이 연구로는 국립 연구소의 건강 중화 프로그램 부처간 계약 # AOD13015-001 지원 되었다. 우리는 그들의 노력과 전문 비디오 제작에 대 한 스테파니 Froberg 피터 허스트를 감사 하 고 싶습니다.

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	<li>Randleman, B., Hampton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drugs, Diseases and Procedures. , (2011).</li><li>Fish, R., Davidson, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Management+of+ocular+thermal+and+chemical+injuries,+including+amniotic+membrane+therapy.">Management of ocular thermal and chemical injuries, including amniotic membrane therapy.</a> Current Opinion in Ophthalmology. 21 (4), 317-321 (2010).</li><li>Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+treatment+strategies+for+hydrofluoric+acid+burns:+current+status+and+future+prospects.">A review of treatment strategies for hydrofluoric acid burns: current status and future prospects.</a> Burns. 40 (8), 1447-1457 (2014).</li><li>Gaytan, B. D., Vulpe, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+toxicology:+tools+to+advance+the+future+of+toxicity+testing.">Functional toxicology: tools to advance the future of toxicity testing.</a> Frontiers in Genetics. 5, 110 (2014).</li><li>North, M., Vulpe, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+toxicogenomics:+mechanism-centered+toxicology.">Functional toxicogenomics: mechanism-centered toxicology.</a> International Journal of Molecular Sciences. 11 (12), 4796-4813 (2010).</li><li>McManus, M. T., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+silencing+in+mammals+by+small+interfering+RNAs.">Gene silencing in mammals by small interfering RNAs.</a> Nature Reviews Genetics. 3 (10), 737-747 (2002).</li><li>Bassik, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+mammalian+genetic+interaction+map+reveals+pathways+underlying+ricin+susceptibility.">A systematic mammalian genetic interaction map reveals pathways underlying ricin susceptibility.</a> Cell. 152 (4), 909-922 (2013).</li><li>Solaimani, P., Damoiseaux, R., Hankinson, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+RNAi+high-throughput+screen+identifies+proteins+necessary+for+the+AHR-dependent+induction+of+CYP1A1+by+2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin.">Genome-wide RNAi high-throughput screen identifies proteins necessary for the AHR-dependent induction of CYP1A1 by 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin.</a> Toxicological Sciences. 136 (1), 107-119 (2013).</li><li>Cox, J. A., Gooding, R., Kolakowski, J. E., Whitmire, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Chemical Terrorism Risk Assessment; CSAC 12-006. , (2012).</li><li>Zang, R., Li, D., Tang, I., Wang, J., Yang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-Based+Assays+in+High-Throughput+Screening+for+Drug+Discovery.">Cell-Based Assays in High-Throughput Screening for Drug Discovery.</a> International Journal of Biotechnology for Wellness Industries. 1, 31-51 (2012).</li><li>Ray, R., Hauck, S., Kramer, R., Benton, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+convenient+fluorometric+method+to+study+sulfur+mustard-induced+apoptosis+in+human+epidermal+keratinocytes+monolayer+microplate+culture.">A convenient fluorometric method to study sulfur mustard-induced apoptosis in human epidermal keratinocytes monolayer microplate culture.</a> Drug and Chemical Toxicology. 28 (1), 105-116 (2005).</li><li>Ruff, A. L., Dillman, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sulfur+mustard+induced+cytokine+production+and+cell+death:+investigating+the+potential+roles+of+the+p38,+p53,+and+NF-kappaB+signaling+pathways+with+RNA+interference.">Sulfur mustard induced cytokine production and cell death: investigating the potential roles of the p38, p53, and NF-kappaB signaling pathways with RNA interference.</a> Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. 24 (3), 155-164 (2010).</li><li>Smith, W. J., Gross, C. L., Chan, P., Meier, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+human+epidermal+keratinocytes+in+culture+as+a+model+for+studying+the+biochemical+mechanisms+of+sulfur+mustard+toxicity.">The use of human epidermal keratinocytes in culture as a model for studying the biochemical mechanisms of sulfur mustard toxicity.</a> Cell Biology and Toxicology. 6 (3), 285-291 (1990).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Toxnet. , (2016).</li><li>Bancroft, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Medical Department of the United States Army in the World War. 14, (1926).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Chloropicrin Risk Characterization Document. , (2012).</li><li>Aigueperse, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fluorine Compounds, Inorganic. Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry. , (2000).</li><li>Sotozono, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Second+Injury+in+the+Cornea:+The+Role+of+Inflammatory+Cytokines+in+Corneal+Damage+and+Repair.">Second Injury in the Cornea: The Role of Inflammatory Cytokines in Corneal Damage and Repair.</a> Cornea. 19 (6), S155-S159 (2000).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guidelines and Recommendations for Dharmacon siRNA Libraries. , (2015).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Lipofectamine RNAiMAX Reagent. , (2017).</li><li>Denizot, F., Lang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+colorimetric+assay+for+cell+growth+and+survival.+Modifications+to+the+tetrazolium+dye+procedure+giving+improved+sensitivity+and+reliability.">Rapid colorimetric assay for cell growth and survival. Modifications to the tetrazolium dye procedure giving improved sensitivity and reliability.</a> Journal of Immunological Methods. 89 (2), 271-277 (1986).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> IL-8 (human) AlphaLISA Detection Kit, 5,000 Assay Points. , (2016).</li><li>Araki-Sasaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+SV40-immortalized+human+corneal+epithelial+cell+line+and+its+characterization.">An SV40-immortalized human corneal epithelial cell line and its characterization.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 36 (3), 614-621 (1995).</li><li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays.">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li><li>Ruff, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+mouse+model+for+sulfur+mustard-induced+ocular+injury+and+long-term+clinical+analysis+of+injury+progression.">Development of a mouse model for sulfur mustard-induced ocular injury and long-term clinical analysis of injury progression.</a> Cutaneous and Ocular Toxicology. 32 (2), 140-149 (2013).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> GeneTitan MC Instrument North America/Japan (110V). , (2018).</li><li>Zhang, X. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pair+of+new+statistical+parameters+for+quality+control+in+RNA+interference+high-throughput+screening+assays.">A pair of new statistical parameters for quality control in RNA interference high-throughput screening assays.</a> Genomics. 89 (4), 552-561 (2007).</li><li>He, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Sodium+Fluoride+on+the+Proliferation+and+Gene+Differential+Expression+in+Human+RPMI8226+Cells.">Effect of Sodium Fluoride on the Proliferation and Gene Differential Expression in Human RPMI8226 Cells.</a> Biological Trace Element Research. 167 (1), 11-17 (2015).</li><li>Tabuchi, Y., Yunoki, T., Hoshi, N., Suzuki, N., Kondo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+and+gene+networks+involved+in+sodium+fluoride-elicited+cell+death+accompanying+endoplasmic+reticulum+stress+in+oral+epithelial+cells.">Genes and gene networks involved in sodium fluoride-elicited cell death accompanying endoplasmic reticulum stress in oral epithelial cells.</a> International Journal of Molecular Sciences. 15 (5), 8959-8978 (2014).</li><li>Pesonen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloropicrin-induced+toxic+responses+in+human+lung+epithelial+cells.">Chloropicrin-induced toxic responses in human lung epithelial cells.</a> Toxicology Letters. 226 (2), 236-244 (2014).</li><li>Wilhelm, S. N., Shepler, K., Lawrence, L. J., Lee, H., Seiber, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fumigants: Environmental Fate, Exposure, and Analysis. 652, (1997).</li><li>Adamek, E., Pawlowska-Goral, K., Bober, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+effects+of+fluoride+ions+on+enzyme+activity.">In vitro and in vivo effects of fluoride ions on enzyme activity.</a> Annales Academiae Medicae Stetinensis. 51 (2), 69-85 (2005).</li><li>Heard, K., Hill, R. E., Cairns, C. B., Dart, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+neutralizes+fluoride+bioavailability+in+a+lethal+model+of+fluoride+poisoning.">Calcium neutralizes fluoride bioavailability in a lethal model of fluoride poisoning.</a> Journal of Toxicology: Clinical Toxicology. 39 (4), 349-353 (2001).</li><li>Sparks, S. E., Quistad, G. B., Casida, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloropicrin:+reactions+with+biological+thiols+and+metabolism+in+mice.">Chloropicrin: reactions with biological thiols and metabolism in mice.</a> Chemical Research in Toxicology. 10 (9), 1001-1007 (1997).</li><li>Sparks, S. E., Quistad, G. B., Li, W., Casida, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloropicrin+dechlorination+in+relation+to+toxic+action.">Chloropicrin dechlorination in relation to toxic action.</a> Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. 14 (1), 26-32 (2000).</li><li>Byron, K. A., Varigos, G., Wootton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrocortisone+inhibition+of+human+interleukin-4.">Hydrocortisone inhibition of human interleukin-4.</a> Immunology. 77 (4), 624-626 (1992).</li><li>van der Poll, T., Lowry, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide-induced+interleukin+8+production+by+human+whole+blood+is+enhanced+by+epinephrine+and+inhibited+by+hydrocortisone.">Lipopolysaccharide-induced interleukin 8 production by human whole blood is enhanced by epinephrine and inhibited by hydrocortisone.</a> Infection and Immunity. 65 (6), 2378-2381 (1997).</li><li>Solomon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doxycycline+inhibition+of+interleukin-1+in+the+corneal+epithelium.">Doxycycline inhibition of interleukin-1 in the corneal epithelium.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 41 (9), 2544-2557 (2000).</li><li>Mishra, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+oxidative+stress-induced+epigenetic+modifications+in+pancreatic+epithelial+cells.">Mitochondrial oxidative stress-induced epigenetic modifications in pancreatic epithelial cells.</a> International Journal of Toxicology. 33 (2), 116-129 (2014).</li><li>Stockholm, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+of+phenotypic+heterogeneity+in+a+clonal+cell+population+in+vitro.">The origin of phenotypic heterogeneity in a clonal cell population in vitro.</a> PLoS One. 2 (4), e394 (2007).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> ATCC Animal Cell Culture Guide. , (2014).</li><li>Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+reducing+edge+effect+in+cell-based+assays.">A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 8 (5), 566-570 (2003).</li><li>Mpindi, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+normalization+methods+on+high-throughput+screening+data+with+high+hit+rates+and+drug+testing+with+dose-response+data.">Impact of normalization methods on high-throughput screening data with high hit rates and drug testing with dose-response data.</a> Bioinformatics. 31 (23), 3815-3821 (2015).</li><li>Zhang, X. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illustration+of+SSMD,+z+score,+SSMD*,+z*+score,+and+t+statistic+for+hit+selection+in+RNAi+high-throughput+screens.">Illustration of SSMD, z score, SSMD*, z* score, and t statistic for hit selection in RNAi high-throughput screens.</a> Journal of Biomolecular Screening. 16 (7), 775-785 (2011).</li></ol>

