Name: cell aggregation assays to evaluate the binding of the drosophila notch with trans-ligands and its inhibition by cis-ligands
Uploaded: 2018-01-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 48 s
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저자 인정 NIH/NIGMS에서 지원 (HJN에 R01GM084135) 및 Glycoscience (부여 #110071 HJN), 그리고 톰 V. 리 토론 및 분석 실험에 대 한 제안에 대 한 감사에 대 한 미즈타 니 재단과 Spyros Artavanis-Tsakonas, Hugo Bellen, 로버트 플레밍, 켄 어바인과 플라스 미드를 세포 초파리 게놈 자원 센터 (DGRC)

1. 가짜 최저 두 배 좌초 RNA (dsRNA)의 준비
<ol>
	<li>제품의 PCR 증폭
	<ol>
		<li>야생-타입 옐로우 화이트 (y w) 게놈 DNA와 pAc5.1 EGFP 템플릿과 다음 뇌관 쌍으로 dsRNA 합성에 사용 된 DNA 파편을 증폭을 사용 합니다. 다음 PCR 온도 프로 파일을 사용 하 여: 변성 (95 ° C, 30 s), 어 닐 링 (58 ° C, 30 s) 및 확장 (72 ° C, 1 분). 
		녹색 형광 단백질 강화 (EGFP) dsRNA 뇌관 (5'-3')- 앞으로 뇌관-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGGTGAGCAAGGGCGAGGAG 반전 뇌관-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGGTCTTTGCTCAGGGCGG 
		Shams dsRNA 뇌관 (5'-3')- 앞으로 뇌관-TTAATACGACTCACTATAGGGGAGATGCTGTATGTGGACACGGAT 반전 뇌관-TTAATACGACTCACTATAGGGGAGATCCGTGGATAACCTTAACGA 참고: EGFP dsRNA 부정적인 컨트롤로 사용 됩니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>젤-제조 업체의 프로토콜에 따라 상업 젤 정화 키트를 사용 하 여 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 제품을 정화.</li>
	<li>전사 체 외에 상업 제품 제조 업체의 프로토콜에 따라 T7 발기인에서 속기의 능력을 사용 하 여 수행 합니다.</li>
	<li>제조 업체의 프로토콜에 따라 RNA 정화 키트를 사용 하 여 dsRNA를 정화 하 고-80 ° c.에 저장</li>
	<li>다음 단계 (1.5.1-1.5.5)를 사용 하 여 가짜 최저의 효율성을 평가 합니다.
	<ol>
		<li>태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 100 U/mL 페니실린-스 셀 사용 하 여 수동으로 hemocytometer 및 플레이트 5 x 105 s 2 셀에는 6의 각 잘 잘 플레이트 1 mL/슈나이더의 매체의 10% 보충 수.</li>
		<li>각 잘 하 EGFP-또는 shams dsRNA의 7.5 µ g을 추가 하 고 24 시간에 대 한 25 ° C에서 품 어.</li>
		<li>수확 컨트롤 (EGFP dsRNA 치료) 및 25 ° C에서 5 분 동안 1000 x g와 RNA 분리에 따라 RNA 추출 키트를 사용 하 여 프로세스에서 원심 분리에 의해 아래로 산 뒤 부드러운 pipetting으로 shams dsRNA 취급 S2 셀 제조 업체의 프로토콜입니다.</li>
		<li>분 광 광도 계 및 프로세스 100 사용 하 여 RNA를 정량 1 단계 qRT-PCR 상업 정량 시 약 및 뇌관/프로브와 다음 PCR 온도 프로 파일을 사용 하 여에 대 한 RNA의 ng: 변성 (95 ° C, 15 s) 및 소 둔/확장 (60 ° C, 1 분). 참고: 뇌관/프로브 세트와 이러한 연구에서 shams 및 제어 qRT-PCR 실험을 위해 사용 하는 악기에 정보에 대 한 테이블의 자료 를 참조 하십시오.</li>
		<li>2-ΔΔCT 방법16를 사용 하 여 상대 shams mRNA 레벨을 계산 합니다.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 평가의 노치 수용 체와 트랜스사이의 바인딩-ligands
<ol>
	<li>신호 수신 셀 (S2 노치 수용 체를 표현)을 준비 합니다.
	<ol>
		<li>hemocytometer를 사용 하 여 수동으로 셀 및 플레이트 5 x 105 S2 및 안정적인 S2-노치 셀에 1 ml에서 6 잘 플레이트/슈나이더의 매체의 잘 각 잘 보충 10 %FBS 및 100 U/mL 페니실린-스. 참고: S2 노치 셀, 초파리 게놈 자원 센터 (DGRC)에서 사용할 수 있는 미디어에 200 nM 토트를 추가 합니다. 0.5 m m 토트 재고 솔루션을 준비 하려면 먼저 1 M NaOH의 250 µ L에 20 mM 토트 솔루션 준비. 다음, 0.5 m m 1 M 인산 염 버퍼 식 염 수에-20 ° c.에가을이 솔루션을 희석 S2-노치 셀에 노치 단백질의 표정은 pMT 벡터에 초파리 metallothionein 발기인의 제어.</li>
		<li>각 잘 하 dsRNA의 7.5 µ g을 추가 하 고 24 시간에 대 한 25 ° C에서 품 어.</li>
		<li>0.7 m m 노치의 표현을 유도 하 여 25 ° C에서 3 일 동안 품 어 CuSO4 를 추가 합니다. 참고: CuSO4 metallothionein 발기인에 의해 제어 하는 단백질의 표정을 유도 하는 데 사용 됩니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>신호를 보내는 셀 (S2 셀 델타 또는 Serrate ligands 표현)을 준비 합니다.
	<ol>
		<li>사용 하 여 수동으로 hemocytometer를 접시 ~ 5 x 106 안정 S2 델타 또는 S2 Serrate톰 셀 1 ml에서 6 잘 플레이트의 각 음에 셀/슈나이더의 매체의 보충 10 %FBS 및 100 U/mL 페니실린-스. 참고: 미디어에 S2-델타 셀 200 nM 토트와 100 µ g/mL hygromycin S2 Serrate톰 셀을 추가 합니다. 델타와 Serrate톰의 표정-Serrate12의 토마토 태그, 기능 버전- pMT 벡터에 초파리 metallothionein 발기인을 받고 있다.</li>
