이 연구는 공공, 상업, 또는 하지-위한-비영리 부문에 자금 지원 기관에서 어떤 특정 그랜트를 받지 않았다.

모든 실험 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 다이 이치 산 쿄 주식회사에 의해 승인 되었다
1. 샘플 준비
<ol><li>EDTA 2 K 포함 된 튜브에 cynomolgus 원숭이의 대 퇴 정 맥에서 혈액 (적어도 0.5 mL)를 수집 합니다. 참고: 시트르산과 헤 파 린 허용 되지 않습니다 때문에 이러한 응고 억제 이후 PCR14,15.</li>
	<li>즉시 얼음과 컬렉션의 2 시간 이내 플라즈마 격리 프로세스에 수집 된 샘플을 놓습니다.</li>
	<li>5 분 동안 4 ° C에서 10000 x g에서 샘플 원심</li>
	<li>2 mL microtube, 세포 파편 및 잔여 혈소판을 제거 하 5 분 동안 4 ° C에서 16000 x g에서 원심 분리 뒤에 상쾌한을 전송 합니다. 참고: 정량화 miRNAs의 혈소판 오염16에 의해 크게 달라질 수 있습니다.</li>
	<li>신선한 2 mL-microtubes에 상쾌한의 200 µ L aliquots를 놓고 사용까지-80 ° C에 저장 합니다. 참고: 각 샘플의 고정된 볼륨은 사용할 RNA 추출; 따라서,는 약 수의 볼륨 정확 해야 합니다.</li>
</ol>2. RNA 추출
<ol><li>냉동된 샘플 (1.5 단계)에서 얼음에 녹여<ol>
<li>계속 샘플 차가운 얼음에 RNA 추출 하는 동안. 세포 시 약을 진정 하 고 사용 하기 전에 얼음에 클로 프롬.</li>
	</ol>
</li>
	<li>세포 시 약, 포함 하는 샘플 (200 µ L), 페 놀 및 guanidine isothiocyanate monophasic 솔루션의 5 볼륨 (1000 µ L)를 추가 하 고 1 분 동안 vortexing에 의해 적극적으로 혼합.</li>
	<li>5 nM 합성의 5 µ L 추가 꼬마 선 충 미르 (Syn-cel-미르-238-3 p).</li>
	<li>클로 프롬의 1 볼륨 (200 µ L)를 추가 하 고 1 분 동안 vortexing에 의해 적극적으로 혼합.</li>
	<li>2 ~ 3 분 동안 얼음에 유지 하 고 15 분 동안 4 ° C에서 12000 x g에서 샘플을 원심.</li>
	<li>신중 하 게 새로운 microtube 수성 단계 전송. 참고: 유기 단계 (빨간색) 또는 interphase (흰색)를 전송 하지 않습니다. 수집 된 수성 단계의 볼륨 증가 기술 변화에서 결과 불일치를 처리 하지 않도록 균일 해야 한다. 이 프로토콜에 수성 단계의 일반적인 금액 650 µ L 이었다.</li>
	<li>에탄올, 1.5 볼륨 (975 µ L)를 추가 하 고 아래로 pipetting으로 잘 혼합.</li>
	<li>해당 열과 어댑터, 진공 건조 진공 매니폴드를 사용 하 여 3 분 뒤에 샘플을 전송 합니다. 샘플 볼륨 이상 700 µ L 이면 나머지 솔루션을 처리 하려면이 단계를 반복 합니다. 참고: 열 기반 RNA 격리 진공 및 원심 분리 방법와 호환 됩니다.</li>
	<li>뒤에 1 분 동안 진공 건조 열에 에탄올의 200 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>뒤에 2 분 동안 진공 건조 열 RWT 버퍼의 800 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>RPE 버퍼의 800 µ L 뒤에 2 분 동안 진공 건조 하 여 열을 추가 합니다.</li>
	<li>2.11 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>뒤에 1 분 동안 진공 건조 열에 에탄올의 300 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>새로운 microtube에 열을 배치 하 고 1 분 동안 실 온 (15 ~ 25 ° C)에서 12000 x g에서 원심.</li>
	<li>새로운 microtube에 열을 전송 하 고 nuclease 무료 물 50 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>실 온 (15 ~ 25 ° C)에서 3 분, 그리고 1 분 동안 실 온 (15 ~ 25 ° C)에서 8000 × g에서 원심 분리기에 대 한 서.</li>
	<li>다시는 eluate 열에 적용 됩니다.</li>
	<li>2.16, 단계를 반복 하 고 사용까지 eluate-80 ° C에서 저장.</li>
</ol>3입니다. cDNA 합성
<ol><li>(단계 2.18)에서 냉동된 샘플 녹여</li>
	<li>
대상 miRNAs에 해당 하는 합성 RNA oligonucleotides의 알려진된 농도 준비 합니다.
	<ol>
<li>합성 RNA oligonucleotide를 사용 하 여 정량에서 표준 곡선을 생성 하기 위한. 1 x 108 복사 / µ L 농도의 재고 솔루션 스토리지 목적을 위해 준비가 되어 있습니다.</li>
		<li>재고 솔루션을 1 x 107 복사 / µ L (하지 미리 증폭된 샘플) 또는 1 x 105 복사 / µ L (미리 증폭된 샘플) 작업 솔루션 표준 곡선을 만들기 위한 가장 높은 농도 10 배 희석. 일반적으로, 표준 곡선 농도 대 한 제안된 범위는 1 x 102 복사 / µ L (하지 미리 증폭된 샘플)을 1 x 107 또는 1 x 100 복사 / µ L (미리 증폭된 샘플)을 1 x 105 .</li>
	</ol>
</li>
	<li>멀티플렉스 RT 뇌관 수영장 대상 miRNAs에 대 한 20 x RT 뇌관의 동일한 볼륨을 혼합 하 여 준비 합니다. 참고: 지금까지 그림 2에서 같이에 포함 된 최대 4 대상 miRNAs 수영장 수영장에서 miRNAs의 각각의 20 배 RT 뇌관을 혼합 하 여 만들 수 있습니다. Cel-미르-238 (외부 제어) 각 관에서 대상 miRNAs의 하나로 포함 되어야 합니다. 미만 4 대상 miRNAs의 경우 20 x RT 뇌관 대신 1/10 테 버퍼의 동일한 볼륨을 추가 합니다.</li>