저자는 공개 없다.
면책 조항:이 문서에 표현 들 저자와 군대의 부, 국방부, 또는 미국 정부의 공식 정책 반영 하지 않습니다. 이 연구는 NIH/NIAID 사이의 USAMRICD, 부처간의 합의 의해 지원 되었고 일부 대학원 연구 참여 프로그램에는 미국 육군 의료 연구 연구소의 화학 방어에 약속에 의해 오크에 의해 관리 릿지 연구소 과학 미국 에너지 부와 USAMRMC 사이의 부처간 합의 통해 교육에 대 한.

본 모델의 HF와 CP 부상 연구에 대 한 심사는 높은 처리량 각 막 상피 세포의 개발에 우리의 방법 및 결과 설명 우리. 우리는 또한 HF 부상에 대 한 기본 siRNA 화면에서 결과 제시. TIC 상해 연구를 위한 HTS 모델의 개발에 많은 도전을 했다. 우리가 셀 문화 모델에 HF, HFA 또는 CP의 연구와 관련 된 문학에서 찾을 수 있는 방법은 작은 도움의 이었다. 불 소 이온에 대부분 생체 외에서 연구 구강 세포를 포함 하 고 (대 한 몇 가지 예제 참조28,29) 나트륨 불 화물와 HF 또는 HFA를 활용. 체 외에 노출에 기관지 상피 세포의 CP 일부 방법론 Pesonen 그 외 여러분 에 의해 게시 되었습니다. 30. 궁극적으로, 우리 도전과 변수가이 유독 필요한 HTS 개발에서 연구에 관련 된의 대다수와 HF, HFA 또는 CP, HTS 연구에 관련 된 문학에서 아무 특정 방법을 찾아냈다. 시간 및 성공적인 HTS 연구에 필요한 수많은 심사 플레이트 노출 일관성의 고차를 달성 하는 데 특별 한 주의 지불 했다.
한 가지 유형의 발생 도전 toxicant의 세포 배양 시스템에 응용 프로그램에 관련 되었다. 일부 이용과 함께 반응 또는 수성 해결책에서 불안정입니다. 유독 우리 연구에 대 한 선택 하지 이러한 불안정성 문제를 가진 것으로 간주 됩니다. CP의 photohydrolysis 조사는 농업 연구 물에 CP의 0.001 M 솔루션 31.1 h 1100 럭 스 크 세 논 빛 소스 (흐린된 날의 햇빛 강도)에 10 일, 12 시간 하루31당에 대 한 노출의 반감기 했다 보여주었다. 때 솔루션 어둠 속에 저장 된 동일한 10 일 동안 아무 측정 가수분해가 있었습니다. HFA의 양성자 및 불 소 이온은 명확 하 게 물에 안정. 그러나 있다,, toxicant 희석 세포 배양에 관한 추가 안정성 고려 사항. 우리는 그 때 어느 정도 세포 독성의 초기 변화는 유독 다음 시간의 짧은 기간에 후 안정화 세포 배양 매체에 희석 먼저 했다 발견. 우리는 이것이 toxicant 바인딩 또는 매체에서 성분 complexing 믿습니다. 셀 중간에는 칼슘, 마그네슘, 단백질, 등 불 소 이온32,33와 상호 작용을 한다고 알려져 있습니다 포함 되어 있습니다. CP는 생물 thiols와 산화 반응을 하 알려져 있지만 그것은 또한 DNA, 단백질, 및 다른 nucleophiles34,35를 바인딩할 수 있습니다. 일단 이러한 반응 및 상호 작용을 완료 했거나 평형에 도달, 사용 가능한 toxicant의 양을 안정화 하 고 따라서 명백한 세포 독성 안정 시킨다. 우리는 처음 작업 희석의 중간 성분 toxicant 상호 작용을 피하기 위해 노출에 대 한 사용 하는 작업 주식에 대 한 이용과의 염 분 및 물 희석의 사용을 탐험. 식 염 수를 사용 하 여 또한 HFA 부상 노출 매체 교환에 의해 수행에 대 한의 산 성 구성 요소를 유지 것입니다. 우리 발견 물과 식 염 수 희석에 유독 하 셀 죽음 응답 중간 교환 (데이터 표시 되지 않음) 세포 배양 매체 희석을 사용 하는 방법 보다 더 많은 변수를 했다. HFA와 스파이크 노출 방법에 관한 다양성 셀룰러 대상 사용 가능한 불 소 이온에 대 한 중간 성분 경쟁에 잘 선도에 분산 하는 스파이크에 불일치 될 수 있습니다. 중간 교류 HFA 식 염 수 희석 하 여 HFA 노출에 변화에 대 한 이유를 완전히 명확 하지 않다. 어떤 경우에, HFA에 대 한 식 염 수 희석을 사용 하 여 노출 방법 포기 하 고 CP에 대 한 탐험 하지. 중간에 우리의 HFA 희석의 독성 아마 밀접 하 게 셀 중간 우리의 HFA 희석에 무료 양성자 버퍼링 때문에 나트륨 불 소를 사용 하 여 연구를 모방 합니다.
