그녀의 우수한 기술 지원에 대해 Miyako Shigeta에게 감사드립니다. 이 연구는 JSPS 가켄 (교부 번호 25461252)에 의해 부분적으로 지원되었다.

모든 동물 실험 프로토콜은 Jichi Medical University의 동물 윤리위원회의 승인을 얻었으며 Jichi Medical University Laboratory Animals 안내서의 Experimental Animals Use and Care of Animals 지침에 따라 수행되었습니다. 1. 복막 샘플 수집 <ol><li> 다음 품목을 수집하십시오 : isoflurane, 코르크 시트, 인산염 완충 식염수 (PBS), 수술 가위 및 포 셉과 페트리 접시에 흠뻑 목화와 50 ML 원심 분리기 튜브. </li><li> Isofluorane의 과다 복용으로 쥐를 안락사시키고, 70 % 에탄올로 쥐의 복부 피부를 스프레이하고, 뒤에 코르크 시트에 쥐를 탑재. </li><li> 가위와 포셉을 사용하여 복부 피부, 근육 및 복막에 세로 절개를하십시오. </li><li> 포 셉를 사용하여 복막을 집어 들고, 다이어프램 아래의 가장 낮은 늑골을 따라 그 상단 부분에 수평 절개를하고,외과 용 가위를 사용하여 옆쪽 영역에있는 오우리어 쪽. 다음으로 외과 용 가위를 사용하여 몸에서 복막을 제거하기 위해 세로로 절개하십시오. 그런 다음 페트리 접시에 PBS로 씻으십시오. </li><li> 외과 용 가위 및 집게를 사용하여 다음 단계에 적합한 크기 인 복막 막 샘플 20mg (3 ~ 5mm 2 )을 잘라내어 다듬습니다. </li></ol> 2. 복막 막 샘플로부터 전체 RNA 정제 참고 : 여기에 무게가 20mg 인 복막 샘플을 유리 호 모지 나이저 및 미세 원심 분리기 스핀 컬럼에서 생체 고분자 파쇄 시스템을 사용하여 균질화합니다. 그런 다음 복막 막 샘플의 총 RNA를 실리카 멤브레인 기반 스핀 컬럼을 사용하여 분리합니다. <ol><li> 다음 항목을 수집하십시오 : 1.5 또는 2.0 ML microcentrifuge 튜브, 100 % 에탄올, 클로로포름, 유리 호 모지 나이저, 얼음, biopolymer - microcentrifuge 스핀 열 10 에서 시스템을 분쇄 </s( 10) , 페놀 / 구아니딘 계 용해제, 구아니딘과 에탄올을 포함한 세척 완충액 (세척 완충액 1), 에탄올을 포함한 세척 완충액 (세척 완충액 2)을 포함한다. </li><li> 유리 호 모지 나이저에 20 MG 복막 샘플을 넣고 페놀 / 구아니딘 기반 용해 시약 700 μL를 추가합니다. </li><li> 뒤틀린 상태에서 유봉을 천천히 눌러 시료를 균질화하십시오. 복막 막 샘플이 페놀 / 구아니딘 기반 용해 시약에 완전히 용해 될 때까지 얼음 위에서이 과정을 수십 번 반복합니다. </li><li> 추가 균질, 2.0 ML 수집 튜브에 microcentrifuge 스핀 칼럼에 biopolymer - 파쇄 시스템에 균질 lysate을 전송합니다. 그런 다음 14,000 xg에서 4 분간 3 분간 원심 분리하십시오. </li><li> Homogenized lysate를 새로운 미세 원심 분리 튜브로 옮긴다. </li><li> 균질화 lysate에 클로로포름 140 μL를 추가하고 욕조를 모자안전하게. 그런 다음 튜브를 15 초 동안 뒤집어서 혼합하십시오. </li><li> 실온에서 2-3 분 동안 샘플을 품어 낸다. 그런 다음 12,000 xg에서 15 분 동안 4 ℃에서 원심 분리하십시오. </li><li> 침전물을 방해하지 않고 상등액 (일반적으로 300 μL)을 새로운 미세 원심 분리 튜브로 옮기고 100 배 에탄올의 1.5 배량 (일반적으로 450 μL)을 첨가하십시오. 그런 다음 5 초 동안 볼 텍싱하여 샘플을 섞으십시오. </li><li> 시료 700 μL를 2.0 mL 수집 튜브에 놓여있는 실리카 멤브레인 기반 스핀 컬럼에 넣으십시오. 컬럼의 캡을 닫으십시오. 그런 다음 15,000 xg에서 15 초 동안 원심 분리하십시오. 원심 분리 후 수집 튜브의 유액을 버립니다. </li><li> 엄격하게 샘플을 씻어 실리카 막 기반 스핀 칼럼에 세척 버퍼 1 700 μL를 추가합니다. 컬럼의 캡을 닫으십시오. 그런 다음 15,000 xg에서 15 초 동안 원심 분리하십시오. 원심 분리 후 수집 튜브의 유액을 버립니다. </li><li> 실리카 멤에 세척 버퍼 2 500 μL를 추가하십시오rane 기반의 스핀 컬럼으로 소금의 흔적을 제거합니다. 컬럼의 캡을 닫으십시오. 그런 다음 15,000 xg에서 15 초 동안 원심 분리하십시오. 원심 분리 후 수집 튜브의 유액을 버립니다. </li><li> 2.11을 반복하십시오. </li><li> 실리카 멤브레인 기반 스핀 컬럼을 15,000 xg에서 1 분간 다시 원심 분리하십시오. 원심 분리 후 수집 튜브의 유액을 버립니다. </li><li> 새로운 1.5 ML 수집 튜브에 실리카 멤브레인 기반 스핀 칼럼을 놓습니다. 그런 다음 RNase가없는 물 25 μL를 컬럼으로 옮긴다. 컬럼의 캡을 닫으십시오. 샘플을 실온에서 5 분 동안 방치하십시오. 그런 다음 15,000 xg에서 1 분간 원심 분리합니다. </li><li> 총 RNA가 포함 된 25 μL 용리액을 새로운 미세 원심 분리 튜브에 옮기십시오. 그런 다음 사용하기 전에 -80 ° C에서 보관하십시오. </li></ol> 3. 