	<li>RT 반응 혼합 준비: 3 µ L RT 뇌관의 dTTP와 100mm dNTPs의 0.15 µ L, 역전사 (50 U / µ L), RT 버퍼 x 1.5 µ L 10, RNase 억제제 (20 U / µ L)의 0.19 µ L의 1 µ L (3.3 단계)에서 수영장 및 4.16 µ L nuclease 무료의 물.</li>
	<li>RT 반응의 믹스 10 µ L pipetting, 여 (3.1 단계)에서 RNA 샘플 또는 (3.2 단계)에서 oligonucleotides의 5 µ L를 혼합 하 고 5 분 동안 얼음에 품 어.</li>
	<li>열 cycler 기구에 반전 녹음 방송 실행: 16 ° C 30 분, 30 분 동안 42 ° C에 대 한 다음 5 분에 85 ° C에서 최종 역전사 비활성화 단계 저장소 역방향 베낀된 샘플-80 ° C에서 사용까지.</li>
</ol>4입니다. preamplification (선택 사항)
참고: Cq 값 35 또는 후속 정량에 더 이상 보여 주는 miRNAs는 미리 증폭.
<ol><li>냉동된 샘플 (3.6 단계)에서 녹여</li>
	<li>10 직렬 희석 합성 RNA oligonucleotides;에서 실시간 제품의 확인 1 x 10을 1 x 100 복사 / µ L 표준 곡선을 생성 하기 위한5 .</li>
	<li>대상 miRNAs 200-fold 묽 게 되 고 각 분석 결과 뇌관의 최종 농도 대 한 분석 결과 뇌관 x 20의 다중 분석 결과 뇌관 풀 같은 볼륨 (5 µ L)를 혼합 하 여 준비 테 버퍼 1000 µ L의 최종 볼륨에 의해. 참고: 해당 대상 miRNAs 사전 증폭 없이 cel-미르-238 (외부 제어)에 대 한 후속 정량에서 감지 수 분석 결과 뇌관 뇌관 수영장에는 포함 되지 않습니다.</li>
	<li>사전 증폭 반응 혼합물 준비: 2 x 준비-사용 preamplification 시 약, 분석 결과 뇌관 풀 (4.3 단계)에서 3.75 µ L nuclease 무료 물 6.25 µ L의 12.5 µ L.</li>
	<li>사전 증폭 반응의 µ L 믹스 22.5 pipetting, 여 역 베낀된 샘플 (4.1 단계) 또는 (4.2 단계)에서 oligonucleotides의 2.5 µ L를 혼합 하 고 5 분 동안 얼음에 품 어.</li>
	<li>반응 열 cycler 기구에 실행: 95 ° C 10 분; 15 s 및 4 분 동안 60 ° C까지 사용-80 ° C에 미리 증폭된 샘플을 저장 하는 동안 95 ° C의 12 주기 다음.</li>
</ol>5. 정량 실시간 PCR (정량)
<ol><li>냉동된 샘플 (3.6 단계 또는 단계 4.6)에서 녹여</li>
	<li>5-fold 샘플을 희석 소독 물.</li>
	<li>합성 RNA oligonucleotides;에서 파생 된 RT 제품의 10 연속 희석을 준비 1 x 102 복사 / µ L (하지 미리 증폭된 샘플)을 1 x 107 또는 1 x 105 1 x 100 복사 / µ L (미리 증폭된 샘플) 표준 곡선을 생성 합니다.</li>
	<li>정량 Pcr 반응 혼합 준비: 준비-사용 증폭 시 약, 분석 시 약, 앞으로 또는 반전 PCR 뇌관 및 조사 대상 미르에 포함 된 x 20의 1 µ L과 nuclease 무료 물 7 µ L x 2의 10 µ L.</li>
	<li>정량 Pcr 반응 혼합에서 빠른 광학 96-잘 반응 판 18 µ L를 전송 하 고 우물에 (단계 5.2 또는 5.3 단계)에서 희석 샘플 2 µ L를 추가 합니다. 참고: 샘플 및 정량에 대 한 표준을 설정 됩니다 중복에.</li>
	<li>접착 필름, 접시를 봉인 하 고 짧게 원심.</li>
	<li>반응 실시간 열 cycler에서 실행: 20 95 ° C 95 ° C의 45 주기 다음 s 1 s 및 20 60 ° C에 대 한 s.</li>
</ol>6. 데이터 분석
<ol><li>해당 실시간 열 cycler와 함께 작동 하는 데이터 분석 소프트웨어를 사용 하 여 각 샘플의 원시 복사본 수를 계산 합니다. 참고: 임계값 줄 설정 됩니다 수동으로 "1.0"은 연구에 모든 접시에 그들의 Cq vales 비교해보면 재현성 확인 하. Cq에서 차단 수준 설정 > 40 주기.</li>
	<li>중복에서 각 샘플의 원시 복사본 수의 평균을 계산 합니다.</li>
	<li>해당 관의 모든 샘플에서 cel-미르-238의 복사본 수의 평균에 의해 cel-미르-238 각 샘플에서의 복사본 수를 분할 하 여 수정 계수를 계산 합니다. 참고: 그림 2에서처럼 각 튜브 4 대상 miRNAs cel-미르-238 (외부 제어) 등까지 포함 합니다. 따라서, cel-미르-238의 해당 값을 사용 하 여 각 튜브에 대 한 수정 계수를 계산 합니다.</li>
	<li>(단계 6.2)에서 각 샘플의 평균된 원시 복사본 수를 분할 하 여 각 샘플 (단계 6.3)에서 수정 계수에 의해 조정된 복사본 수를 계산 합니다.</li>
	<li>여 (단계 6.4)에서 각 샘플의 조정된 원시 복사본 수를 곱하여 절대 복사본 수를 계산는 각 샘플에 대 한 희석 비율. 참고: 희석 요인은 단계 5.2에서 파생 되는이 프로토콜에 "5"입니다.</li>
	<li>로그 cDNA 농도 대 한 각 직렬 희석 Cq 값의 작의의 사면에서 PCR 증폭의 효율을 계산 합니다. 참고: 수식을 계산 하는 효율성; E = (10(-1/경사) -1) x 100%.</li>
	<li>계산 수식 E를 사용 하 여 모든 샘플에서 cel-미르-238의 Cq 값을 사용 하 여 기술 변화 = (2 x 확대 효능)ΔCt(Max(Cq)-Min(Cq)). 참고: 6.5, 6.7 단계 절차의 품질 평가에 사용 됩니다.</li>
</ol>