		<li>0.7 m m ligands의 표현을 유도 하는 3 h 25 ° C에서 품 어 CuSO4 를 추가 합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>신호 보내기 및 신호 받기 셀 사이의 집계를 수행 합니다.
	<ol>
		<li>DsRNA 취급 S2 수확 (제어)과 부드러운 pipetting 접시 2.5 x 105 셀/잘 hemocytometer에 의해 수동 계산 후 24-잘 접시에에서 의해 S2-노치 셀.</li>
		<li>5 x 105 안정 S2 델타 또는 S2 Serrate톰 셀 슈나이더의 매체의 200 µ L의 전체 볼륨에 추가 (보충 10 %FBS 및 100 U/mL 페니실린-스). 참고: 모든 S2 셀 (를 포함 하 여 도금, 유도 및 dsRNA 처리) 처리는 biosafety 캐비닛 아래 이루어졌다.</li>
		<li>150 rpm (942.48 rad/min)에서 궤도 통에 접시를 놓습니다.</li>
		<li>1 분 후 각의 내용을 혼합 하 고 꺼내 20 µ L의 수를 계산 합니다.<ol>
			<li>10 배 확대 (PLL 10/0.25 목표)를 사용 하 여 거꾸로 화합물 현미경 대표 이미지 걸릴 동시에.</li>
			<li>수동으로 집계를 계산 (&#62; 6 셀)는 hemocytometer를 사용 하 여.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>통에 접시를 놓습니다.</li>
		<li>이미지 수집 및 5 분 후, 15 분 집계의 계산을 반복 합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>트랜스의 정량화를 수행-바인딩.
	<ol>
		<li>배경 컨트롤 S2 셀과 S2 델타 또는 S2 Serrate톰 셀 간의 mL 당 집계 수를 계산 합니다.</li>
		<li>S2-노치와 S2-델타 또는 S2 Serrate톰 셀 사이의 mL 당 집계 수를 계산 ( 트랜스의 크기-바인딩).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3입니다.노치와 트랜스간의 바인딩의 저해의 평가- Cis에 의해 ligands-ligands
<ol>
	<li>신호 수신 셀을 준비 합니다.
	<ol>
		<li>플레이트 5 x 105 s 2 셀의 1 mL에는 6-잘 접시/슈나이더의 매체의 잘 각 잘 보충 10 %FBS 및 100 U/mL 페니실린-스.</li>
		<li>각 잘 하 dsRNA의 7.5 µ g을 추가 하 고 24 시간에 대 한 25 ° C에서 품 어.</li>
		<li>공동 transfect dsRNA 치료 셀 pBluescript 및 pMT 노치11 (DGRC) 혼자 또는 pMT 노치 및 pMT 델타11 (DGRC) 또는 pMT Serrate총17 DNA는 2 µ g/잘 사용 하 여 제조 업체의 프로토콜에 따라 상업 transfection 시 약의 농도. 참고: pBluescript 컨트롤로 사용 됩니다. 공동 transfected 세포 S2-노치 이라고 불릴 것 이다 &#38; 델타과도 또는 S2-노치 &#38; Serrate과도 셀이.</li>
		<li>뚜렷이 페 S2 셀 24 h에 대 한 25 ° c를 품 어.</li>
		<li>0.7 m m 노치와는 ligands의 표현을 유도 하 여 25 ° C에서 3 일 동안 품 어 CuSO4 를 추가 합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>2.2에 설명 된 대로 신호를 보내는 셀을 준비 합니다.</li>
	<li>2.3 섹션에 설명 된 대로 신호 보내기 및 신호 받기 셀 사이의 집계를 수행 합니다.</li>
	<li>트랜스의 저해를 계량- cis에 의해 바인딩-ligands.
	<ol>
		<li>배경 컨트롤 S2 셀과 S2 델타 또는 S2 Serrate 셀 간의 mL 당 집계 수를 계산 합니다.</li>
		<li>Cis에 의해 억제의 크기를 정량화-다음과 같이 ligands.<ol>
			<li>S2-노치과도 S2-델타 세포 사이의 집계의 수로 A 를 정의 합니다.</li>
			<li>S2 셀 사이의 집계 수 노치와 델타 정도 공동 페 B 정의 (S2-노치 &#38; 델타과도)와 S2-델타 세포.</li>
			<li>상대 집계 C 계산 = (B x 100) /A</li>
			<li>Cis-ligand (델타 또는 Serrate) 100-의해 억제의 크기를 계산 C. 참고: 한 예로, 상대 집계가 45%, cis-ligands 횡단을 억제 하는 것으로 간주 됩니다-55% 바인딩.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>de Celis, J. F., Bray, S., Garcia-Bellido, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signalling+regulates+veinlet+expression+and+establishes+boundaries+between+veins+and+interveins+in+the+Drosophila+wing.">Notch signalling regulates veinlet expression and establishes boundaries between veins and interveins in the Drosophila wing.</a> Development. 124 (10), 1919-1928 (1997).</li><li>Fortini, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling:+the+core+pathway+and+its+posttranslational+regulation.">Notch signaling: the core pathway and its posttranslational regulation.</a> Dev Cell. 16 (5), 633-647 (2009).</li><li>del Alamo, D., Rouault, H., Schweisguth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+and+significance+of+cis-inhibition+in+Notch+signalling.">Mechanism and significance of cis-inhibition in Notch signalling.</a> Curr Biol. 21 (1), R40-R47 (2011).