총 RNA의 역전사 참고 : 정량 실시간 PCR 실험의 출판을위한 최소 정보에 대한 참고 및 준수iments (MIQE) 지침은 더 나은 실습을 장려하고 신뢰성 있고 명확한 결과를 얻는 데 도움이됩니다. 참고 : 여기서 역전사 효소, poly (A) polymerase 및 oligo-dT primer를 사용하여 총 1.0 μg의 분리 된 RNA를 역전 사합니다. <ol><li> 다음 품목을 수집하십시오 : 1.5 mL microcentrifuge tubes; 8- 웰 스트립 튜브; RNase없는 물; 얼음; 역전사 효소 키트 (물질 표 참조) 11 . </li><li> 2.0 μL의 10x 핵산 믹스, 2.0 μL의 역전사 효소 믹스 (키트에서), 4.0 μL의 5x hi-spec 버퍼를 포함하는 마스터 믹스 용액을 튜브 당 총 8.0 μL로 준비하십시오. </li><li> 마스터 믹스 용액 (키트에서) 8.0 μL를 각 튜브에 분배합니다. </li><li> 분광 광도계를 사용하여 전체 RNA 양을 측정하십시오. 복막 막 샘플에서 정제 된 분리 된 총 RNA 1.0 μg을 각 튜브에 첨가합니다. 참고 : qRT-PCR은 미국에서 수행 할 수 있습니다.정화 된 총 RNA의 품질 관리를 위해 역전사없이 전체 RNA를 주형으로 사용합니다. DNA가 오염되면 qRT-PCR에 의해 예상치 못한 증폭 산물이 관찰됩니다. </li><li> 총 20 μL까지 각 튜브에 RNase가없는 물을 첨가하십시오. 그런 다음 피펫 팅으로 철저히 혼합하고 15 초 동안 원심 분리하십시오. </li><li> 37 ° C에서 60 분 동안 견본을 품어 라. 95 ° C에서 5 분간 즉시 품어 라. 참고 :이 단계는 열 순환 장치에서 수행 할 수 있습니다. </li><li> cDNA를 새로운 미세 원심 분리 튜브에 옮기고 RNase가없는 물로 10 배 희석하십시오 (1:10). </li><li> 희석 된 cDNA를 얼음에 일시적으로 보관하고 사용하기 전에 장기간 -80 ° C에서 보관하십시오. </li></ol> 4. miRNA의 qRT-PCR 참고 : miRNA의 qRT-PCR은 인터 칼 레이팅 염료를 사용하여 수행됩니다. 여기에는 RNA, U6 small nuclear 2 (RNU6-2), miRNA-142-3p, miRNA-21-5p, miRNA-221-3p, miRNA-223-3p, miRNA-327 및 miRNA-34a-5p 프라이머 사용 된. <ol><li>다음 항목을 수집 : 1.5 ML microcentrifuge 튜브, qRT - PCR, 96 - 웰 반응 플레이트에 대한 접착 필름, miRNA 특정 primers, 녹색 염료 기반의 PCR 키트 (자료 테이블을 참조하십시오) 11 에 대한 96 잘 반응 플레이트, 그리고 실시간 PCR 기기. </li><li> 2x PCR 마스터 믹스 12.5 μL, nuclease-free 물에 용해 된 5 μM 각 miRNA 프라이머 2.5 μL 및 각 웰에 대한 10 배 범용 프라이머 1.25 μL가 들어있는 마스터 믹스를 준비하십시오. </li><li> 96- 웰 플레이트의 각 웰에 22.5 μL의 마스터 믹스를 분배합니다. </li><li> 각 우물에 2.5 μL의 template cDNA를 첨가한다. </li><li> 96- 웰 반응 플레이트 용 접착 필름으로 플레이트를 밀봉하십시오. 그런 다음 플레이트를 1,000 xg에서 30 초간 원심 분리하십시오. </li><li> 다음과 같이 실시간 PCR Instrument 및 소프트웨어로 PCR cycling 프로그램을 실행하십시오. <ol><li> 실시간 PCR 장비에 플레이트를 놓습니다. 실시간 PCR 소프트웨어에서 실험적 속성을 정의합니다 (실험적으로 입력이름, 악기의 실험 유형에 대한 &quot;96 - 우물&quot;을 선택, &quot;SYBR 녹색 시약&quot;대상 시퀀스를 감지하는 &quot;SYBR 녹색 시약&quot;을 선택 &quot;2 - ΔΔCT 방법&quot;을 선택하고, &quot;표준 램프 속도&quot;를 선택하십시오 악기 실행). </li><li> 그런 다음 샘플에 이름을 지정하고 각 웰에서 miRNA를 표적으로 삼습니다. 샘플은 항상 결과 검증을위한 충분한 데이터를 얻기 위해 중복 또는 3 중으로 테스트됩니다. 표준 시료와 내인성 대조군을 선택하십시오. 염료가 수동 기준으로 사용하려면 &quot;없음&quot;을 선택하십시오. </li><li> 지시에 따라 실시간 PCR 소프트웨어에 &quot;20 μL&quot;의 반응 부피와 다음의 PCR 사이클링 조건을 입력하십시오 : 95 ° C에서 15 분 동안 프리 인큐베이션 한 다음 94 ° C에서 15 초 동안 변성 55 ° C에서 30 초, 어닐링은 70 ° C에서 30 초 동안 수행 하였다. </li></ol></li><li> qRT-PCR 데이터 분석 u실시간 PCR 장비의 소프트웨어를 부릅니다. 소프트웨어에 의해 자동으로 결정되는 임계 값과 기준선이 각 우물에서 적절한 지 확인하십시오. </li><li> 각 표본에서 표적 miRNA의 임계주기를 확인하십시오. 임계주기는 증폭 곡선과 임계 선 사이의 교차점입니다. 그런 다음, 내인성 대조군으로서 RNU6-2에 대한 표적 miRNA의 발현 수준을 표준화하고, 2 - ΔΔCT 방법 13을 사용하여 표적 miRNA의 상대 발현 수준을 계산한다. 참고 : 내인성 대조 miRNA의 발현 수준의 안정성을 확인해야합니다. 이 실험에서, RNU6-2는 높은 수준에서 각 그룹에 걸쳐 상대적으로 변하지 않는 것으로 확인되었다. </li></ol>

