이 프로토콜은 세균 분비 복합체의 조립 기능을 특성화하는 데 유용하며 숙주 병원체 상호 작용에 필요한 분자 메커니즘의 근본적인 이해로 이어질 수 있습니다. 이 기술은 샘플의 기본 구조를 보존하고 그대로 세균 세포에서 단백질 복합체의 시각화를 허용하고 볼 수있는 보완적 인 접근 방식을 통합합니다. 그것은 세균 성 분비 시스템의 구조적 기능 관계에 대한 우리의 이해를 증가시킵니다.
이 방법은 다양한 세균성 종에서 다른 유형의 분비 시스템 또는 기타 세포 복합체를 연구하도록 조정할 수 있습니다. 라이브 세포 이미징을 위한 아가로즈 패드를 만드는 것으로 시작합니다. 약 30mL의 1% 낮은 용융 아가로즈 용액을 물에 넣고 유리 플라스크에 넣고 약 90초 간 전자레인지에 넣고 아가로즈가 완전히 용해될 때까지 가끔 소용돌이치기도 한다.
22 바이 22 바이 22 바이 0.15mm 유리 슬라이드를 25 by 75 by 1.1mm 유리 슬라이드를 다른 쪽 위에 놓습니다. 그런 다음 다른 가장자리에 두 개의 작은 슬라이드를 더 쌓습니다. 용융 아가로의 약 1mL은 두 개의 상부 유리 슬라이드 사이의 중앙 슬라이드로 들어가 서기포의 형성을 피하기 위해 용융 아가로즈 위에 또 다른 큰 슬라이드를 놓습니다.
슬라이드를 섭씨 4도에서 15분간 식힌 다음 메스나 면도날을 사용하여 패드를 작은 사각형으로 부드럽게 자릅니다. 25 by 75 by 1.1mm 유리 슬라이드에 양면 접착 프레임을 수정하고 슬라이드에 여러 패드를 배치합니다. 레지오넬라 폐렴필라의 무거운 패치를 1mL의 이중 증류수에 녹입니다.
그런 다음 소용돌이와 파이펫 2 ~ 3 개의 마이크로 리터가 패드에 희석됩니다. 접착제 프레임 위에 58 by 24 by 0.15 mm 커버 슬립을 부드럽게 놓습니다. 밝은 필드 조명을 사용하여 이미징을 위해 셀을 선택합니다.
그런 다음 현미경 소프트웨어의 캡처 창에서 ND를 180으로 조정하고 비닝을 2대 2로 조정합니다. 488 나노미터 채널을 사용하여 500 에서 1000 밀리초 동안 샘플을 노출하고 태그가 없는 레지오넬라 폐렴구균을 동일한 매개 변수로 이미징하여 형광의 특이성을 검증합니다. 극성을 정량화하려면 박테리아가 명확하게 보이도록 이미지 대비를 조정합니다.
그런 다음 관심 영역을 확대하고 지역 도구를 사용하여 극에서 시작하여 사각형이 세균 테두리 내에 남아 있는지 확인하기 위해 세포질로 확장하여 0.25 에서 1.3 마이크로미터 직사각형을 배치합니다. 최소 200개의 박테리아를 표시하고 분석 메뉴에서 마스크를 사용하여 마스크를 만듭니다. 마스크 통계를 클릭하고 마스크 범위 아래의 개체를 선택합니다.
그런 다음 피처와 강도에서 평균 강도와 분산을 표시합니다. 데이터를 텍스트 파일로 내보내고 스프레드시트 응용 프로그램을 사용하여 각 박테리아의 극성 점수를 분산과 평균 강도 사이의 비율로 계산합니다. 높은 처리량 응용 프로그램의 경우 얼굴 대비 현미경 을 사용하여 듀얼 채널 이미지를 수집합니다.
박테리아가 완전히 분리된 뷰 필드를 선택해야 합니다. 다음으로, 박테리아가 명확하게 보이는 수준으로 이미지의 얼굴 채널 대비를 조정합니다. 듀얼 채널 이미지를 열고 세그먼트 마스크 창 만들기를 시작합니다.
적절한 임계값을 조정한 다음 정의 된 개체 버튼을 클릭하고 최소 크기를 100 픽셀로 조정하여 작은 개체를 제거합니다. 정제 마스크에서 가장자리 오브젝트와 서로 인접한 박테리아의 마스크를 분리하십시오. 융합 단백질의 역학을 정량화하려면 이미지 캡처 창을 열고 시간 경과를 표시합니다.