</li><li>Sprinzak, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cis-interactions+between+Notch+and+Delta+generate+mutually+exclusive+signalling+states.">Cis-interactions between Notch and Delta generate mutually exclusive signalling states.</a> Nature. 465 (7294), 86-90 (2010).</li><li>Kopan, R., Ilagan, M. 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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+interactions+between+the+protein+products+of+the+neurogenic+loci+Notch+and+Delta,+two+EGF-homologous+genes+in+Drosophila.">Molecular interactions between the protein products of the neurogenic loci Notch and Delta, two EGF-homologous genes in Drosophila.</a> Cell. 61 (3), 523-534 (1990).</li><li>Fleming, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+extracellular+region+of+Serrate+is+essential+for+ligand-induced+cis-inhibition+of+Notch+signaling.">An extracellular region of Serrate is essential for ligand-induced cis-inhibition of Notch signaling.</a> Development. 140 (9), 2039-2049 (2013).</li><li>Saj, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combined+ex+vivo+and+in+vivo+RNAi+screen+for+notch+regulators+in+Drosophila+reveals+an+extensive+notch+interaction+network.">A combined ex vivo and in vivo RNAi screen for notch regulators in Drosophila reveals an extensive notch interaction network.</a> Dev Cell. 18 (5), 862-876 (2010).</li><li>Fiuza, U. M., Klein, T., Martinez Arias, A., Hayward, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+ligand-mediated+inhibition+in+Notch+signaling+activity+in+Drosophila.">Mechanisms of ligand-mediated inhibition in Notch signaling activity in Drosophila.</a> Dev Dyn. 239 (3), 798-805 (2010).</li><li>Ahimou, F., Mok, L. P., Bardot, B., Wesley, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adhesion+force+of+Notch+with+Delta+and+the+rate+of+Notch+signaling.">The adhesion force of Notch with Delta and the rate of Notch signaling.</a> J Cell Biol. 167 (6), 1217-1229 (2004).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Okajima, T., Xu, A., Irvine, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+notch-ligand+binding+by+protein+O-fucosyltransferase+1+and+fringe.">Modulation of notch-ligand binding by protein O-fucosyltransferase 1 and fringe.</a> J Biol Chem. 278 (43), 42340-42345 (2003).</li><li>Acar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rumi+is+a+CAP10+domain+glycosyltransferase+that+modifies+Notch+and+is+required+for+Notch+signaling.">Rumi is a CAP10 domain glycosyltransferase that modifies Notch and is required for Notch signaling.</a> Cell. 132 (2), 247-258 (2008).</li><li>Bruckner, K., Perez, L., Clausen, H., Cohen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycosyltransferase+activity+of+Fringe+modulates+Notch-Delta+interactions.">Glycosyltransferase activity of Fringe modulates Notch-Delta interactions.</a> Nature. 406 (6794), 411-415 (2000).</li><li>Yamamoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mutation+in+EGF+repeat-8+of+Notch+discriminates+between+Serrate/Jagged+and+Delta+family+ligands.">A mutation in EGF repeat-8 of Notch discriminates between Serrate/Jagged and Delta family ligands.</a> Science. 338 (6111), 1229-1232 (2012).</li></ol>

