Name: fish sperm assessment using software and cooling devices
Uploaded: 2018-07-28T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fish Sperm Assessment Using Software and Cooling Devices at JoVE.com

이 프로젝트 비용 협회 로부터 자금 받았다 (음식과 농업 비용 액션 FA1205: AQUAGAMETE, 그리고 유럽 연합의 지평선 2020 연구와 혁신 프로그램 마리 Sklodowska-퀴리 아래 프로젝트 감동 (GA 없음 642893). 우리는 특히 학생에 게는 알베르토 벤드 렐 베르나,이 프로젝트의 비디오 기록에 그의 적극적인 참여에 대 한 PROiSER의 과학 팀에 게 감사 하 고 싶습니다.

절차와 관련 된 동물 주제 되었습니다 승인 (2015/VSC/완두콩/00064) 농업 생산 및 가축 Universitat Politècnica de València에서의 일반적인 방향으로.
1. 포로에서 성숙한 유럽 뱀장어에서 정자 수집
참고: 사용 유럽 장 어 남성 해 수와 일정 온도 (20 ° C)에서 재순환 시스템 탱크에서 유지. (인간의 융 생식 샘 자극 호르몬 (hCG), 물고기 몸 무게의 g 당 1.5 IU) 주간 복 주사를 통해 호르몬 치료. 해 수와 교체 뒤 점차 시작 3 일 민물 물고기 순응 (탱크에서 총 수의 1/3) 37.0 g/mL의 염 분을 도달할 때까지 매 2 일.
<ol><li>더 나은 품질의 정자 샘플을 얻기 위해 호르몬 주사 후 24 h 장 어를 anesthetize.<ol>
<li>사전에 마 취 준비: 70% 에탄올 100ml에 benzocaine의 300 밀리 그램을 추가. 잘 혼합 하 고 4 ° c.에 저장</li>
		<li>60 mg/L의 최종 농도 고 제대로 혼합 시스템 물 5 l 유연한 버킷에서 benzocaine를 희석.</li>
		<li>Benzocaine와 시스템 물 양동이에 물고기를 전송 합니다. 물고기는 진정 될 때까지 몇 분 정도 기다립니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>물으로 음부를 선택을 취소 하 고 정자 샘플 대변, 소변 또는 바닷물의 오염을 피하기 위하여 흡수 성 종이 함께 건조.</li>
	<li>복 부 지역에 부드러운 압력을 적용 하 고 15 mL 플라스틱 튜브 진공 펌프를 사용 하 여 정자 샘플을 수집. 정자 볼륨 남성에 따라 최대 6-7 mL.</li>
	<li>운동 성 분석 실시 될 때까지 적어도 1 시간에 4 ° C에서 정자 샘플을 유지.</li>
</ol>2. 냉동 및 정자 샘플을 희석
<ol><li>Diluter 솔루션을 미리 준비 합니다. 참고: 각 종족에 대 한 특정 extender 솔루션 정자 샘플을 희석 한다.<ol>
<li>장 어 정자 샘플 (P1 매체)에 대 한 비-활성 제 매체를 준비 합니다. 나트륨 중 탄산염, 염화 나트륨, 염화 마그네슘, 염화 칼륨 및 증류수 250 mL를 염화 칼슘의 0.037 g 0.56 g의 0.127 g의 1.828 g의 0.42 g을 추가 합니다. 믹스 잘 분해 하. 4 ° c.에 게</li>
	</ol>
</li>
	<li>일정 한 온도에서 샘플을 유지 하기 위해 4 ° C에서 쿨러 블록을 설정 합니다. 온도 안정화 될 때까지 기다립니다.</li>
	<li>사용 하 여 각 종족에 대 한 diluter 솔루션 특정 정자 샘플을 희석. 참고: 희석 비율 특정 종족 이며, 표준화 프로토콜을 정의 합니다. 첫째, 정자 농도 3, 4 단계에 설명 된 대로 소프트웨어를 사용 하 여 운동 성의 사전 분석에서 얻은 농도에 따라 예상 됩니다. 이 분석, 그것은 또한 운동 성의 비율에 따라 최고의 정자 샘플을 선택할 수입니다. 이 후, 연구원 최고의 샘플을 사용 하 여 정확한 농도와 실험에 대 한 데이터 수집을 시작할 수 있습니다.<ol>
<li>1시 50분의 비율로 P1 매체에서 장 어 정자 샘플을 희석. 500 µ L 희석 장 어 정자의 준비, 신선한 정자 샘플의 50 µ L과 p 1의 450 µ L를 추가 합니다. 잘 믹스.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 평가 정자 운동 성 매개 변수