<ol>
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저자는 공개 충돌의 관심이 있다.

우리의 포괄적인 평가 개별 샘플 사이 변이의 크기는 매우 다른 miRNAs 테스트 중 명확 하 게 표시 동적 범위의 넓이의 더 엄격한 통계 분석을 제공 합니다. 비록 이러한 유사 체액에 그들의 작은 수량에 기인 수 있습니다, 생물학 변화 뿐만 아니라 기술 변화 반영 하는 이러한 데이터 주목 해야한다. 기술 변화의 대부분은 다른 분석 결과 플랫폼18에서 사용 되는 외부 제어 (cel-미르-238)의 Cq 값에 의하여 평가 수 있습니다. 이후 미르 분석에 아무 표준된 내부 통제 되었습니다, 기술 변화에 대 한 정보 분석 결과19의 품질을 결정 하기 위한 분석에 포함 되어야 합니다. 기술 변화 3 미만 이기 위하여 견적 되었다이 보고서에 설명 된 방법에. 다른 연구에 비해 기술 정보 부족으로 인해이 절차에 대 한 품질 수준을 확인할 수는 없습니다, 비록 같은 정보를 포함 하 여 신뢰성 향상에 기여 하 고 간의 호환성 보장 다른 연구입니다.
최근 논문의 수는 샘플 처리, 저장 조건, 처리 하기 전에 저장 기간 등 다양 한 사전 분석 변수 영향을 미칠 수 안정성과 재현성 미르 측정20 순환의 보고 , 21. 다음 단계 변화를 최소화 하기 위해 샘플 준비 하는 동안 신중 하 게 다음이 연구 취하지 않았다 고려 사항으로 사전 분석 변수 효과, 비록. 첫째, 플라즈마 플라즈마8,22miRNAs의 안정성의 영향을 최소화 하기 위해 (2 시간 후 컬렉션)에서 최대한 빨리 처리 했다. MiRNAs는 실 온 (15 ~ 25 ° C)에서 안정적인 것으로 간주 됩니다, 하지만 그것은 하지 아직 분명 혈액 수집 및 플라스마 또는 혈 청의 처리 간격 미르 수준에 영향을 미치는 여부. 둘째, 각 플라즈마 샘플 miRNAs23순환의 수준에 영향을 미칠 수 있는 혼란 요인 중 하나를 나타내는 hemolyzed 붉은 혈액 세포, 오염에서 형태소 분석 바이어스를 제거 하기 위해 시각적으로 검사 했다.
사전 증폭 검출 바이어스24를 도입 하지 않고 매우 작은 양의 biofluids에 miRNAs의 탐지를 개선 하기 위해 유용 합니다. 현재 연구에서 미리 증폭된 합성 oligonucleotides를 사용 하 여 건설 표준 곡선의 Cq 값은 분석 실험에서 높은 재현성을 보여주었다. 이 절대 정량 미리 증폭된 샘플, miRNAs의 소량 검출을 활성화를 사용 하 여 허용. 다른 한편으로, 낮은 복사 번호 기준 (1 x 102 또는 103 복사 / µ L)는 사전 확대와 함께에서 특정 amplicons를 표시 되지 않습니다. Mestdagh 외. 24 보고 낮은 복사 번호 miRNAs의 측정 번호 miRNAs, miRNA의 결과 수 있는 반전 녹음 방송의 낮은 효율으로 인해 중간 또는 높은 복사에 비해 사전 확대 절차 후 높은 변화 보여 시퀀스 특성입니다. 따라서, 각 miRNA에 대 한 표준 곡선의 감지 범위 생물 학적 샘플, 특히 거짓 양성 결과 제거 하기 위해 미리 증폭된 miRNAs의 정량화 하기 전에 확인 해야 합니다. 더 중요 한 것은, 그것은 미리 증폭된 샘플의 수량 각 미르에 지정 되지 않은 때문에 미리 증폭과 비 전 증폭 샘플 등 다르게 처리 miRNAs의 절대 수준 직접 비교 될 수 없다 언급 해야 합니다.
이 보고서는 실시간 정량 Pcr를 사용 하 여 플라즈마 샘플에서 절대 미르 수준의 결심을 위한 절차를 설명 합니다. 몇몇 miRNAs 했다 전 확대 후에 검색 되지 않습니다. 같은 낮은 식 miRNAs, 감지 하는 다른 접근 방식을 사용할 수 할 수 있습니다. 큰 샘플 수량을 사용 하 여 간단한 솔루션으로이 문제를 우회 수 있습니다, 하지만 많은 양의 샘플 제공 되지 않습니다 항상. 날짜 하려면, 기술 진보는 미르25,26프로 파일링에 대 한 다양 한 플랫폼의 개발을 활성화 했습니다. 드롭릿 디지털 PCR (ddPCR) 최근 개발 된 절대 정량화에 대 한 기존의 RT 정량 다른 방법을 제공 하. 이 혁신적인 기술은 1 복사 / µ L27,28의 수준에서 대상 miRNA를 감지할 수 있는, 재현성, 정확 하 고 민감한 방법으로 보고 되었습니다. DdPCR 사전 증폭 단계 없이 miRNAs의 낮은 농도 감지할 수 있습니다, 그것은 것 큰 장점은 여러 miRNAs의 수준이 서로 비교 될 수 있다 때문에. 추출 절차와 후속 실시간 정량, 분자 플랫폼 및 시 약 사용에 변화는 필연적으로 결과가 되지 변수. 그러나,이 변이 외부 컨트롤 및 개별 miRNAs에 대 한 절대 레벨의 투명 한 결과 제공 하는 경우 해결할 수 있습니다. 적절 한 품질 평가 방법의 개선 연구를 프로 파일링 하는 miRNA에 생물 학적 변화의 분별 열쇠입니다.

연구의 증가 진단 및 암의 예 후에 대 한 생체로 microRNAs (miRNAs)를 탐험 또는 모니터링 및 nonclinical 및 임상 연구1,2,3에에서 다른 질병을 감지 . 양이 많은 실시간 반전 녹음 방송 PCR (RT-정량)이이 기술은 microarray4 와 RNA 시퀀싱 플랫폼5기반 보다 더 중요 한 있기 때문에 개별 대상 miRNAs, 평가 하는 데 사용 하는 가장 일반적인 방법 중 하나입니다. 일반적으로, 미르 식6의 ΔCq 메서드 사용 하 여 참조 샘플을 기준으로 측정 됩니다. 이 방법은 조사 대상 유전자 식 수준에 생리 적 변화에 대 한 적절 한입니다. 그러나, 순환 miRNAs의 상대 부 량 그들의 소량 때문에 유틸리티를 제한 했다. 또한, 기술 변형 하기가 다른 실험실 사용자 정의 실시간 정량 Pcr 실험 프로토콜 다르게, 일관성에 이르게 하거나 심지어 모순에서 결과 때문에 다른 연구에서 결과 비교 하기 어려운 다른 연구7.
위에서 언급 한 문제에 비추어 절대 정량화는 더 작은 양의 체액에서 miRNAs의 평가 적합 수 있습니다. 절대 정량화 방법은 해당 대상 미르8의 시퀀스와 동일한 합성 RNA oligonucleotides의 알려진된 농도에서 생성 된 표준 곡선을 사용 합니다. 건강과 환경 과학 연구소 (HESI) 유전체학 회 최근 여러 테스트 사이트에서 플라즈마 miRNAs의 절대 측정의 결과 비교 하는 포괄적인 연구를 실시 했다. 결과 여러 테스트 사이트9에서 유사한 결과 굴복 miRNAs의 절대 정량에 대 한 표준 프로토콜을 사용 하 여 보였다. 현재 연구에서 설명 하는 실시간 정량 분석 방법을 거의 여러 miRNA 표적, 및 낮은 식 miRNAs의 검색을 돕기 위해 사전 증폭의 다중화 분석 포함 HESI의 표준 프로토콜.
이 연구에서 EDTA-혈장 혈액에서 준비의 고정된 볼륨 (200 µ L) 의식 cynomolgus 원숭이의 대 퇴 정 맥에서 수집 (n = 50) 사용10. 다음과 같은 프로토콜의 추출, miRNA 및 RT-정량, 사전 증폭을 포함 하 여 플라즈마 샘플의 준비를 위한 절차를 설명 합니다. 샘플에서 대상 miRNAs의 수량 충분 한 자격이 프로세스와 함께에서 유효성을 검사할 수 있도록 더 중요 하 게는 프로토콜에 대 한 추가 기술 정보 포함 되었습니다. 첫째, 각 미르의 표준 곡선 생물학 견본에서 그것의 부 량 이전의 개별 검색 범위에 대 한 유효성을 검사 했다. 둘째, 현재 방법론의 품질 외부 컨트롤 (cel-미르-238)의 Cq 값에 의해 종합적으로 평가 되었습니다. 따라서,이 플랫폼은 다른 연구 나 실험실에서 결과 비교 하기 위한 더 유익 하 고 신뢰할 수 있는 데이터를 생성 합니다.
8 miRNAs의 프로필 대표 결과로이 보고서에 포함 된 시험 방법을 여기에 설명 된에서. 이러한 miRNAs (미르-1, 미르 208a, 미르-208b, 그리고 미르-499a), 심장 및 골격 근육 (133a 미르와 미르-206) 설치류와 인간3, 잠재적인 안전 생체 (122 미르와 미르-192), 간 조직 상해와 관련 된으로 제안 되어 11,,1213.

