 컨텍스트 또는 Dc의 성숙 CD40L 유도, calcineurin 억제제 cyclosporin A와 FK506 보여주었다 CD83, CD80 그리고 CD86, MHC II33의 표현에는 영향을 주지 않습니다. 교류 cytometry 분석에 의해 같이, TolDC CDDO-DFPA에 의해 유도 CD80, CD86, MHC II, PD-L1, CD40 등 Dc의 표면 ligand LPS 유발 식에 더 큰 영향을 했다. (그림 2)입니다.
또한, BMDCs의 비교 transcriptome와 사이토카인 분석 치료 또는 CDDO DFPA 없이 존재 또는 부재 LPS의 묘사 변조 염증 유전자 프로 파일. CDDO-DFPA 치료 IFN-γ, 일리노이 등 유도 LPS 프로-염증 성 cytokine 유전자 감소-12, EDN1, TNFα, 일리노이-6, 일리노이-23 (그림 3A-3 층). 이러한 cytokines Th1 알려져 있다 (IFN-γ와 IL-12)와 Th17 (일리노이-6, 일리노이-23) 세포 감 별 법. 또한, CDDO-DFPA BMDCs 향상 된 표현의 예: IL-4, 안티-염증 성 cytokine 유전자 보였다 치료 IL-10, TGF-β, 및 호-1 (그림 4A-4D). 이러한 항 염증 유전자 Th2 홍보 함으로써 면역 변조기를 알려져 있다 (IL-4) 및 (IL-10과 TGF-β) Treg 세포 분화. 40 여기 그것은 독특한 IL-12−; IL-10+ cytokine 생산36, 호-1 식13, 유도 및 억제 EDN 141 의 CDDO DFPA 치료에 의해 유도 된, 모두 알려진 Dc tolerogenic 기능 인증입니다.
TolDCs의 세포 및 기능 특성 체 외
T 세포 중재 하는 DC 확산 costimulatory 표면 ligand의 약혼 cytokines, 수용 성 중재자7의 분 비에 의해 트리거될 수 알려져 있다. 그러나, TolDCs 몇 가지 메커니즘을 통해 T 세포 응답 억제: autoreactive 셀의 삭제를 적극적으로 홍보 하 여 고 Tregs42naïve T 세포의 양극 화를 촉진 함으로써 T 세포 아를 유도. 우리는 이미 CDDO DFPA의 기능 특성화 유도 TolDCs37을 보고 있다. T 세포 아 및 삭제 autoreactive T 세포의 수 분석 하지 독립적으로 표면 마커 또는 Annexin V/7-AAD 얼룩을 선택 하 여. 그러나, 우리가 직접 확인 하지이 형 T 세포 확산 지 수를 측정 하 여. 이 위해, 우리는 C57BL/6 OTII 유전자 변형 쥐 T 세포를 활용 하 고 syngeneic Dc C57BL/6 마우스에서 추출 하 고 CDDO DFPA의 유무에 관계 없이 치료에 그들을 노출. 이 Dc 세척 되었고 OVA 펩 티 드와 T 세포를 얼룩이 CFSE와 공동 경작. 우리는 CDDO DFPA 미리 치료 Dc, 제안 하는 그들의 tolerogenic 표현 형 (그림 5)에 의해 T 세포 확산에 상당한 감소를 관찰.
Vivo에서 면역의 전 임상 모델에서 TolDCs의 기능 특성
마지막으로, 전 임상 vivo에서 모델 특징 또는 염증 성 면역 기능에 DFPA 이용한 TolDCs의 기능을 테스트할 수 있습니다. 이후, EAE 임상 면역 중재 하는 중앙 신경 조직 질병, MS43의 널리 인정된 전 임상 murine 모델, 우리는 우리의 현재 연구에 이것을 활용. 더는 vivo에서 시험 하기 위하여 CDDO DFPA의 기능 유도 TolDCs, 우리는 수동 EAE의 전 임상 murine 모델에 그들을 도전. 이 위해, BMDCs LPS와 집 고 양이 (35-55)의 존재에 CDDO DFPA 없이 경작 했다. 