Name: visualization of dna compaction in cyanobacteria by high-voltage cryo-electron tomography
Uploaded: 2018-07-17T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
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저자는 원고, 고 마 코 하 야 시와의 사유리 하기와 라 주의 재배에 대 한 중요 한 독서와 남조류, 요시타카 Kimori 이미지 처리를 위해, Chihong 노래, 미야자키 나 오 유키, 그리고 님의 Tammo Reisewitz 감사 나가요시는 구조의 세분화와 도움에 대 한입니다. 이 작품 국립 연구소의 공동 연구 프로그램에 의해 지원 되었다 생리 적인 과학 (일본군)에 영 규 과장

1. 동기 문화 박테리아의
<ol><li>S. elongatus 한 천 1.5% (w/v) 및 0.3% (w/v) 나트륨 thiosulfate8(에 9 cm 살 균 플라스틱 페 트리 접시) 소독된 BG 11 접시에 PCC 7942 문화.</li>
	<li>12 h 빛/12 h 어두운 주기 및 50 µE/m2/s의 광도와 23 ° C에서 성장 챔버에 접시를 놓습니다.</li>
	<li>일주일에 한 번 신선한 BG11 한 천 배지 위에 셀을 전송 합니다. 참고:는 agar에 문화의 녹색 띠로 표시 됩니다이 문화 조건 1 주일 후 셀 적극적으로 확산.</li>
	<li>신선한 BG11 한 천 격판덮개에 셀 셀 화 염 멸 균된 와이어 루프와 행진의 녹색 덩어리를 가져가 라. 이렇게 깨끗 한 벤치에.</li>
</ol>2. 형광 현미경 검사 법에 의해 모니터링
<ol><li>6 일에 대 한 천 배지에서 배양 세포를 사용 하 여 DNA 압축을 관찰. 셀에서에서 수집 접시 빛 기간의 끝에서 0.2 M 자당 솔루션의 따르는 1 mL에 의해 셀에. 셀의 대부분을 수집할 셀에 솔루션을 붓는 반복 합니다. DNA 얼룩에 대 한 마이크로 튜브로 중단 셀 솔루션을 전송 합니다.</li>
	<li>DNA 얼룩 염료 (예: Hoechst 33342) 솔루션 1 µ g/mL의 최종 농도에 마이크로 튜브에서 일시 중단 된 셀 솔루션의 500 µ L 추가 합니다. 그런 다음, 10 분 동안 어둠 속에서 튜브를 유지.</li>
	<li>2000 x g 침전 물에 1 분 동안 원심 셀. 삭제는 상쾌한 고 고밀도 세포 현 탁 액을 얻기 위해 0.2 M 자당 솔루션의 10 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>슬라이드 유리에 얼룩진된 셀을 포함 하는 솔루션의 1 µ L를 전송, 커버 슬립 넣고 100 X 및 침수 기름의 확대와 함께 대물 렌즈를 사용 하 여 UV 필터 장착 형광 현미경으로 관찰.</li>
	<li>DNA 압축은 대부분의 세포에서이 시점에서 관찰 확인 다음 다음 동결 단계에 대 한 샘플을 준비 합니다.</li>
</ol>3입니다. 샘플 곳을 알아내는-HVET에 대 한 동결
<ol><li>식이-냉동 장치를 설정 합니다. 액체 질소 탱크를 테 플 론 튜브 탱크와 챔버를 연결한 후 cryo 약 실 냉각 시작.</li>
	<li>액체 질소 온도 챔버를 냉각 후 챔버 내부에 작은 cupper 냄비에 액체 탄을 입력 합니다. 액체 탄 폭발 때문에 작업 중 안경 착용.</li>
	<li>글로우 방전 홀리 탄소 코팅 그들의 탄소 쪽 그리드 (홀리 그리드) 30 50 s mA 플라즈마 이온 bombarder를 사용 하 여.</li>
	<li>1 µ L BSA 금 추적 프로그램의 적용 (15 nm) 표준 표식으로 홀리 눈금.</li>
	<li>DNA 압축 단계에서 홀리 그리드 셀의 2.5 µ L 약 수를 적용 됩니다. 필터 종이 초과 솔루션에서 오 점. 즉시 식이 냉동 장치에 플런저를 사용 하 여 액체 탄으로 그리드를 급락.</li>
	<li>그들은 검사 때까지 냉동된 격자 액체 질소 저장소에 저장 합니다.</li>
</ol>4. 곳을 알아내는-HVET
<ol><li>1의 높은 전압에서 HVEM 설정 MV.</li>
	<li>탑재 cryo-견본 홀더 HVEM cryo-워크스테이션, 내부 액체 질소로-150 ° C에 precooled에 대 한 언된 표는 HVEM에 로드 합니다. 얼음으로 오염을 피하기 위하여 주의 해야 합니다.</li>
	<li>1, 낮은 확대율에서 이미징 영역 선택 000 X. Eucentric z 축 높이 조정 합니다.</li>
	<li>-60 °에 견본 단계 기울기와 기울기 회전의 반발을 제거.</li>
	<li>10, 확대 대상 위치 근처 초점 조정 000 X. 설정 된 초점된 이미지에서 편차에 의해 6 ~ 10 µ m의 초점에서. 이미지 설정 복용량 2 e-/Å-2 미리 견본에서.</li>
	<li>HVEM에 이미지 화면에 전류 밀도 의해 전자 복용량을 측정 합니다. 전자 필름 또는 디지털 카메라 초점 프로세스에서 동일한 배율에서 이미지를 가져가 라.</li>
	<li>수집 기울기 이미지 수동으로 (4.5)와 같은 절차에 의해-60 °에서 60 °에 2 ° ~ 4 °의 기울기 각도 증가 합니다. 참고: 많은 현대 전자 현미경, 기울기 시리즈의 수집 디지털 카메라의 조합에 의해 자동화입니다. 이 경우, 설명서를 따르십시오. 네거티브 필름에 대 한 전체 강도 개발자를 사용 하 여 개발자 탱크에 20 ° C에서 12 분에 대 한 영화를 개발 하 고 10 분 디지털화 4000 dpi (0.635 nm/픽셀 이미지)의 해상도에서 영화에 대 한 해결사 수정 평판 스캐너를 사용 하 여. 디지털 카메라의 경우 다음 이미지 처리 단계에 직접 수집 된 이미지를 제목. 필요한 경우, 중간 필터 2 ~ 4 범주화 (크기 줄이는 요소) 및 적절 한 소프트웨어 (예: ImageJ)를 사용 하 여 이미지 크기를 줄입니다.</li>
</ol>5. 단층 촬영 재구성
<ol><li>스택 이미지 파일을 개별에서 기울기 아이 모드 소프트웨어9명령 "tif2mrc" 또는 "newstack"를 사용 하 여 이미지를 확인 합니다.</li>
	<li>아이 모드에서 eTomo GUI 소프트웨어를 시작 하 고 이미지 매개 변수 설정: 픽셀 크기, 표준 직경, 이미지 회전, 등등. 그런 다음 스크립트를 만듭니다.</li>
	<li>자료의 테이블에 나열 된 소프트웨어에 따라 개별 프로그램 실행 어디 기울기 시리즈 (오류와 함께 평균 잔여 0.5 미만) 표준 마커를 사용 하 여 정렬 됩니다. 마지막으로, 3D tomogram 아이 모드에서 SIRT 알고리즘을 사용 하 여 재구성 합니다.</li>
	<li>tomogram에서 관심 (ROI) 영역을 추출 하 고 denoise 필터를 사용 하 여 denoise: 아이 모드, EMAN10, 양자 필터 또는 수학 형태학에 비 등방성 확산 필터 필터11, 등, 적절 한 매개 변수 대비를 향상 시킵니다.</li>
</ol>6입니다. 관심의 기능 세분화
참고: 아래 설명 된 절차는 소프트웨어 사용 (참조 자료 테이블) 특정 하지만 다른 소프트웨어 패키지를 대신 사용할 수 있습니다. 그들의 사용자 가이드를 참조 하십시오.
<ol><li>3D 뷰어 창에서 Amira 소프트웨어에 tomogram 파일을 열고 생성 한 OrthoSlice.</li>
	<li>세그먼트화 편집기 창에서 새로운 "레이블 필드"를 선택 하 여 분할 파일을 만듭니다.</li>