우리가 발생 하는 다른도 전에 HTS.에 사용 하기 위해 셀 문화 모델의 구체화와 관련 있었다 우리는 그것 셀 실험, 특히 날린과 항생제에 대 한 세포 배양 매체 성분 수정 해야 하는 것을 발견. 우리 순진한 SV40-HCEC에서 본 cytokine 생산에 가끔 스파이크를 억제 하기 위해 노출 연구 기간 동안 날린 (0.5 µ g/mL)의 저수준을 활용. 이 낮은 양의 날린 셀의 toxicant 응답을 부정적인 영향을 주지 않았다 고 일반적으로 흥분 제36,37응답에 경작된 한 세포에 의해 사이토카인 생산을 억제 하는 데 사용 하는 수준 이었다. 왜 순진한 SV40 HCEC 세포는 때때로 초과 cytokines을 생산 하는 정확한 이유는 알려져 있지 않습니다, 하지만 셀은 변함없이 셀 뿌리고 도금 하는 동안 발생 하는 사소한 스트레스에 민감한 가능 합니다. 많은 실험실은 정기적으로 셀 문화 유지 보수 매체, 하지만 몇 가지 항생제에 항생제를 포함, tetracyclines 특히, 각 막 상피 세포38를 포함 하 여 경작된 한 세포에 항 염증 성 효과 전시에 표시 되었습니다. 일반적으로, 우리의 실험실이 잠재적으로 연구를 혼동 수 있습니다 이후 가능 하면 항생제의 사용을 방지 합니다. 우리는 또한 문화에서 우리의 세포의 여러 구절을 통해 phenotypic 드리프트를 조사. 그것은 여러 통로 통해 유전 그리고/또한 phenotypic 드리프트를 불멸 하 게 셀에 대 한 일반적인 아니라면 confluency에 도달 하도록 허용 하거나 특정 환경 스트레스39,40 노출 지 수 단계에서 유지 ,41. 따라서, 그것은 중요 높은 처리량 화면 셀 라인 제대로 유지 하 고 알려진된 phenotypic 응답을 유지 하는 셀 통로 숫자를 사용 하 여 화면을 완료 하는 동안. 다 잘 플레이트 가장자리 효과 종종 다 잘 플레이트의 외부 경계 우물에 성장 셀 같은 응답 하지 않는 또는 실내에 성장 하는 세포로 같은 일관성 있는 우물42현상입니다. 통계 연습, 데이터 세트43에 가장자리 효과 최소화 하기 위해 활용 될 수 있는 중간 폴란드어, 등이 있다. 그러나, 그것은 항상 지 잘, 테스트 및 이동 대상 복제 사이 격판덮개 레이아웃 변화 또는 지 웰 스의 컨트롤은 물류는 특정 대상 또는 컨트롤 가장자리 효과 제거할 수 있는 아무 통계 운동이 있다 실용적인 또는 비용 효과적입니다. 그것은 세포 기반 HTS 분석 실험에 가장자리 우물의 사용을 포함 한다 결정 신중 하 게 우리의 의견 이다. 우리는 컨트롤 및 대상 지 우물에 성장 하는 셀의 사용을 제거 하는 데 필요한 발견.
HF 부상 시험관에 대 한 우리의 HTS 셀 모델 및 노출 방법론 3120 대상의 기본 siRNA 화면 성공적으로 완료 하는 데 사용 되었다. SSMD 히트 선택 컨트롤 및 siRNA27사이의 차이의 크기를 측정 하는 구체적으로 제안 했다 때문에 사용 되었다. 세포 생존 능력에 대 한 우리의 결과 표시 SSMD 및 거의 모든 대상에 대 한 배 변화 사이 듀얼 손전등 음모에 선형 관계를 했다. 이 따라서, SSMD의 단일 기준이이 끝점에 대 한 적중된 선택에 대 한 사용 했습니다. IL-8 데이터 다른 강한 하지만 일치 하지 않는 효과 보여 일부 대상 약한 하지만 일관성 효과 했다에서 다릅니다. 따라서이 끝점에 대 한 적중된 선택 기준에 대 한 배 변화 및 SSMD를 사용 우리. SSMD 값 두 세포 생존 능력에 대 한 적중된 선택 사용 및 IL-8 데이터 차단 1과 1.645 (또는-1와-1.65) 사이의 낮은 거짓 발견 및 비-디스커버리 요금44얻을 있기 때문에 선택 되었다. 세포 생존 능력 및 IL-8 데이터 조회 수 있던 어떤 목표물을 확인 하 고 있었다. 이러한 경우 deconvolution 라이브러리에 포함에 대 한 선호 (향상 된 생존 능력 및 감소 IL-8) 전반적인 건강을 개선 또는 부상 악화의 동일한 방향에서 그들의 효과 발휘 하는 그 대상에 주어졌다 (세포 죽음 증가 하 고 증가 IL-8). 전반적으로, 우리는 세포 생존 능력 및 HF 부상 deconvolution 라이브러리를 IL-8 끝점 사이 250 대상의 전체 선택. 생체 외에서 CP 부상에 대 한 기본 화면 진행 중입니다.
요약 하자면, 노출 및 문화 조건 적합 HF와 CP 눈 상해의 HTS 연구 개발 했습니다. 노출 및 문화 조건에서 여러 변수 세련 되었고 최적화, 그리고 모델 z HTS 연구에 적합 확인 했다 ' 요소 분석. 우리 더 HF 모델에 siRNA 도서관의 기본 화면을 작성 하 여이 모델의 유틸리티를 입증 했다. 많은 부상 및 아니오의 질병 또는 부상 및 거의 모든 실험실에서 질병의 HTS 연구를 용이 하 게 제약 또는 생명 공학 산업, CP와 HF 포함, toxicant 부상에 제한 된 관심 및 벤치탑 로봇의 출현 . 높은 처리량 genomic 데이터 세트 특정 유전자에 부상 또는 질병 보다 효율적으로 초점을 도울 수 있는 재생 하는 역할의 이해에 크게 기여할 수 있다 생체 외에서 또는 vivo에서 학문에 따라.