<table><tbody><tr><td>BD Microtainer tube (K2EDTA)</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>365974</td><td>For blood collection</td></tr><tr><td>Eppendorf PCR Tubes, 0.2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030124359</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock micro test tubes&amp;nbsp; 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030120086</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock micro test tubes&amp;nbsp; 2.0 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030120094</td><td></td></tr><tr><td>Synthetic oligonucleotide</td><td>Hokkaido System Science</td><td>-</td><td>Individual miRNA (0.2 &amp;mu;mol,HPLC grade)</td></tr><tr><td>Tris-EDTA Buffer&amp;nbsp; (pH 8.0)</td><td>Nippon Gene</td><td>314-90021</td><td>TE buffer</td></tr><tr><td>Buffer RPE</td><td>QIAGEN</td><td>-</td><td>Contents in miRNeasy mini kit&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Buffer RWT</td><td>QIAGEN</td><td>-</td><td>Contents in miRNeasy mini kit&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>miRNeasy Mini Kit</td><td>QIAGEN</td><td>217004</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-Free Water&amp;nbsp;</td><td>QIAGEN</td><td>129114</td><td></td></tr><tr><td>QIAzol Lysis Reagent</td><td>QIAGEN</td><td>-</td><td>Contents in miRNeasy mini kit&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Syn-cel-miR-238-3p miScript miRNA Mimic&amp;nbsp;</td><td>QIAGEN</td><td>219600</td><td>ID:MSY0000293, 5 nmol</td></tr><tr><td>SC Adapters</td><td>TAIGEN Bioscience Corporation</td><td>S0120</td><td>For RNA extraction</td></tr><tr><td>VacEZor 36 Complete System</td><td>TAIGEN Bioscience Corporation</td><td>M3610</td><td>For RNA extraction</td></tr><tr><td>7900HT Fast Real-Time PCR System</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>4351405</td><td>Fast 96-Well Block</td></tr><tr><td>GeneAmp PCR System 9700</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>9700</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>4346907</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Optical Adhesive Film</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>4311971</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Fast Advanced Master Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>4444557</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan MicroRNA Assays (cel-miR-238-3p)</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>4427975</td><td>Assay ID: 000248</td></tr><tr><td>TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-122-5p)</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>4427975</td><td>Assay ID: 002245</td></tr><tr><td>TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-133a-3p)</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>4427975</td><td>Assay ID: 002246</td></tr><tr><td>TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-1-3p)</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>4427975</td><td>Assay ID: 002222</td></tr><tr><td>TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-192-5p)</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>4427975</td><td>Assay ID: 000491</td></tr><tr><td>TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-206)</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>4427975</td><td>Assay ID: 000510</td></tr><tr><td>TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-208a-3p)</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>4427975</td><td>Assay ID: 000511</td></tr><tr><td>TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-208b-3p)</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>4427975</td><td>Assay ID: 002290</td></tr><tr><td>TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-499a-5p)</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>4427975</td><td>Assay ID: 001352</td></tr><tr><td>TaqMan MicroRNA Reverse&lt;br/&gt; Transcription Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>4366597</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan PreAmp Master Mix (2&amp;times;)</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>4391128</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform&amp;nbsp;</td><td>Wako Pure Chemicals</td><td>035-02616</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol (99.5)</td><td>Wako Pure Chemicals</td><td>057-00456</td><td></td></tr></tbody></table>

absolute quantification of plasma microrna levels in cynomolgus monkeys, using quantitative real-time reverse transcription pcr

실시간 정량 Pcr 개별 대상 miRNAs 평가 하는 가장 일반적인 방법 중 하나입니다. MiRNAs 수준 일반적으로 참조 샘플을 기준으로 측정 됩니다. 이 방법은 조사 대상 유전자 식 수준에 생리 적 변화에 대 한 적절 한입니다. 그러나, 더 나은 통계 분석을 사용 하 여 절대 정량화 유전자 식 레벨의 포괄적인 평가 위해 바람직합니다. 절대 부 량은 여전히 공통 사용 하지. 이 보고서 또는 사전 증폭 없이 실시간 정량 Pcr를 사용 하 여 플라즈마 miRNA의 절대 레벨을 측정 하기 위한 프로토콜을 설명 합니다.
EDTA 플라스마의 고정된 볼륨 (200 µ L) 의식 cynomolgus 원숭이의 대 퇴 정 맥에서 수집 된 혈액에서 준비 되었다 (n = 50). 총 RNA는 상업적으로 사용 가능한 시스템을 사용 하 여 추출 되었다. 플라즈마 miRNAs는 프로브 기반 실시간 정량 Pcr 분석 실험 미르 관련 앞으로 또는 반전 PCR 뇌관 및 프로브를 포함 하 여 정량 했다. 절대 정량화에 대 한 표준 곡선 상용 합성 RNA oligonucleotides를 사용 하 여 생성 되었다. 합성 cel-미르-238 표준화 및 품질 평가 대 한 외부 제어로 사용 되었다. MiRNAs는 정량화 35 위 주기 (Cq) 값 정량 단계 전에 미리 증폭 했다.
가운데 8 miRNAs 검사, 미르-122, 미르-133a, 및 미르-192 했다 사전 증폭 없이 감지 미르-1, 미르-206, 그리고 미르-499a 그들의 낮은 식 수준 때문에 사전 확대를 요구 하는 반면. 미르-208a와 미르 208b 했다 감지 전 확대 후에. 샘플 처리 효율 아군된 cel-미르-238의 Cq 값에 의해 평가 되었다. 이 분석 방법에서 기술 변화 3 미만 이기 위하여 견적 되었다 하 고 정량화 (LLOQ)의 하한값은 102 복사 / µ L, 시험된 miRNAs의 대부분을 위해.
이 프로토콜 플라즈마 miRNAs의 수량의 더 나은 견적을 제공 하 고 다른 연구에서 해당 하는 데이터의 품질 평가 허용 한다. 체액, 사전 증폭 miRNAs의 낮은 수는 저조한의 탐지를 향상 시키기 위해 유용 고려 miRNAs 표현.

