Name: development of an in vitro assay to quantitate hematopoietic stem and progenitor cells (hspcs) in developing zebrafish embryos
Uploaded: 2017-11-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells HSPCs in Developing Zebrafish Embryos at JoVE.com

건강의 국가 학회에 의해 제공 된 자금 (NIH: K01-DK087814-01A1 D.L.S.에), 생명 공학에서 연구 및 교육을 위한 캘리포니아 주립 대학 프로그램 (CSUPERB: D.L.S. 척추 조 혈 틈새의 분자 제어) 캘리포니아 주립 대학 치 코 (A.C.B.) 하에서 대학원 사무실에서.

캘리포니아 주립 대학, 치 코, 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 자문 위원회는 모든 방법을 아래에 설명 된 승인.
1. 블리치 48 hpf Zebrafish 태아
<ol><li>와 함께 15 cm (w) x 15 c m (l) x 7 cm (h) 플라스틱 용기 3 세척 스테이션 만들기: 1) 1000 mL 배아 매체 (E3, 표 1참조) 표 백제 5%의 1 mL, 2)와 함께 살 균 E3와 함께 3) 살 균 E3. 각 컨테이너에 배아 잠수함 솔루션의 500 mL 있는지 확인 하십시오. 참고: 테스트 각 조건에 대해 적어도 10 배아 필요할 것 이다. 이 세척 절차는 최대 200 배아를 수용할 수 있습니다.</li>
	<li>전송 피 펫과 배아 차 여과기에 놓고 5 분 (내부 배아)와 차 여과기를 제거 하 고 세척 역 5 분;에 대 한 # 2에 대 한 세척 역 # 1에에서 계란을 잠수함 마지막 5 분 동안 세척 역 # 3를 반복 합니다.</li>
	<li>마지막 세척 후 깨끗 한 10 cm 배양 접시에 거꾸로 그것을 선회 하 고 부드럽게 배아를 rinsing 하 여 차 여과기에서 린스 배아에서 살 균 e 3와 차 여과기 및 전송 피 펫.</li>
</ol>2. Dechorionate 배아
<ol><li>전송 피 펫와 함께 제거와 페 트리 접시에서 가능한 많은 e 3를 삭제 하 고 추가 dechorionation 프로 테아 제 (10mg/mL)의 500 μ 배아. 5 분 부드럽게 누릅니다 완전히 제거 하는 chorions를 페 트리 접시의 측면에 대 한 실 온에서 품 어.</li>
	<li>혈 청 학적인 피 펫으로 메 마른 E3 효소 희석의 20 mL를 추가 합니다. 정착, 배아를 허용 하 고 전송 피 펫으로 E3를 제거 합니다. 3 번 dechorionation 효소의 모든 흔적을 제거 하려면이 세 단계를 반복 합니다.</li>
</ol>3. 배아 샘플 준비
<ol><li>P1000 피 펫을 사용 하 여 단일 균 1.5 mL microcentrifuge 튜브로 10 배아를 놓습니다.</li>
	<li>피 펫과 e 3를 제거 하 고 삭제. 주의: 플라스틱 주의 배아 수 쉽게 전치 하 고 다음 세척 단계 삭제.</li>
</ol>4. 배아를 분리에 대 한 준비
<ol><li>층 류 두건에 샘플을 전송 하 고 1 mL을 추가 하 여 태아를 씻어 살 균 E3. 배아 튜브의 하단에 정착 하 고 상쾌한 P1000 피 펫과 제거를 허용 합니다. 3 세척의 총에 대 한 반복 합니다.</li>
	<li>마지막 세척 후 e 3를 제거 하 고 삭제 합니다. E3 점액 코팅 (및 포자, 효 모, 또는 박테리아에 갇혀 있을 수 있습니다) 배아 zebrafish를 둘러싼 제거 하에 10 m m dithiothreitol (DTT)의 1 mL를 추가 합니다. Microcentrifuge 튜브 가로로 층 류 두건은 25 분에 실 온에서 품 어.</li>
</ol>5. 배아 분리
<ol><li>샘플 3 번 (캘리포니아2 + , 마그네슘2 +)와 함께 살 균 DPBS의 1 mL로 씻는 다. 마지막 세척 후 (캘리포니아2 + , 마그네슘2 +)와 함께 DPBS의 500 μ를 추가 하 고 추가 5 mg/mL (26 U/mL) 분리 효소의 5 μ. 주의:이 효소 필요 캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 +, 그래서는 DPBS 이러한 이온을 포함 하는 것을 확인 하십시오.</li>
	<li>층 류 두건에서 60 분 장소 샘플에 대 한 180 rpm에서 수평 궤도 통에 37 ° C에서 샘플을 품 어와 샘플은 완전히 해리까지 한 P1000와 배아를 triturate. 주의: 주기적으로 그들은 해리 될 때 결정 하는 배아를 확인 합니다. 배아 솔루션 있어야 어느 정도의 조직. 그것은 완전히 동질적인 해서는 안됩니다. 수-다이제스트 ( 보충 그림 1참조) HSPCs 파괴 됩니다.</li>
</ol>6입니다. 천연된 배아의 준비
<ol><li>5 mL 폴리스 티 렌의 최고 저수지에 피 펫 10 해리 배아 라운드 35 μ m 셀 스 트레이너 캡 하단 튜브.</li>
	<li>피 펫와 린스 (Ca2 + 나 가진 Mg2 +) 살 균 PBS와 전송 솔루션 5 mL를 포함 하는 폴리스 티 렌 관을 배양 튜브 단계 6.1에서에서 셀 필터링. 액체의 4 mL 5 mL 폴리스 티 렌 튜브에 존재 하는 때까지 반복 합니다. 참고: PBS, DPBS, 또는 다른 isotonic 버퍼 솔루션 사용할 수 있습니다이 단계에서 그들은 포함 되지 않은 Ca2 + 또는 Mg2 + 로
</li>
	<li>4 ° C와 5 분 무 균된 셀 샘플을 펠 렛 300g x 튜브 원심 피 펫, 제거와 상쾌한 라운드 하단 튜브에서 삭제. 튜브의 하단에 수송과 세포를 방해 하지 않는 주의 하십시오. PBS의 100 μ 셀 resuspend</li>
</ol>7입니다. 스 준비
<ol><li>완전 한 스 (표 1) 재고 솔루션 x 1을 생성 하 고 메 마른 라운드-하단 14 mL 튜브 3 mL 주사기와 바늘 16 G 2.5 mL을 추가. 한 튜브를 사용 하 여 테스트 하는 각 조건에 대 한.</li>
	<li>
Cytokines, 작은 분자, 또는 다른 에이전트 각 샘플에 조사를 추가 합니다.
	<ol>
<li>골수성 차별화에 대 한 1% 잉어 혈 청 및 0.3 mg/mL 재조합 zebrafish granulocyte 콜로 니 자극 인자 (Gcsf)34 스 매체를 추가 합니다. 참조 Svoboda 외. 37 잉어 혈 청 및 재조합 cytokines 생성 하는 방법에 전체 설명</li>
		<li>Erythroid 차별 화를 위한 스 보통 1% 잉어 혈 청 및 0.1 mg/mL 재조합 zebrafish erythropoietin (Epo)38 을 추가 합니다.</li>
		<li>Multilineage 창시자 검사, Epo, Gcsf를 추가 합니다. 주의: Cytokines 및 첨가제 해야 하지 총 총 볼륨의 10% 이상으로 매체 개별 식민지 분별 충분히 점성 되지 않습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>8입니다. 스 천연된 배아의 추가
<ol><li>피 펫을 사용 하 여, 재조합 cytokines와 잉어 혈 청을 준비 스의 표면에 해리 10 태아의 100 μ를 추가 합니다. 캡 뚜껑 하 고 완벽 하 게 균질 샘플을 부드럽게 소용돌이. 각 튜브는 이제 10 배아의 천연된 조직이 있어야 합니다.</li>
	<li>3 mL 주사기와 바늘 16 G, 2 별도 35 mm 페 트리 접시에 샘플의 aliquot 1 mL을 사용 하 여. 샘플 페 트리 접시에 걸쳐 완전히 분산 된 다는 것을 확인 하십시오. 각 샘플에 대해 반복 합니다.</li>
	<li>15 cm 배양 접시에 스에 셀 35 m m 접시를 놓습니다. 각 15 cm 접시 한 35mm 페 트리 접시를 샘플 축이다 살 균 물 5 mL를 추가 합니다. 7-10 일 동안 32 ° C, 5% CO2 에서 품 어.</li>
</ol>9. HSPC 파생 된 콜로 니 형성 단위 (CFUs)의 시각화
<ol><li>7 일 잠복기 후 시각화 및 열거형에 대 한 40-100 X에는 거꾸로 한 현미경에 샘플을 배치 합니다. 이 시점에서 개별 식민지 절연 한 피 펫을 하 고 얼룩 및 유전자 분석 대상이 될 수 있습니다.</li>
</ol>