Toxicant 유도 눈 부상 화학 빠르게 상당한 조직 손상을 입힐 잠재력을가지고 있기 때문에 진정한 눈 비상 이다. 불행 하 게도, 아니 특정 치료제가이 부상 치료 존재에 toxicant 유발 각 막 부상에 대 한 치료 일반적으로 지원만 있습니다. 현재 치료 전략 일반적인 주로 같은 윤활제, 항생제, 국 소 치료 요법을 포함 하 고 cycloplegics 뒤에 소염제 (예를 들어, 스테로이드) 한 번 각 막1 epithelialized 다시 있다 ,2. 최고의 현재 치료 치료 옵션을 사용할에 불구 하 고 장기적인 예 후는 일반적으로 진보적인 각 막 흐려 및 neovascularization2,3가난.
동물 모델 화학 독성을 조사 하 고 상해의 메커니즘을 이해를 전통적으로 사용 되어 왔습니다. 그러나, 동물 연구는 시간이 소모 되 고 비싸다. 노력을 줄이기 위해 동물 실험도 있다. 예를 들어 유럽 연합에 도달 법안 (EC 1907/2006)를 동물 실험을 줄이기 위한 규정 있다. 규정 회사 동물 테스트 및 동물에 제안 된 테스트를 수행 하기 전에 유럽 화학 제품 기관에서 승인을 얻는 피하기 위하여 데이터 공유 요구 사항이 포함 됩니다. 규정에 따라 동물 실험 최후의 수단 이어야 한다. 또한 단계적으로 동물에서 화장품의 테스트 유럽 화장품 규정 (EC 1223/2009)이 있다. 동물 연구를 실시 하는 경우 그들이 3Rs의 원칙에 의해 인도 된다 (구체화, 감소, 및 교체), 더 자비 롭 동물 연구를 수행, 사용, 동물의 수를 감소 및 비 동물 대안을 사용 하 여 프레임 워크를 제공 하는 가능한 경우. 이러한 이유로 독물학 분야는 독성의 분자 메커니즘에 대 한 통찰력을 제공할 수 있습니다 하 고 높은 처리량4에서 행 해질 수 있다 생체 외에서 분석을 채택 하고자 결정 했다. 이것은 기능 독극물 접근 어디 유독 전적으로 그들의 화학에 의해 보다는 오히려 그들의 기능에 의해 정의 됩니다. 단계는 또한, 기능 toxicogenomics 추구 특정 유전자 유독5의 효과에서 재생 역할을 이해 하. SiRNA 기술을 응용, 유독에 분자와 세포질 응답에 유전자 기능을 조사 하기 위해 화면 높은 처리량에 수행할 수 있습니다. siRNA는 19-25의 뉴클레오티드 긴 포스트 transcriptional 유전자 입을 통로 모든 포유류 세포6에 활용 하는 두 배 좌초 된 RNA 분자. 이 종합적으로 만들어지고 특정 유전자를 대상으로 설계 된. 셀에 도입 하는 경우는 siRNA 처리 되 고 한 가닥, 가이드 물가 RNA 유도 입을 복잡 한 (RISC)에 로드 됩니다. siRNA는 mRNA 분자에 상호 보완적인 영역에 RISC 지시 하 고 있는 RISC 저하는 mRNA. 특정 유전자의 표정 감소 결과. 특정 유전자의 표현의 결과 감소는 toxicant에 세포질 응답에 그 유전자의 기능을 확인 toxicant 노출된 셀에 다음 공부 수 있습니다. 이러한 접근은 더욱 CYP1A17,8의 a h R-종속 유도 리 민감성의 메커니즘 이해 하 사용 되었습니다.
화학 테러 위험 평가 (CTRA) 목록 및 독성 산업용 화학 물질 (TIC) 목록 선택 화학 물질의 독성과 테러, 전쟁, 또는 산업 재해 이벤트9중 출시 될 가능성에 따라 항목별로 나 누이고 있다. 우리는 siRNA 높은 처리량 검열 (HTS) toxicogenomic 접근 테러 사건에서 사용의 높은 위험에 확인 된 CTRA 목록 이용과의 연구에 적용 하 고 있다. 화학 생물;에 있는 불리 한 효과 이해 하고자 하는 전통적인 독물학 그러나, 우리는 더 욕망의 치료제 및 치료 접근을 가능 하 게, 개발을 알리는 목적으로 상해의 메커니즘을 이해 하는 분자 치료 개발에 대 한 대상으로 지정할 수 있는 발견. 몇 가지 방법으로이 노력 유사한 높은 처리량 siRNA 심사 및 약 발견 과정10에서 셀 기반 분석의 사용을 고려할 수 있습니다. 주요 차이점은 우리의 접근 방식에 다소 가능성이 크다 toxicant 노출의 치료에 대 한 높은 치료 가치와 단일 대상 될 것 이다 반면 그 약물 발견 일반적으로 치료 발견에 대 한 단 수 목표를 추구 될 것 이다. 우리 예상 어떤 효과적인 치료 패러다임 toxicant 노출에 대 한 높은 치료 가치를 달성 하는 다각적인 접근 방식이 필요로 하 고 toxicogenomic 데이터 극히 효과적인 치료 패러다임을 알릴 수 있습니다.
벤치탑 자동화 실험실 제약 또는 생명 공학 산업 밖에 서 높은 처리량 방법론을 제공합니다. 우리 연구소에서 생체 외에서 연구 역사적으로 낮은 처리량11,,1213전통적인 분석 되었습니다. 지난 몇 년 동안, 우리의 실험실 벤치탑 높은 처리량 siRNA 심사를 수행 하기 위해 로봇의 사용에 전환 했다. 여기, 우리가 현재 눈 셀 모델의 세련미와 체 외에서 의 개발 수소 불 화물 (HF)와 chloropicrin (CP) 높은 처리량 siRNA 심사 적합에 대 한 노출 방법. 우리의 목표는 이러한 유독 응답에 세포질 상해를 조절 하는 분자를 식별 하는. 우리는 선택 하는 siRNA 도서관의 목표는 G 단백질 결합 된 수용 체, 단백질 kinases, 프로 테아 제, 가수분해, 이온 채널, 그리고 다른 잠재적으로 druggable 대상 포함 됩니다. HF와 CP 선정 됐다 연구에 대 한 상호 CTRA 목록 에이전트 산업 사고의 ToxNet 보고서를 통해 증기 노출9,14눈 상해의 가장 중대 한 모험을 선물 하는 그를 찾을 수 있습니다. WWI15에 최 루 가스 CP (Cl3CNO2화학식, CAS 번호 76-06-2) 원래 사용 했다. 현재16nematicide, 살 균 제, 살충제는 농업 fumigant 및 기능으로 사용 됩니다. 수소 불 화물 (HF)는 정유 및 화학 fluorination 유기 화합물17의 알을 포함 하 여 프로세스에서 사용 됩니다. HF (화학식 HF, CAS 번호 62778-11-4)는 가스 이지만 수성 형태로 소산 (HFA, CAS 번호 7664-39-3). 따라서, 우리가 우리의 셀 HFA를 사용 하 여 선출 노출 모델. SV40 큰 T 항 원 SV40 HCEC 연구에 대 한 선정 되었다 인간 각 막 상피 세포 선 불후. 세포질 상해에 관련 된 목표 세포 죽음과 선 동적인 응답에 반영 해야 하기 때문에 세포 생존 능력 및 염증 성 마커 IL-8 끝점으로 선정 됐다. 특히, 대상 toxicant 노출에서 보호 역할을 한다면, 세포 죽음 또는 염증 성 cytokine 생산 증가 한다 때 대상 식 siRNA에 의해 저해. 반대로 부정적인 역할을 하는 대상에 대 한 사실 것입니다. 또한, 만성 염증 후 노출, 및 세포 죽음 통로 있는 내정간섭에 임상 결과2,18이 향상 시킬 수 있습니다 각 막 병 리에 역할을 나타납니다.