이러한 세포 그림 6A 에 표시 된 예정 된 프로토콜로 반복적으로 주입 후 했다 고 마우스 임상 증상의 발현에 대 한 정기적으로 관찰 했다. 그러나 예상 했던 대로, LPS, 집 고 양이 (35-55) 펄스 BMDCs EAE의 임상 증상을 보였다; CDDO-DFPA BMDCs 치료 그룹 보였다 지연된 발병을 크게 감소 임상 증상 (그림 6B)와 질병의 끝났다. 이러한 결과 TolDCs CDDO-DFPA 치료에 의해 유도 된의 면역 표현 형 검사.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57637/57637fig1.jpg"> 그림 1: 개발 및 BMDCs의 phenotypic 특성: (A) 골 수 세포 C57BL/6 마우스의 경골 및 대 퇴 골 뼈에서 밖으로 플러시 그리고 BMDCs를 더 분화. 적절 한 셀 클러스터 형성은 가벼운 현미경 검사 법 차별화 (스케일 바, 100µm)의 전체 기간 동안에 추적 됩니다. (B) BMDCs 차별화 FACS에 의해 분석 CD11c 표면 식으로 확인 됐다. 그래프 확대 CD11c의 비율 묘사+ 세포 인구. (C) Gating 전략 BMDCs 세포의 파편 (FSC SSC 대)를 제외 하 문이 처음 했다. 더블 릿 제외 게이트 셀 (FL2 승 대 FL2-A) singlets에 게이트를 이용 되었다. 내의 셀 내에서 라이브 셀 7 AAD 플롯 (FSC 대 7-AAD)에 문이 있었다. 다음 셀 추가 분석 되었고 CD11c 식에 갔는데. <a href="/files/ftp_upload/57637/57637fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57637/57637fig2.jpg"> 그림 2: DC 세포 표면 ligand 식 CDDO DFPA에 의해 불변 이다. 셀 존재 또는 CDDO DFPA의 부재에서 미리 치료 했다 (200 nM) LPS로 자극 하기 전에 1 시간 (100 ng/ml) 24 시간. CD86, CD40, CD80, PD-L1, MHC II의 세포 표면 표현 cytometry에 의해 분석 되었다. 이 그림에서 과학적 보고서 7, 문서 번호 수정 되었습니다: 9886 (2017), doi:10.1038 / s41598-017-06907-4. 복제 및 게시를 저작권 허가입니다. <a href="/files/ftp_upload/57637/57637fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57637/57637fig3.jpg"> 그림 3: CDDO DFPA BMDCs Dc. 면역성의 유전자 및 단백질 표현 형 변경 미리 1 시간 전에 LPS의 추가 대 한 존재 또는 부재 CDDO-DFPA (50-400 nM)의 치료 (100 ng/ml), RNA 추출 (4에 대 한 수확 중 시입니다.) 24 상태 문화 매체를 허용 또는 시간. 이전에 사이토카인 분석에 대 한 컬렉션. IL-12 (B), TNFα (D), 일리노이-6 (E), 및 IL-23 (F)의 수준은 qRT-PCR과 ELISA로 측정 되었다. 반면 IFN-γ (A)의 수준 qRT-PCR과 ELISA 혼자에 의해 EDN-1 (C)로 측정 되었다. 결과 평균 ± 사 우 스 다코타 3 실험으로 표현 됩니다. * P < 0.05, * * P < 0.01, * * * P < 0.001 LPS 처리 그룹에 비해. 짝이 없는 학생 t-테스트 합니다. 이 그림에서 과학적 보고서 7, 문서 번호 수정 되었습니다: 9886 (2017), doi:10.1038 / s41598-017-06907-4. 