	<li>수동으로 추적 관심 (아버지)의 기능의 테두리. 모든 tomogram 슬라이스를 통해 법을 따릅니다. 두 번째 아버지에 대 한 새로운 "물자" 만들고 동일한 작업을 반복 합니다.</li>
	<li>"SurfaceGen" 메뉴를 선택 하 여 표면 렌더링을 생성 합니다. 세그먼트 볼륨 시각화 "SurfaceView" 메뉴를 선택 합니다. 이동, 회전 하 고 3D 볼륨 확대, 3D 뷰어 창에는 도구를 사용 합니다.</li>
	<li>자동 분할에 대 한 마법 지팡이 도구를 사용 합니다. 개체를 클릭 하 고 개체의 기능에 의해 완전히 선택 되도록 값의 범위를 커버 하는 디스플레이와 마스킹 슬라이더를 조정.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Smith, R. M., Williams, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+rhythms+in+gene+transcription+imparted+by+chromosome+compaction+in+the+cyanobacterium+Synechococcus+elongatus.">Circadian rhythms in gene transcription imparted by chromosome compaction in the cyanobacterium Synechococcus elongatus.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 103 (22), 8564-8569 (2006).</li><li>Kondo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cyanobacterial+circadian+clock+based+on+the+kai+oscillator.">A cyanobacterial circadian clock based on the kai oscillator.</a> CSHS Quant. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspectives+of+molecular+and+cellular+electron+tomography.">Perspectives of molecular and cellular electron tomography.</a> J. struct. boil. 120 (3), 276-308 (1997).</li><li>Lu&#269;i&#263;, V., Rigort, A., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+tomography:+The+challenge+of+doing+structural+biology+in+situ.">Cryo-electron tomography: The challenge of doing structural biology in situ.</a> J. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+most-probable+loss+tomography+of+thick+selectively+stained+biological+specimens+with+quantitative+measurement+of+resolution+improvement.">Automated most-probable loss tomography of thick selectively stained biological specimens with quantitative measurement of resolution improvement.</a> J. Struct. Biol. 148 (3), 297-306 (2004).</li><li>Egerton, R. F., Li, P., Malac, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation+damage+in+the+TEM+and+SEM.">Radiation damage in the TEM and SEM.</a> Micron. 35 (6), 399-409 (2004).</li><li>Danev, R., Buijsse, B., Khoshouei, M., Plitzko, J. M., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volta+potential+phase+plate+for+in-focus+phase+contrast+transmission+electron+microscopy.">Volta potential phase plate for in-focus phase contrast transmission electron microscopy.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 111 (44), 15635-15640 (2014).</li><li>Murata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zernike+phase+contrast+cryo-electron+microscopy+and+tomography+for+structure+determination+at+nanometer+and+subnanometer+resolutions.">Zernike phase contrast cryo-electron microscopy and tomography for structure determination at nanometer and subnanometer resolutions.</a> Structure. 18 (8), 903-912 (2010).</li><li>Wolf, S. G., Houben, L., Elbaum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-scanning+transmission+electron+tomography+of+biological+cells.">Cryo-scanning transmission electron tomography of biological cells.</a> Nat. Methods. 11 (4), 423-428 (2014).</li><li>Ophus, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+linear+phase+contrast+in+scanning+transmission+electron+microscopy+with+matched+illumination+and+detector+interferometry.">Efficient linear phase contrast in scanning transmission electron microscopy with matched illumination and detector interferometry.</a> Nat. Comm. 7, 1-7 (2016).</li><li>Schertel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo+FIB-SEM:+Volume+imaging+of+cellular+ultrastructure+in+native+frozen+specimens.">Cryo FIB-SEM: Volume imaging of cellular ultrastructure in native frozen specimens.</a> J. Struct. Biol. 184 (2), 355-360 (2013).</li></ol>

저자 아무 경쟁 금융 관심사를 선언합니다.