<table><tbody><tr><td>Bravo liquid handing platform</td><td>Agilent or equivalent</td><td>G5409A</td><td></td></tr><tr><td>Bravo plate shaker</td><td>Agilent or equivalent</td><td>Option 159</td><td></td></tr><tr><td>Bravo 96LT disposable tip head</td><td>Agilent or equivalent</td><td>Option 178</td><td>96-channel large tip pipetting head unit</td></tr><tr><td>Bravo 96ST disposable tip head</td><td>Agilent or equivalent</td><td>Option 177</td><td>96-channel small tip pipetting head unit</td></tr><tr><td>Bravo 384ST disposable tip head</td><td>Agilent or equivalent</td><td>Option 179</td><td>384-channel small tip pipetting head unit</td></tr><tr><td>Bravo 96 250 &amp;mu;L sterile barrier tips</td><td>Agilent or equivalent</td><td>19477-022</td><td></td></tr><tr><td>Bravo 384 30 &amp;mu;L sterile barrier tips</td><td>Agilent or equivalent</td><td>19133-212</td><td></td></tr><tr><td>Bravo 384 70 &amp;mu;L sterile barrier tips</td><td>Agilent or equivalent</td><td>19133-212</td><td></td></tr><tr><td>EnSpire multimode plate reader</td><td>Perkin Elmer or equivalent</td><td>2300-0000</td><td>AlphaLISA assay detector with high power laser excitation</td></tr><tr><td>IL-8 (human) AlphaLISA Detection Kit&amp;nbsp;</td><td>Perkin Elmer or equivalent</td><td>AL224F</td><td>no-wash bead-based assay</td></tr><tr><td>ProxiPlate-384 Plus white 384-shallow well microplates</td><td>Perkin Elmer or equivalent</td><td>6008359</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMAX</td><td>Invitrogen or equivalent</td><td>13778500</td><td>Transfection reagent</td></tr><tr><td>Opti-MEM 1 Reduced Serum Medium</td><td>Invitrogen or equivalent</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Gibco or equivalent</td><td>12605010</td><td>Cell detachment solution</td></tr><tr><td>IncuCyte Zoom</td><td>Essen Instruments or equivalent</td><td>ESSEN BIOSCI 4473</td><td>Incubator-housed automated microscope</td></tr><tr><td>Chloropicrin</td><td>Trinity Manufacturing or equivalent</td><td>N/A</td><td>Acute toxicity and irritant</td></tr><tr><td>DMEM-F12 cell culture medium</td><td>Invitrogen or equivalent</td><td>11330-057</td><td>Contains HEPES</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Invitrogen or equivalent</td><td>1891471</td><td></td></tr><tr><td>Human epidermal growth factor (cell culture grade)</td><td>Invitrogen or equivalent</td><td>E9644-.2MG</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant human insulin (cell culture grade)</td><td>Invitrogen or equivalent</td><td>12585-014</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin solution (cell culture grade)</td><td>Invitrogen or equivalent</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortisone (cell culture grade)</td><td>Sigma or equivalent</td><td>H0888-10G</td><td></td></tr><tr><td>Glucose&amp;nbsp; (cell culture grade)</td><td>Sigma or equivalent</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>PBS&amp;nbsp; (cell culture grade)</td><td>Sigma or equivalent</td><td>P5493</td><td></td></tr><tr><td>siRNA</td><td>Dharmacon or equivalent</td><td>various</td><td></td></tr><tr><td>Thiazolyl blue tetrazolium bromide</td><td>Sigma or equivalent</td><td>M5655</td><td>MTT assay substrate</td></tr><tr><td>siRNA buffer</td><td>Thermo or equivalent</td><td>B002000</td><td></td></tr><tr><td>96-well cell culture plates</td><td>Corning or equivalent</td><td>CLS3595</td><td></td></tr><tr><td>T150 cell culture flasks</td><td>Corning or equivalent</td><td>CLS430825</td><td></td></tr><tr><td>BSL-2 cell culture hood</td><td>Nuaire or equivalent</td><td>NU-540</td><td></td></tr><tr><td>300 mL robotic reservoirs</td><td>Thermo or equivalent</td><td>12-565-572&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>96 baffled automation reservoirs</td><td>Thermo or equivalent</td><td>1064-15-8</td><td></td></tr><tr><td>500 mL sterile disposable storage bottles</td><td>Corning or equivalent</td><td>CLS430282</td><td></td></tr><tr><td>Microplate heat sealer</td><td>Thermo or equivalent</td><td>AB-1443A</td><td></td></tr><tr><td>Microplate heat sealing foil</td><td>Thermo or equivalent</td><td>AB-0475</td><td></td></tr><tr><td>Cardamonin</td><td>Tocris or equivalent</td><td>2509</td><td>Anti-inflammatory, used as positive control</td></tr><tr><td>SKF 86002&amp;nbsp;</td><td>Tocris or equivalent</td><td>2008</td><td>Anti-inflammatory, used as positive control</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma or equivalent</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>48% hydrofluoric acid</td><td>Sigma or equivalent</td><td>339261</td><td>Corrosive and acute toxicity</td></tr><tr><td>1000 &amp;mu;L Single channel pipettors</td><td>Rainin or equivalent</td><td>17014382</td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;mu;L Single channel pipettors</td><td>Rainin or equivalent</td><td>17014391</td><td></td></tr><tr><td>20 &amp;mu;L Single channel pipettors</td><td>Rainin or equivalent</td><td>17014392</td><td></td></tr><tr><td>1000 &amp;mu;L 12-channel pipettors</td><td>Rainin or equivalent</td><td>17014497</td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;mu;L 12-channel pipettors</td><td>Rainin or equivalent</td><td>17013810</td><td></td></tr><tr><td>20 &amp;mu;L 12-channel pipettors</td><td>Rainin or equivalent</td><td>17013808</td><td></td></tr><tr><td>Pipettor tips 1000 &amp;mu;L</td><td>Rainin or equivalent</td><td>17002920</td><td></td></tr><tr><td>Pipettor tips 200 &amp;mu;L</td><td>Rainin or equivalent</td><td>17014294</td><td></td></tr><tr><td>Pipettor tips 20 &amp;mu;L</td><td>Rainin or equivalent</td><td>17002928</td><td></td></tr><tr><td>Chemical fume hood</td><td>Jamestown Metal Products</td><td>MHCO_229</td><td></td></tr><tr><td>384-well sample storage plates</td><td>Thermo or equivalent</td><td>262261</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma or equivalent</td><td>S6191</td><td></td></tr><tr><td>50 mL conical tubes</td><td>Thermo or equivalent</td><td>14-959-49A</td><td></td></tr><tr><td>Serological pipettes 50 mL</td><td>Corning or equivalent</td><td>07-200-576</td><td></td></tr><tr><td>Serological pipettes 25 mL</td><td>Corning or equivalent</td><td>07-200-575</td><td></td></tr><tr><td>Serological pipettes 10 mL</td><td>Corning or equivalent</td><td>07-200-574</td><td></td></tr><tr><td>Serological pipettes 5 mL</td><td>Corning or equivalent</td><td>07-200-573</td><td></td></tr><tr><td>SV40-HCEC immortalized human corneal epithelial cells</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>These cells are not commercially available, but can be obtained from the investigators cited in the article</td></tr><tr><td>Sceptor Handheld Automated Cell Counter</td><td>Millipore or equivalent</td><td>PHCC20060</td><td></td></tr><tr><td>GeneTitan Multi-Channel (MC) Instrument</td><td>Affymetrix or equivalent</td><td>00-0372</td><td></td></tr><tr><td>Affymetrix 24- and 96-array plates</td><td>Affymetrix or equivalent</td><td>901257; 901434</td><td></td></tr><tr><td>Draegger tube HF</td><td>Draeger or equivalent</td><td>8103251</td><td></td></tr><tr><td>Draegger tube CP</td><td>Draeger or equivalent</td><td>8103421</td><td></td></tr><tr><td>Draegger pump</td><td>Draeger or equivalent</td><td>6400000</td><td></td></tr><tr><td>Clear Plate seals</td><td>Resesarch Products International or Equivalent</td><td>202502</td><td></td></tr><tr><td>Reagent reservoirs</td><td>VistaLab Technologies or equivalent</td><td>3054-1000</td><td></td></tr><tr><td>Xlfit</td><td>IDBS or equivalent</td><td>N/A</td><td>Excel add-in used for automated curve fitting</td></tr></tbody></table>