복제 하 고 저작권 허가 함께 게시. " <a href="/files/ftp_upload/57637/57637fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57637/57637fig4.jpg"> 그림 4: TolDCs 표현 형 유전자와 단백질 식으로 확인을 유도 하는 CDDO DFPA. BMDCs CDDO-DFPA (10-400 nM)의 유무에서 미리 치료 LPS의 추가 전에 1 시간 동안 했다 (100 ng/ml), 셀 24 후 RNA 추출에 대 한 수확 했다 시간. QRT-PCR에 의해 일리노이-4 (A), IL-10 (B), 및 TGF-β (C)의 수준은 측정 했다. (D) 세포 단백질 lysates 12에 수집 된 시간. 분석 및 호-1, 그리고 β-말라의 수준에 대 한 식 부 럽에 의해 결정 했다. 결과 평균 ± 사 우 스 다코타 3 실험으로 표현 됩니다. * P < 0.05, * * P < 0.01, * * * P < 0.001 LPS 처리 그룹에 비해. 짝이 없는 학생 t-테스트 합니다. <a href="/files/ftp_upload/57637/57637fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57637/57637fig5.jpg"> 그림 5: CDDO DFPA Dc 노출 T 세포 증식을 억제. DCs CDDO-DFPA (100-400 nM)과 사전 치료 1 시간만에 후 세척 하 고 공동으로 경작 CFSE 스테인드 T 세포는 1:10 비율. (A) 비장 T 세포와 Dc 각각 C57BL/6 마우스 C57BL/6 OTII 유전자 변형 쥐를 격리 했다. CDDO-DFPA 청소용된 Dc 공동 경작 했다 CFSE와 스테인드 (승)와 T 셀 없이 (제외) 외피 동안 OVA 추가. T 세포 증식은 하루 2에서 cytometry에 의해 결정 되었다. 그래프 T 세포 T 세포 숫자를 기준으로 나눈 비율을 나타냅니다. 데이터 3 독립적인 실험의 표현입니다. 이 그림에서 과학적 보고서 7, 문서 번호 수정 되었습니다: 9886 (2017), doi:10.1038 / s41598-017-06907-4. 복제 및 게시를 저작권 허가입니다. <a href="/files/ftp_upload/57637/57637fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57637/57637fig6.jpg"> 그림 6: DC 유도 수동 EAE TolDCs에 의해 폐지를 준비 하는 집 고 양이. (집 고 양이 (35-55)에 의해 A) EAE 유도-펄스 BMDCs. 성숙 BMDCs CDDO-DFPA의 유무에서 취급 했다 (400 nM)와 그 후 4 집 고 양이 (35-55)와 펄스 시간. 2 × 106 세포의 200 μ의 총 4 개의 주사의 총 한 번 매주 C57BL/6 마우스의 측면 지역으로 피하 주입에 의해 관리 되었다. 각 시간 PTX 관리 되었다 i.p. 주입 즉시 고 다시 2 일 후 (4 사이클에 하루 0). (B) 임상 점수 표준 기준을 사용 하 여 기록 된 모든 4 개의 주사 했다. 모든 데이터가 평균 ± S.E.M.로 제시 했다 * P < 0.05. 여러 t-테스트 Holm Sidak 분석 (n = 7 쥐 각 그룹에서). 이 그림에서 과학적 보고서 7, 문서 번호 수정 되었습니다: 9886 (2017), doi:10.1038 / s41598-017-06907-4. 복제 및 게시를 저작권 허가입니다. <a href="/files/ftp_upload/57637/57637fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Development and Functional Characterization of Murine Tolerogenic Dendritic Cells