<ol>
	<li>Krol, J., Loedige, I., Filipowicz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+widespread+regulation+of+microRNA+biogenesis,+function+and+decay.">The widespread regulation of microRNA biogenesis, function and decay.</a> Nat Rev Genet. 11 (9), 597-610 (2010).</li><li>Beermann, J., Piccoli, M. T., Viereck, J., Thum, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-coding+RNAs+in+Development+and+Disease:+Background,+Mechanisms,+and+Therapeutic+Approaches.">Non-coding RNAs in Development and Disease: Background, Mechanisms, and Therapeutic Approaches.</a> Physiol Rev. 96 (4), 1297-1325 (2016).</li><li>Saikumar, J., Ramachandran, K., Vaidya, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+micromarkers.">Noninvasive micromarkers.</a> Clin Chem. 60 (9), 1158-1173 (2014).</li><li>Yang, G., Yang, L., Wang, W., Wang, J., Xu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+and+validation+of+extracellular/circulating+microRNAs+during+idiopathic+pulmonary+fibrosis+disease+progression.">Discovery and validation of extracellular/circulating microRNAs during idiopathic pulmonary fibrosis disease progression.</a> Gene. 562 (1), 138-144 (2015).</li><li>Zhang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+miR-126+is+a+potential+biomarker+to+predict+the+onset+of+type+2+diabetes+mellitus+in+susceptible+individuals.">Circulating miR-126 is a potential biomarker to predict the onset of type 2 diabetes mellitus in susceptible individuals.</a> Biochem Biophys Res Commun. , (2015).</li><li>Zhong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-21+is+a+key+therapeutic+target+for+renal+injury+in+a+mouse+model+of+type+2+diabetes.">miR-21 is a key therapeutic target for renal injury in a mouse model of type 2 diabetes.</a> Diabetologia. 56 (3), 663-674 (2013).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Downregulation+of+urinary+cell-free+microRNA-214+as+a+diagnostic+and+prognostic+biomarker+in+bladder+cancer.">Downregulation of urinary cell-free microRNA-214 as a diagnostic and prognostic biomarker in bladder cancer.</a> J Surg Oncol. , (2015).</li><li>Morishita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+expression+profiling+in+peritoneal+fibrosis.">MicroRNA expression profiling in peritoneal fibrosis.</a> Transl Res. 169, 47-66 (2016).</li><li>Minami, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNA+expression+atlas+in+male+rat.">miRNA expression atlas in male rat.</a> Sci Data. 1, 140005 (2014).</li><li>Morse, S. M., Shaw, G., Larner, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concurrent+mRNA+and+protein+extraction+from+the+same+experimental+sample+using+a+commercially+available+column-based+RNA+preparation+kit.">Concurrent mRNA and protein extraction from the same experimental sample using a commercially available column-based RNA preparation kit.</a> Biotechniques. 40 (1), 54-58 (2006).</li><li>Mestdagh, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+quantitative+miRNA+expression+platforms+in+the+microRNA+quality+control+(miRQC)+study.">Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study.</a> Nat Methods. 11 (8), 809-815 (2014).</li><li>Bustin, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MIQE+guidelines:+minimum+information+for+publication+of+quantitative+real-time+PCR+experiments.">The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments.</a> Clin Chem. 55 (4), 611-622 (2009).</li><li>Schmittgen, T. D., Livak, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+real-time+PCR+data+by+the+comparative+C(T)+method.">Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method.</a> Nat Protoc. 3 (6), 1101-1108 (2008).</li><li>Krediet, R. T., Lindholm, B., Rippe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+peritoneal+membrane+failure.">Pathophysiology of peritoneal membrane failure.</a> Perit Dial Int. 20, S22-S42 (2000).</li><li>Devuyst, O., Margetts, P. J., Topley, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathophysiology+of+the+peritoneal+membrane.">The pathophysiology of the peritoneal membrane.</a> J Am Soc Nephrol. 21 (7), 1077-1085 (2010).</li><li>Hirahara, I., Ishibashi, Y., Kaname, S., Kusano, E., Fujita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methylglyoxal+induces+peritoneal+thickening+by+mesenchymal-like+mesothelial+cells+in+rats.">Methylglyoxal induces peritoneal thickening by mesenchymal-like mesothelial cells in rats.</a> Nephrol Dial Transplant. 24 (2), 437-447 (2009).</li><li>Dallas, P. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+levels+assessed+by+oligonucleotide+microarray+analysis+and+quantitative+real-time+RT-PCR+--+how+well+do+they+correlate?.">Gene expression levels assessed by oligonucleotide microarray analysis and quantitative real-time RT-PCR -- how well do they correlate?.</a> BMC Genomics. 6, 59 (2005).</li><li>Rockett, J. C., Hellmann, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confirming+microarray+data--is+it+really+necessary?.">Confirming microarray data--is it really necessary?.</a> Genomics. 83 (4), 541-549 (2004).</li></ol>

저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.