저자는 전혀 충돌의 관심이 없다.

정식 노치 신호 노치 수용 체와 ligands5간의 상호 작용에 따라 달라 집니다. 노치 통로에 대부분의 연구는 주로 노치와 인접 셀 (트랜스)에 ligands의 바인딩은 고려, 하지만 노치와 같은 셀 ligands 할 상호 작용, 그리고 이러한 소위 cis-상호 작용 단계에서 억제 역할을 재생할 수 있습니다 신호3,4. 따라서, 정식 노치 신호에 한?...

정식 노치 신호 노치 수용 체와 그들의 ligands1간의 상호 작용을 촉진 하기 위하여 세포를 이웃의 육체적 인 접촉을 필요로 하는 단거리에 셀 통신 메커니즘입니다. Ligands와 노치 수용 체 (신호 수신 세포의 표면에 존재 하는)의 상호 작용 (신호 전송의 표면에 세포) 노치 신호를 시작 하 고 트랜스로 알려져 있다-활성화2. 다른 한편으로, 노치와 동일한 셀에 있는 그것의 ligands 사이 상호 작용 노치 통로의 억제를 지도 하 고 cis로 알려져 있다-금지3. 트랜스-와 cis사이의 균형-상호 작용 최적의 ligand 의존 노치4신호를 확인 하는 데 필요한. 초파리 는 포유류, 4 개의 노치 수용 체 있고 5 개의 ligands에 반대 한 노치 수용 체 및 두 ligands (델타와 Serrate) [가변 1 (JAG1), JAG2, 델타 같은 1 (DLL1), DLL3 및 DLL4]5. 이 단순 데, 초파리 모델 부드럽게 해 부 연구 노치 ligand 상호 작용 및 이후에 노치 신호 통로 한정자의 효과를 제공 합니다. ( 초파리날개 개발 포함), 동물 개발 하는 동안 특정 상황에서 cis-및 트랜스-상호 적절 한 노치 신호를 달성 하기 위해 운명1,6 셀 관련 . 시스- 트랜스대에 이러한 상황에서 노치 통로 한정자의 효과 구별 하는 것이 중요 하다-그것의 ligands와 노치의 상호 작용.
우리의 그룹은 이전 부정적인 초파리 노치를 xylose 라는 탄수화물 잔류물의 날개 개발7을 포함 한 특정 컨텍스트에서 노치 신호 조절 보고. Shams 의 손실 (효소는 xylosylates 노치) "날개 정 맥의 손실" 형7리드. 최근에, 유전자 복용량 실험 및 클론 분석 shams 의 손실 델타 중재 노치 내 서 향상을 보여 사용 되었다. Shams 돌연변이에 향상 된 노치 신호는 감소 cis의 결과 여부를 구별 하는 것-금지 또는 증가 트랜스-활성화, 애벌레 윙 imaginal 디스크에 노치 ligands의 소성 overexpression 학문 민 진 당-GAL4 드라이버를 사용 하 여 수행 했다. Shams 트랜스규제를 제안 하는 증거를 제공 하는이 실험-노치 cis를 영향을 주지 않고 델타에 의해 노치의 활성화-ligands8에 의해 저해. 그러나, 피드-다시 규정 그리고 내 인 성 ligands의 효과 소성 overexpression 학문1,,69의 해석 복잡 하 게 만들 수 있습니다.
10 사용 되었다 초파리 S2 세포가이 문제를 해결 하려면는 노치 ligand 상호 작용 연구11,12간단한 체 외에 시스템을 제공 합니다. S2 셀 하지 생 노치 수용 체 델타 리간드11 을 표현 하 고 표현 Serrate13, 노치 ligand 집계 실험8에 영향을 주지 않는 낮은 수준. 따라서, S2 셀 수 수 안정적으로 또는 정도 페 노치 또는 개별 ligands 델타 (Serrate) 독점적으로 노치 수용 체 또는 그것의 ligands의 하나를 표현 하는 세포를 생성 하 또는 그들의 조합에 의해. Heterotypic 수용 체 ligand 바인딩11,,1214중재의 형성에 S2 셀 결과 ligand 표현 S2 노치 표현 세포의 혼합. 트랜스의 측정을 제공 하는 집계 형성의 정량화-노치와 그것의 ligands15 (그림 1) 사이의 바인딩. 마찬가지로, S2 셀 노치와 델타 또는 Serrate ligands와 공동 transfected 수 (즉, cis-ligands). Cis-S2 노치 표현 세포에 ligands 파기 트랜스와 노치의 바인딩-ligands 및 결과에 집계 형성8,,1214감소. Cis에 의해 발생 하는 집계 형성의 상대적 감소- cis의 억제 효과의 측정을 제공 하는 ligands-노치와 트랜스간의 바인딩에 ligands-ligands (그림 2). 따라서, 셀 집계 분석 트랜스-와 cis에 xylosylation의 손실의 영향을 검토 하 활용 했다-노치와 그것의 ligands 사이 상호 작용.
여기, 선물이 상세한 프로토콜 트랜스와 노치의 바인딩을 평가를 겨냥 한 셀 집계 분석 실험-ligands 및 cis에 의해 그것의 억제-ligands 초파리 S2 세포를 사용 하 여. 예를 들어, 제공 하는 데이터 바인딩 노치와 트랜스사이 노치 xylosylation의 효과 결정 하는-델타8. 이러한 간단 분석 노치 ligand 상호 작용에서 생체 외에서 의 반 정량적 평가 제공 하 고 기본 노치 통로 한정자의 비보에 효과 분자 메커니즘을 결정 하는 데 도움이.

<table><tbody><tr><td>BioWhittaker Schneider&amp;rsquo;s Drosophila medium, Modified</td><td>Lonza</td><td>04-351Q</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Penicillin-Streptomycin 100X solution</td><td>GE Healthcare lifescience&amp;nbsp;</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR 6 well plate</td><td>Greiner Bio-One</td><td>657 160</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR 24 well plate</td><td>Greiner Bio-One</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>VWR mini shaker</td><td>Marshell Sceintific</td><td>12520-956</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Fisher Sceintific&amp;nbsp;</td><td>267110</td><td></td></tr><tr><td>FuGENE HD Transfection Reagent</td><td>Promega</td><td>E2311</td><td></td></tr><tr><td>MEGAscrip T7 Transcription Kit</td><td>Ambion</td><td>AM1334</td><td></td></tr><tr><td>Quick-RNA MiniPrep (RNA purification Kit)</td><td>Zymo Research</td><td>R1054</td><td></td></tr><tr><td>VistaVision Inverted microscope</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>9MP USB2.0 Microscope Digital Camera + Advanced Software</td><td>AmScope</td><td>MU-900</td><td>Image acquisition using ToupView software</td></tr><tr><td>PureLink Quick Gel Extraction Kit</td><td>Invitrogen</td><td>K210012</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>GenDepot</td><td>F0600-050</td><td></td></tr><tr><td>Methotrexate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6770-10</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycin B</td><td>Invitrogen</td><td>HY068-L6</td><td></td></tr><tr><td>Copper sulphate</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>4448-02</td><td></td></tr><tr><td>S2 cells</td><td>Invitrogen</td><td>R69007</td><td></td></tr><tr><td>S2-Serrate&lt;sup&gt;Tom &lt;/sup&gt;cells</td><td></td><td></td><td>Gift from R. Fleming (Fleming et al, Development, 2013)</td></tr><tr><td>S2-Delta cells</td><td>DGRC</td><td>152</td><td></td></tr><tr><td>S2-Notch cells</td><td>DGRC</td><td>154</td><td></td></tr><tr><td>pMT-Delta vector</td><td>DGRC</td><td>1021</td><td>Gift from S. Artavanis-Tsakonas</td></tr><tr><td>pMT-Serrate vector</td><td></td><td></td><td>Gift from Ken Irvine (Okajima et al, JBC, 2003)</td></tr><tr><td>pMT-Notch vector</td><td>DGRC</td><td>1022</td><td>Gift from S. Artavanis-Tsakonas</td></tr><tr><td>pAc5.1-EGFP</td><td></td><td></td><td>Gift from Hugo Bellen</td></tr><tr><td>TaqMan RNA-to-Ct 1-&lt;em&gt;Step&lt;/em&gt; Kit</td><td>Applied Biosystem</td><td>1611091</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Assay for CG9996 (Shams)</td><td>Applied Biosystem</td><td>Dm02144576_g1&amp;nbsp;</td><td>with FAM-MGB dye</td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Assay for CG7939 (RpL32)</td><td>Applied Biosystem</td><td>Dm02151827_g1</td><td>with FAM-MGB dye</td></tr><tr><td>Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR system</td><td>Applied Biosystem</td><td>4351405</td><td>96-well Block module</td></tr></tbody></table>