high throughput sirna screening for chloropicrin and hydrogen fluoride-induced cornea epithelial cell injury

Toxicant 유도 눈 부상 화학 빠르게 상당한 조직 손상을 입힐 잠재력을가지고 있기 때문에 진정한 눈 비상 이다. 아무 특정 치료제가이 부상 치료 존재 toxicant 유발 각 막 부상에 대 한 치료는 일반적으로 지원. 치료 및 노출에 대 한 관심에 치료제를 개발 하는 노력, 그것은이 상해의 분자 및 세포 메커니즘을 이해 하는 것이 중요 수. 있습니다 우리는 높은 처리량 작은 금지 RNA (siRNA) 심사의 활용 화학 각 막 상피 상해의 분자 메커니즘을 더 빠르게 명료를 도울 수 있는 중요 한 도구가 될 수 있습니다 제안 합니다. siRNA는 siRNA에 상 동을가지고 있는 19-25의 뉴클레오티드 긴 mRNA를 저하 하는 통로 입을 post-transcriptional 유전자를 활용 더블 좌초 RNA 분자는. 특정 유전자의 표현의 결과 감소는 toxicant에 세포질 응답에 그 유전자의 기능을 확인 toxicant 노출된 셀에 다음 공부 수 있습니다. 개발 및 체 외에 노출 모델 및 수소 불 화물 (HF) 및 chloropicrin (CP) 유도 눈 부상 (HTS)을 상영 하는 높은 처리량 방법의 유효성 검사는이 문서에 표시 됩니다. 하지만 우리는 이러한 두 가지 유독 선택, 우리의 방법 toxicant 노출 프로토콜에 사소한 수정 다른 유독의 연구에 적용 됩니다. SV40 큰 T 항 원 SV40 HCEC 연구에 대 한 선정 되었다 인간 각 막 상피 세포 선 불후. 세포 생존 능력 및 IL-8 생산 심사 프로토콜에서 끝점으로 선정 됐다. Toxicant 노출의 개발와 관련 된 몇 가지 과제 고 셀 문화 방법 HTS 연구에 대 한 적합 한 표시 됩니다. 이 유독 HTS 모델 설립 화학 눈 부상에 대 한 잠재적인 치료에 대 한 화면을 상해의 메커니즘을 이해 하기 더 연구에 대 한 수 있습니다.