<ol>
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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+kidney+stromal+cell+lines+support+multilineage+hematopoiesis.">Zebrafish kidney stromal cell lines support multilineage hematopoiesis.</a> Blood. 114, 279-289 (2009).</li><li>Svoboda, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+tools+for+the+clonal+analysis+of+zebrafish+hematopoiesis.">Ex vivo tools for the clonal analysis of zebrafish hematopoiesis.</a> Nat Protoc. 11, 1007-1020 (2016).</li><li>Paffett-Lugassy, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+conservation+of+erythropoietin+signaling+in+zebrafish.">Functional conservation of erythropoietin signaling in zebrafish.</a> Blood. 110, 2718-2726 (2007).</li><li>Stachura, D. L., Traver, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+dissection+of+zebrafish+hematopoiesis.">Cellular dissection of zebrafish hematopoiesis.</a> Methods Cell Biol. 133, 11-53 (2016).</li><li>Traver, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+and+in+vivo+imaging+of+multilineage+engraftment+in+zebrafish+bloodless+mutants.">Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants.</a> Nat Immunol. 4, 1238-1246 (2003).</li><li>Kobayashi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+localization+of+side+population+(SP)+cells+in+zebrafish+kidney+hematopoietic+tissue.">Characterization and localization of side population (SP) cells in zebrafish kidney hematopoietic tissue.</a> Blood. 111, 1131-1137 (2008).</li><li>Henninger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+fate+mapping+quantifies+the+number+of+haematopoietic+stem+cells+that+arise+during+development.">Clonal fate mapping quantifies the number of haematopoietic stem cells that arise during development.</a> Nat Cell Biol. 19, 17-27 (2017).</li><li>Tamplin, O. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cell+arrival+triggers+dynamic+remodeling+of+the+perivascular+niche.">Hematopoietic stem cell arrival triggers dynamic remodeling of the perivascular niche.</a> Cell. 160, 241-252 (2015).</li></ol>