cell aggregation assays to evaluate the binding of the drosophila notch with trans-ligands and its inhibition by cis-ligands

노치 신호 동물 개발 및 성인 유지 관리에 광범위 하 게 사용 되는 진화론 보존된 셀 통신 시스템입니다. 신호 통로의 활성화를 유도 하는 이웃 세포에서 ligands와 노치 수용 체의 상호 작용 (트랜스-활성화) 신호를 억제 하는 ligands는 동일한 세포에서와 상호 작용 하는 동안, (cis-억제). 트랜스사이의 적절 한 균형-활성화 및 cis-억제 노치 동물 개발 하는 동안 일부 컨텍스트에서 신호의 최적 수준을 확립 도움이 됩니다. 노치와 많은 세포 유형에의 ligands의 겹치는 식 도메인 및 피드백 메커니즘의 존재, 트랜스- cis대에 주어진된 포스트 번역 상 수정의 효과 공부-노치의 상호 작용 및 그것의 ligands에서 비보에 어렵습니다. 여기, 우리 노치의 트랜스 와 cis각 ligand 바인딩에 노치 통로 한정자 노크의 효과 평가 하기 위해 셀 집계 분석 실험에서 초파리 S2 세포를 사용 하기 위한 프로토콜을 설명 합니다. S2 셀 안정적으로 또는 정도 페 노치 표현 벡터와 각 노치 ligand (S2-델타 또는 S2 Serrate)를 표현 하는 세포와 혼합 됩니다. 트랜스-수용 체와 ligands 간의 바인딩을 heterotypic 셀의 형성 귀착되 고 mL의 구성 당 집계 수 측정 된다 &#62; 6 셀. Cis의 억제 효과 검토-ligands, S2 셀 공동 노치와 각 ligand를 표현 S2 델타 또는 S2 Serrate 세포 혼합 및 위에서 설명한 대로 집계의 수 정량은. Cis의 존재로 인해 집계 수의 상대적 감소- cis의 측정을 제공 하는 ligands-ligand- 트랜스의 저해를 중재-바인딩. 이러한 간단 분석 실험 유전 또는 약리학 바인딩에 노치의에 조작의 ligands의 효과에 반 양적 데이터를 제공할 수 있습니다 그리고 vivo에서 효과의 기본 분자 메커니즘을 파악 하는 것을 도울 수 있다 노치 신호에 같은 조작.

우리의 vivo에서 관측 제안는 노치 신호 때문에 이득에 xylosyltransferase 유전자 shams 결과의 손실 증가 델타 중재 트랜스- cis를 영향을 주지 않고 노치의 활성화-의 저해 노치 ligands8. 이 테스트 하려면 셀 집계 분석 생체 외에서 수행 했다. 첫째, shams 식 S2 셀에는 뜨 shams dsRNA를 사용 하 여. EGFP dsRNA 제어로 ?...

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Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Vivo에서 시스템의 복잡성 트랜스-와 cis에 의해 활성화 노치 수용 체의 억제 사이 구별 하 게 어려운 게-ligands, 각각. 여기, 우리가 시험관에서 셀 집계 분석 실험의 트랜스를 초파리 노치의 바인딩 질적 및 반 정량적 평가 위한 기반 프로토콜 제시-ligands 대 cis-ligands.

트랜스와 초파리 노치의 바인딩을 평가를 집계 분석 셀-Ligands 및 Cis에 의해 그것의 억제-Ligands

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

7.5K 조회수.  Baylor College of Medicine. Vivo에서 시스템의 복잡성 트랜스-와 cis에 의해 활성화 노치 수용 체의 억제 사이 구별 하 게 어려운 게-ligands, 각각. 여기, 우리가 시험관에서 셀 집계 분석 실험의 트랜스를 초파리 노치의 바인딩 질적 및 반 정량적 평가 위한 기반 프로토콜 제시-ligands 대 cis-ligands.