이 원고에 제시된 프로토콜을 사용하여, qRT-PCR을 사용하여 쥐 복막의 miRNA를 성공적으로 정제하고 검출 하였다. qRT-PCR 데이터 분석의 신뢰성은 정제 된 miRNA의 품질에 달려 있습니다. 따라서 miRNA의 순도는 분광 광도계를 사용하여 측정 할 수있는 280 nm에서의 흡광도 대 260 nm에서의 흡광도의 비율로 qRT-PCR 전에 확인할 수 있습니다. qRT-PCR을 사용하여 miRNA가 현저히 증폭되지 않으면 주형 cDNA의 농도가...

MicroRNAs (miRNAs)는 전 사적으로 mRNA (messenger RNA) 발현을 조절하는 짧은 비 암호화 RNA입니다. miRNA의 발현 변화는 암, 염증, 대사 장애 및 섬유증 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8을 비롯한 다양한 병리학 적 조건에서 중추적 인 역할을하는 많은 mRNA의 발현을 조절합니다. 따라서 miRNA는 새로운 바이오 마커 및 치료 표적 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 로 잠재력이 있습니다. miRNA 발현 프로파일은 다양한 래트에서 결정되었다간, 심장, 폐 및 신장을 포함한 장기 및 조직 9 . 그러나, 랫 복막에서 miRNA의 정제 및 검출에 대한 표준 방법은 잘 확립되어 있지 않다. 이 프로토콜의 전체 목표는 성공적으로 쥐의 복막에 miRNAs을 정화하고 감지하는 것입니다. 먼저, 유리 호 모지 나이저를 사용하여 복막 막 샘플을 균질화시킨 다음, 미세 원심 분리기 스핀 컬럼 10 에서 생체 고분자 파쇄 시스템에 노출시켰다. 다음으로, 실리카 막 기반 스핀 컬럼 10을 이용하여 복막 샘플로부터 miRNA를 포함한 total RNA를 정제 하였다. 이어서 역전사 효소, 폴리 (A) 중합 효소 및 oligo-dT 프라이머 11을 사용하여 정제 된 전체 RNA로부터 cDNA를 합성 하였다. 마지막으로, 삽입 염료 11을 사용하여 qRT-PCR에 의해 miRNA의 발현을 측정 하였다. 이 프로토콜의 이론적 근거는 b이전 연구에서 단순한 과정으로 조직에서 miRNA의 유의 한 정화 및 검출을 보여주었습니다 8 , 10 , 11 . 미세 원심 분리기 스핀 컬럼과 실리카 멤브레인 기반 스핀 컬럼에서 생체 고분자 파쇄 시스템을 사용하면 조직에서 고품질의 총 RNA를 정제 할 수 있다고보고되었습니다. 역전사 효소, 폴리 (A) 중합 효소 및 oligo-dT 프라이머를 사용하여 정제 된 전체 RNA로부터 cDNA를 합성하는 방법 및이 프로토콜에서 인터 칼 레이팅 염료를 사용하는 qRT-PCR에 의한 miRNA 발현을 검출하는 방법이 높은 정확성을 보인 것으로보고되었다. 감도 11 . 또한이 작업은 시간을 절약하고 기술적 오류를 방지하는 간단한 프로세스입니다. 따라서이 프로토콜은 광범위한 병리학 적 조건에서 쥐 복막에서 miRNA의 매우 정확하고 민감한 검출을 필요로하는 연구에 유용합니다.

<table><tbody><tr><td>QIA shredder</td><td>Qiagen</td><td>79654</td><td>biopolymer-shredding system in a micro centrifuge spin-column</td></tr><tr><td>miRNeasy Mini kit</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td>silica-membrane based spin column</td></tr><tr><td>QIAzol Lysis Reagent</td><td>Qiagen</td><td>79306</td><td>phenol/guanidine-based lysis reagent</td></tr><tr><td>Buffer RLT</td><td>Qiagen</td><td>79216</td><td>wash buffer 1</td></tr><tr><td>Buffer RWT</td><td>Qiagen</td><td>1067933</td><td>wash buffer 2</td></tr><tr><td>miScript II RT kit&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>218161</td><td>includes 10&amp;times; Nucleics Mix containing deoxynucleotides, ribonucleotide triphosphates, and oligo-dT primers; miScript Reverse Transcriptase Mix containing poly(A) polymerase and reverse transcriptase and; miScript HiSpec buffer</td></tr><tr><td>miScript SYBR Green PCR kit</td><td>Qiagen</td><td>218073</td><td>includes QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix and miScript Universal Primer</td></tr><tr><td>RNU6-2 primer&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>MS00033740</td><td>not disclosed</td></tr><tr><td>miRNA-142-3p primer</td><td>Qiagen</td><td>MS00031451</td><td>5&#039;-UGUAGUGUUUCC&lt;br/&gt; UACUUUAUGGA-3&#039;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>miRNA-21-5p primer</td><td>Qiagen</td><td>MS00009079</td><td>5&#039;-UAGCUUAUCAG&lt;br/&gt; ACUGAUGUUGA-3&#039;</td></tr><tr><td>miRNA-221-3p primer</td><td>Qiagen</td><td>MS00003857</td><td>5&#039;-AGCUACAUUGU&lt;br/&gt; CUGCUGGGUUUC-3&#039;</td></tr><tr><td>miRNA-223-3p primer</td><td>Qiagen</td><td>MS00033320</td><td>5&#039;-UGUCAGUUUG&lt;br/&gt; UCAAAUACCCC-3&#039;</td></tr><tr><td>miRNA-34a-5p primer</td><td>Qiagen</td><td>MS00003318</td><td>5&#039;-UGGCAGUGUCU&lt;br/&gt; UAGCUGGUUGU-3&#039;</td></tr><tr><td>miRNA-327 primer</td><td>Qiagen</td><td>MS00000805</td><td>5&#039;-CCUUGAGGGG&lt;br/&gt; CAUGAGGGU-3&#039;</td></tr><tr><td>MicroAmp Optical 96 well reaction plate for qRT-PCR</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4316813</td><td>96-well reaction plate</td></tr><tr><td>MicroAmp Optical Adhesive Film&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4311971</td><td>adhesive film for 96-well reaction plate</td></tr><tr><td>QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4472380</td><td>real-time PCR instrument</td></tr><tr><td>QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1.</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4472380</td><td>real-time PCR instrument software</td></tr><tr><td>methylglyoxal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0252</td><td></td></tr><tr><td>Midperic</td><td>Terumo</td><td>not assign&amp;nbsp;</td><td>peritoneal dialysis fluid</td></tr><tr><td>Sprague&amp;ndash;Dawley rats</td><td>SLC</td><td>not assign&amp;nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