저자는 공개 없다.

Zebrafish 모델 시스템은 원시적이 고 확실 한 척추 조 공부, 효과적, 효율적이 고 저렴 한 모델이 되었다. 빠르고, 저렴 한, 그리고 몇 가지 기술적인 어려움을 제시 하는 분석 실험의 세대는 작은 분자를 테스트, 돌연변이 배아를 분석 하 고 분자 경로 HSPC 생물학에 대 한 중요 한 elucidating 활용할 수 있습니다. 생체 외에서 도금 HSPCs의 성인 제 브라에서 mutagenesis, cytokines, 그리고 조 혈 결함을 공...

조는 다양 한 생명체의 생존에 필요한 성숙한 혈액 세포를 만드는 과정입니다. 성숙한 혈액을 구성 하는 발달 제한 된 세포 유형의 다양 한으로 조 혈 줄기 세포 (HSCs)의 분화에 관련 된 주요 발달 과정 이다. 이러한 HSCs 시스템은 결코 소진 하 고 그들은 죽을 때까지 초기 배아 개발에서 유지 해야 갱신 자가 해야 합니다. 척추 동물, 지속적인 차별화 및 조 혈 줄기와 조상 세포 (HSPCs)의 확산 하는 데 필요한 포스트 mitotic 혈액 세포의 대부분을 보충 적절 하 게 매일 재활용 되 고. HSCs 제한 조상 세포;의 하위 집합에 첫 번째 차별화 하 여 성숙한 혈액 세포 생성 일반적인 림프 창시자 (CLPs)1, 결국 T, B, NK 세포를 생산, 그리고 granulocytes, 적혈구, macrophages, 및 없으며 생성 하는 일반적인 골수성 창시자 (CMPs)2 . 이러한 창시자 특정 세포 계보를 생성 하는 최선을 다하고 있습니다 및 추가 골수성 erythroid 창시자 (Mep) 적혈구와 혈소판, 또는 granulocyte 생성 하는 등 더 발달 제한 조상 세포로 분화 대 식 세포 창시자 (GMPs) basophils, 호 산 구는 고 대 식 세포, 호 중구,2를 생성 하는. 식별 하 고 이러한 창시자 분리 중요 한 분자 경로 식별 조 혈 분화에 관련 된 있으며이 조상 세포를 제대로 하지 못할 때 발생 하는 백혈병 등 많은 조 혈 질환 차별화.
지난 몇 년간 zebrafish (Danio rerio) 모델 시스템 배아 및 성인 조 혈 연구에 대 한 주요 연구 도구 되고있다. Zebrafish 순종 유전자 분석 하 고 비슷한 맥 관 구조와 인 간에 게 조 혈 시스템 phylogenetically 낮은 척추 모델 종. Zebrafish 태아 전 utero, 개발 하 고 48 시간 게시물 내 수정 (hpf) 생성 HSPCs3,,45,6,,78. Zebrafish는 또한 높은 다 산, 여 성과 단일 클러치에 100 달걀에 누워 큰 샘플 크기와 실험적인 복제 허용. Zebrafish 태아는 광학 투명, 조 혈 시스템의 미세한 시각화에 대 한 허용 합니다. HSCs runx1같은 표시 zebrafish의 여러 형광 유전자 변형 라인: EGFP 물고기9, cd41: EGFP 물고기10및 kdrl:mCherry; cmyb: GFP3 더블 양성 동물, HSC 출현과 확장 vivo에서3,4,7,8,의 라이브, 실시간 시각화를 위한 허용 9. Zebrafish의 빠른 생성 시간 및 개발 utero 전 을 주도하 고 있다 mutagenesis 연구11,12,13,,1415 에 약물의 사용 16,17,18,,1920 인간의 혈액 질환에 대 한 치료 약속을 잡고 화합물에 대 한 검사. 전반적으로, 조 혈 시스템, 존재의 유전자 변형, 선과 빠른 재생 시간을 쉽게 개발의 보존이 했다는 제 브라는 저렴, 신속 하 고, 유연 하 고 이상적인 조 혈 연구에 대 한 모델을.
포유류 조 혈 시스템에서 분리 하 고 테스트 HSCs의 수많은 방법이 개발 되었습니다. 수사 경과 염료25,26에 HSCs의 능력을 악용 뿐만 아니라 마크 HSCs21,22,,2324, 세포 표면 수용 체의 결합을 이용할 수 있다. 후에 그들은 분류는 형광 활성화 셀 정렬 (FACS) 그들의 물리적 분리 수 있습니다. 셀은 HSC 임을 증명 해 내 생 HSPCs, 상 상속 HSCs, 이식 장기, 다중 계보 재구성 모든 혈액 세포 유형 성숙 관찰 하 고 파괴 하는 호스트 동물 필요 합니다. 조 혈 모 세포 및 면역 이식에 대 한 일치를 촉진 하는 타고 난된 마우스 긴장에 대하여 수많은 세포 표면 항 체는이 분석 실험 쥐에서 잘 작동 합니다. 그러나, 몇 가지 zebrafish 조 혈 모 세포 표면 항 체 생성 된27, 식별 및 격리 HSCs의 방해 되었습니다. Zebrafish HSCs를 분리 하 고 하는 가장 일반적인 방법은 유전자 변형 동물, 그것에 의하여 셀 특정 발기인 순서 운전 형광 단백질의 표정은. 연구 시각 있고이 기술을3,4,,89를 이용 하 여 현미경으로 등 쪽 대동맥의 복 부 벽에 HSCs를 열거. 다른 실험실 zebrafish28,29 의 클론 변종 생성 하 고 일치 하는 MHC 동물30성공적인 이주를 수행 했습니다. 그러나, 이러한 기술은 비용 많은 실험실에 금지, 기술적으로 어려운 이며 시간이 소요. 이러한 문제를 해결 하기 위해 실험실 여러 생체 외에서 분석 실험을 존재, 확산 속도, 그리고 HSPCs31,,3233의 분화 능력에 대 한 테스트 생성 34,,3536. 이 분석 실험 쇼 확산 및 HSPCs 시험관에31,32,33,,3435,36의 구조의 차별화 조 혈 결함36, 그리고 발견 하 고 cytokines33,,3435테스트는 효율적인 방법. 그들은 또한 유전자 HSPC 생물학31,32에 대 한 책임을 식별 하기 위해 활용 되었습니다. 이 연구에서 우리 걸릴이 분석 한 단계 더 나아가, 발전 zebrafish 태아에 있는 HSPCs의 정량 수 있도록. 이 분석 실험 또한 돌연변이 동물에 HSPCs의 수를 quantitate에 이용 될 수 있다 고 동물 조 혈 파괴 약물 치료. 본질적으로,이 분석 실험은 빠르고, 현재 몇 가지 기술 과제, 되며 quantitate HSPC 숫자, 그들의 확산을 시험 하 고 차별화에 블록을 조사 하는 저렴 한 방법.