우리는 박테리아에 과도 DNA 압축을 시각화에 대 한 프로토콜의 순서를 제시 했습니다. 기본 개념은 상호 빛과 전자 현미경 검사 법 (클레 멘 타인)12의 비슷합니다. 또한,이 방법에서는, 살아있는 박테리아 형광 현미경 검사 법에 의해 모니터링, EM 격자에 급속 하 게 동결 되었고 직접 높은 전압 cryo 전자 단층 촬영으로 시각. 첫 번째 응용 프로그램, DNA의 상세한 구조 압축 세균 세포로 성공적으로 3d에서 시각화 했다. 현재,이 절차는이 주제에, 하지만 경우에 따라 수정 된 방법론으로 더 광범위 하 게 적용 됩니다. 여기, 장점, 한계, 그리고이 방법의 미래 가능성 설명 되어 있습니다.
이 방법의 장점 중 하나는 전체 셀의 3 차원 시각화 이다. 1 MV HVEM 성공적으로 동적 시각 subcellular 세포에서 DNA의 구조 압축 셀. 그러나, 정상 세포 내부의 미세 구조 때문에 낮은 이미지 대비 구분할 수 없습니다. 탄력 증가 및 두꺼운 표본에서 여러 분산13이미지 흐리게 합니다. 에너지 필터에 의해 필터링 하는 0-대부분 추정 손실 및 이미지는 inelastic 산란14,15, 줄여 이미지 대비를 향상 시킬 수 있습니다 하지만 iMFP 보다 두꺼운 표본에 대 한 작동 하지 않습니다. 0-가장 가능성이 손실 및 봉우리 견본 두께 대폭 감소. 그것은 특히 전자 민감한 얼음 포함 된 표본에 대 한 충분 한 신호 대 잡음 비율을 얻기 어렵다입니다. 무라 타 외. 나타났습니다 그 1MV 스캐닝 전송 플라스틱에서 밝은 필드 이미지 보다 높은 이미지 대비 5 µ m 두께, 효 모 세포를 포함 하는 현미경 (줄기) 제공 이미지 대비 진폭 대비13에 의해 주어진 주로 . 그러나, 높은 가속된 전자에 효과 연쇄 피해의 또 다른 한계 손상에 민감한 곳을 알아내는-표본16에 대 한 방사선 조사 복용량을 만듭니다 예상 된다. HVEM 볼타 Zernike 단계 격판덮개17,18 의 적용은 미래에 총 복용량을 줄여 연쇄 피해를 줄이기 위해 수 있습니다. HVEM 두꺼운 표본에 대 한 사용 하 여 또 다른 한계는 사용자 시설 HVEM을 제공 하는 세계적으로 부족 한는 사실에서 온다.
두꺼운 표본, 300 곳을 알아내는-줄기 단층을 관찰 하는 다른 방법론을 사용 하 여 kV 몇 백 나노미터19이상의 두께와 냉동 화 표본에 높은 콘트라스트 이미지를 설명 했다. 곳을 알아내는-줄기에 단계 대조를 검색 하려면 전자 pthychographic 현미경 검사 법 또한 도입 되었습니다, 있는 단계 접시 콘덴서 렌즈에 transposes pixelated 2D 탐지기20위상 변조 회절. 이미지는 여러 diffractions에서 계산에 의해 검색 됩니다. 큰 기본 냉동 샘플, cryo-거짓말-SEM의 직접적이 고 빠른 3D cryo 이미징 또한 사용된21, 어디에 집중 된 이온 빔을 단면 직렬 고 수 얼굴 이미지 차단에 대 한 이미징 완전히 수 화 냉동된 표본에 적용 됩니다. 비록 이러한 기술은 생물 표본 보기 범위를 확장, 박테리아의 대상 위치를 찾을 수 어렵습니다 예: 대상과 완전히 얼음은 자르기 전에 확인할 수 수 없습니다 때문에 박테리아를 표시.
DNA 압축 박테리아에 고유한 구조를 생성합니다. DNA는 세포를 압축 때문에 정상 세포에 존재 하지 않는 셀 내에서 큰 밀도 바이어스 얼룩이 되 고 없이 쉽게 구별 됩니다. 그러나, 세포 내의 더 많은 지역 이벤트를 시각화 하기 위해 그것은 전자 현미경에 붙일 레이블된 ROI를 전송 하는 데 필요한. 상호 빛과 전자 현미경 검사 법 (클레 멘 타인)에 대 한 가벼운 현미경 이미지와 전자 현미경 이미지는 일반적으로 상관 EM 파인더 격자12형광 라텍스 구슬 또는 양자 도트를 사용 하 여. 라벨 입자 형광 뿐만 아니라 높은 전자 밀도의 해야 합니다. 그들은 수 있는 정확 하 고 안정적으로 상관 두 이미지 사이의 위치. 또한, cryo-가벼운 현미경 검사 법으로 레이블이 지정 된 영역을 확인 하 여 두 현미경 사이 완전 한 중복 투자 수익의를 얻을 수 있습니다. 더 자세한 구조 이벤트 DNA 압축 특성화 때이 입자 및 곳을 알아내는-가벼운 현미경 보다 강력 하 고 정확한 상관 관계를 미래에 대 한 필수적인 도구 있을 것입니다.
이 문서에서는 동기 문화, 형광 현미경 검사 법 및 높은 전압 cryo 전자 단층 촬영의 조합에 의해 박테리아의 DNA 압축의 일시적인 구조를 특성화 하는 방법을 보여 줍니다. 이 프로토콜은 압축 된 DNA의 관찰에 중점을 둡니다. 위에서 언급 한 다른 새로운 기술로이 메서드를 결합 하 여 더 자세히, DNA 압축 하는 과정을 조사할 수 있을 것입니다 하 고 적절 한 수정된 방법을 널리 박테리아에서 다른 동적 구조 이벤트에 적용 되는.