<ol><li>
설정 소프트웨어의 운동 성 모듈
	<ol>
<li>4 ° C에서 쿨러 무대를 설정 하 고 안정 될 때까지 기다립니다.</li>
		<li>소프트웨어를 오픈 하 고 운동 성 모듈을 선택 합니다. 필요한 경우 사용자 이름 및 암호를 만듭니다.</li>
		<li>속성 을 선택 하 고 정자 분석을 시작 하기 전에 원하는 매개 변수를 선택 합니다.<ol>
<li>종 클릭 | 물고기.</li>
			<li>각 종족에 대 한 최고의 기술 조건에 따라 초당 프레임 및 이미지 번호를선택 합니다. 초당 120 이미지에서 두 옵션을 설정 합니다.</li>
			<li>네거티브 대비를 선택 합니다. 그것은 정 충 궤도16의 정확한 개조에 대 한 필수입니다.</li>
			<li>해당 계산 챔버 와 비디오 카메라의 규모 를 선택 합니다. 실험에 사용 된 확대 렌즈에 대 한 비디오 카메라를 보정. 세 실으로 SpermTrack10 및 10 X 규모를 설정 합니다. 참고: 일반적으로, 세 실에서 10 µ m의 깊이 10 X의 확대 렌즈는 권장된 조건 때문에 그들은 모든 정 충의 더 나은 초점을 제공 하 고 세포의 가장 높은 번호를 캡처. 그러나, 각 종족의 운동 성 분석에 대 한 최적의 조건의 이전 연구를 확인 하는 것이 좋습니다.</li>
			<li>각 종족에 대 한 입자 영역 및 연결 을 조정 합니다. 2 µ m2 와 7 µ m에서 연결 최소 입자 영역을 설정 합니다. 참고: 물고기, 2-5 µ m, 연결 사이 입자 영역 범위의 최소 값에 따라 다릅니다 정 충 속도 및 프레임 속도.</li>
			<li>설정을 저장 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>캡처를 선택 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
소프트웨어와 함께 유럽 장 어 정자를 분석
	<ol>
<li>25 ml 증류수 2 %BSA 상업 소금 0.946 g를 추가 하 여 활성 솔루션 (인공 해 수)를 준비 합니다.</li>
		<li>활성 솔루션 (인공 해 수)의 500 mL 고 쿨러 블록에. 참고: 일반적으로, 생선 정자 활성화 됩니다 삼투성 충격 이벤트, 일부 수 종에 대 한 이온 농도 또한 중요할 수 있지만. 담 수 종, 활성 매체 있어야 당뇨 osmolality 동안 해양 종 매체 고 해야 합니다.</li>
		<li>냉각 단계 아래 세 챔버를 넣고 온도 4 ° c.에 안정화 될 때까지 기다립니다</li>
		<li>활성 제와 희석된 정자 정 충을 활성화 하 고 운동 성 비디오 활성화 후 5-10 s 사이 녹화 시작을 섞는다.<ol>
<li>세 실에서 활성 솔루션 및 장소 4 µ L를 가져가 라.</li>
			<li>부드럽게 정 충 세포에 손상을 방지 하는 microcentrifuge 3 번 흔들어 희석된 정자 균질.</li>
			<li>희석의 0.5 µ L를가지고, 활성기를 함께 혼합 하 고 신속 하 게 계산 챔버에 커버를 넣어. 참고:이 단계 5 개 이상 걸리지 않을 겁니다 최대한 빨리 분석을 시작 하는 s.</li>
			<li>정 충 세포에 집중 하 고 최고의 시각적 영역, 정 충 (150 ~ 200 셀)을 피하기 위해 셀 (보충 그림 1A) 사이의 차단의 낮은 수에 의해 정의 됩니다. 속도 따라 구분 되는 정 충 트랙을 캡처 비디오 를 선택 합니다.</li>
			<li>결과에서 낮은 변화 하기 전에 진행 하는 최적의 간격을 3 ~ 7 필드를 캡처 를 선택 합니다. 세 실의 표지에 응축을 피하기 위하여 120 s 후 정품 인증까지 기록 영화.</li>
			<li>출구 는 모든 분야의 일반적인 보기를 선택 합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 운동 데이터를 얻기
<ol><li>필드를 선택 | 부분 | 저장 파일 이름을 선택 하 고. 저장을 클릭 합니다. 참고: 스프레드시트 부분 데이터, 차트 및 정 충 트랙의 이미지의 평균값을 제공합니다.</li>