여기, 선물이 개발 및 특성 tolerogenic 수지상 세포 (TolDCs) 하 고 그들의 immunotherapeutic 유틸리티를 평가 하는 프로토콜.

개발 및 Murine Tolerogenic 수지상 세포의 기능적 특성

The immune system operates by maintaining a tight balance between coordinating responses against foreign antigens and maintaining an unresponsive state ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Medicine

10.6K 조회수.  Case Western Reserve University. 여기, 선물이 개발 및 특성 tolerogenic 수지상 세포 (TolDCs) 하 고 그들의 immunotherapeutic 유틸리티를 평가 하는 프로토콜.

비디오: Development and Functional Characterization of Murine Tolerogenic Dendritic Cells

Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to infection. Because these are the most potent antigen presenting cells, DCs are being increasingly used as a vaccine vector to study the induction of antigen-specific immune responses. In this video, we demonstrate the procedure for harvesting tibias and femurs from a donor mouse, processing the bone marrow and differentiating DCs in vitro. The properties of DCs change following stimulation: immature dendritic cells are potent phagocytes, whereas mature DCs are capable of antigen presentation and interaction with CD4+ and CD8+ T cells. This change in functional activity corresponds with the upregulation of cell surface markers and cytokine production. Many agents can be used to mature DCs, including cytokines and toll-like receptor ligands. In this video, we demonstrate flow cytometric comparisons of expression of two co-stimulatory molecules, CD86 and CD40, and the cytokine, IL-12, following overnight stimulation with CpG or mock treatment. After differentiation, DCs can be further manipulated for use as a vaccine vector or to generate antigen-specific immune responses by in vitro pulsing using peptides or proteins, or transduced using recombinant viral vectors. 

This video demonstrates the procedure for differentiating myeloid dendritic cells from mouse bone marrow. Isolation of mouse tibia and femur, and processing of bone marrow are demonstrated. Pictures demonstrating cell morphology before and after differentiation, and figures depicting cell phenotype and IL-12 production following maturation using CpG are shown.

골수 엽 성의 전구 물질에서 골수양 돌기 세포의 문화

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to ...

연구

생물학

Generation of Bone Marrow Derived Murine Dendritic Cells for Use in 2-photon Imaging

Several methods for the preparation of murine dendritic cells can be found in the literature. Here, we present a method that produces greater than 85% CD11c high dendritic cells in culture that home to the draining lymph node after subcutaneous injection and present antigen to antigen specific T cells (see video). Additionally, we use Essen Instruments Incucyte to track dendritic cell maturation, where, at day 10, the morphology of the cultured cells is typical of a mature dendritic cell and &lt;85% of cells are CD11chigh. The study of antigen presentation in peripheral lymph nodes by 2-photon imaging revealed that there are three distinct phases of dendritic cell and T cell interaction1, 2. Phase I consists of brief serial contacts between highly motile antigen specific T cells and antigen carrying dendritic cells1, 2. Phase two is marked by prolonged contacts between antigen-specific T cell and antigen bearing dendritic cells1, 2. Finally, phase III is characterized by T cells detaching from dendritic cells, regaining motility and beginning to divide1, 2. This is one example of the type of antigen-specific interactions that can be analyzed by two-photon imaging of antigen-loaded cell tracker dye-labeled dendritic cells.

Antigen presentation in secondary lymphoid organs by dendritic cells is crucial for the initiation of the T cell mediated adaptive immune response. Here we demonstrate the culture of bone marrow derived murine dendritic cells, activation, and labeling for 2-photon imaging.

골수의 생성은 2 광자 영상에서 사용하기 위해 Murine 돌기 세포를 유래

Several methods for the preparation of murine dendritic cells can be found in the literature. Here, we present a method that produces greater than 85% ...

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer's Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal Peyer&#39;s patch (PP). Common dendritic cell progenitors (CDPs, lin- c-kitlo CD115+ Flt3+) were purified from the bone marrow of C57BL6 mice by FACS and transferred to recipient mice that lack a significant pDC population in PP; in this case, Ifnar-/- mice were used as the transfer recipients. In some mice, overexpression of the dendritic cell growth factor Flt3 ligand (Flt3L) was enforced prior to adoptive transfer of CDPs, using hydrodynamic gene transfer (HGT) of Flt3L-encoding plasmid. Flt3L overexpression expands DC populations originating from transferred (or endogenous) hematopoietic progenitors. At 7-10 days after progenitor transfer, pDCs that arise from the adoptively transferred progenitors were distinguished from recipient cells on the basis of CD45 marker expression, with pDCs from transferred CDPs being CD45.1+ and recipients being CD45.2+. The ability of transferred CDPs to contribute to the pDC population in PP and to respond to Flt3L was evaluated by flow cytometry of PP single cell suspensions from recipient mice. This method may be used to test whether other progenitor populations are capable of generating PP pDCs. In addition, this approach could be used to examine the role of factors that are predicted to affect pDC development in PP, by transferring progenitor subsets with an appropriate knockdown, knockout or overexpression of the putative developmental factor and/or by manipulating circulating cytokines via HGT. This method may also allow analysis of how PP pDCs affect the frequency or function of other immune subsets in PPs. A unique feature of this method is the use of Ifnar-/- mice, which show severely depleted PP pDCs relative to wild type animals, thus allowing reconstitution of PP pDCs in the absence of confounding effects from lethal irradiation.