DNA 압축 일부 박테리아에서 확인 된 극적인 세포질 이벤트입니다. 때 Synechococcus elongatus 는 교양 12 h 아래 각 명암 주기, 압축 된 다른 시간에 그것의 외관에서 명확 하 게 다른 빛 기간의 끝에 등장 하는 DNA1포인트. 그것은 제안 되었습니다이 프로세스 카이 단백질2에 따라 circadian 시계에 의해 제어 됩니다. 세 키 외 DNA Hoechst 33342 물 빛 기간의 끝으로 S. elongatus 세포에 압축 되었고 형광 현미경 물결 막대 모양을 보여주었다 보고 했다. 다음 압축된 DNA 셀 분할 그리고 마지막으로3각 딸 세포는 정상적인 균일 한 분포에 반환으로 막대의 센터에서 두 가지로 구분. 그러나, 일시적인 자연과 전자 현미경 검사 법에 대 한 큰 크기 구조 분석을 방해. 무라 타 외. 동기 문화, 형광 현미경 검사 법, 급속 동결, 및 높은 포함 여러 방법을 결합 전압 전자 cryo-단층 촬영 (cryo-HVET), 그리고 일시적인 DNA 압축의 구조 확인에 성공 polyphosphate 시체 (PPBs)4의 활동을 포함 하 여. 원고 실험 절차를 결합 하 여 자세히 이러한 어려운 자료의 시각적 설명을 제공 합니다.
S. elongatus 는 캡슐 모양, 길이 2 ~ 5 µ m, 너비 0.5 µ m에 대 한 완벽 한 DNA 압축의 아주 짧은 시간 동안만 생활 셀에 나타납니다. 따라서, cyanobacterial DNA 압축에서 발생 하는 구조적인 변화 자세히 알려지지 않은 됐다. 전자 현미경 검사 법에 의해 이러한 구조를 조사 하기 위하여 그것은 두 가지 주요 기술적 문제를 극복 하는 데 필요한입니다. 하나는 기본 조건, 근처에 전체 박테리아 같은 두꺼운 표본 관찰 이며 다른 동적 구조의 급속 한 고정. 첫 번째 문제에 관해서는 전자의 탄성이 평균 자유 경로 (iMFP) 전자 현미경5의 가속 전압에 따라 달라 집니다. 전송 전자 현미경 (TEM) 300에서 kV, 그것은 보다 350 nm. 예를 들어, 얼음 포함 cyanobacterium (견본 간격 ≈ 600 nm)는 200kV TEM에서 관찰 (iMFP ≈ 250 nm), 셀 내부 구조는 관찰 하기 어려운. 1 MV 가장 대조적 (iMFP ≈ 500 nm) 줄 수 있고 이미지 셀 (그림 1)에 걸쳐 세포질 구조. 솔루션 1의 가속 전압에 고전압 전자 현미경 (HVEM)의 한 부분으로,이 프로토콜에 MV 고용 했다. 그러나, 시설 HVEM을 구현 하는 세계적으로 제한 됩니다. 가능한 대체 솔루션을 또한 토론 섹션에 설명 되어 있습니다. 두 번째 문제는 cryo 전자 현미경 검사 법 (cryo-EM)에 의해 해결 되었다. 이 기본 조건, 표본을 급속 냉동 장치를 사용 하 여 액체 탄에 급속 하 게 얼 고 냉동된 순간 수정6의 최소와 함께 직접 관찰은 근처에 동적 구조를 시각화를 위한 강력한 도구입니다. 단층 촬영을 결합, 3 차원 (3D) 구조의 스냅숏으로 기울기 시리즈7에서 개축 될 수 있다. 이 실험에서 DNA 압축 S. elongatus 미만 12 h 각 명암 주기, 동기 문화를 사용 하 여 재현 했다 그리고는 시료의 동결의 타이밍 형광 현미경 모니터링에 의해 결정 되었다.
여기에 설명 된 방법 세균성 세포, 예를 들어 세포 분열, 염색체 분리 및 살 균 소 감염에 동적 구조 연구에 광범위 하 게 적용 되며 미생물 연구에 새로운 길을 열 가능성이 있다.

<table><tbody><tr><td>Hoechst 33342 solution</td><td>Dojindo</td><td>346-07951</td><td>1mg/mL in H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Agar Powder (for plant culture)</td><td>Wako</td><td>016-11875</td><td></td></tr><tr><td>Boric acid</td><td>Wako</td><td>027-02192</td><td>99.5%</td></tr><tr><td>Manganese chloride tetrahydrate</td><td>Wako</td><td>139-00722</td><td>99%</td></tr><tr><td>Zinc sulfate heptahydrate</td><td>Wako</td><td>264-00405</td><td>99.5%</td></tr><tr><td>Sodium molybdate</td><td>Wako</td><td>196-02472</td><td>99%</td></tr><tr><td>Copper sulfate pentahydrate</td><td>Wako</td><td>039-04412</td><td>99.5%</td></tr><tr><td>Cobalt nitrate hexahydrate</td><td>Wako</td><td>031-03752</td><td>99.5%</td></tr><tr><td>Sodium nitrate</td><td>Wako</td><td>191-02542</td><td>99%</td></tr><tr><td>Magnesium sulfate heptahydrate</td><td>Wako</td><td>131-00405</td><td>99.5%</td></tr><tr><td>Calcium chloride dehydrate</td><td>Wako</td><td>031-00435</td><td>99.5%</td></tr><tr><td>Citric acid</td><td>Wako</td><td>036-05522</td><td>98%</td></tr><tr><td>EDTA-2Na</td><td>Dojindo</td><td>343-01861</td><td>99.5%</td></tr><tr><td>Sodium carbonate</td><td>Wako</td><td>197-01581</td><td>99.8%</td></tr><tr><td>Potassium phosphate dibasic</td><td>Wako</td><td>164-04295</td><td>99%</td></tr><tr><td>TES (Good&amp;rsquo;s buffer)</td><td>Dojindo</td><td>344-02653</td><td>99%</td></tr><tr><td>Ferric ammonium citrate</td><td>Wako</td><td>092-00802</td><td>1st Grade</td></tr><tr><td>Sodium thiosulfate pentahydrate</td><td>Wako</td><td>197-03585</td><td>99%</td></tr><tr><td>BSA gold tracer 15nm</td><td>Aurion</td><td>215.133</td><td></td></tr><tr><td>Quantifoil EM grid</td><td>Quantifoil MicroTools</td><td>R3.5/1 Copper grid</td><td></td></tr><tr><td>Electron films</td><td>Kodak</td><td>SO-163</td><td></td></tr><tr><td>Developer</td><td>Kodak</td><td>D19</td><td></td></tr><tr><td>Fixer</td><td>Kodak</td><td>Rapid fixer</td><td>Solution</td></tr><tr><td>Filter paper</td><td>Whatman</td><td>Grade 1</td><td></td></tr><tr><td>Growth chamber</td><td>NKsystem</td><td>LH-100SP</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent microscope</td><td>Nikon</td><td>ECLIPSE 50i</td><td></td></tr><tr><td>High voltage TEM</td><td>HItachi</td><td>H1250M</td><td></td></tr><tr><td>Cryo-specimen holder for HVEM</td><td>Gatan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>plunge-freezing device</td><td>Leica</td><td>EM CPC</td><td></td></tr><tr><td>Plasma Ion bombarder</td><td>Vacuum device</td><td>PIB-10</td><td></td></tr><tr><td>Liquid nitrogen storage</td><td>Taylor-Wharton</td><td>25LDB</td><td></td></tr><tr><td>Developing tank</td><td>Dosaka EM</td><td>TB-3-75</td><td></td></tr><tr><td>flatbed scanner</td><td>Nikon</td><td>Coolscan 9000ED</td><td></td></tr><tr><td>Segmentation software</td><td>FEI</td><td>Amira</td><td>https://www.fei.com/software/amira</td></tr><tr><td>Tomographic Reconstruction software</td><td>eTOMO</td><td></td><td>http://bio3d.colorado.edu/imod</td></tr></tbody></table>