실시간 정량 Pcr에 의해 분석 결과 miRNA의 워크플로 및 품질 assessment 그림 1 에서 정량10를 사용 하 여 혈액 샘플 분석 결과 miRNA의 워크플로 보여 줍니다. Cel-미르-238는 외부 컨트롤을 포함 하 여 실험의 품질을 확인할 수 있습니다. 이 RNA 추출 기술 변화를 보여줄 것입니다 및 후속 실시간 정량 Pcr 처리 합니다. 이 연구에서는 50 샘플에서 계산 하는 Cq 값의 평균 ± SD 21.0 ± 0.4 (표 1) 이었다. Cel-미르-238 사전 증폭 단계 때문에 희석 했다, Cq 값 24.2 ± 0.4 (표 1)을 했다. 여기 설명 하는 시험 방법을에서 기술 변화의 정도 Cq 값에 차이에 따라 미만 3 것으로 추정 했다. 변화의 정도 추가 사전 증폭 단계 포함 해야만 하는 경우에 일관 된 체재. 이러한 값은 같은 쥐, 쥐, 및 인간 (데이터 표시 되지 않음) 본이 연구실에서 수행 다른 동물 종에서 다른 샘플에 대 한 호환.
대상 miRNA에 대 한 표준 곡선에서 감지 범위
샘플의 아무 사전 증폭
1 x 107 복사 / µ L의 농도에서 합성 RNA oligonucleotides에서 역방향 베낀된 (RT) 제품 직렬 후속 정량 사전 희석 되었다. 이 시리즈는 사전 증폭 단계 없이 감지 했다 모든 생물 학적 샘플의 일관 된 적용을 보장 하는 표준 곡선을 생성 하는 데 사용 되었다. 1 x 102 복사 / µ L 농도에서 표준 샘플의 Cq 값 일반적으로 각 대상 miRNA에 대 한 수준 잘라 가까이 했다. 따라서, 검출 한계 1 x 102 복사 / µ L (그림 3) 추정 했다.
미리 증폭된 샘플
사전 증폭을 필요로 하는 샘플의 감지 범위를 확인 하려면 그림 4에서 볼 수 있듯이 두 개의 서로 다른 일련의 희석된 샘플 비교 되었다. 표준 곡선 A를 생성 하기 위한 사전 증폭 단계 전에 RT 제품의 직렬 희석 준비 되었다. 다음 일련의 미리 증폭된 표준 후속 정량 사용 되었다. 표준 곡선 B를 생성 하기 위한 첫 번째 희석 미리 증폭 샘플 1 x 105 복사 / µ L의 농도에 되었다. 이러한 표준 곡선 보여주었다 분명히 다른 검출 한계 (그림 5). 표준 곡선 A 10 미만의 농도에서 특정 amplicons에 사용할 수 없습니다 비록 표준 곡선 B 1 복사 / µ L까지 증가의 선형 범위를 보여,2 또는 103 복사 / µ L (그림 5). 이 결과 제안 miRNAs의 매우 소량 사전 증폭 단계와도 평가 될 수 없습니다. 또한, 미리 증폭된 샘플 판정 신중 하 게 Cq 값이 > 30, 미리 증폭된 샘플의 탐지 한계 때문에이 값을 닫습니다. 따라서, 일반적으로 표준 곡선 B 표준 작의 부족 한 수를 사용 하지 않도록 하기 위해만 감지 범위를 결정 한 후 여기에, 설명 하는 방법을에 사용 되었다.
따라서, 정량화 (LLOQ)의 하한값 102 복사 / µ L (그림 3 과 그림 5)는 miRNAs의 대부분 이었다. 미르-1 보여준 높은 LLOQ만 (103 복사 / µ L) (그림 5). 평균 증폭 효율 0.998에서 1.000까지 표준 곡선의 약 90%, 상관 계수 (R2)와 함께 했다. 정확한 실시간 정량 분석 결과 수는 선형 R2 0.98와 90 ~ 11017의 PCR 증폭 효율 보다 크거나 간주 됩니다. 따라서, 분석 결과에서 표준 곡선의 품질 확인 했습니다.
MiRNAs의 소량에 대 한 사전 확대의 효과
MiRNAs는 Cq 값 35 이상 위의 후속 정량에 미리 증폭 했다. 이 절차는 miRNAs의 소량 검출 향상. 예를 들어 사전 증폭-미르-206의 Cq 값 (평균 ± SD) 27.0 ± 2.2 감소 미리 증폭된 미르-206의 그 37.9 ± 1.9 이었다. 중복 측정 쌍 사이의 중요 한 차이 높은 Cq 값 (그림 6)에서 사전 증폭-샘플에서 관찰 되었다. 반면, 미리 증폭된 샘플 중복 (그림 6)에서 거의 같은 값을 보여주었다. 이러한 결과 사전 증폭 소량 샘플의 경우에 더 정확 하 고 신뢰할 수 있는 데이터를 제공 하기 위한 효과적일 것 이라고 지적 했다.
Cynomolgus 원숭이에서 플라즈마 miRNAs의 프로 파일링
설립된 시험 플랫폼을 사용 하 여, 원숭이 했다 50 cynomolgus에서 8 miRNAs (미르-1, 미르-122, 미르 133a, 미르-192, 미르-206, 미르 208a, 미르-208b, 및 미르-499a)의 플라스마 수준 분석 (그림 7)10. 미르-1, 미르-206, 그리고 미르-499a 그들의 낮은 식 수준 때문에 사전 확대를 요구 하는 반면이 분석 결과, 미르-122, 미르-133a, 및 미르-192를 사전 증폭 없이 감지 했다. 그러나, 미르 208a도 미르 208b 사전 증폭으로 감지 했다. 데이터는 일반적으로 분산 되지 했다; 따라서, 로그 변환 그들의 평균 및 표준 편차를 계산 하기 위해 수행 되었다. 시험, 미르-122 miRNAs 중 보여주었다 가장 높은 비 열 플라즈마 수준 (104 복사 / µ L x 5.71), 작은 동적 범위 (20-fold). 대조적으로, 큰 동적 범위 관찰 되었다 미르-1 (581-fold), 미르 133a (971-fold), 그리고 미르-206 (426-fold).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56850/56850fig1.jpg"> 그림 1 : 실시간 정량 Pcr에 의해 분석 결과 miRNA의 도식 워크플로. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56850/56850fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56850/56850fig2.jpg"> 그림 2 : 미르 분석 결과의 반전 녹음 방송의 도식 워크플로. 포함 된 최대 4 대상 miRNAs 수영장 수영장에서 miRNAs의 각각의 20 배 RT 뇌관을 혼합 하 여 만들 수 있습니다. Cel-미르-238 (외부 제어) 각 관에서 대상 miRNAs의 하나로 포함 되어야 합니다. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56850/56850fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="2">미르-238 데이터 분석</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>없이 사전 증폭</td>
			<td>와 함께 사전 증폭</td>
		</tr>
<tr>
<td>N</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
		</tr>
<tr>
<td>평균</td>
			<td>21.0</td>
			<td>24.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>SD</td>
			<td>0.4</td>
			<td>0.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>Max Cq</td>
			<td>21.8</td>
			<td>25.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>분 Cq</td>
			<td>20.3</td>
			<td>23.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>중간</td>
			<td>21.0</td>
			<td>24.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>최대-최소</td>
			<td>1.3</td>
			<td>1.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>증폭 효능</td>
			<td>89</td>
			<td>89</td>
		</tr>
<tr>
<td>변형</td>
			<td>2.4</td>
			<td>2.8</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: cel-미르-238의 정량화 주기 (Cq) 값을 사용 하 여 품질 평가. 기술 변화는 각 분석 결과에서 미르-238의 Cq 값에서 평가 했다. 50 샘플 (오른쪽)에 해당 하는 두 그룹으로 분할 되었다 아니면 사전 증폭 단계 (왼쪽) 없이. 변형 E 수식을 사용 하 여 계산 = (2 x 확대 효능)ΔCt(Max(Cq)-Min(Cq)). 증폭 효능 표준 곡선의 기울기 로부터 계산 됩니다. 사전 증폭 단계를 요구 하는 샘플은 사전 증폭 단계 희석 (미르-238 자체 사전 증폭 되지 않았습니다). 이 그림 우리의 보고서10에서 수정 되었습니다.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56850/56850fig3.jpg"> 그림 3 : 사전 증폭-샘플에 대 한 표준 곡선의 줄거리. 표준 곡선 (N = 3, 중복) 플로팅 Cq. 선형 회귀 분석 증폭 효율에 해당 기울기를 결정 하기 위해 계산 된 대 로그 농도 의해 생성 된. 표준 곡선 미르-122 (위)에 대 한 미르-192 (중간), 그리고 미르-133a (아래) 시험된 범위에서 Cq와 농도 사이의 선형 관계를 보여주었다. 표준 곡선에서 오차 막대는 3 개의 독립적인 분석 실험에서 1 표준 편차를 나타냅니다. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56850/56850fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56850/56850fig4.jpg"> 그림 4 : 미리 증폭된 샘플에 대 한 표준 곡선을 생성 하는 절차. (표준 곡선 A) 합성 올리고 (1 x 105 복사 / µ L)의 농도 대표 했다 역 문자, 표준 샘플의 10 연속 희석 시리즈를 준비 하 여 다음. 이러한 사전 증폭된 표준 후속 정량 사용 되었다. (표준 곡선 B) 합성 올리고 (1 x 105 복사 / µ L)의 대표적인 집중 되었고 역 복사할 미리 증폭. 다음, 표준 샘플의 10 연속 희석 시리즈 후속 정량 사전 준비 되었다. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56850/56850fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56850/56850fig5.jpg"> 그림 5 : 미리 증폭된 샘플에 대 한 표준 곡선 A와 B의 줄거리. 표준 곡선 A (n = 1, 중복) 및 표준 곡선 B (n = 3, 중복) 플로팅 Cq. 선형 회귀 분석 증폭 효율에 해당 기울기를 결정 하기 위해 계산 된 대 로그 농도 의해 생성 된. (위) 표준 곡선 (점선) 표준 곡선 B (실선) 미르-1의 시험된 범위에서 Cq와 농도 사이의 선형 관계를 보여준 반면 1 x 102 복사 / µ L에서 분명히 일반적인 amplicon을 보였다. (중간 와 더 낮은) 표준 곡선 (점선) 1 x 102 복사 / µ L 이하로의 농도에서 아무 amplicon 보여준 반면 표준 곡선 B (실선) Cq와 농도 사이의 선형 관계에서 보였다 미르-499a의 시험된 범위 및 미르-206입니다. B 표준 곡선에서 오차 막대는 3 개의 독립적인 분석 실험에서 1 표준 편차를 나타냅니다. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56850/56850fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56850/56850fig6.jpg"> 그림 6 : 증폭 비 사전 증폭과 미리 증폭 샘플에 대 한 줄거리. (상단) 미르-206 (위)에 하지 않고 대표 샘플 (A, B, C)에서 증폭 줄거리 또는 사전 증폭 (아래). 측정은 중복에서 설정 했다. 비 사전 증폭 샘플, 특히 더 높은 Cq 샘플 (A와 B)에 중복으로 설정 하는 두 샘플 간의 차이점을 확인 하 고 있었다. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56850/56850fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56850/56850fig7.jpg"> 그림 7 : Cynomolgus 원숭이에 플라즈마 microRNAs (miRNAs)의 절대값. miRNAs의 식 수준 점 플롯으로 표현 됩니다. 평균, 및 평균 (회색 상자에 표시), 위 아래 두 개의 표준 편차에 대 한 값은 로그 변환 후 결정 했다. 이 그림 우리의 보고서10에서 수정 되었습니다. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56850/56850fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Absolute Quantification of Plasma MicroRNA Levels in Cynomolgus Monkeys, Using Quantitative Real-time Reverse Transcription PCR