This protocol describes experimental procedures to assess the differentiation of plasmacytoid dendritic cells in Peyer&#8217;s patch from common dendritic cell progenitors, using techniques involving FACS-mediated cell isolation, hydrodynamic gene transfer, and flow analysis of immune subsets in Peyer&#8217;s patch.

조혈 전구 세포의 입양 전송을 사용 Peyer의 패치에 쥐과 Plasmacytoid 수지상 세포의 개발을 평가

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal ...

면역학 및 감염병학

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) are powerful type I interferon (IFN-I) producing cells that are activated in response to infection or during inflammatory responses. Unfortunately, study of pDC function is hindered by their low frequency in lymphoid organs, and existing methods for in vitro DC generation predominantly favor the production of cDCs over pDCs. Here we present a unique approach to efficiently generate pDCs from common lymphoid progenitors (CLPs) in vitro. Specifically, the protocol described details how to purify CLPs from bone marrow and generate pDCs by coculturing with &#947;-irradiated AC-6 feeder cells in the presence of Flt3 ligand. A unique characteristic of this culture system is that the CLPs migrate underneath the AC-6 cells and become cobblestone area-forming cells, a critical step for expanding pDCs. Morphologically distinct DCs, namely pDCs and cDCs, were generated after approximately 2 weeks with a composition of 70-90% pDCs under optimal conditions. Typically, the number of pDCs generated by this method is roughly 100-fold of the number of CLPs seeded. Therefore, this is a novel system with which to robustly generate the large numbers of pDCs required to facilitate further studies into the development and function of these cells.

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

In this study we present an in vitro culture system that can efficiently generate pDCs by co-culturing common lymphoid progenitors with AC-6 feeder cells in the presence of Flt3 ligand.

AC-6 공급 시스템을 사용하여 일반 림프 전구 세포에서 쥐 형질 수지상 세포의 체외 세대

Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) are powerful type I interferon (IFN-I) producing cells that are activated in response to infection or during ...

An Efficient and High Yield Method for Isolation of Mouse Dendritic Cell Subsets

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen presenting molecules to initiate T-cell-mediated immunity. Dendritic cells can be separated into several phenotypically and functionally heterogeneous subsets. Three important subsets of splenic dendritic cells are plasmacytoid, CD8&#945;Pos and CD8&#945;Neg cells. The plasmacytoid DCs are natural producers of type I interferon and are important for anti-viral T cell immunity. The CD8&#945;Neg DC subset is specialized for MHC class II antigen presentation and is centrally involved in priming CD4 T cells. The CD8&#945;Pos DCs are primarily responsible for cross-presentation of exogenous antigens and CD8 T cell priming. The CD8&#945;Pos DCs have been demonstrated to be most efficient at the presentation of glycolipid antigens by CD1d molecules to a specialized T cell population known as invariant natural killer T (iNKT) cells. Administration of Flt-3 ligand increases the frequency of migration of dendritic cell progenitors from bone marrow, ultimately resulting in expansion of dendritic cells in peripheral lymphoid organs in murine models. We have adapted this model to purify large numbers of functional dendritic cells for use in cell transfer experiments to compare in vivo proficiency of different DC subsets.