visualization of dna compaction in cyanobacteria by high-voltage cryo-electron tomography

이 프로토콜에는 남조류에 과도 DNA 압축을 시각화 하는 방법을 설명 합니다. DNA 압축 최근 일부 남조류 세포 분열의 앞에 발견 하는 극적인 세포질 이벤트입니다. 그러나, 큰 셀 크기와 과도 문자, 그것은 자세히 구조 조사 어렵다입니다. 어려움을 극복 하기 위해 먼저, DNA 압축 reproducibly에서 생산 됩니다 cyanobacterium Synechococcus elongatus PCC 7942 각 명암 주기 12 h를 사용 하 여 동기 문화. 둘째, DNA 압축 형광 현미경 검사 법에 의해 모니터링 이며 급속 동결에 의해 점령. 셋째, DNA의 상세한 구조 압축 셀 고전압 cryo 전자 단층 촬영 하 여 3 차원 (3D)에 시각 이다. 방법의이 세트는 박테리아, 예를들면 세포 분열, 염색체 분리, 살 균 소 감염 등에서 일시적인 구조 조사를 광범위 하 게 적용., 형광 현미경 검사 법에서 모니터링 하 고 직접에 의해 시각 적절 한 시간 점에서 cryo 전자 tomography

정확한 동기 문화 각 명암 주기 12 h 미만, Hoechst 표시 DNA 어두운 상태 (그림 2a)에서 정상적인 균일 한 분포를 보여줍니다. 그러나, 그것은 점차적으로 빛 기간 동안 셀 내에 압축 하 고 가벼운 기간의 끝에 물결 막대 모양의 구조 (그림 2b)으로 나타납니다. 마지막으로, 막대 ( 그림 2c에서 화살표) 센터에서 분할 그리고 그 두 부분 딸 세포 (그림 2d)로 배포 됩니다. 세포 분열 후 압축된 DNA 사라집니다 즉시, 그리고 DNA는 정상적인 균일 한 분포를 반환 합니다.
때 DNA 압축의 최종 단계에 있는 셀을 포함 하는 셀의 약 수 했다 즉시 전송 홀리 그리드와 빠른 냉동 액체 탄, 그리고 냉동된 그리드 1 MV cryo-HVEM, 남조류 등의 내부 구조에 의해 관찰 되었다 DNA, thylakoid 막, 세포 벽, 레이어와 PPBs, 동결 (그림 3a)의 순간에 스냅숏으로로 나타났다. 많은 셀 셀 ( 그림 3a에서 흰색 화살표)에 고유한 DNA 압축 그리고 정상 세포 ( 그림 3b에서 흰색 화살표)에서 쉽게 구별 될 수 있습니다. 일부 전시 세포의 중심에 수축 세포 분열 (노란색 화살표 그림 3a에서) 전에 예상 대로.
3D tomograms에서 셀의 주요 세포를 세그먼트 수 있습니다; 세포 벽, thylakoid 막, DNA, 레이어와 PPBs 수 구별 (그림 4). 특히, 압축 된 DNA는 세포질 DNA 저밀도 물자에 의해 포위 되었다 고 thylakoid 막 레이어 압축된 DNA의 물결 막대 따라 왜곡 됐다에서 뚜렷한 간격에 의해 분리 되었다. PPBs의 동적 동작을 새롭게 관찰 되었다: DNA에 압축 셀, 그들은 큰 반면 많은 작은 PPBs DNA에 보인 적은 정상 세포에서. 또한, 대부분은 PPBs의 쌍으로 등장 하 고 일부 DNA는 PPBs에서 분리의 과정에 있을 것으로 보인다. 이 DNA 합성에 대 한 인산의 공급 업체로 스스로 PPBs DNA 복제 및 기능으로 2로 분할 된다 제안 했다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57197/57197fig1.jpg"> 그림 1입니다. 곳을 알아내는-EM 얼음 포함 정상적인 박테리아, S. elongatus PCC 7942 다른 가속 전압에서의 이미지. a) 200kV 및 b) 1000kV. 눈금 막대 = 500 nm. <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57197/57197fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57197/57197fig2.jpg"> Cyanobacterium S. elongatus 셀의 그림 2: 형광 현미경 검사 법. 동기 문화 12 시간 미만 각 명암 주기, 후 셀 Hoechst 33342와 얼룩이 있었다. (a) 어두운 상태의 발병의 2 시간 후 셀 표시 동일한 DNA 라벨. 많은 세포에서 DNA는 점차적으로 가벼운 기간 동안 집 광. 그것은 궁극적으로 두꺼운 물결 막대 (b) DNA 압축의 전형적인 형성. 이 단계 후에 신속 하 게 세포 분열 (c), 그리고 2 개의 파편 중 그들의 센터 (화살촉)에서 분할 압축된 DNA 구조 딸 세포로 분리 된 (d). 딸 세포는 균일 한 DNA 라벨 어두운 기간에 다시 돌아갑니다. 눈금 막대 = 2 µ m. <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57197/57197fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57197/57197fig3.jpg"> 그림 3: 곳을 알아내는-HVEM 이미지 남조류의 무 조직 얼음에 포함 된 (a)은 raw 이미지 0 ° 기울기입니다. 이미지 조명 기간의 끝에서 찍은 사진. 일부 셀 표시 물결 막대 모양의 DNA 시체 핵 압축 된 염색체 (흰색 화살표)와 비슷합니다. 정상 세포에 박테리아 (흰색 화살표) 세포질 내에서 뚜렷한 DNA 구조를 전시 한다. 일부 전시 세포 분열 (노란색 화살표) 전에 예상 대로 셀의 중심에 수축. (b) xy, xz, yz-3D tomogram의 조각. 노란색 점선을 조각의 교차점 표시. 눈금 막대 = 2 µ m. <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57197/57197fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57197/57197fig4.jpg"> 그림 4: 포함 된 셀의 열 대권 외 압축 DNA. 주요 구성 요소는 세그먼트: 세포 벽 (밝은 노란색), thylakoid 막 (빨간색), 그리고 DNA (파란색). 3D tomogram의 z 슬라이스 (a) 보여준다. (b) 모든 세그먼트. 세포 분리를 나타내는 수축 (화살표) 셀의 가운데에 나타납니다. PPBs 노란색 또는 주황색 분야;으로 모델링 됩니다. 각 주황색 구체 가까운 노란색 영역에의 대응을 나타냅니다. 눈금 막대 = 500 nm. <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57197/57197fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Visualization of DNA Compaction in Cyanobacteria by High-voltage Cryo-electron Tomography