detection of microrna expression in peritoneal membrane of rats using quantitative real-time pcr

MicroRNAs (miRNAs)는 전사 후 사슬 RNA 발현을 조절하는 작은 비 암호화 RNA입니다. miRNA 발현 프로파일은 쥐의 다양한 기관과 조직에서 조사되었습니다. 그러나, miRNA의 정제 및 쥐 복막에서의 발현 검출을위한 표준 방법은 잘 확립되어 있지 않다. 우리는 랫트 복막에서 정량적 실시간 역전사 중합 효소 연쇄 반응 (qRT-PCR)을 이용하여 miRNA를 정제하고 정량화하는 효과적이고 신뢰성있는 방법을 개발했다. 이 프로토콜은 4 단계로 구성되어 있습니다 : 1) 복막 샘플의 정화; 2) 복막 막 시료로부터의 miRNA를 포함하는 전체 RNA의 정제; 3) cDNA를 생산하기위한 miRNA의 역전사; 및 4) miRNA 발현을 검출하기위한 qRT-PCR. 이 프로토콜을 사용하여 6 개의 miRNA (miRNA-142-3p, miRNA-21-5p, miRNA-221-3p, miRNA-223-3p, miRNA-327 및 miRNA-34a-5p)의 발현이 증가한 것을 성공적으로 확인했습니다.쥐 복막 섬유증 모델의 복막이 대조군에 비해 유의하게 높았다. 이 프로토콜은 많은 병리학 조건에서 쥐의 복막에서 miRNA 표현의 프로필을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

여기에 제시된 결과는 이전에보고 된 연구 8 에 근거합니다. 우리는 복막 섬유증에서 miRNA 발현 프로파일을 조사했다. 복막 섬유증은 복막 투석의 주요 합병증입니다. 그것은 mesothelial 세포 monolayer의 손실과 extracellular 매트릭스 구성 요소의 과도한 축적을 특징으로하고, 복막 막 실패 14 , 15 와 관련이 있습니다....

Watch this Scientific Journal Video about Detection of microRNA Expression in Peritoneal Membrane of Rats Using Quantitative Real-time PCR at JoVE.com

Detection of microRNA Expression in Peritoneal Membrane of Rats Using Quantitative Real-time PCR

여기 우리는 양적 실시간 역전사 중합 효소 연쇄 반응을 사용하여 쥐 복막에서 microRNA 표현의 탐지 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 여러 병리학 적 조건에서 쥐 복막에서 microRNA 발현 프로파일을 연구하는데 적합합니다.

정량 실시간 PCR을 이용한 쥐 복막 막의 microRNA 발현 검출

MicroRNAs (miRNAs) are small noncoding RNAs that regulate messenger RNA expression post-transcriptionally. The miRNA expression profile has been ...

detection-microrna-expression-peritoneal-membrane-rats-using

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Genetics

7.8K 조회수.  Saitama Medical Center, Jichi Medical University.  여기 우리는 양적 실시간 역전사 중합 효소 연쇄 반응을 사용하여 쥐 복막에서 microRNA 표현의 탐지 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 여러 병리학 적 조건에서 쥐 복막에서 microRNA 발현 프로파일을 연구하는데 적합합니다. 

비디오: Detection of microRNA Expression in Peritoneal Membrane of Rats Using Quantitative Real-time PCR

High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs

The broad involvement of miRNAs in critical processes underlying development, tissue homoeostasis and disease has led to a surging interest among the research and pharmaceutical communities. To study miRNAs, it is essential that the quantification of microRNA levels is accurate and robust. By comparing wild-type to small RNA deficient mouse embryonic stem cells (mESC), we revealed a lack of accuracy and robustness in previous published multiplex qRT-PCR techniques. Here, we describe an optimized method, including purifying away excessive primers from previous multiplex steps before singleplex real time detection, which dramatically increases the accuracy and robustness of the technique. Furthermore, we explain how performing the technique on a microfluidic chip at nanoliter volumes significantly reduces reagent costs and permits time effective high throughput miRNA expression profiling.

Here we describe an optimized multiplex reverse transcriptase quantitative PCR (qRT-PCR) protocol in combination with a microfluidic platform as a cost and time effective high-throughput screening tool for microRNA (miRNA) expression levels, especially when working with limited amounts of sample.

높은 처리량 MicroRNA의 프로파일 : 최적 멀티 플렉스 플루 동적 ArrayTM의 IFCs에 Nanoliter의 규모 qRT - PCR

The broad involvement of miRNAs in critical processes underlying development, tissue homoeostasis and disease has led to a surging interest among the ...