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Drug-induced Sensitization of Adenylyl Cyclase: Assay Streamlining and Miniaturization for Small Molecule and siRNA Screening Applications

Sensitization of adenylyl cyclase (AC) signaling has been implicated in a variety of neuropsychiatric and neurologic disorders including substance abuse and Parkinson&#39;s disease. Acute activation of G&#945;i/o-linked receptors inhibits AC activity, whereas persistent activation of these receptors results in heterologous sensitization of AC and increased levels of intracellular cAMP. Previous studies have demonstrated that this enhancement of AC responsiveness is observed both in vitro and in vivo following the chronic activation of several types of G&#945;i/o-linked receptors including D2 dopamine and &#956; opioid receptors. Although heterologous sensitization of AC was first reported four decades ago, the mechanism(s) that underlie this phenomenon remain largely unknown. The lack of mechanistic data presumably reflects the complexity involved with this adaptive response, suggesting that nonbiased approaches could aid in identifying the molecular pathways involved in heterologous sensitization of AC. Previous studies have implicated kinase and Gb&#947; signaling as overlapping components that regulate the heterologous sensitization of AC. To identify unique and additional overlapping targets associated with sensitization of AC, the development and validation of a scalable cAMP sensitization assay is required for greater throughput. Previous approaches to study sensitization are generally cumbersome involving continuous cell culture maintenance as well as a complex methodology for measuring cAMP accumulation that involves multiple wash steps. Thus, the development of a robust cell-based assay that can be used for high throughput screening (HTS) in a 384&#160;well format would facilitate future studies. Using two D2 dopamine receptor cellular models (i.e.&#160;CHO-D2L and HEK-AC6/D2L), we have converted our 48-well sensitization assay (&#62;20 steps 4-5 days) to a five-step, single day assay in 384-well format. This new format is amenable to small molecule screening, and we demonstrate that this assay design can also be readily used for reverse transfection of siRNA in anticipation of targeted siRNA library screening.

Persistent activation of inhibitory G protein-coupled receptors results in sensitization of adenylyl cyclase signaling. To identify the essential molecular pathways, nonbiased approaches are necessary; however, this strategy requires the development of a scalable cell-based cAMP sensitization assay. Herein, we describe a sensitization assay for small molecule and siRNA screening.

아데 닐 레이트 사이 클라 제의 약물에 의한 과민성 : 작은 분자와 siRNA의 심사 응용 프로그램에 대한 분석 최적화 기술과 소형화

Sensitization of adenylyl cyclase (AC) signaling has been implicated in a variety of neuropsychiatric and neurologic disorders including substance abuse ...

연구

생체공학

Methods to Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular disease and various neurological diseases1. We have optimized simple and robust behavioral assays for determining larval locomotion, adult climbing ability (RING assay), and courtship behaviors of Drosophila. These behavioral assays are widely applicable for studying the role of genetic and environmental factors on fly behavior. Larval crawling ability can be reliably used for determining early stage changes in the crawling abilities of Drosophila larvae and also for examining effect of drugs or human disease genes (in transgenic flies) on their locomotion. The larval crawling assay becomes more applicable if expression or abolition of a gene causes lethality in pupal or adult stages, as these flies do not survive to adulthood where they otherwise could be assessed. This basic assay can also be used in conjunction with bright light or stress to examine additional behavioral responses in Drosophila larvae. Courtship behavior has been widely used to investigate genetic basis of sexual behavior, and can also be used to examine activity and coordination, as well as learning and memory. Drosophila courtship behavior involves the exchange of various sensory stimuli including visual, auditory, and chemosensory signals between males and females that lead to a complex series of well characterized motor behaviors culminating in successful copulation. Traditional adult climbing assays (negative geotaxis) are tedious, labor intensive, and time consuming, with significant variation between different trials2-4. The rapid iterative negative geotaxis (RING) assay5 has many advantages over more widely employed protocols, providing a reproducible, sensitive, and high throughput approach to quantify adult locomotor and negative geotaxis behaviors. In the RING assay, several genotypes or drug treatments can be tested simultaneously using large number of animals, with the high-throughput approach making it more amenable for screening experiments.

Methods to Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster is a genetically and behaviorally tractable model system that has been used to understand the molecular and cellular basis of many important biological processes for over a century 1. Drosophila has been well exploited to gain insights into the genetic basis of fly behavior.

분석의 방법 Drosophila 행동

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular ...

신경과학

A Cell-based Assay to Investigate Non-muscle Myosin II Contractility via the Folded-gastrulation Signaling Pathway in Drosophila S2R+ Cells

We have developed a cell-based assay using Drosophila cells that recapitulates apical constriction initiated by folded gastrulation (Fog), a secreted epithelial morphogen. In this assay, Fog is used as an agonist to activate Rho through a signaling cascade that includes a G-protein-coupled receptor (Mist), a G&#945;12/13 protein (Concertina/Cta), and a PDZ-domain-containing guanine nucleotide exchange factor (RhoGEF2). Fog signaling results in the rapid and dramatic reorganization of the actin cytoskeleton to form a contractile purse string. Soluble Fog is collected from a stable cell line and applied ectopically to S2R+ cells, leading to morphological changes like apical constriction, a process observed during developmental processes such as gastrulation. This assay is amenable to high-throughput screening and, using RNAi, can facilitate the identification of additional genes involved in this pathway.

A Cell-based Assay to Investigate Non-muscle Myosin II Contractility via the Folded-gastrulation Signaling Pathway in Drosophila S2R+ Cells

Here we describe a contractility assay using Drosophila S2R+ cells. The application of an exogenous ligand, folded gastrulation (Fog), leads to the activation of the Fog signaling pathway and cellular contractility. This assay can be used to investigate the regulation of cellular contractility proteins in the Fog signaling pathway.