<table><tbody><tr><td>10% Bovine Serum Albumin in Iscove&#039;s MDM</td><td>StemCell Technologies&amp;nbsp;</td><td>9300</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (10x) with Calcium&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; and Magnesium&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;</td><td>Life Technologies</td><td>14080-055</td><td></td></tr><tr><td>HyClone PBS (1x)</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>sh30256.01</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;DMEM 500 mL</td><td>Corning CellGrow</td><td>10-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Ham&#039;s F12 500 mL</td><td>Corning CellGrow</td><td>10-080-CV</td><td></td></tr><tr><td>FBS 500 mL</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>100-108</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 100 mL (1 M)</td><td>Gibco life technologies</td><td>15-630-080</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/streptomycin (5000 U/mL&lt;br/&gt; and 5000 mg/mL) with L-Glutamine (200 mM)</td><td>Corning Mediatech</td><td>30-009-CI</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycin Sulfate 10 mL (50 mg/mL)</td><td>Corning Mediatech</td><td>30-005-CR</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL MCF tube</td><td>FisherBrand</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>3 mL 23gx1 injection needle with Luer lock</td><td>BD Safety Glide</td><td>305905</td><td></td></tr><tr><td>5 mL polystyrene round bottom tube with cell strainer cap</td><td>Corning Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>Methocel MC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>64630</td><td></td></tr><tr><td>14 mL Polystyrene round bottom tube</td><td>Corning Falcon</td><td>352057</td><td></td></tr><tr><td>10 mm polystyrene easygrip Petri dish</td><td>Corning Falcon</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>Librease TM</td><td>Roche Sigma-Aldrich</td><td>5401119001</td><td>dissociation protease</td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Roche Sigma-Aldrich</td><td>11459643001</td><td>dechorionation protease</td></tr><tr><td>15 cm Petri dish</td><td>Corning Falcon</td><td>351058</td><td></td></tr><tr><td>AB</td><td>Zebrafish International Resource Center (ZIRC)</td><td>ZL1</td><td>zebrafish strain used</td></tr><tr><td>Dithiolthreitol (DTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>646563</td><td></td></tr></tbody></table>

development of an in vitro assay to quantitate hematopoietic stem and progenitor cells (hspcs) in developing zebrafish embryos