연구

생체공학

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR (qPCR)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process including development1, apoptosis2, and cell cycle regulation3. MiRNAs are estimated to regulate the expression of 30% to 90% of human genes4 by binding to their target messenger RNAs (mRNAs)5. Widespread dysregulation of miRNAs has been reported in various diseases and cancer subtypes6. Due to their prevalence and unique structure, these small molecules are likely to be the next generation of biomarkers, therapeutic agents and/or targets.
Methods used to investigate miRNA expression include SYBR green I dye- based as well as Taqman-probe based qPCR. If miRNAs are to be effectively used in the clinical setting, it is imperative that their detection in fresh and/or archived clinical samples be accurate, reproducible, and specific. qPCR has been widely used for validating expression of miRNAs in whole genome analyses such as microarray studies7. The samples used in this protocol were from patients who underwent radical prostatectomy for clinically localized prostate cancer; however other tissues and cell lines can be substituted in. Prostate specimens were snap-frozen in liquid nitrogen after resection. Clinical variables and follow-up information for each patient were collected for subsequent analysis8.
Quantification of miRNA levels in prostate tumor samples. The main steps in qPCR analysis of tumors are: Total RNA extraction, cDNA synthesis, and detection of qPCR products using miRNA-specific primers. Total RNA, which includes mRNA, miRNA, and other small RNAs were extracted from specimens using TRIzol reagent. Qiagen's miScript System was used to synthesize cDNA and perform qPCR (Figure 1). Endogenous miRNAs are not polyadenylated, therefore during the reverse transcription process, a poly(A) polymerase polyadenylates the miRNA. The miRNA is used as a template to synthesize cDNA using oligo-dT and Reverse Transcriptase. A universal tag sequence on the 5' end of oligo-dT primers facilitates the amplification of cDNA in the PCR step. PCR product amplification is detected by the level of fluorescence emitted by SYBR Green, a dye which intercalates into double stranded DNA. Specific miRNA primers, along with a Universal Primer that binds to the universal tag sequence will amplify specific miRNA sequences. 
The miScript Primer Assays are available for over a thousand human-specific miRNAs, and hundreds of murine-specific miRNAs. Relative quantification method was used here to quantify the expression of miRNAs. To correct for variability amongst different samples, expression levels of a target miRNA is normalized to the expression levels of a reference gene. The choice of a gene on which to normalize the expression of targets is critical in relative quantification method of analysis. Examples of reference genes typically used in this capacity are the small RNAs RNU6B, RNU44, and RNU48 as they are considered to be stably expressed across most samples. In this protocol, RNU6B is used as the reference gene.

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR qPCR

Quantitative Real Time polymerase chain reaction (qPCR) is a rapid and sensitive method to investigate the expression levels of various microRNA (miRNA) molecules in tumor samples. Using this method expression of hundreds of different miRNA molecules can be amplified, quantified, and analyzed from the same cDNA template.

정량 실시간 PCR (qPCR)에 의한 전립선 종양에 MicroRNA 감지

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process ...

의학

Detection of MicroRNAs in Microglia by Real-time PCR in Normal CNS and During Neuroinflammation

Microglia are cells of the myeloid lineage that reside in the central nervous system (CNS)1. These cells play an important role in pathologies of many diseases associated with neuroinflammation such as multiple sclerosis (MS)2. Microglia in a normal CNS express macrophage marker CD11b and exhibit a resting phenotype by expressing low levels of activation markers such as CD45. During pathological events in the CNS, microglia become activated as determined by upregulation of CD45 and other markers3. The factors that affect microglia phenotype and functions in the CNS are not well studied. MicroRNAs (miRNAs) are a growing family of conserved molecules (~22 nucleotides long) that are involved in many normal physiological processes such as cell growth and differentiation4 and pathologies such as inflammation5. MiRNAs downregulate the expression of certain target genes by binding complementary sequences of their mRNAs and play an important role in the activation of innate immune cells including macrophages6 and microglia7. In order to investigate miRNA-mediated pathways that define the microglial phenotype, biological function, and to distinguish microglia from other types of macrophages, it is important to quantitatively assess the expression of particular microRNAs in distinct subsets of CNS-resident microglia. Common methods for measuring the expression of miRNAs in the CNS include quantitative PCR from whole neuronal tissue and in situ hybridization. However, quantitative PCR from whole tissue homogenate does not allow the assessment of the expression of miRNA in microglia, which represent only 5-15% of the cells of neuronal tissue. Hybridization in situ allows the assessment of the expression of microRNA in specific cell types in the tissue sections, but this method is not entirely quantitative. In this report we describe a quantitative and sensitive method for the detection of miRNA by real-time PCR in microglia isolated from normal CNS or during neuroinflammation using experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), a mouse model for MS. The described method will be useful to measure the level of expression of microRNAs in microglia in normal CNS or during neuroinflammation associated with various pathologies including MS, stroke, traumatic injury, Alzheimer's disease and brain tumors.

Microglia are resident macrophages that provide the first line of defense and immune surveillance of the central nervous system. MicroRNAs are regulatory molecules that play an important role in many physiological processes including activation and differentiation of macrophages. In this article, we describe the method for measurement of microRNAs in microglia.

일반 CNS의 실시간 PCR에 의한과 Neuroinflammation 동안 Microglia에 MicroRNAs의 탐지

Microglia are cells of the myeloid lineage that reside in the central nervous system (CNS)1. These cells play an important role in pathologies of many ...