조사 비 근육 Myosin II 수축 통해 접혀 gastrulation 신호 전달 경로 초파리 S2R + 셀에 셀 기반 분석 결과

We have developed a cell-based assay using Drosophila cells that recapitulates apical constriction initiated by folded gastrulation (Fog), a secreted ...

발생학

Live Dissection of Drosophila Embryos: Streamlined Methods for Screening Mutant Collections by Antibody Staining

Drosophila embryos between stages 14 and 17 of embryonic development can be readily dissected to generate "fillet" preparations. In these preparations, the central nervous system runs down the middle, and is flanked by the body walls. Many different phenotypes have been examined using such preparations. In most cases, the fillets were generated by dissection of antibody-stained fixed whole-mount embryos. These "fixed dissections" have some disadvantages, however. They are time-consuming to execute, and it is difficult to sort mutant (GFP-negative) embryos from stocks in which mutations are maintained over GFP balancer chromosomes. Since 2002, our group has been conducting deficiency and ectopic expression screens to identify ligands for orphan receptors. In order to do this, we developed streamlined protocols for live embryo dissection and antibody staining of collections containing hundreds of balanced lines. We have concluded that it is considerably more efficient to examine phenotypes in large collections of stocks by live dissection than by fixed dissection. Using the protocol described here, a single trained individual can screen up to 10 lines per day for phenotypes, examining 4-7 mutant embryos from each line under a compound microscope. This allows the identification of mutations conferring subtle, low-penetrance phenotypes, since up to 70 hemisegments per line are scored at high magnification with a 40X water-immersion lens.

Live Dissection of Drosophila Embryos: Streamlined Methods for Screening Mutant Collections by Antibody Staining

We describe a streamlined protocol for generating "fillet" preparations of Drosophila embryos of specific genotypes. This protocol allows efficient execution of a variety of genetic screens. It also allows excellent visualization of structures in the late embryo.

라이브 해부 Drosophila 태아 : 항체 스테 이닝에 의해 돌연변이 컬렉션을 검사 늘씬한 방법

Drosophila embryos between stages 14 and 17 of embryonic development can be readily dissected to generate "fillet" preparations.  In these preparations, ...

생물학

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval neuromuscular junction (NMJ) in Drosophila. Previous studies have shown that the postsynaptic distribution of Dlg at the larval NMJ overlaps with that of Hu-li tai shao (Hts), a homologue to the mammalian adducins. In addition, Dlg and Hts are observed to form a complex with each other based on co-immunoprecipitation experiments involving whole adult fly lysates. Due to the nature of these experiments, however, it was unknown whether this complex exists specifically at the NMJ during larval development.
Proximity Ligation Assay (PLA) is a recently developed technique used mostly in cell and tissue culture that can detect protein-protein interactions in situ. In this assay, samples are incubated with primary antibodies against the two proteins of interest using standard immunohistochemical procedures. The primary antibodies are then detected with a specially designed pair of oligonucleotide-conjugated secondary antibodies, termed PLA probes, which can be used to generate a signal only when the two probes have bound in close proximity to each other. Thus, proteins that are in a complex can be visualized. Here, it is demonstrated how PLA can be used to detect in situ protein-protein interactions at the Drosophila larval NMJ. The technique is performed on larval body wall muscle preparations to show that a complex between Dlg and Hts does indeed exist at the postsynaptic region of NMJs.

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

This protocol demonstrates how Proximity Ligation Assay can be used to detect in situ protein-protein interactions at the Drosophila larval neuromuscular junction. With this technique, Discs large and Hu-li tai shao are shown to form a complex at the postsynaptic region, an association previously identified through co-immunoprecipitation.

검출<em&gt; 현장에서</em상기&gt; 단백질 - 단백질 복합체<em&gt; 초파리</em근접 내고 분석을 사용하기&gt; 애벌레 신경 근육 접합부

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval ...

Antibody-Mediated Live Imaging을 통한 단백질 시각화 향상

Visualizing Low-Abundance Proteins and Post-Translational Modifications in Living Drosophila Embryos via Fluorescent Antibody Injection

Visualization of proteins in living cells using GFP (Green Fluorescent Protein) and other fluorescent tags has greatly improved understanding of protein localization, dynamics, and function. Compared to immunofluorescence, live imaging more accurately reflects protein localization without potential artifacts arising from tissue fixation. Importantly, live imaging enables quantitative and temporal characterization of protein levels and localization, crucial for understanding dynamic biological processes such as cell movement or division. However, a major limitation of fluorescent tagging approaches is the need for sufficiently high protein expression levels to achieve successful visualization. Consequently, many endogenously tagged fluorescent proteins with relatively low expression levels cannot be detected. On the other hand, ectopic expression using viral promoters can sometimes lead to protein mislocalization or functional alterations in physiological contexts. To address these limitations, an approach is presented that utilizes highly sensitive antibody-mediated protein detection in living embryos, essentially performing immunofluorescence without the need for tissue fixation. As proof of principle, endogenously GFP-tagged Notch receptor that is barely detectable&#160;in living embryos can be successfully visualized after antibody injection. Furthermore, this approach was adapted to visualize post-translational modifications (PTMs) in living embryos, allowing the detection of temporal changes in tyrosine phosphorylation patterns during early embryogenesis and revealing a novel subpopulation of phosphotyrosine (p-Tyr) underneath apical membranes. This approach can be modified to accommodate other protein-specific, tag-specific, or PTM-specific antibodies and should be compatible with other injection-amenable model organisms or cell lines. This protocol opens new possibilities for live imaging of low-abundance proteins or PTMs that were previously challenging to detect using traditional fluorescent tagging methods.