이 보고서 또는 사전 증폭 없이 양적 실시간 반전 녹음 방송 PCR를 사용 하 여 플라즈마 miRNA의 절대 레벨을 측정 하기 위한 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜 플라즈마 miRNAs의 수량의 더 나은 이해를 제공 하 고 다른 연구 나 실험실에서 해당 데이터의 질적 평가 허용 한다.

Cynomolgus 원숭이, 양적 실시간 반전 녹음 방송 PCR를 사용 하 여 플라즈마 예측에 관한 레벨의 절대 정량화

RT-qPCR is one of the most common methods to assess individual target miRNAs. MiRNAs levels are generally measured relative to a reference sample. This ...

absolute-quantification-plasma-microrna-levels-cynomolgus-monkeys

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

11.5K 조회수.  Daiichi Sankyo Co., Ltd.. 이 보고서 또는 사전 증폭 없이 양적 실시간 반전 녹음 방송 PCR를 사용 하 여 플라즈마 miRNA의 절대 레벨을 측정 하기 위한 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜 플라즈마 miRNAs의 수량의 더 나은 이해를 제공 하 고 다른 연구 나 실험실에서 해당 데이터의 질적 평가 허용 한다.

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High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs

The broad involvement of miRNAs in critical processes underlying development, tissue homoeostasis and disease has led to a surging interest among the research and pharmaceutical communities. To study miRNAs, it is essential that the quantification of microRNA levels is accurate and robust. By comparing wild-type to small RNA deficient mouse embryonic stem cells (mESC), we revealed a lack of accuracy and robustness in previous published multiplex qRT-PCR techniques. Here, we describe an optimized method, including purifying away excessive primers from previous multiplex steps before singleplex real time detection, which dramatically increases the accuracy and robustness of the technique. Furthermore, we explain how performing the technique on a microfluidic chip at nanoliter volumes significantly reduces reagent costs and permits time effective high throughput miRNA expression profiling.

Here we describe an optimized multiplex reverse transcriptase quantitative PCR (qRT-PCR) protocol in combination with a microfluidic platform as a cost and time effective high-throughput screening tool for microRNA (miRNA) expression levels, especially when working with limited amounts of sample.

높은 처리량 MicroRNA의 프로파일 : 최적 멀티 플렉스 플루 동적 ArrayTM의 IFCs에 Nanoliter의 규모 qRT - PCR

The broad involvement of miRNAs in critical processes underlying development, tissue homoeostasis and disease has led to a surging interest among the ...

연구

생체공학

Detection of microRNA Expression in Peritoneal Membrane of Rats Using Quantitative Real-time PCR

MicroRNAs (miRNAs) are small noncoding RNAs that regulate messenger RNA expression post-transcriptionally. The miRNA expression profile has been investigated in various organs and tissues in rat. However, standard methods for the purification of miRNAs and detection of their expression in rat peritoneal membrane have not been well established. We have developed an effective and reliable method to purify and quantify miRNAs using quantitative real-time reverse-transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR) in rat peritoneal membrane. This protocol consists of four steps: 1) purification of peritoneal membrane sample; 2) purification of total RNA including miRNA from peritoneal membrane sample; 3) reverse transcription of miRNA to produce cDNA; and 4) qRT-PCR to detect miRNA expression. Using this protocol, we successfully determined that the expression of six miRNAs (miRNA-142-3p, miRNA-21-5p, miRNA-221-3p, miRNA-223-3p, miRNA-327, and miRNA-34a-5p) increased significantly in the peritoneal membrane of a rat peritoneal fibrosis model compared with those in control groups. This protocol can be used to study the profile of miRNA expression in the peritoneal membrane of rats in many pathological conditions.

Here we present a protocol for the detection of microRNA expression in rat peritoneal membrane using quantitative real-time reverse-transcription polymerase chain reaction. This method is suitable for studying the microRNA expression profile in rat peritoneal membrane in several pathological conditions.

정량 실시간 PCR을 이용한 쥐 복막 막의 microRNA 발현 검출

MicroRNAs (miRNAs) are small noncoding RNAs that regulate messenger RNA expression post-transcriptionally. The miRNA expression profile has been ...