시간 포인트 상자에 두 개를 입력합니다. 관심의 형광 단백질을 표현하는 레지오넬라 폐렴구의 두 개의 성공적인 이미지를 획득. 셀이 명확하게 표시될 때까지 이미지 콘트라스트를 조정합니다.
그런 다음 지역 도구를 사용하여 적어도 400 개의 세포 중간에 0.25 마이크로 미터 사각형을 배치하십시오. 다음으로 영역을 사용하여 분석 메뉴에서 단추를 마스크하여 관심 있는 사각형의 마스크를 만듭니다. 새 빈 마스크를 만들고 픽셀 도구를 사용하여 최소 25개의 임의 셀 영역을 표시합니다.
다른 마스크를 만들고 큰 브러시 도구를 사용하여 셀 사이의 영역을 표시합니다. 마지막으로 마스크 통계를 선택하고 마스크 스코프의 마스크 범위 아래에 개체가 선택되었는지 확인합니다. 피처와 강도 하에서 평균 강도를 선택합니다.
데이터를 내보내고 마스크 2에 대한 프로세스를 반복합니다. 마스크 3의 경우 전체 마스크를 선택하고 평균 강도를 내보냅니다. 전자 극저온 소영 샘플을 준비하려면 CYE 아그라스트렙토미즘 플레이트에서 37도에서 48시간 동안 레지오넬라 폐렴구균의 무거운 패치를 자랍니다.
약 0.7의 OD 600에 물에 있는 세포를 재중단합니다. 그런 다음 셀 서스펜션의 20 마이크로 리터에 콜로이드 금 입자 5 마이크로 리터를 추가합니다. 글로우는 구멍이 뚫린 탄소 그리드와 파이펫 5 마이크로리터를 세포 혼합물에 배출합니다.
1 분 동안 서보자. 필터 용지로 그리드를 블롯하고 중력 구동 플런저 장치를 사용하여 액체 에탄으로 고정하십시오. 레지오넬라 폐렴구균 염색체에 슈퍼폴더 GFP를 삽입한 후, 살아있는 세포 형광 현미경 검사는 형광 신호를 부모 슈퍼폴더 GFP 음수조의 것과 비교하기 위해 수행되었다.
또한, 밝은 필드 현미경 검사는 특정 형광 신호를 가진 세포의 비율을 검사하기 위해 사용되었다. DotB 슈퍼폴더 GFP를 생산한 세포의 극일부만이 융합 단백질의 극성 국소화를 나타냈다. DotB 형광 신호의 분포를 특성화할 때, 극에서 DotB 슈퍼폴더 GFP의 강도가 사이토솔보다 약 2배 높은 것으로 나타났다.
DotB 슈퍼폴더 GFP 극성 국소화가 완전히 조립된 4형 분비 시스템에 종속되어 있는지 조사하기 위해, DotB 슈퍼폴더 GFP의 극성 점수는 야생형및 4형 분비 시스템 돌연변이체에서 개별 세포에 대해 결정되었다. 실제로 DotB 슈퍼폴더 GFP의 극지 위치 지정은 도트/ICM 시스템이 삭제되었을 때 사라졌습니다. 동적 패턴은 DotB ATPase가 동적 세포소 집단에 존재하고 후기 단계 조립 반응에서 극국국화 된 도트 / ICM 유형 4 분비 시스템에 모집되었다는 것을 나타냈다.
높은 처리량 극저온-ET는 도트B 슈퍼폴더 GFP를 발현하는 레지오넬라 폐렴필라 균주에서 온전형 4분비시스템 장치를 시각화하는 데 사용되었다. 셀의 재구성은 셀 봉투에 내장된 여러 Dot/ICM 기계를 밝혀냈습니다. 도트B 및 슈퍼폴더 GFP의 전체 위치지정은 그대로 4형 분비시스템 기계와 관련하여 결정되었다.
3차원 표면 렌더링은 초폴더 GFP가 도트B hexamer 아래에 위치하며, 이는 세포질 ATPase 컴플렉스의 베이스에 디스크로 조립된다. 이 기술을 시도할 때, 이미지 수집을 진행하기 전에 융합 단백질의 안정성과 태그 분비 시스템의 기능을 평가해야 한다. 모델링 및 피팅은 동적 패턴 및 구조 밀도를 분석하고 구조로 하위 단위의 형태 변화 또는 지역화를 평가하는 데 효과적인 방법이 될 수 있습니다.
이 방법을 사용하면 서로 다른 유형 4개의 비밀 시스템 구성 요소가 어떻게 작동하는지, 더 복잡한 내에서 상호 작용하는 방법 및 다른 하위 어셈블리가 수행하는 기능을 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다.