조는 조 혈 줄기와 조상 세포 (HSPCs) 성숙한 혈액을 구성 하는 다른 세포 계보의 무리로 분화 하는 필수적인 세포 프로세스입니다. 격리 및 식별이이 HSPCs의 어렵습니다 때문에 정의 된 전 게시물 사실상; 그들은 특정 세포 계보에 그들의 감 별 법 후만 정의할 수 있습니다. 지난 몇 년간 제 브라 (Danio rerio) 조 연구에 모델 생물 되고있다. Zebrafish 태아 utero 전, 개발 하 고 48 h 후 수정 (hpf)에 의해 확실 한 HSPCs. 분석 HSPC 차별화를 평가 하기 위해 생성 된 이식 활용 확산 기능 개발 된 이후 confocal 현미경 검사 법으로 특수 유전자 변형 라인 시각화 뿐만 아니라 조 혈 시스템의 재구성. 그러나, 이러한 분석 비용 금지, 기술적으로, 어렵고 많은 실험실에 대 한 시간이 소모 되는. HSPCs를 평가 하기 위해 생체 외에서 모델의 개발 비용 효과적이 고, 빨리, 그리고 이전에 비해 적은 어려움 설명 방법, 신속 하 게 HSPC 생물학에 영향을 주는 mutagenesis와 약 스크린을 평가 하기 위해 실험실을 수 있도록. 이 소설 체 외에서 분석 결과 HSPCs를 평가 하는 도금 해리 전체 zebrafish 태아 및 HSPC 차별화 및 확산 촉진 추가 외 인 요인에 의해 수행 됩니다. 배아는 단일 세포로 해리 하 고 단일 조상 세포에서 발생 하는 콜로 니 형성 단위 (CFUs)을 생성 하는 그들을 원인이 HSPC 지원 식민지 자극 요인으로 도금. 이 분석 실험 분자 통로의 더 주의 깊은 검사 HSPC 확산, 차별화, 및 그것의 dysregulation 척추 조의 토대를 이해 하는 연구자 수 있도록 규칙에 대 한 책임을 허용 해야 동안에 질병.

배아 zebrafish에 HSPC 숫자를 평가 하기 위해 48 hpf 배아 소화, exogenous 지원 조 혈 성장 인자, 스에 도금 되었고 7 일 (그림 1A)에 대 한 인 큐베이 팅. 7 일 후, 콜로 니 형성 단위 (CFUs) 열거 (그림 1B)과 이미지 (그림 1C) 했다. 제어 함으로써 추가 다른 cytokines, 한 식민지 생산?...

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Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells HSPCs in Developing Zebrafish Embryos

여기, 우리는 조 혈 줄기와 조상 세포 (HSPCs) 배아 zebrafish quantitate 간단한 방법을 제시. 천연된 제 브라에서 HSPCs는 지원 요소, 성숙한 혈액으로 차별화와 스에 도금. 혈액의 검출 결함 및 심사 실시 쉽게 마약을 수 수 있습니다.

조 혈 줄기와 뿌리를 Quantitate를 생체 외에서 시험의 개발 세포 (HSPCs) Zebrafish 태아를 개발

Hematopoiesis is an essential cellular process in which hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) differentiate into the multitude of different cell ...

development-an-vitro-assay-to-quantitate-hematopoietic-stem

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) in Developing Zebrafish Embryos

7.9K 조회수.  California State University, Chico. 여기, 우리는 조 혈 줄기와 조상 세포 (HSPCs) 배아 zebrafish quantitate 간단한 방법을 제시. 천연된 제 브라에서 HSPCs는 지원 요소, 성숙한 혈액으로 차별화와 스에 도금. 혈액의 검출 결함 및 심사 실시 쉽게 마약을 수 수 있습니다.

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Large-scale Zebrafish Embryonic Heart Dissection for Transcriptional Analysis

The zebrafish embryonic heart is composed of only a few hundred cells, representing only a small fraction of the entire embryo. Therefore, to prevent the cardiac transcriptome from being masked by the global embryonic transcriptome, it is necessary to collect sufficient numbers of hearts for further analyses. Furthermore, as zebrafish cardiac development proceeds rapidly, heart collection and RNA extraction methods need to be quick in order to ensure homogeneity of the samples. Here, we present a rapid manual dissection protocol for collecting functional/beating hearts from zebrafish embryos. This is an essential prerequisite for subsequent cardiac-specific RNA extraction to determine cardiac-specific gene expression levels by transcriptome analyses, such as quantitative real-time polymerase chain reaction (RT-qPCR). The method is based on differential adhesive properties of the zebrafish embryonic heart compared with other tissues; this allows for the rapid physical separation of cardiac from extracardiac tissue by a combination of fluidic shear force disruption, stepwise filtration and manual collection of transgenic fluorescently labeled hearts.