이 프로토콜에는 남조류에 과도 DNA 압축을 시각화 하는 방법을 설명 합니다. 동기 재배, 형광 현미경 검사 법, 급속 한, 및 높은 모니터링 전압 cryo 전자 단층 촬영 사용 됩니다. 이러한 방법론에 대 한 프로토콜을 제공 하 고 미래의 응용 프로그램 및 개발 논의.

높은 전압 Cryo 전자 단층 촬영으로 박테리아의 DNA 압축의 시각화

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

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Preparation of Primary Neurons for Visualizing Neurites in a Frozen-hydrated State Using Cryo-Electron Tomography

Neurites, both dendrites and axons, are neuronal cellular processes that enable the conduction of electrical impulses between neurons. Defining the structure of neurites is critical to understanding how these processes move materials and signals that support synaptic communication. Electron microscopy (EM) has been traditionally used to assess the ultrastructural features within neurites; however, the exposure to organic solvent during dehydration and resin embedding can distort structures. An important unmet goal is the formulation of procedures that allow for structural evaluations not impacted by such artifacts.
Here, we have established a detailed and reproducible protocol for growing and flash-freezing whole neurites of different primary neurons on electron microscopy grids followed by their examination with cryo-electron tomography (cryo-ET). This technique allows for 3-D visualization of frozen, hydrated neurites at nanometer resolution, facilitating assessment of their morphological differences. Our protocol yields an unprecedented view of dorsal root ganglion (DRG) neurites, and a visualization of hippocampal neurites in their near-native state. As such, these methods create a foundation for future studies on neurites of both normal neurons and those impacted by neurological disorders.

To preserve neuronal processes for ultrastructural analysis, we describe a protocol for plating of primary neurons on electron microscopy grids followed by flash freezing, yielding samples suspended in a layer of vitreous ice. These samples can be examined with a cryo-electron microscope to visualize structures at the nanometer scale.

극저온 전자 단층 촬영을 사용하여 냉동 수화 상태에서 신경 돌기를 시각화에 대한 기본 뉴런의 준비

Neurites, both dendrites and axons, are neuronal cellular processes that enable the conduction of electrical impulses between neurons. Defining the ...

연구

신경과학

Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native context at a molecular level. The technique involves initially preserving the sample in its native state by rapidly freezing the specimen in vitreous ice, then collecting a series of micrographs from different angles at high magnification, and finally computationally reconstructing a 3-D density map. The frozen-hydrated specimen is extremely sensitive to the electron beam and so micrographs are collected at very low electron doses to limit the radiation damage. As a result, the raw cryo-tomogram has a very low signal to noise ratio characterized by an intrinsically noisy image. To better visualize subjects of interest, conventional imaging analysis and sub-tomogram averaging in which sub-tomograms of the subject are extracted from the initial tomogram and aligned and averaged are utilized to improve both contrast and resolution. Large datasets of tilt-series are essential to understanding and resolving the complexes at different states, conditions, or mutations as well as obtaining a large enough collection of sub-tomograms for averaging and classification. Collecting and processing this data can be a major obstacle preventing further analysis. Here we describe a high-throughput cryo-ET protocol based on a computer-controlled 300kV cryo-electron microscope, a direct detection device (DDD) camera and a highly effective, semi-automated image-processing pipeline software wrapper library tomoauto developed in-house. This protocol has been effectively utilized to visualize the intact type III secretion system (T3SS) in Shigella flexneri minicells. It can be applicable to any project suitable for cryo-ET.

We present a protocol on how to utilize high-throughput cryo-electron tomography to determine high resolution in situ structures of molecular machines. The protocol permits large amounts of data to be processed, avoids common bottlenecks and reduces resource downtime, allowing the user to focus on important biological questions.

Tomoauto 사용 : 프로토콜 높은 처리량 자동화 된 곳을 알아내는 - 전자 단층 촬영을 위해

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native ...

생체공학

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Today, cryo-electron tomography (cryo-ET) is the only technique that can provide near-atomic resolution structural data on macromolecular complexes in situ. Owing to the strong interaction of an electron with the matter, high-resolution cryo-ET studies are limited to specimens with a thickness of less than 200 nm, which restricts the applicability of cryo-ET only to the peripheral regions of a cell. A complex workflow that comprises the preparation of thin cellular cross-sections by cryo-focused ion beam micromachining (cryo-FIBM) was introduced during the last decade to enable the acquisition of cryo-ET data from the interior of larger cells. We present a protocol for the preparation of cellular lamellae from a sample vitrified by plunge freezing utilizing Saccharomyces cerevisiae as a prototypical example of a eukaryotic cell with wide utilization in cellular and molecular biology research. We describe protocols for vitrification of S. cerevisiae into isolated patches of a few cells or a continuous monolayer of the cells on a TEM grid and provide a protocol for lamella preparation by cryo-FIB for these two samples.