저자 스포트라이트: Unveiling the Dynamics of Mechanical and Biochemical Signals in Animal Morphogenesis Research (동물 형태 형성 연구에서 기계적 및 생화학적 신호의 역학 공개) 

This protocol describes the customized antibody-based fluorescence labeling and injection into early Drosophila embryos to enable live imaging of low-abundance proteins or post-translational modifications that are challenging to detect using traditional GFP/mCherry-tag approaches.

형광 항체 주입을 통한 살아있는 초파리 배아의 저농도 단백질 및 번역 후 변형 시각화

Visualization of proteins in living cells using GFP (Green Fluorescent Protein) and other fluorescent tags has greatly improved understanding of protein ...

Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

With the rising prevalence of neurodegenerative diseases, it is increasingly important to understand the underlying pathophysiology that leads to neuronal dysfunction and loss. Fluorescence-based imaging tools and technologies enable unprecedented analysis of subcellular neurobiological processes, yet there is still a need for unbiased, reproducible, and accessible approaches for extracting quantifiable data from imaging studies. We have developed a simple and adaptable workflow to extract quantitative data from fluorescence-based imaging studies using Drosophila models of neurodegeneration. Specifically, we describe an easy-to-follow, semi-automated approach using Fiji/ImageJ to analyze two cellular processes: first, we quantify protein aggregate content and profile in the Drosophila optic lobe using fluorescent-tagged mutant huntingtin proteins; and second, we assess autophagy-lysosome flux in the Drosophila visual system with ratiometric-based quantification of a tandem fluorescent reporter of autophagy. Importantly, the protocol outlined here includes a semi-automated segmentation step to ensure all fluorescent structures are analyzed to minimize selection bias and to increase resolution of subtle comparisons. This approach can be extended for the analysis of other cell biological structures and processes implicated in neurodegeneration, such as proteinaceous puncta (stress granules and synaptic complexes), as well as membrane-bound compartments (mitochondria and membrane trafficking vesicles). This method provides a standardized, yet adaptable reference point for image analysis and quantification, and could facilitate reliability and reproducibility across the field, and ultimately enhance mechanistic understanding of neurodegeneration.

Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

We have developed a simple and adaptable workflow to extract quantitative data from fluorescence-imaging-based cell biological studies of protein aggregation and autophagic flux in the central nervous system of Drosophila models of neurodegeneration.

ImageJ를 사용 하 여 붙일 태그가 단백질의 편견된 분석 통해 초파리 에서 Neurodegeneration의 양적 세포 생물학

With the rising prevalence of neurodegenerative diseases, it is increasingly important to understand the underlying pathophysiology that leads to neuronal ...

Measuring Transcellular Interactions through Protein Aggregation in a Heterologous Cell System

Protein interactions at cellular interfaces dictate a multitude of biological outcomes ranging from tissue development and cancer progression to synapse formation and maintenance. Many of these fundamental interactions occur in trans and are typically induced by heterophilic or homophilic interactions between cells expressing membrane anchored binding pairs. Elucidating how disease relevant mutations disrupt these fundamental protein interactions can provide insight into a myriad of cell biology fields. Many protein-protein interaction assays do not typically disambiguate between cis and trans interactions, which potentially leads to an overestimation of the extent of binding that is occurring in vivo and involve labor intensive purification of protein and/or specialized monitoring equipment. Here, we present an optimized simple protocol that allows for the observation and quantification of only trans interactions without the need for lengthy protein purifications or specialized equipment. The HEK cell aggregation assay involves the mixing of two independent populations of HEK cells, each expressing membrane-bound cognate ligands. After a short incubation period, samples are imaged and the resulting aggregates are quantified.

Here, we present an optimized protocol to rapidly and semiquantitatively measure ligand-receptor interactions in trans in a heterologous cell system using fluorescence microscopy.

이종 세포 시스템에서 단백질 응집을 통한 세포 간 상호 작용 측정

Protein interactions at cellular interfaces dictate a multitude of biological outcomes ranging from tissue development and cancer progression to synapse ...

트랜스와 초파리 노치의 바인딩을 평가를 집계 분석 셀-Ligands 및 Cis에 의해 그것의 억제-Ligands

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아데 닐 레이트 사이 클라 제의 약물에 의한 과민성 : 작은 분자와 siRNA의 심사 응용 프로그램에 대한 분석 최적화 기술과 소형화

분석의 방법 Drosophila 행동

조사 비 근육 Myosin II 수축 통해 접혀 gastrulation 신호 전달 경로 초파리 S2R + 셀에 셀 기반 분석 결과

라이브 해부 Drosophila 태아 : 항체 스테 이닝에 의해 돌연변이 컬렉션을 검사 늘씬한 방법

검출

형광 항체 주입을 통한 살아있는 초파리 배아의 저농도 단백질 및 번역 후 변형 시각화

형광 항체 주입을 통한 살아있는 초파리 배아의 저농도 단백질 및 번역 후 변형 시각화

형광 항체 주입을 통한 살아있는 초파리 배아의 저농도 단백질 및 번역 후 변형 시각화

ImageJ를 사용 하 여 붙일 태그가 단백질의 편견된 분석 통해 초파리 에서 Neurodegeneration의 양적 세포 생물학

이종 세포 시스템에서 단백질 응집을 통한 세포 간 상호 작용 측정