To analyse cardiac gene expression profiles during zebrafish heart development, total RNA has to be extracted from isolated hearts. Here, we present a protocol for collecting functional/beating hearts by rapid manual dissection from zebrafish embryos to obtain cardiac-specific mRNA.

전사 분석을위한 대규모 Zebrafish의 배아 심장의 해부

The zebrafish embryonic heart is composed of only a few hundred cells, representing only a small fraction of the entire embryo. Therefore, to prevent the ...

연구

발생학

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an organism. The functional definition of a HSC is a transplanted cell that has the ability to reconstitute all the blood lineages of an irradiated recipient long term. This designation was established by decades of seminal work in mammalian systems. Using hematopoietic cell transplantation (HCT) and reverse genetic manipulations in the mouse, the underlying regulatory factors of HSC biology are beginning to be unveiled, but are still largely under-explored. Recently, the zebrafish has emerged as a powerful genetic model to study vertebrate hematopoiesis. Establishing HCT in zebrafish will allow scientists to utilize the large-scale genetic and chemical screening methodologies available in zebrafish to reveal novel mechanisms underlying HSC regulation. In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish. We show the dissection and preparation of zebrafish whole kidney marrow, the site of adult hematopoiesis in the zebrafish, and the introduction of these donor cells into the circulation of irradiated recipient fish via intracardiac injection. Additionally, we describe the post-transplant care of fish in an "ICU" to increase their long-term health. In general, gentle care of the fish before, during, and after the transplant is critical to increase the number of fish that will survive more than one month following the procedure, which is essential for assessment of long term (&lt;3 month) engraftment. The experimental data used to establish this protocol will be published elsewhere. The establishment of this protocol will allow for the merger of large-scale zebrafish genetics and transplant biology.

In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish.

성인 Zebrafish의 전체 신장 마로우의 이식

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

생물학

Isolation and Culture of Adult Zebrafish Brain-derived Neurospheres

The zebrafish is a highly relevant model organism for understanding the cellular and molecular mechanisms involved in neurogenesis and brain regeneration in vertebrates. However, an in-depth analysis of the molecular mechanisms underlying zebrafish adult neurogenesis has been limited due to the lack of a reliable protocol for isolating and culturing neural adult stem/progenitor cells. Here we provide a reproducible method to examine adult neurogenesis using a neurosphere assay derived from zebrafish whole brain or from the telencephalon, tectum and cerebellum regions of the adult zebrafish brain. The protocol involves, first the microdissection of zebrafish adult brain, then single cell dissociation and isolation of self-renewing multipotent neural stem/progenitor cells. The entire procedure takes eight days. Additionally, we describe how to manipulate gene expression in zebrafish neurospheres, which will be particularly useful to test the role of specific signaling pathways during adult neural stem/progenitor cell proliferation and differentiation in zebrafish.

Here we provide a reproducible method to examine adult neurogenesis using a neurosphere assay derived from the whole brain or from either the telencephalic, tectal or cerebellar regions of the adult zebrafish brain. Additionally, we describe the procedure to manipulate gene expression in zebrafish neurospheres.

성인 Zebrafish의 뇌 유래 neurosphere를의 분리 및 문화

The zebrafish is a highly relevant model organism for understanding the cellular and molecular mechanisms involved in neurogenesis and brain regeneration ...

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been described at the morphological level, little is known about the molecular basis of cellular changes that occur as the organism develops. With recent advancements in microfluidics and multiplexing technologies, it is now possible to characterize gene expression in single cells. This allows for investigation of heterogeneity between individual cells of specific cell populations to identify and classify cell subtypes, characterize intermediate states that occur during cell differentiation, and explore differential cellular responses to stimuli. This study describes a protocol to isolate viable, single cells from zebrafish embryos for high throughput multiplexing assays. This method may be rapidly applied to any zebrafish embryonic cell type with fluorescent markers. An extension of this method may also be used in combination with high throughput sequencing technologies to fully characterize the transcriptome of single cells. As proof of principle, the relative abundance of cardiac differentiation markers was assessed in isolated, single cells derived from nkx2.5 positive cardiac progenitors. By evaluation of gene expression at the single cell level and at a single time point, the data support a model in which cardiac progenitors coexist with differentiating progeny. The method and work flow described here is broadly applicable to the zebrafish research community, requiring only a labeled transgenic fish line and access to microfluidics technologies.

This protocol describes a method for isolating single cells from zebrafish embryos, enriching for cells of interest, capturing zebrafish cells in microfluidic based single cell multiplex systems, and assessing gene expression from single cells.