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

We present a protocol for lamella preparation of plunge frozen biological specimens by cryo-focused ion beam micromachining for high-resolution structural studies of macromolecules in situ with cryo-electron tomography. The presented protocol provides guidelines for the preparation of high-quality lamellae with high reproducibility for structural characterization of macromolecules inside the&#160;Saccharomyces cerevisiae.

냉동 전자 단층 촬영을위한 사카로미세스 cerevisiae의 준비 및 Cryo-FIB 마이크로 매칭

Today, cryo-electron tomography (cryo-ET) is the only technique that can provide near-atomic resolution structural data on macromolecular complexes in ...

생화학

Electron Cryotomography of Bacterial Cells

While much is already known about the basic metabolism of bacterial cells, many fundamental questions are still surprisingly unanswered, including for instance how they generate and maintain specific cell shapes, establish polarity, segregate their genomes, and divide. In order to understand these phenomena, imaging technologies are needed that bridge the resolution gap between fluorescence light microscopy and higher-resolution methods such as X-ray crystallography and NMR spectroscopy.
Electron cryotomography (ECT) is an emerging technology that does just this, allowing the ultrastructure of cells to be visualized in a near-native state, in three dimensions (3D), with "macromolecular" resolution (~4nm).1, 2 In ECT, cells are imaged in a vitreous, "frozen-hydrated" state in a cryo transmission electron microscope (cryoTEM) at low temperature (&lt; -180&deg;C). For slender cells (up to ~500 nm in thickness3), intact cells are plunge-frozen within media across EM grids in cryogens such as ethane or ethane/propane mixtures. Thicker cells and biofilms can also be imaged in a vitreous state by first "high-pressure freezing" and then, "cryo-sectioning" them. A series of two-dimensional projection images are then collected through the sample as it is incrementally tilted along one or two axes. A three-dimensional reconstruction, or "tomogram" can then be calculated from the images. While ECT requires expensive instrumentation, in recent years, it has been used in a few labs to reveal the structures of various external appendages, the structures of different cell envelopes, the positions and structures of cytoskeletal filaments, and the locations and architectures of large macromolecular assemblies such as flagellar motors, internal compartments and chemoreceptor arrays.1, 2
In this video article we illustrate how to image cells with ECT, including the processes of sample preparation, data collection, tomogram reconstruction, and interpretation of the results through segmentation and in some cases correlation with light microscopy.

We illustrate here how to use electron cryotomography (ECT) to study the ultrastructure of bacterial cells in near-native states, to "macromolecular" (~4 nm) resolution.

세균성 세포의 전자 Cryotomography

While much is already known about the basic metabolism of bacterial cells, many fundamental questions are still surprisingly unanswered, including for ...

생물학

Applying Live Cell Imaging and Cryo-Electron Tomography to Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System

The Dot/Icm secretion system of Legionella pneumophila is a complex type IV secretion system (T4SS) nanomachine that localizes at the bacterial pole and mediates the delivery of protein and DNA substrates to target cells, a process generally requiring direct cell-to-cell contact. We have recently solved the structure of the Dot/Icm apparatus by cryo-electron tomography (cryo-ET) and showed that it forms a cell envelope-spanning channel that connects to a cytoplasmic complex. Applying two complementary approaches that preserve the native structure of the specimen, fluorescent microscopy in living cells and cryo-ET, allows in situ visualization of proteins and assimilation of the stoichiometry and timing of production of each machine component relative to other Dot/Icm subunits. To investigate the requirements for polar positioning and to characterize dynamic features associated with T4SS machine biogenesis, we have fused a gene encoding superfolder green fluorescent protein to Dot/Icm ATPase genes at their native positions on the chromosome. The following method integrates quantitative fluorescence microscopy of living cells and cryo-ET to quantify polar localization, dynamics, and structure of these proteins in intact bacterial cells. Applying these approaches for studying the Legionella pneumophila T4SS is useful for characterizing the function of the Dot/Icm system and can be adapted to study a wide variety of bacterial pathogens that utilize the T4SS or other types of bacterial secretion complexes.

Applying Live Cell Imaging and Cryo-Electron Tomography to Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System

Imaging of bacterial cells is an emerging systems biology approach focused on defining static and dynamic processes that dictate the function of large macromolecular machines. Here, integration of quantitative live cell imaging and cryo-electron tomography is used to study Legionella pneumophila type IV secretion system architecture and functions.

레지오넬라 폐렴 구균 도트/Icm 분비 시스템의 시공간적 특징을 해결하기 위해 라이브 세포 이미징 및 극저온 단층 촬영 적용

The Dot/Icm secretion system of Legionella pneumophila is a complex type IV secretion system (T4SS) nanomachine that localizes at the bacterial pole and ...

면역학 및 감염병학

Visualization of ATP Synthase Dimers in Mitochondria by Electron Cryo-tomography

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as cells, organelles, membrane vesicles, or viruses at molecular detail. To achieve this, the aqueous sample is rapidly vitrified in liquid ethane, which preserves it in a close-to-native, frozen-hydrated state. In the electron microscope, tilt series are recorded at liquid nitrogen temperature, from which 3D tomograms are reconstructed. The signal-to-noise ratio of the tomographic volume is inherently low. Recognizable, recurring features are enhanced by subtomogram averaging, by which individual subvolumes are cut out, aligned and averaged to reduce noise. In this way, 3D maps with a resolution of 2 nm or better can be obtained. A fit of available high-resolution structures to the 3D volume then produces atomic models of protein complexes in their native environment. Here we show how we use electron cryo-tomography to study the in situ organization of large membrane protein complexes in mitochondria. We find that ATP synthases are organized in rows of dimers along highly curved apices of the inner membrane cristae, whereas complex I is randomly distributed in the membrane regions on either side of the rows. By subtomogram averaging we obtained a structure of the mitochondrial ATP synthase dimer within the cristae membrane.

We present a protocol of how to collect and process electron cryo-tomograms of whole mitochondria. The technique provides detailed insights into the structure, function, and organization of large membrane protein complexes in native biological membranes.

전자 곳을 알아내는-단층 촬영에 의한 미토콘드리아에서 ATP 합성 효소 이량 체의 시각화

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as ...