면역학 및 감염병학

Quantitative Real-Time PCR Evaluation of microRNA Expressions in Mouse Kidney with Unilateral Ureteral Obstruction

MicroRNAs (miRNAs) are single stranded, non-coding RNA molecules that typically regulate gene expression at the post-transcriptional level by binding to partially complementary target sites in the 3&#39; untranslated region (UTR) of messenger RNA (mRNA), which reduces the mRNA&#39;s translation and stability. The miRNA expression profiles in various organs and tissues of mice have been investigated, but standard methods for the purification and quantification of miRNA in mouse kidney have not been available. We have established an effective and reliable method for extracting and evaluating miRNA expression in mouse kidney with renal interstitial fibrosis by quantitative reverse-transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR). The protocol required five steps: (1) creation of sham and unilateral ureteral obstruction (UUO) mice; (2) extraction of kidney samples from the UUO mice; (3) extraction of total RNA, which includes miRNA, from the kidney samples; (4) complementary DNA (cDNA) synthesis with reverse transcription from miRNA; and (5) qRT-PCR using the cDNA. Using this protocol, we successfully confirmed that compared to the controls, the expression of miRNA-3070-3p was significantly increased and those of miRNA-7218-5p and miRNA-7219-5p were significantly decreased in the kidneys of a mouse model of renal interstitial fibrosis. This protocol can be used to determine the miRNA expression in the kidneys of mice with UUO.

We describe a method for evaluating the microRNA expression in the kidneys of mice with unilateral ureteral obstruction (UUO) by quantitative reverse-transcription polymerase chain reaction. This protocol is suitable for studying kidney microRNA expression profiles in mice with UUO and in the context of other pathological conditions.

일방적 인 요원 방해와 마우스 신장에서 microRNA 표현의 정량적 실시간 PCR 평가

MicroRNAs (miRNAs) are single stranded, non-coding RNA molecules that typically regulate gene expression at the post-transcriptional level by binding to ...

유전학

Quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction Evaluation of MicroRNA Expression in Kidney and Serum of Mice with Age-Dependent Renal Impairment

MicroRNAs (miRNAs) are small, noncoding RNAs consisting of 21-25 bases. They are not translated into proteins but rather work to impede the functioning of their target messenger RNAs (mRNAs) by destabilizing them and disrupting their translation. Although the miRNA expression profiles in various mouse organs and tissues have been investigated, there have been no standard methods for purifying and quantifying mouse kidney and serum miRNAs. We have established an effective and reliable method for extracting and evaluating the miRNA expression in the serum and kidney of mice with age-dependent renal impairment. 
The method uses quantitative reverse-transcription-polymerase chain reaction (qRT-PCR), and the protocol requires six steps: (1) preparing senescence-accelerated mouse resistance 1 (SAMR1) mice and senescence-accelerated mouse prone (SAMP1) mice; (2) extracting serum samples from these mice; (3) extracting a kidney sample from each mouse; (4) extracting total RNA (including miRNA) from kidney and serum samples from each mouse; (5) the synthesis of complementary DNA (cDNA) with reverse transcription from the miRNA; (6) conducting a qRT-PCR using the cDNA obtained. 
This protocol was used to confirm that, compared to the controls, the expression of miRNA-7218-5p and miRNA-7219-5p was significantly changed in the kidney and serum of a mouse model of age-dependent renal impairment. This protocol also clarified the relationship between the kidney and serum of the mouse model of age-dependent renal impairment. This protocol can be used to determine miRNA expression in the kidney and serum of mice with age-dependent renal impairment.

We present a method for evaluating microRNA expression in the kidney and serum of mice with age-dependent renal impairment by quantitative reverse-transcription polymerase chain reaction.

연령 의존적 신장 장애가 있는 마우스의 신장 및 혈청에서 MicroRNA 발현의 정량적 실시간 중합효소 연쇄반응 평가

MicroRNAs (miRNAs) are small, noncoding RNAs consisting of 21-25 bases. They are not translated into proteins but rather work to impede the functioning of ...

Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their translational repression. Changes in miRNA expression have been shown to be involved in the development of all major complex diseases. Furthermore, recent findings showed that miRNAs can be secreted to the extracellular environment and enter the bloodstream and other body fluids where they can circulate with high stability. The function of such circulating miRNAs remains largely elusive, but systematic high throughput approaches, such as miRNA profiling arrays, have lead to the identification of miRNA signatures in several pathological conditions, including neurodegenerative disorders and several types of cancers. In this context, the identification of miRNA expression profile in the cerebrospinal fluid, as reported in our recent study, makes miRNAs attractive candidates for biomarker analysis.
There are several tools available for profiling microRNAs, such as microarrays, quantitative real-time PCR (qPCR), and deep sequencing. Here, we describe a sensitive method to profile microRNAs in cerebrospinal fluids by quantitative real-time PCR. We used the Exiqon microRNA ready-to-use PCR human panels I and II V2.R, which allows detection of 742 unique human microRNAs. We performed the arrays in triplicate runs and we processed and analyzed data using the GenEx Professional 5 software.
Using this protocol, we have successfully profiled microRNAs in various types of cell lines and primary cells, CSF, plasma, and formalin-fixed paraffin-embedded tissues.

We describe a protocol of real time PCR to profile microRNAs in the cerebrospinal fluid (CSF). With the exception of RNA extraction protocols, the procedure can be extended to RNA extracted from other body fluids, cultured cells, or tissue specimens.

정량 실시간 PCR을 사용하여 뇌척수액의 마이크로 RNA 프로파일

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their ...