	<li>일반 데이터 선택 | 파일 이름 | 저장. 참고: 데이터를 개별 정 충의 모든 필드에 대 한 운동 값을 제공합니다.</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

이 프로토콜에서 사용 하는 정자 분석 소프트웨어 사용 되었습니다 연구자에 의해 전세계 물고기를 포함 하 여 다른 종족에 대 한. 그러나, 생선 몇 가지 특정 기능을 정자 평가 영향을 미칠 수 있다. 물고기 정 충 신속 하 게 거부 하 고 활성화 후 운동 성의 짧은 시간에 지도 활성화의 순간에 높은 속도 보여주었다. 게다가, 재생산의 온도 종 종속적 이며, 어떤 경우에 약 4 ° C2,4,,812수 있습니다. 따라서, 그것은 생선 정자 분석을 위한 컴퓨터 시스템의 효율성을 개선 하기 위해 몇 가지 적응을 만들 필요가 있다. 운동 성 매개 변수의 기본 원리 수집 및 운동 정 충의 연속 이미지의 분석 이다. 대부분의 시스템 하드웨어 및 소프트웨어17,,1819,20,,2122의 제한으로 인해 표준 프레임 속도 (16, 25, 30, 50 또는 60 프레임)을 사용합니다. 그러나, 일부 연구는 더 높은 프레임 속도 증가 VCL, STR, 같은 몇 가지 속도 매개 변수를 보여 BCF15,,2324. 정 충의 hyperactivation를 평가 하 고 정 충11,17,,1819, 의 최대 속도 찾을 필요가 있을 때 이것은 특히 중요 하다 25. 분석의 온도 관하여 광학 현미경 샘플 일정 온도에서 냉장 보관 하는 새로운 기술에 대 한 냉각 판 수 또한 분석 시간이 지나면서 개선. 현재 작업 2 생선 정자 운동 성 분석 및 온도 감와 관련 된 주요 문제를 해결 하는 방식을 제공 합니다. 정품 인증 매체 각 종족에 대 한 적응 해야 하지만 몇 가지 담 수 종에 초점을 맞추고 결과도 불구 하 고이 방법론 해양 종, 사용 수 있습니다.
시장에서 제품의 범위 또는 동일한 제품의 다른 버전이 있다. 시스템은 동일한 원리를 할 수 있습니다, 경우에 각자 다른 세부 결과 결과26,,2728의 비 호환성에 있다. 게다가, 생선 정자 품질 평가 수 여전히 제한이 방법론 및 기술. 활성화 후 분석 시간과 정자 활성화 기술 정자 품질 평가29,30에 영향을 주는 두 가지 필수 요소가 있습니다. 비디오 녹화에 대 한 이미지의 안정화와 정자 샘플의 활성화 사이의 시간 약 5 해야 첫 번째 초 (5-20 s의 시간 간격)부터 s 가장 유용한 데이터2,4를 제공 합니다. 정자 분석의 시간 유리 슬라이드에 응축 문제 때문에 제한 될 수 있습니다. 그러나, 물고기 정 충 활성 상태로 유지는 활발 한 움직임으로 미만 2 분2. 기술 수준에서 "최적의" 프레임 속도 정 충 궤적15의 정확한 개조를 제공 하는 세부 정보를 알 필요가 있다. 낮은 프레임 속도에서 더 높은 프레임 속도, 정보 중복15,31된다 반면 궤적의 세부 특히 신속 하 고 비선형 정 충에 대 한 손실 됩니다. 일부 어 종에 대 한 프레임 속도 (최대 250 fps) 충분히 Grayling, 연어 등 일부 어 종에 대 한 정 충의 최대 속도 찾을 수 없습니다. 이 변화는 특정 종 고 프로토콜을 표준화 하 고 신뢰할 수 있는 결과15,,2324에 각 종에 대해 정의 해야 합니다. 세 실의 깊이 물고기의 큰 생물체의 움직임을 제한할 수 있습니다 하 고는 정 충은 최대 속도11,,3233를 도달 하지 못했습니다. 게다가, 소프트웨어 있을 수 있습니다 몇 가지 제한 사항이 실제 정 충의 검출에 있을 때 셀의 교차로.
정자 품질의 클래식 평가 농도의 추정과 운동 성, 결과에 변화를 생산할 수 있는의 비율에 따라 주관적인 분석입니다. 그러나, 컴퓨터 시스템 운동 매개 변수의 신속, 정확 하 고 양적 측정을 제공합니다. 이 객관적인 분석 데이터의 큰 금액을 제공 하 고 결과34,35,,3637의 가변성을 감소 시킨다. 정자 운동 성 행동의 응답 분석의 온도에 따라 달라 집니다 그리고 종38,,3940마다 다릅니다. 정자 분석의 최적의 온도 정자 속도 복제38,40의 자연 조건에 비슷한 운동 기간의 기간 제공할 수 있습니다. 따라서, 냉각 장치를 가진 정자 분석 소프트웨어 물고기 정자 품질 평가 향상 시킵니다.