Distinct dendritic cell subsets exist as rare populations in lymphoid organs, and therefore are challenging to isolate in sufficient numbers and purity for immunological experiments. Here we describe a high efficiency, high yield method for isolation of all of the currently known major subsets of mouse splenic dendritic cells.

마우스 수지상 세포 하위 집합의 분리를위한 효율적이고 높은 수율 방법

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen ...

Generation of Immature, Mature and Tolerogenic Dendritic Cells with Differing Metabolic Phenotypes

Immune response results from a complex interplay between the antigen non-specific innate immune system and the antigen specific adaptive immune system. The immune system is a constant balance in maintaining tolerance to self-molecules and reacting rapidly to pathogens. Dendritic cells (DCs) are powerful professional antigen presenting cells that link the innate immune system to the adaptive immune system and balance the adaptive response between self and non-self. Depending on the maturation signals, immature dendritic cells can be selectively stimulated to differentiate into immunogenic or tolerogenic DCs. Immunogenic dendritic cells provide proliferation signals to antigen-specific T cells for clonal expansion; while tolerogenic dendritic cells regulate tolerance by antigen-specific T-cell deletion or clonal expansion of regulatory T-cells. Due to this unique property, dendritic cells are highly sought after as therapeutic agents for cancer and autoimmune diseases. Dendritic cells can be loaded with specific antigens in vitro and injected into the human body to mount a specific immune response both immunogenic and tolerogenic. This work presents a means to generate in vitro from monocytes, immature monocyte derived dendritic cells (moDCs), tolerogenic and mature moDCs that differ in surface marker expression, function and metabolic phenotypes.

Immature dendritic cells can be selectively differentiated into tolerogenic or mature dendritic cells to regulate the balance between immunity and tolerance. This work presents a means to generate from immature monocyte derived dendritic cells (moDCs), in vitro tolerogenic and mature moDCs that differ in metabolic phenotypes.

대사 표현형을 각기 다른 미성숙, 성숙 및 Tolerogenic 수지상 세포의 생성

Immune response results from a complex interplay between the antigen non-specific innate immune system and the antigen specific adaptive immune system. ...

Study of Dendritic Cell Development by Short Hairpin RNA-Mediated Gene Knockdown in a Hematopoietic Stem and Progenitor Cell Line In vitro

Dendritic cells (DCs) are important antigen-presenting cells that connect innate and adaptive immune responses. DCs are heterogeneous and can be divided into conventional DCs (cDCs) and plasmacytoid DCs (pDCs). cDCs specializes in presenting antigens to and activate na&#239;ve T cells. On the other hand, pDCs can produce large quantities of type I interferons (IFN-I) during viral infection. The specification of DCs occurs at an early stage of DC progenitors in the bone marrow (BM) and is defined by a network of transcription factors (TFs). For example, cDCs highly express ID2, while pDCs highly express E2-2. Since more and more subsets of DCs are being identified, there is a growing interest in understanding specific TFs controlling DC development. Here, we establish a method to screen TFs critical for DCs differentiation in vitro by delivering lentivirus carrying short hairpin RNA (shRNA) into an immortalized hematopoietic stem and progenitor cell (iHSPCs) line. After the selection and in vitro differentiation, cDC and pDC potential of the stable knockdown cell lines are analyzed by flow cytometry. This approach provides a platform to identify genes potentially governing DC fates from progenitors in vitro.

Study of Dendritic Cell Development by Short Hairpin RNA-Mediated Gene Knockdown in a Hematopoietic Stem and Progenitor Cell Line In vitro

Here we provide a protocol for screening potential transcription factors involved in the development of dendritic cell (DC) using lentiviral transduction of shRNA to obtain stable knockdown cell lines for in vitro DC differentiation.

대장포에이성 줄기및 전구세포주에서 짧은 헤어핀 RNA 중재 유전자 녹다운에 의한 수지상 세포 개발 연구

Dendritic cells (DCs) are important antigen-presenting cells that connect innate and adaptive immune responses. DCs are heterogeneous and can be divided ...