Isolation of Murine Peritoneal Macrophages to Carry Out Gene Expression Analysis Upon Toll-like Receptors Stimulation

During infection and inflammation, circulating monocytes leave the bloodstream and migrate into tissues, where they differentiate into macrophages. Macrophages express surface Toll-like receptors (TLRs), which recognize molecular patterns conserved through evolution in a wide range of microorganisms. TLRs play a central role in macrophage activation which is usually associated with gene expression alteration. Macrophages are critical in many diseases and have emerged as attractive targets for therapy. In the following protocol, we describe a procedure to isolate murine peritoneal macrophages using Brewer&#8217;s thioglycollate medium. The latter will boost monocyte migration into the peritoneum, accordingly this will raise macrophage yield by 10-fold. Several studies have been carried out using bone marrow, spleen or peritoneal derived macrophages. However, peritoneal macrophages were shown to be more mature upon isolation and are more stable in their functionality and phenotype. Thus, macrophages isolated from murine peritoneal cavity present an important cell population that can serve in different immunological and metabolic studies. Once isolated, macrophages were stimulated with different TLR ligands and consequently&#160;gene expression was evaluated.

We describe here a simple protocol to isolate murine peritoneal macrophages. This procedure is followed by RNA extraction to carry out gene expression analysis upon Toll-like receptors stimulation.

쥐 복막 대 식세포의 분리는 수신자 같은 수용체 자극하면 유전자 발현 분석을 수행하기

During infection and inflammation, circulating monocytes leave the bloodstream and migrate into tissues, where they differentiate into macrophages. ...

Detection of MicroRNA Expression in the Kidneys of Immunoglobulin A Nephropathic Mice

Immunoglobulin A (IgA) nephropathy is a type of primary glomerulonephritis characterized by the abnormal deposition of IgA, leading to the end-stage renal failure. In recent years, the involvement of microRNAs (miRNAs) has been reported in the pathogenesis of IgA nephropathy. However, there is no established method for profiling miRNAs in IgA nephropathy using small animal models. Therefore, we developed a reliable method for analyzing miRNA in the kidney of an IgA mouse model (HIGA mouse). The goal of this protocol is to detect the altered expression levels of miRNAs in the kidneys of HIGA mice when compared with the levels in kidneys of control mice. In brief, this method consists of four steps: 1) obtaining kidney samples from HIGA mice; 2) purifying total RNA from kidney samples; 3) synthesizing complementary DNA from total RNA; and 4) quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR) of miRNAs. Using this method, we successfully detected the expression levels of several miRNAs (miR-155-5p, miR-146a-5p, and miR-21-5p) in the kidneys of HIGA mice. This new method can be applied to other studies profiling miRNAs in IgA nephropathy.

microRNAs are involved in the pathogenesis of IgA nephropathy. We have developed a reliable method for detecting microRNA expression levels in the kidneys of an IgA nephropathy mouse model (HIGA mice). This new method will facilitate to check for miRNAs involvement in IgA nephropathy.

면역글로불린 A 신병성 마우스의 신장에서 MicroRNA 발현 검출

Immunoglobulin A (IgA) nephropathy is a type of primary glomerulonephritis characterized by the abnormal deposition of IgA, leading to the end-stage renal ...

A Quantitative Detection Method for MicroRNAs in the Kidney of an Ischemic Kidney Injury Mouse Model

MicroRNAs (miRNAs) are involved in various disease states and are effective biomarkers for the early diagnosis of diseases and treatment in mice. However, standard protocols for the purification of miRNAs and detection of their expression in the kidneys of acute kidney injury (AKI) mice have not been well established. This study developed an effective and simple protocol to purify and quantify miRNAs in the kidneys of an AKI mouse model induced by renal ischemia-reperfusion using quantitative real-time reverse-transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR). This protocol comprises five steps: 1) induction of AKI by renal ischemia-reperfusion, 2) harvesting of kidneys, 3) purification of total RNA, including miRNAs, from kidneys, 4) cDNA synthesis by reverse transcription of miRNA, and 5) qRT-PCR to detect miRNA expression. Using this protocol, the renal ischemia-reperfusion injury model can be generated with mild to severe forms of AKI. Additionally, if the procedure is followed properly, a consistent AKI model with minimal individual differences can be obtained. This qRT-PCR assay shows a very wide dynamic range and enables the discrimination of mature miRNAs, which can be accurately quantified with high specificity. This protocol can be used to study the miRNA expression profile in AKI kidneys.

This article presents a protocol for detecting microRNA expression in the kidneys of an acute kidney injury mouse model using quantitative real-time reverse-transcription polymerase chain reaction. This protocol emphasizes an ischemic kidney injury mouse model and the careful extraction of microRNA samples.

MicroRNAs (miRNAs) are involved in various disease states and are effective biomarkers for the early diagnosis of diseases and treatment in mice. However, ...

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that provides an accurate and reproducible analysis. Probe-based chemistry offers the least background fluorescence as compared to other (dye-based) chemistries. Presently, there are several platforms available that use probe-based chemistry to quantitate transcript abundance. qPCR in a 96 well plate is the most routinely used method, however only a maximum of 96 samples or miRNAs can be tested in a single run. This is time-consuming and tedious if a large number of samples/miRNAs are to be analyzed. High-throughput probe-based platforms such as microfluidics (e.g. TaqMan Array Card) and nanofluidics arrays (e.g. OpenArray) offer ease to reproducibly and efficiently detect the abundance of multiple microRNAs in a large number of samples in a short time. Here, we demonstrate the experimental setup and protocol for miRNA quantitation from serum or plasma-EDTA samples, using probe-based chemistry and three different platforms (96 well plate, microfluidics and nanofluidics arrays) offering increasing levels of throughput.

Circulating microRNAs have recently emerged as promising and novel biomarkers for various cancers and other diseases. The goal of this article is to discuss three different probe-based real-time PCR platforms and methods that are available to quantify and determine the abundance of circulating microRNAs.

프로브 기반의 실시간 PCR은 마이크로 RNA의 정량 측정을위한 접근 방법

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...