유전학

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR (qPCR)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process including development1, apoptosis2, and cell cycle regulation3. MiRNAs are estimated to regulate the expression of 30% to 90% of human genes4 by binding to their target messenger RNAs (mRNAs)5. Widespread dysregulation of miRNAs has been reported in various diseases and cancer subtypes6. Due to their prevalence and unique structure, these small molecules are likely to be the next generation of biomarkers, therapeutic agents and/or targets.
Methods used to investigate miRNA expression include SYBR green I dye- based as well as Taqman-probe based qPCR. If miRNAs are to be effectively used in the clinical setting, it is imperative that their detection in fresh and/or archived clinical samples be accurate, reproducible, and specific. qPCR has been widely used for validating expression of miRNAs in whole genome analyses such as microarray studies7. The samples used in this protocol were from patients who underwent radical prostatectomy for clinically localized prostate cancer; however other tissues and cell lines can be substituted in. Prostate specimens were snap-frozen in liquid nitrogen after resection. Clinical variables and follow-up information for each patient were collected for subsequent analysis8.
Quantification of miRNA levels in prostate tumor samples. The main steps in qPCR analysis of tumors are: Total RNA extraction, cDNA synthesis, and detection of qPCR products using miRNA-specific primers. Total RNA, which includes mRNA, miRNA, and other small RNAs were extracted from specimens using TRIzol reagent. Qiagen's miScript System was used to synthesize cDNA and perform qPCR (Figure 1). Endogenous miRNAs are not polyadenylated, therefore during the reverse transcription process, a poly(A) polymerase polyadenylates the miRNA. The miRNA is used as a template to synthesize cDNA using oligo-dT and Reverse Transcriptase. A universal tag sequence on the 5' end of oligo-dT primers facilitates the amplification of cDNA in the PCR step. PCR product amplification is detected by the level of fluorescence emitted by SYBR Green, a dye which intercalates into double stranded DNA. Specific miRNA primers, along with a Universal Primer that binds to the universal tag sequence will amplify specific miRNA sequences. 
The miScript Primer Assays are available for over a thousand human-specific miRNAs, and hundreds of murine-specific miRNAs. Relative quantification method was used here to quantify the expression of miRNAs. To correct for variability amongst different samples, expression levels of a target miRNA is normalized to the expression levels of a reference gene. The choice of a gene on which to normalize the expression of targets is critical in relative quantification method of analysis. Examples of reference genes typically used in this capacity are the small RNAs RNU6B, RNU44, and RNU48 as they are considered to be stably expressed across most samples. In this protocol, RNU6B is used as the reference gene.

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR qPCR

Quantitative Real Time polymerase chain reaction (qPCR) is a rapid and sensitive method to investigate the expression levels of various microRNA (miRNA) molecules in tumor samples. Using this method expression of hundreds of different miRNA molecules can be amplified, quantified, and analyzed from the same cDNA template.

정량 실시간 PCR (qPCR)에 의한 전립선 종양에 MicroRNA 감지

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process ...

의학

Detection of MicroRNAs in Microglia by Real-time PCR in Normal CNS and During Neuroinflammation

Microglia are cells of the myeloid lineage that reside in the central nervous system (CNS)1. These cells play an important role in pathologies of many diseases associated with neuroinflammation such as multiple sclerosis (MS)2. Microglia in a normal CNS express macrophage marker CD11b and exhibit a resting phenotype by expressing low levels of activation markers such as CD45. During pathological events in the CNS, microglia become activated as determined by upregulation of CD45 and other markers3. The factors that affect microglia phenotype and functions in the CNS are not well studied. MicroRNAs (miRNAs) are a growing family of conserved molecules (~22 nucleotides long) that are involved in many normal physiological processes such as cell growth and differentiation4 and pathologies such as inflammation5. MiRNAs downregulate the expression of certain target genes by binding complementary sequences of their mRNAs and play an important role in the activation of innate immune cells including macrophages6 and microglia7. In order to investigate miRNA-mediated pathways that define the microglial phenotype, biological function, and to distinguish microglia from other types of macrophages, it is important to quantitatively assess the expression of particular microRNAs in distinct subsets of CNS-resident microglia. Common methods for measuring the expression of miRNAs in the CNS include quantitative PCR from whole neuronal tissue and in situ hybridization. However, quantitative PCR from whole tissue homogenate does not allow the assessment of the expression of miRNA in microglia, which represent only 5-15% of the cells of neuronal tissue. Hybridization in situ allows the assessment of the expression of microRNA in specific cell types in the tissue sections, but this method is not entirely quantitative. In this report we describe a quantitative and sensitive method for the detection of miRNA by real-time PCR in microglia isolated from normal CNS or during neuroinflammation using experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), a mouse model for MS. The described method will be useful to measure the level of expression of microRNAs in microglia in normal CNS or during neuroinflammation associated with various pathologies including MS, stroke, traumatic injury, Alzheimer's disease and brain tumors.

Microglia are resident macrophages that provide the first line of defense and immune surveillance of the central nervous system. MicroRNAs are regulatory molecules that play an important role in many physiological processes including activation and differentiation of macrophages. In this article, we describe the method for measurement of microRNAs in microglia.

일반 CNS의 실시간 PCR에 의한과 Neuroinflammation 동안 Microglia에 MicroRNAs의 탐지

Microglia are cells of the myeloid lineage that reside in the central nervous system (CNS)1. These cells play an important role in pathologies of many ...

면역학 및 감염병학

Enrichment of Native Lipoprotein Particles with microRNA and Subsequent Determination of Their Absolute/Relative microRNA Content and Their Cellular Transfer Rate

Lipoprotein particles are predominately transporters of lipids and cholesterol in the bloodstream. Furthermore, they contain small amounts of strands of noncoding microRNA (miRNA). In general, miRNA alters the protein expression profile due to interactions with messenger-RNA (mRNA). Thus, knowledge of the relative and absolute miRNA content of lipoprotein particles is essential to estimate the biological effect of cellular particle uptake. Here, a quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR)-based protocol is presented to determine the absolute miRNA content of lipoprotein particles&#8212;exemplified shown for native and miRNA-enriched lipoprotein particles. The relative miRNA content is quantified using multiwell microfluidic array cards. Furthermore, this protocol allows scientists to estimate the cellular miRNA and, thus, the lipoprotein particle uptake rate. A significant increase of the cellular miRNA level is observable when using high-density lipoprotein (HDL) particles artificially loaded with miRNA, whereas incubation with native HDL particles yields no significant effect due to their rather low miRNA content. In contrast, the cellular uptake of low-density lipoprotein (LDL) particles&#8212;neither with native miRNA nor artificially loaded with it&#8212;did not alter the cellular miRNA level.

Here, a quantitative real-time polymerase chain reaction-based protocol is presented for the determination of the native micro-RNA content (absolute/relative) of lipoprotein particles. In addition, a method for increasing the micro-RNA level, as well as a method for determining the cellular uptake rate of lipoprotein particles, is demonstrated.

마이크로 로르 나를 사용한 네이티브 단백 입자의 농축과 그에 따른 절대/상대 미세 유 변 함량 및 셀룰러 전송 속도의 후속 측정

Lipoprotein particles are predominately transporters of lipids and cholesterol in the bloodstream. Furthermore, they contain small amounts of strands of ...

생화학

Quantitative Real-Time PCR Evaluation of microRNA Expressions in Mouse Kidney with Unilateral Ureteral Obstruction

MicroRNAs (miRNAs) are single stranded, non-coding RNA molecules that typically regulate gene expression at the post-transcriptional level by binding to partially complementary target sites in the 3&#39; untranslated region (UTR) of messenger RNA (mRNA), which reduces the mRNA&#39;s translation and stability. The miRNA expression profiles in various organs and tissues of mice have been investigated, but standard methods for the purification and quantification of miRNA in mouse kidney have not been available. We have established an effective and reliable method for extracting and evaluating miRNA expression in mouse kidney with renal interstitial fibrosis by quantitative reverse-transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR). The protocol required five steps: (1) creation of sham and unilateral ureteral obstruction (UUO) mice; (2) extraction of kidney samples from the UUO mice; (3) extraction of total RNA, which includes miRNA, from the kidney samples; (4) complementary DNA (cDNA) synthesis with reverse transcription from miRNA; and (5) qRT-PCR using the cDNA. Using this protocol, we successfully confirmed that compared to the controls, the expression of miRNA-3070-3p was significantly increased and those of miRNA-7218-5p and miRNA-7219-5p were significantly decreased in the kidneys of a mouse model of renal interstitial fibrosis. This protocol can be used to determine the miRNA expression in the kidneys of mice with UUO.