Simplified Volumetric Models as an Effective Strategy for Segmenting Actin Networks in Cryo-Electron Tomograms

Efficient methods for the extraction of features of interest remain one of the biggest challenges for the interpretation of cryo-electron tomograms. Various automated approaches have been proposed, many of which work well for high-contrast datasets where the features of interest can be easily detected and are clearly separated from one another. Our inner ear stereocilia cryo-electron tomographic datasets are characterized by a dense array of hexagonally packed actin filaments that are frequently cross-connected. These features make automated segmentation very challenging, further aggravated by the high-noise environment of cryo-electron tomograms and the high complexity of the densely packed features. Using prior knowledge about the actin bundle organization, we have placed layers of a highly simplified ball-and-stick actin model to first obtain a global fit to the density map, followed by regional and local adjustments of the model. We show that volumetric model building not only allows us to deal with the high complexity, but also provides precise measurements and statistics about the actin bundle. Volumetric models also serve as anchoring points for local segmentation, such as in the case of the actin-actin cross connectors. Volumetric model building, particularly when further augmented by computer-based automated fitting approaches, can be a powerful alternative when conventional automated segmentation approaches are not successful.

Here, we present a protocol to place simplified volumetric models into noisy, complex, tomographic 3D volumes. This allows the fast segmentation of actin filament densities, detection of systematic filament bending and of gaps in hair bundle filaments, as well as convenient quantification of volumetric model properties, such as distances.

Efficient methods for the extraction of features of interest remain one of the biggest challenges for the interpretation of cryo-electron tomograms. ...

A 3D Cartographic Description of the Cell by Cryo Soft X-ray Tomography

Imaging techniques are fundamental in order to understand cell organization and machinery in biological research and the related fields. Among these techniques, cryo soft X-ray tomography (SXT) allows imaging whole cryo-preserved cells in the water window X-ray energy range (284-543 eV), in which carbon structures have intrinsically higher absorption than water, allowing the 3D reconstruction of the linear absorption coefficient of the material contained in each voxel. Quantitative structural information at the level of whole cells up to 10 &#181;m thick is then achievable this way, with high throughput and spatial resolution down to 25-30 nm half-pitch. Cryo-SXT has proven itself relevant to current biomedical research, providing 3D information on cellular infection processes (virus, bacteria, or parasites), morphological changes due to diseases (such as recessive genetic diseases) and helping us understand drug action at the cellular level, or locating specific structures in the 3D cellular environment. In addition, by taking advantage of the tunable wavelength at synchrotron facilities, spectro-microscopy or its 3D counterpart, spectro-tomography, can also be used to image and quantify specific elements in the cell, such as calcium in biomineralization processes. Cryo-SXT provides complementary information to other biological imaging techniques such as electron microscopy, X-ray fluorescence or visible light fluorescence, and is generally used as a partner method for 2D or 3D correlative imaging at cryogenic conditions in order to link function, location, and morphology.

Here, a protocol describing the sample preparation and data collection steps required in cryo soft X-ray tomography (SXT) to image the ultrastructure of whole cryo-preserved cells at a resolution of 25 nm half pitch, is presented.

Cryo Soft X선 단층 촬영에 의한 세포의 3D Cartographic 설명

Imaging techniques are fundamental in order to understand cell organization and machinery in biological research and the related fields. Among these ...

Cryo-Electron Tomography Remote Data Collection and Subtomogram Averaging

Cryo-electron tomography (cryo-ET) has been gaining momentum in recent years, especially since the introduction of direct electron detectors, improved automated acquisition strategies, preparative techniques that expand the possibilities of what the electron microscope can image at high-resolution using cryo-ET and new subtomogram averaging software. Additionally, data acquisition has become increasingly streamlined, making it more accessible to many users. The SARS-CoV-2 pandemic has further accelerated remote cryo-electron microscopy (cryo-EM) data collection, especially for single-particle cryo-EM, in many facilities globally, providing uninterrupted user access to state-of-the-art instruments during the pandemic. With the recent advances in Tomo5 (software for 3D electron tomography), remote cryo-ET data collection has become robust and easy to handle from anywhere in the world. This article aims to provide a detailed walk-through, starting from the data collection setup in the tomography software for the process of a (remote) cryo-ET data collection session with detailed troubleshooting. The (remote) data collection protocol is further complemented with the workflow for structure determination at near-atomic resolution by subtomogram averaging with emClarity, using apoferritin as an example.

The present protocol describes high-resolution cryo-electron tomography remote data acquisition using Tomo5 and subsequent data processing and subtomogram averaging using emClarity. Apoferritin is used as an example to illustrate detailed step-by-step processes to achieve a cryo-ET structure at 2.86 &#197; resolution.

초저온 전자 단층 촬영 원격 데이터 수집 및 서브 단층 촬영 평균화

Cryo-electron tomography (cryo-ET) has been gaining momentum in recent years, especially since the introduction of direct electron detectors, improved ...

Visualization of Organelles In Situ by Cryo-STEM Tomography

Cryogenic electron microscopy (cryo-EM) relies on the imaging of biological or organic specimens embedded in their native aqueous medium; water is solidified into a glass (i.e., vitrified) without crystallization. The cryo-EM method is widely used to determine the structure of biological macromolecules recently at a near-atomic resolution. The approach has been extended to the study of organelles and cells using tomography, but the conventional mode of wide-field transmission EM imaging suffers a severe limitation in the specimen thickness. This has led to a practice of milling thin lamellae using a focused ion beam; the high resolution is obtained by subtomogram averaging from the reconstructions, but three-dimensional relations outside the remaining layer are lost. The thickness limitation can be circumvented by scanned probe imaging, similar to the scanning EM or the confocal laser scanning microscope. While scanning transmission electron microscopy (STEM) in materials science provides atomic resolution in single images, the sensitivity of cryogenic biological specimens to electron irradiation requires special considerations. This protocol presents a setup for cryo-tomography using STEM. The basic topical configuration of the microscope is described for both two- and three-condenser systems, while automation is provided by the non-commercial SerialEM software. Enhancements for batch acquisition and correlative alignment to previously-acquired fluorescence maps are also described. As an example, we show the reconstruction of a mitochondrion, pointing out the inner and outer membrane and calcium phosphate granules, as well as surrounding microtubules, actin filaments, and ribosomes. Cryo-STEM tomography excels in revealing the theater of organelles in the cytoplasm and, in some cases, even the nuclear periphery of adherent cells in culture.