정자 품질 분석 결과 생선 정자 특성 및 모든 동물 종41,42에 정자 평가 미래 수 있는 정자 모집단에 따라 품질에 대 한 지식을 향상 시킬 수 있습니다. 실용적인 수준에서이 기술은 높은-품질 사육 및 선정 과정, 인공 수정, 정자 경쟁 속도 누진세에 따라 정액 복용량 계산 정자에 대 한 더 많은 정보를 얻을 하는 데 도움이의 지표 수 및 불 임 가능성입니다. 이 모든 지식은 물고기 정자 저장에 대 한 관심 및 마지막 십 년간2,13cryopreservation 자극 양식 및 보존 프로그램을 포함 하는 다른 연구 분야에 적용할 수 있습니다. 독성 효과 또한 지 고 특별 한 관심 때문에 연구 뿐만 아니라 환경 문제, 정자 운동 성 특성43,44에 기반한 phylogenetical 연구 개발.
이 작품은 생선 정자 운동 성 분석을 위한 자동 소프트웨어의 최적화 결과 향상 하는 방법을 보이고 있다. 프로토콜의 표준화 분석 및 종에 따라 다를 수 있는 프레임 속도의 온도 계정에 취해야 합니다. 그러나, 물고기 정자 운동 성 분석 연구원에 주의 기울여야 한다 2 개의 중요 한 단계가 있다. 정자 컬렉션은 대변, 소변 및 물 오염으로 인해 샘플을 파괴할 수 있는 중요 한 첫걸음 이다 (해 수 또는 담 수). 다른 중요 한 포인트는 정자 활성화의 순간과 비디오 녹화의 시작에 연결 됩니다. 이 단계는 정 충은 활발 한 움직임을가지고 하는 경우 데이터 수집을 가능 한 한 빨리 이루어져야 한다.

생식의 효능 두 gametes (계란과 정자)1,2의 품질에 따라 달라 집니다. 이 성공적인 수정, 허용 가능한 자손3,4의 개발에 기여 하는 주요 요소입니다. 배우자 품질의 편리한 평가 표본의 불 임 가능성을 정의 하기 위한 최고의 도구입니다.
여러 남성에서 정자를 혼합 많은 수생 상업 종4의 생산에 있는 관행 이다. 그러나, 남성 사이 정자 가변성 정자 경쟁으로 이어질 수 있습니다 그리고, 따라서, 모든 남성 동등에 기여 하는 유전자5. 이런이 의미에서 개별 정액/정 충 등의 기능 운동, 올바른 평가 잠재적인 개별 남성 불 임에 대 한 차별적인 정보를 얻기 위해 기본적 이다. 정자의 운동 성의 직접 관찰 시간과 경험, 일관성의 부족, 결과6,7의 호환성 요구 하는 때 부정확 하 고 주관적인 데이터를 생성할 수 있습니다. 그러나, 믿을 수 있는 정자 품질 분석2,4를 제공할 수 있는 많은 혁신적이 고 신속한 양적 기술이 있다.
컴퓨터 기반 정자 분석 정자 품질8에 대 한 정확한 데이터를 제공 하기 위해 개발 되었다. 이 기술은 위상 대비 현미경 정자 운동 성 평가 수와 관련 된 소프트웨어의 개발을 포함 합니다. 그러나, 운동 성 매개 변수의 제한 요소 비디오 카메라의 프레임 속도입니다. 개별 정 충 정 충을 기반으로하는 궤도 머리 중심 위치 연속 프레임에서 비디오 녹화의 flagellar 운동 패턴3,,910, 와 상관 11. 주요 운동 매개 변수 측정은 직선 속도 (VSL), 곡선 속도 (VCL)와 평균 경로 속도 (VAP). VSL 시작과 끝점 시간으로 나눈 정 충에 의해 촬영 사이의 거리입니다. 소스는 정 충에 의해 정확한 궤적을 따라 실제 속도입니다. VAP 궤적의 파생된 매끄러운된 경로 따라 속도입니다. 이러한 매개 변수는 선형성 (린), 직진도 (STR), 동요 (WOB) 및 측면 머리 운동 (ALH)와 비트 크로스 주파수 (BCF)4,10의 진폭 같은 박동 측정을 포함 한 추가 운동 정보를 수 있습니다.