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High Throughput SiRNA Screening for Chloropicrin and Hydrogen Fluoride-Induced Cornea Epithelial Cell Injury

높은 처리량 작은 금지 RNA 검사 화학 각 막 상피 상해의 분자 메커니즘을 더 빠르게 명료를 도울 수 있는 중요 한 도구입니다. 여기, 우리는 개발 및 노출 모델 및 각 막 상피 부상 수소 불 화물 그리고 chloropicrin 유도의 높은 처리량 검열 방법의 유효성 검사 제시.

Chloropicrin 및 수소 불 화물 유발 각 막 상피 세포 상해에 대 한 높은 처리량 SiRNA 심사

Toxicant-induced ocular injury is a true ocular emergency because chemicals have the potential to rapidly inflict significant tissue damage. Treatments ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

5.8K 조회수.  US Army Medical Research Institute of Chemical Defense. 높은 처리량 작은 금지 RNA 검사 화학 각 막 상피 상해의 분자 메커니즘을 더 빠르게 명료를 도울 수 있는 중요 한 도구입니다. 여기, 우리는 개발 및 노출 모델 및 각 막 상피 부상 수소 불 화물 그리고 chloropicrin 유도의 높은 처리량 검열 방법의 유효성 검사 제시.

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RNA Interference-based Investigation of the Function of Heat Shock Protein 27 during Corneal Epithelial Wound Healing

Small interfering RNA (siRNA) is among the most widely used RNA interference methods for the short-term silencing of protein-coding genes. siRNA is a synthetic RNA duplex created to specifically target a mRNA transcript to induce its degradation and it has been used to identify novel pathways in various cellular processes. Few reports exist regarding the role of phosphorylated heat shock protein 27 (HSP27) in corneal epithelial wound healing. Herein, cultured human corneal epithelial cells were divided into a scrambled control-siRNA transfected group and a HSP27-specific siRNA-transfected group. Scratch-induced directional wounding assays, and western blotting, and flow cytometry were then performed. We conclude that HSP27 has roles in corneal epithelial wound healing that may involve epithelial cell apoptosis and migration. Here, step-by-step descriptions of sample preparation and the study protocol are provided.

Herein, we present a protocol to use heat shock protein 27 (HSP27)-specific small interfering RNA to assess the function of HSP27 during corneal epithelial wound healing. RNA interference is the best method for effectively knocking-down gene expression to investigate protein function in various cell types.

각막 상피 ​​창상 치유 기간 동안 열 충격 단백질 27의 기능의 RNA 간섭 기반 조사

Small interfering RNA (siRNA) is among the most widely used RNA interference methods for the short-term silencing of protein-coding genes. siRNA is a ...

연구

유전학

Drug-induced Sensitization of Adenylyl Cyclase: Assay Streamlining and Miniaturization for Small Molecule and siRNA Screening Applications

Sensitization of adenylyl cyclase (AC) signaling has been implicated in a variety of neuropsychiatric and neurologic disorders including substance abuse and Parkinson&#39;s disease. Acute activation of G&#945;i/o-linked receptors inhibits AC activity, whereas persistent activation of these receptors results in heterologous sensitization of AC and increased levels of intracellular cAMP. Previous studies have demonstrated that this enhancement of AC responsiveness is observed both in vitro and in vivo following the chronic activation of several types of G&#945;i/o-linked receptors including D2 dopamine and &#956; opioid receptors. Although heterologous sensitization of AC was first reported four decades ago, the mechanism(s) that underlie this phenomenon remain largely unknown. The lack of mechanistic data presumably reflects the complexity involved with this adaptive response, suggesting that nonbiased approaches could aid in identifying the molecular pathways involved in heterologous sensitization of AC. Previous studies have implicated kinase and Gb&#947; signaling as overlapping components that regulate the heterologous sensitization of AC. To identify unique and additional overlapping targets associated with sensitization of AC, the development and validation of a scalable cAMP sensitization assay is required for greater throughput. Previous approaches to study sensitization are generally cumbersome involving continuous cell culture maintenance as well as a complex methodology for measuring cAMP accumulation that involves multiple wash steps. Thus, the development of a robust cell-based assay that can be used for high throughput screening (HTS) in a 384&#160;well format would facilitate future studies. Using two D2 dopamine receptor cellular models (i.e.&#160;CHO-D2L and HEK-AC6/D2L), we have converted our 48-well sensitization assay (&#62;20 steps 4-5 days) to a five-step, single day assay in 384-well format. This new format is amenable to small molecule screening, and we demonstrate that this assay design can also be readily used for reverse transfection of siRNA in anticipation of targeted siRNA library screening.

Persistent activation of inhibitory G protein-coupled receptors results in sensitization of adenylyl cyclase signaling. To identify the essential molecular pathways, nonbiased approaches are necessary; however, this strategy requires the development of a scalable cell-based cAMP sensitization assay. Herein, we describe a sensitization assay for small molecule and siRNA screening.

아데 닐 레이트 사이 클라 제의 약물에 의한 과민성 : 작은 분자와 siRNA의 심사 응용 프로그램에 대한 분석 최적화 기술과 소형화

Sensitization of adenylyl cyclase (AC) signaling has been implicated in a variety of neuropsychiatric and neurologic disorders including substance abuse ...

생체공학

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat because of increased worldwide exchanges and human populations penetrating more and more natural ecosystems. A good example of such an emerging situation is chikungunya virus epidemics of 2005-2006 in the Indian Ocean. Recent progresses in our understanding of cellular pathways controlling viral replication suggest that compounds targeting host cell functions, rather than the virus itself, could inhibit a large panel of RNA viruses. Some broad-spectrum antiviral compounds have been identified with host target-oriented assays. However, measuring the inhibition of viral replication in cell cultures using reduction of cytopathic effects as a readout still represents a paramount screening strategy. Such functional screens have been greatly improved by the development of recombinant viruses expressing reporter enzymes capable of bioluminescence such as luciferase. In the present report, we detail a high-throughput screening pipeline, which combines recombinant measles and chikungunya viruses with cellular viability assays, to identify compounds with a broad-spectrum antiviral profile.

In vitro assays to measure virus replication have been greatly improved by the development of recombinant RNA viruses expressing luciferase or other enzymes capable of bioluminescence. Here we detail a high-throughput screening pipeline that combines such recombinant strains of measles and chikungunya viruses to isolate broad-spectrum antivirals from chemical libraries.