Economical and Efficient Protocol for Isolating and Culturing Bone Marrow-derived Dendritic Cells from Mice

The demand for dendritic cells (DCs) is gradually increasing as immunology research advances. However, DCs are rare in all tissues. The traditional method for isolating DCs primarily involves inducing bone marrow (BM) differentiation into DCs by injecting large doses (&#62;10 ng/mL) of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor/interleukin-4 (GM-CSF/IL-4), making the procedure complex and expensive. In this protocol, using all BM cells cultured in 10 ng/mL GM-CSF/IL-4 medium, after 3-4 half-culture exchanges, up to 2.7 x 107 CD11c+ cells&#160;(DCs) per mouse (two femurs) were harvested with a purity of 80%-95%. After 10 days in culture, the expression of CD11c, CD80, and MHC II increased, whereas the number of cells decreased. The number of cells peaked after 7 days of culture. Moreover, this method only took 10 min to harvest all bone marrow cells, and a high number of DCs were obtained after 1 week of culture.

Here, we present an economical and efficient method to isolate and generate high-purity bone marrow-derived dendritic cells from mice after 7 days of culture with 10 ng/mL GM-CSF/IL-4.

마우스로부터 골수 유래 수지상 세포를 분리하고 배양하기 위한 경제적이고 효율적인 프로토콜

The demand for dendritic cells (DCs) is gradually increasing as immunology research advances. However, DCs are rare in all tissues. The traditional method ...

A Simple and Efficient Method for Testing Immunomodulatory Agents for Generation of Tolerogenic Dendritic Cells from Human CD14+ Monocytes

Tolerogenic dendritic cells (tolDCs) are a subset of dendritic cells (DCs) that are known to influence na&#239;ve T cells toward a regulatory T cell (Treg) phenotype. TolDCs are currently under investigation as therapies for autoimmunity and transplantation, both as a cell therapy and method to induce tolDCs from endogenous DCs. To date, however, the number of known agents to induce tolDCs from na&#239;ve DCs is relatively small and their potency to generate Tregs in vivo has been inconsistent, particularly therapies that induce tolDCs from endogenous DCs. This provides an opportunity to explore novel compounds to generate tolerance.
Here we describe a method to test novel immunomodulatory compounds on monocyte-derived DCs (moDCs) in vitro and validate their functionality to generate autologous Tregs. First, we obtain PBMCs and isolate CD14+ monocytes and CD3+ T cells using commercially available magnetic separation kits. Next, we differentiate monocytes into moDCs, treat them with an established immunomodulator, such as rapamycin, dexamethasone, IL-10, or vitamin D3, for 24 h and test their change in tolerogenic markers as a validation of the protocol. Finally, we co-culture the induced tolDCs with autologous T cells in the presence of anti-CD3/CD28 stimulation and observe changes in Treg populations and T cell proliferation. We envision this protocol being used to evaluate the efficacy of novel immunomodulatory agents to reprogram already differentiated DCs towards tolDC.

We describe a procedure to assess the capacity for pharmacologic agents to generate tolerogenic dendritic cells from na&#239;ve monocyte-derived dendritic cells in vitro and validate their potency by autologous regulatory T cell generation.

인간 CD14+ 단핵구에서 톨러겐 수지상 세포 생성을 위한 면역조절제를 테스트하는 간단하고 효율적인 방법

Tolerogenic dendritic cells (tolDCs) are a subset of dendritic cells (DCs) that are known to influence na&#239;ve T cells toward a regulatory T cell ...

Generation of Immature, Mature, and Tolerogenic Dendritic Cells from Monocytes

Source: Sim, W. J. et al., <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/54128">Generation of Immature, Mature and Tolerogenic Dendritic Cells with Differing Metabolic Phenotypes.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2016).
This video demonstrates the generation of immature, mature, and tolerogenic dendritic cells, or DCs, from human monocytes. The incubation of monocytes with growth factors and cytokines leads to the production of immature DCs. In response to immune regulatory molecules, immature DCs differentiate into tolerogenic and mature DCs.

개발 및 Murine Tolerogenic 수지상 세포의 기능적 특성

요약

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