분리 및 Zebrafish의 배아에서 단일 세포의 특성

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To understand the behavior of neural progenitor cells in the complex in vivo environment, time-lapse live imaging of neural progenitor cells in an intact brain is critically required. In this video, we exploit the unique features of zebrafish embryos to visualize the development of forebrain neural progenitor cells in vivo. We use electroporation to genetically and sparsely label individual neural progenitor cells. Briefly, DNA constructs coding for fluorescent markers were injected into the forebrain ventricle of 22 hours post fertilization (hpf) zebrafish embryos and electric pulses were delivered immediately. Six hours later, the electroporated zebrafish embryos were mounted with low melting point agarose in glass bottom culture dishes. Fluorescently labeled neural progenitor cells were then imaged for 36hours with fixed intervals under a confocal microscope using water dipping objective lens. The present method provides a way to gain insights into the in vivo development of forebrain neural progenitor cells and can be applied to other parts of the central nervous system of the zebrafish embryo.

The present video demonstrates a method which takes advantage of the combination of electroporation and confocal microscopy to perform live imaging on individual neural progenitor cells in the developing zebrafish forebrain. In vivo analysis of the development of forebrain neural progenitor cells at a clonal level can be achieved in this way.

개발 Zebrafish Forebrain에 Clonally 관련 신경 전구 세포의 시간 경과 라이브 영상

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

신경과학

Generation of Parabiotic Zebrafish Embryos by Surgical Fusion of Developing Blastulae

Surgical parabiosis of two animals of different genetic backgrounds creates a unique scenario to study cell-intrinsic versus cell-extrinsic roles for candidate genes of interest, migratory behaviors of cells, and secreted signals in distinct genetic settings. Because parabiotic animals share a common circulation, any blood or blood-borne factor from one animal will be exchanged with its partner and vice versa. Thus, cells and molecular factors derived from one genetic background can be studied in the context of a second genetic background. Parabiosis of adult mice has been &#160;used extensively to research aging, cancer, diabetes, obesity, and brain development. More recently, parabiosis of zebrafish embryos has been used to study the developmental biology of hematopoiesis. In contrast to mice, the transparent nature of zebrafish embryos permits the direct visualization of cells in the parabiotic context, making it a uniquely powerful method for investigating fundamental cellular and molecular mechanisms. The utility of this technique, however, is limited by a steep learning curve for generating the parabiotic zebrafish embryos. This protocol provides a step-by-step method on how to surgically fuse the blastulae of two zebrafish embryos of different genetic backgrounds to investigate the role of candidate genes of interest. In addition, the parabiotic zebrafish embryos are tolerant to heat shock, making temporal control of gene expression possible. This method does not require a sophisticated set-up and has broad applications for studying cell migration, fate specification, and differentiation in vivo during embryonic development.

This protocol provides step-by-step instruction on how to generate parabiotic zebrafish embryos of different genetic backgrounds. When combined with the unparalleled imaging capabilities of the zebrafish embryo, this method provides a uniquely powerful means to investigate cell-autonomous versus non-cell-autonomous functions for candidate genes of interest.

Blastulae 개발의 외과 융합에 의해 Parabiotic 제브라 피쉬 배아의 생성

Surgical parabiosis of two animals of different genetic backgrounds creates a unique scenario to study cell-intrinsic versus cell-extrinsic roles for ...

Genotyping and Quantification of In Situ Hybridization Staining in Zebrafish

In situ hybridization (ISH) is an important technique that enables researchers to study mRNA distribution in situ and has been a critical technique in developmental biology for decades. Traditionally, most gene expression studies relied on visual evaluation of the ISH signal, a method that is prone to bias, particularly in cases where sample identities are known a priori. We have previously reported on a method to circumvent this bias and provide a more accurate quantification of ISH signals. Here, we present a simple guide to apply this method to quantify the expression levels of genes of interest in ISH-stained embryos and correlate that with their corresponding genotypes. The method is particularly useful to quantify spatially restricted gene expression signals in samples of mixed genotypes and it provides an unbiased and accurate alternative to the traditional visual scoring methods.

Gene editing technologies have enabled researchers to generate zebrafish mutants to investigate gene function with relative ease. Here, we provide a guide to perform parallel embryo genotyping and quantification of in situ hybridization signals in zebrafish. This unbiased approach provides greater accuracy in phenotypical analyses based on in situ hybridization.

제브라피시의 인시투 혼성화 염색의 게놈 및 정량화

In situ hybridization (ISH) is an important technique that enables researchers to study mRNA distribution in situ and has been a critical technique in ...

Using Flow Cytometry to Detect and Quantitate Altered Blood Formation in the Developing Zebrafish