RNA 바이러스의 넓은 스펙트럼 화학 억제를위한 높은 처리량 검사

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

면역학 및 감염병학

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational health hazard. Here, we demonstrate the exposure of primary stem cells from the mouse ocular surface to UV-C radiation. Reactive oxygen species (ROS) formation is the readout of the extent of oxidative stress/damage. In an experimental in vitro setting, it is also essential to assess the percentage of dead cells generated due to oxidative stress. In this article, we will demonstrate the 2&#39;,7&#39;-Dichlorofluoresceindiacetate (DCFDA) staining of UV-C exposed mouse primary ocular surface stem cells and their quantification based on the fluorescent images of DCFDA staining. DCFDA staining directly corresponds to ROS generation. We also demonstrate the quantification of dead and live cells by simultaneous staining with propidium iodide (PI) and Hoechst 3332 respectively and the percentage of DCFDA (ROS positive) and PI positive cells.

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

This protocol demonstrates the simultaneous detection of reactive oxygen species (ROS), live cells, and dead cells in live primary cultures from mouse ocular surface cells. 2&#39;,7&#39;-Dichlorofluoresceindiacetate, propidium iodide, and Hoechst staining are used to assess the ROS, dead cells, and live cells, respectively, followed by imaging and analysis.

자외선-C (UV-C) 손상에 응하여 1 차 마우스 안구 표면 세포/줄기 세포에 있는 산화 손상의 평가

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...

발생학

Toxicity Screens in Human Retinal Organoids for Pharmaceutical Discovery

Organoids provide a promising platform to study disease mechanism and treatments, directly in the context of human tissue with the versatility and throughput of cell culture. Mature human retinal organoids are utilized to screen potential pharmaceutical treatments for the age-related retinal degenerative disease macular telangiectasia type 2 (MacTel).
We have recently shown that MacTel can be caused by elevated levels of an atypical lipid species, deoxysphingolipids (deoxySLs). These lipids are toxic to the retina and may drive the photoreceptor loss that occurs in MacTel patients. To screen drugs for their ability to prevent deoxySL photoreceptor toxicity, we generated human retinal organoids from a non-MacTel induced pluripotent stem cell (iPSC) line and matured them to a post-mitotic age where they develop all of the neuronal lineage-derived cells of the retina, including functionally mature photoreceptors. The retinal organoids were treated with a deoxySL metabolite and apoptosis was measured within the photoreceptor layer using immunohistochemistry. Using this toxicity model, pharmacological compounds that prevent deoxySL-induced photoreceptor death were screened. Using a targeted candidate approach, we determined that fenofibrate, a drug commonly prescribed for the treatment of high cholesterol and triglycerides, can also prevent deoxySL toxicity in the cells of the retina.
The toxicity screen successfully identified an FDA-approved drug that can prevent photoreceptor death. This is a directly actionable finding owing to the highly disease-relevant model tested. This platform can be easily modified to test any number of metabolic stressors and potential pharmacological interventions for future treatment discovery in retinal diseases.

Here we present a step-by-step protocol to generate mature human retinal organoids and utilize them in a photoreceptor toxicity assay to identify pharmaceutical candidates for the age-related retinal degenerative disease macular telangiectasia type 2 (MacTel).

제약 발견을 위한 인간 망막 오가노이드의 독성 스크리닝

Organoids provide a promising platform to study disease mechanism and treatments, directly in the context of human tissue with the versatility and ...

간암 세포에서 Dihydroethidium을 사용한 새로운 ROS 정량 분석

High Throughput Screening Assessment of Reactive Oxygen Species (ROS) Generation using Dihydroethidium (DHE) Fluorescence Dye

Reactive oxygen species (ROS) play a key role in the regulation of cellular metabolism in physiological and pathological processes. Physiological ROS production plays a central role in the spatial and temporal modulation of normal cellular functions such as proliferation, signaling, apoptosis, and senescence. In contrast, chronic ROS overproduction is responsible for a wide spectrum of diseases, such as cancer, cardiovascular disease, and diabetes, among others. Quantifying ROS levels in an accurate and reproducible manner is thus essential to understanding normal cellular functionality. Fluorescence imaging-based methods to characterize intra-cellular ROS species is a common approach. Many of the imaging ROS protocols in the literature use 2&#39;-7&#39;-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) dye. However, this dye suffers from significant limitations in its usage and interpretability. The current protocol demonstrates the use of a dihydroethidium (DHE) fluorescent probe as an alternative method to quantify total ROS production in a high-throughput setting. The high throughput imaging platform, CX7 Cellomics, was used to measure and quantify the ROS production. This study was conducted in three hepatocellular cancer cell lines - HepG2, JHH4, and HUH-7. This protocol provides an in-depth description of the various procedures involved in the assessment of ROS within the cells, including - preparation of DHE solution, incubation of cells with DHE solution, and measurement of DHE intensity necessary to characterize the ROS production. This protocol demonstrates that DHE fluorescent dye is a robust and reproducible choice to characterize intracellular ROS production in a high-throughput manner. High throughput approaches to measure ROS production are likely to be helpful in a variety of studies, such as toxicology, drug screening, and cancer biology.

저자 스포트라이트: 간세포주에서 세포 내 ROS 수준의 고처리량 측정

This protocol describes a novel method to quantify intracellular reactive oxygen species (ROS) using dihydroethidium (DHE) as a fluorescence dye probe using a high-throughput screening approach. The protocol describes the methods for quantitative assessment of intracellular reactive oxygen species (ROS) in the three different hepatocellular carcinoma cell lines.

Dihydroethidium(DHE) 형광 염료를 사용한 활성 산소종(ROS) 생성의 고처리량 스크리닝 평가

Reactive oxygen species (ROS) play a key role in the regulation of cellular metabolism in physiological and pathological processes. Physiological ROS ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

배양 된 포유 동물 세포의 생물 학적 경로의 유비퀴틴과 유비​​퀴틴 같은 시스템 레귤레이터를 확인하는 siRNA를 상영

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

생물학

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

후 전사적으로 규제 유전자의 화학 변조기에 대한 높은 처리량 검사

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Chloropicrin 및 수소 불 화물 유발 각 막 상피 세포 상해에 대 한 높은 처리량 SiRNA 심사

요약

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각막 상피 창상 치유 기간 동안 열 충격 단백질 27의 기능의 RNA 간섭 기반 조사

아데 닐 레이트 사이 클라 제의 약물에 의한 과민성 : 작은 분자와 siRNA의 심사 응용 프로그램에 대한 분석 최적화 기술과 소형화

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Dihydroethidium(DHE) 형광 염료를 사용한 활성 산소종(ROS) 생성의 고처리량 스크리닝 평가

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