We describe a method for evaluating the microRNA expression in the kidneys of mice with unilateral ureteral obstruction (UUO) by quantitative reverse-transcription polymerase chain reaction. This protocol is suitable for studying kidney microRNA expression profiles in mice with UUO and in the context of other pathological conditions.

일방적 인 요원 방해와 마우스 신장에서 microRNA 표현의 정량적 실시간 PCR 평가

MicroRNAs (miRNAs) are single stranded, non-coding RNA molecules that typically regulate gene expression at the post-transcriptional level by binding to ...

Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their translational repression. Changes in miRNA expression have been shown to be involved in the development of all major complex diseases. Furthermore, recent findings showed that miRNAs can be secreted to the extracellular environment and enter the bloodstream and other body fluids where they can circulate with high stability. The function of such circulating miRNAs remains largely elusive, but systematic high throughput approaches, such as miRNA profiling arrays, have lead to the identification of miRNA signatures in several pathological conditions, including neurodegenerative disorders and several types of cancers. In this context, the identification of miRNA expression profile in the cerebrospinal fluid, as reported in our recent study, makes miRNAs attractive candidates for biomarker analysis.
There are several tools available for profiling microRNAs, such as microarrays, quantitative real-time PCR (qPCR), and deep sequencing. Here, we describe a sensitive method to profile microRNAs in cerebrospinal fluids by quantitative real-time PCR. We used the Exiqon microRNA ready-to-use PCR human panels I and II V2.R, which allows detection of 742 unique human microRNAs. We performed the arrays in triplicate runs and we processed and analyzed data using the GenEx Professional 5 software.
Using this protocol, we have successfully profiled microRNAs in various types of cell lines and primary cells, CSF, plasma, and formalin-fixed paraffin-embedded tissues.

We describe a protocol of real time PCR to profile microRNAs in the cerebrospinal fluid (CSF). With the exception of RNA extraction protocols, the procedure can be extended to RNA extracted from other body fluids, cultured cells, or tissue specimens.

정량 실시간 PCR을 사용하여 뇌척수액의 마이크로 RNA 프로파일

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their ...

Circulating MicroRNA Quantification Using DNA-binding Dye Chemistry and Droplet Digital PCR

Circulating (of cell-free) microRNAs (miRNAs) are released from cells into the blood stream. The amount of specific microRNAs in the circulation has been linked to a disease state and has the potential to be used as disease biomarker. A sensitive and accurate method for circulating microRNA quantification using a dye-based chemistry and droplet digital PCR technology has been recently developed. Specifically, using Locked Nucleic Acid (LNA)-based miRNA-specific primers with a green fluorescent DNA-binding dye in a compatible droplet digital PCR system it is possible to obtain the absolute quantification of specific miRNAs. Here, we describe how performing this technique to assess miRNA amount in biological fluids, such as plasma and serum, is both feasible and effective.

A sensitive and accurate method for cell-free microRNAs quantification using a dye-based chemistry and droplet digital PCR technology is described.

마이크로 RNA 정량는 DNA 결합 염료 화학, 물방울 디지털 PCR을 사용하여 순환

Circulating (of cell-free) microRNAs (miRNAs) are released from cells into the blood stream. The amount of specific microRNAs in the circulation has been ...

Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques

Single-cell analysis is an important tool for dissecting heterogeneous populations of cells. The identification and isolation of rare cells can be difficult. To overcome this challenge, a methodology combining indexed flow cytometry and high-throughput multiplexed quantitative polymerase chain reaction (qPCR) was developed. The objective was to identify and characterize simian immunodeficiency virus (SIV)-infected cells present within rhesus macaques. Through quantitation of surface protein by fluorescence-activated cell sorting (FACS) and mRNA by qPCR, virus-infected cells are identified by viral gene expression, which is combined with host gene and protein measurements to create a multidimensional profile. We term the approach, targeted Single-Cell Proteo-transcriptional Evaluation, or tSCEPTRE. To perform the method, viable cells are stained with fluorescent antibodies specific for surface markers used for FACS isolation of a cell subset and/or downstream phenotypic analysis. Single cells are sorted followed by immediate lysis, multiplex reverse transcription (RT), PCR pre-amplification, and high throughput qPCR of up to 96 transcripts. FACS measurements are recorded at the time of sorting and subsequently linked to the gene expression data by well position to create a combined protein and transcriptional profile. To study SIV-infected cells directly ex vivo, cells were identified by qPCR detection of multiple viral RNA species. The combination of viral transcripts and the quantity of each provide a framework for classifying cells into distinct stages of the viral life cycle (e.g., productive versus non-productive). Moreover, tSCEPTRE of SIV+ cells were compared to uninfected cells isolated from the same specimen to assess differentially expressed host genes and proteins. The analysis revealed previously unappreciated viral RNA expression heterogeneity among infected cells as well as in vivo SIV-mediated post-transcriptional gene regulation with single-cell resolution. The tSCEPTRE method is relevant for the analysis of any cell population amenable to identification by expression of surface protein marker(s), host or pathogen gene(s), or combinations thereof.

Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques

Described is a methodology to quantitate the expression of 96 genes and 18 surface proteins by single cells ex vivo, allowing for the identification of differentially expressed genes and proteins in virus-infected cells relative to uninfected cells. We apply the approach to study SIV-infected CD4+ T cells isolated from rhesus macaques.

단일 셀 정량 mRNA와 유인원 면역 결핍 바이러스에 감염 된 CD4에 표면 단백질 표정+ T 세포 격리에서 붉은 털 원숭이

Single-cell analysis is an important tool for dissecting heterogeneous populations of cells. The identification and isolation of rare cells can be ...

Digital PCR for Quantifying Circulating MicroRNAs in Acute Myocardial Infarction and Cardiovascular Disease

Circulating serum microRNAs (miRNAs) have shown promise as biomarkers for the cardiovascular disease and acute myocardial infarction (AMI), being released from the cardiovascular cells into the circulation. Circulating miRNAs are highly stable and can be quantified. The quantitative expression of specific miRNAs can be linked to the pathology, and some miRNAs show high tissue and disease specificity. Finding novel biomarkers for cardiovascular diseases is of importance for medical research. Quite recently, digital polymerase chain reaction (dPCR) has been invented. dPCR, combined with fluorescent hydrolysis probes, enables specific direct absolute quantification. dPCR exhibits superior technical qualities, including a low variability, high linearity, and high sensitivity compared to the quantitative polymerase chain reaction (qPCR). Thus, dPCR is a more accurate and reproducible method for directly quantifying miRNAs, particularly for the use in large multi-center cardiovascular clinical trials. In this publication, we describe how to effectively perform digital PCR in order to assess the absolute copy number in serum samples.

Circulating microRNAs have shown promise as biomarkers for cardiovascular diseases and acute myocardial infarctions. In this study, we describe a protocol for miRNA extraction, reverse transcription, and digital PCR for the absolute quantification of miRNAs in the serum of patients with cardiovascular disease.

급성 심근 경색 및 심혈 관 질환 MicroRNAs 순환 측정을 위한 디지털 PCR

Circulating serum microRNAs (miRNAs) have shown promise as biomarkers for the cardiovascular disease and acute myocardial infarction (AMI), being released ...