The diversity of cell lineages that comprise mature blood in vertebrate animals arise from the differentiation of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs). This is a critical process that occurs throughout the lifespan of organisms, and disruption of the molecular pathways involved during embryogenesis can have catastrophic long-term consequences. For a multitude of reasons, zebrafish (Danio rerio) has become a model organism to study hematopoiesis. Zebrafish embryos develop externally, and by 7 days postfertilization (dpf) have produced most of the subtypes of definitive blood cells that will persist for their lifetime. Assays to assess the number of hematopoietic cells have been developed, mainly utilizing specific histological stains, in situ hybridization techniques, and microscopy of transgenic animals that utilize blood cell-specific promoters driving the expression of fluorescent proteins. However, most staining assays and in situ hybridization techniques do not accurately quantitate the number of blood cells present; only large differences in cell numbers are easily visualized. Utilizing transgenic animals and analyzing individuals with fluorescent or confocal microscopy can be performed, but the quantitation of these assays relies on either counting manually or utilizing expensive imaging software, both of which can make errors. Development of additional methods to assess blood cell numbers would be economical, faster, and could even be automated to quickly assess the effect of CRISPR-mediated genetic modification, morpholino-mediated transcript reduction, and the effect of drug compounds that affect hematopoiesis on a large scale. This novel assay to quantitate blood cells is performed by dissociating whole zebrafish embryos and analyzing the amount of fluorescently labelled blood cells present. These assays should allow elucidation of molecular pathways responsible for blood cell generation, expansion, and regulation during embryogenesis, which will allow researchers to further discover novel factors altered during blood diseases, as well as pathways essential during the evolution of vertebrate hematopoiesis.

This assay is a simple method to quantitate hematopoietic cells in developing embryonic zebrafish. Blood cells from dissociated zebrafish are subjected to flow cytometry analysis. This allows the detection of blood defects in mutant animals and after genetic modification.

유동 세포형을 사용하여 개발 중인 제브라피시에서 변경된 혈액 형성을 감지하고 양량화합니다.

The diversity of cell lineages that comprise mature blood in vertebrate animals arise from the differentiation of hematopoietic stem and progenitor cells ...

Isolation of the Side Population in Myc-induced T-cell Acute Lymphoblastic Leukemia in Zebrafish

Heterogeneous cell populations, from either healthy or malignant tissues, may contain a population of cells characterized by a differential ability to efflux the DNA-binding dye Hoechst 33342. This "side population" of cells can be identified using flow cytometric methods after the Hoechst 33342 dye is excited by an ultraviolet (UV) laser. The side population of many cell types contains stem- or progenitor-like cells. However, not all cell types have an identifiable side population. Danio rerio, zebrafish, have a robust in vivo model of T-cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL), but whether these zebrafish T-ALLs have a side population is unknown. The method described here outlines how to isolate the side population cells in zebrafish T-ALL. To begin, the T-ALL in zebrafish is generated via the microinjection of tol2 plasmids into one-cell stage embryos. Once the tumors have grown to a stage at which they expand into more than half of the animal's body, the T-ALL cells can be harvested. The cells are then stained with Hoechst 33342 and examined by flow cytometry for side population cells. This method has broad applications in zebrafish T-ALL research. While there are no known cell surface markers in zebrafish that confirm whether these side population cells are cancer stem cell-like, in vivo functional transplantation assays are possible. Furthermore, single-cell transcriptomics could be applied to identify the genetic features of these side population cells.

Here, we describe a technique to isolate the side population cells from a zebrafish model of myc-induced T-cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL). This side population assay is highly sensitive and is described for zebrafish T-ALL, but it may be applicable to other malignant and non-malignant zebrafish cell types.

측면에서 인구의 분리 나 Myc 유도 T 세포 급성 림프 모구 백혈병 제브라 피쉬

Heterogeneous cell populations, from either healthy or malignant tissues, may contain a population of cells characterized by a differential ability to ...

면역학 및 감염병학

<meta charset="utf8"></head><body>재생 및 개발 연구를 위한 강력한 제브라피시 세포 이식

High-resolution Cell Transplantation in Embryonic and Larval Zebrafish

Development and regeneration occur by a process of genetically encoded spatiotemporally dynamic cellular interactions. The use of cell transplantation between animals to track cell fate and to induce mismatches in the genetic, spatial, or temporal properties of donor and host cells is a powerful means of examining the nature of these interactions. Organisms such as chick and amphibians have made crucial contributions to our understanding of development and regeneration, respectively, in large part because of their amenability to transplantation. The power of these models, however, has been limited by low genetic tractability. Likewise, the major genetic model organisms have lower amenability to transplantation. 
The zebrafish is a major genetic model for development and regeneration, and while cell transplantation is common in zebrafish, it is generally limited to the transfer of undifferentiated cells at the early blastula and gastrula stages of development. In this article, we present a simple and robust method that extends the zebrafish transplantation window to any embryonic or larval stage between at least 1 and 7 days post fertilization. The precision of this approach allows for the transplantation of as little as one cell with near-perfect spatial and temporal resolution in both donor and host animals. While we highlight here the transplantation of embryonic and larval neurons for the study of nerve development and regeneration, respectively, this approach is applicable to a wide range of progenitor and differentiated cell types and research questions.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: 발달 및 재생 중 제브라피시 신경계의 세포 연결성 매핑

Here we present a protocol to transplant cells with high spatial and temporal resolution in zebrafish embryos and larvae at any stage between at least 1 and 7 days post fertilization.

배아 및 유충 제브라피시에서의 고분해능 세포 이식

Development and regeneration occur by a process of genetically encoded spatiotemporally dynamic cellular interactions. The use of cell transplantation ...