정자 분석 시스템은 원래 포유류 종, 사용 되 고 시스템에 대 한 요구 사항 중 하나는 기증자 (약 37 ° C)의 온도에서 동작 하는 것입니다. 물고기 종;이 소프트웨어를 사용하실 수 있습니다. 비록, 그것은 정자 분석 결과의 오류를 줄이기 위해 몇 가지 적응을 만들 필요가 있다. Salmonids 등 장 어8,12, 일부 어 종에 수정 낮은 온도 (약 4 ° C)2,4에 발생합니다. 따라서, 냉각 장치 불편 한 작업 조건을 피하기 위해 개발 되어야 한다. 또한, 물고기 정 충은 정액에서 운동 하 고는 삼투성 충격 운동 성 활성화에 필요한. 담 수 종, 활성 매체 있어야 당뇨 osmolality 동안 해양 종 매체 고 해야 합니다. 그러나, 일부 종 salmonids로 이온 농도 또한 수 있습니다 중요 한3,,49. 활성화 후 생선 정자 운동 성 (2 분 미만)13,14 및 신뢰할 수 있는 데이터15를 최적의 프레임 속도 결정 하는 중요 한 되 고 높은 속도의 급속 한 감소에 의해 특징입니다.
이 연구의 목표는 디자인 생선 정자 샘플에 대 한 냉각 시스템을 적용 하는. 또한,이 프로토콜에는 종에 따라 표준 프로토콜의 설립에 대 한 최적의 프레임 속도 확인 하는 방법을 정의 합니다. 이 프로토콜을 사용 하는 모델로 유럽 장 어를 사용 하 여 물고기 정액 평가의 맥락에서 새로운 문을 엽니다.

<table><tbody><tr><td>Human Chorionic Gonadotropin</td><td>Argent Chemical Laboratories</td><td>hCG</td><td>Hormone</td></tr><tr><td>Benzocaine</td><td>Merck</td><td>E1501 Sigma</td><td>Anesthesia</td></tr><tr><td>sodium bicarbonate</td><td>Merck</td><td>S5761 Sigma&amp;nbsp;</td><td>P1 medium</td></tr><tr><td>sodium chloride</td><td>Merck</td><td>1.06406 EMD Millipore</td><td>P1 medium</td></tr><tr><td>magnesium chloride</td><td>Merck</td><td>1374248 USP</td><td>P1 medium</td></tr><tr><td>potassium chloride</td><td>Merck</td><td>P3911-500G</td><td>P1 medium</td></tr><tr><td>calcium chloride</td><td>Merck</td><td>C7902-500G</td><td>P1 medium</td></tr><tr><td>commercial salt</td><td>Aqua Medic&amp;nbsp;</td><td>Meersalz</td><td>Activator solution&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Merck</td><td>05470 Sigma</td><td>Activator solution&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Falcon tubes 15 ml</td><td>Merck</td><td>T1943-1000EA</td><td></td></tr><tr><td>Falcon tubes support</td><td>Merck</td><td>R5651-5EA</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorfs</td><td>Merck</td><td>T9661-1000EA</td><td></td></tr><tr><td>Micropipet 20 &amp;micro;l</td><td>Gilson</td><td>PIPETMAN&amp;reg; Classic</td><td></td></tr><tr><td>Micropipet 10 &amp;micro;l</td><td>Merck</td><td>Z683787-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Tips for micropipets 20 &amp;micro;l</td><td>Merck</td><td>Z740030-1000EA</td><td></td></tr><tr><td>Tips for micropipets 10 &amp;micro;l</td><td>Merck</td><td>Z740028-2000EA</td><td></td></tr><tr><td>Spermtrack</td><td>PROiSER</td><td>Counting chamber</td><td></td></tr><tr><td>TruMorph</td><td>PROiSER</td><td>TruMorph</td><td></td></tr><tr><td>Microscope UB 200i Serie</td><td>PROiSER</td><td>Microscope</td><td></td></tr><tr><td>Cooler plate</td><td>PROiSER</td><td></td><td>Prototype</td></tr><tr><td>Cooler block</td><td>PROiSER</td><td></td><td>Prototype</td></tr><tr><td>ISAS v1</td><td>PROiSER</td><td>ISAS</td><td>Software</td></tr></tbody></table>

fish sperm assessment using software and cooling devices

배우자 품질 평가 대 한 양식 업에 대 한 유용한 데이터를 제공할 수 있는 혁신적이 고 빠른, 양적 기술이 있다. 정자 분석을 위한 전산화 시스템 여러 매개 변수를 측정 하기 위해 개발 되었다 이며 가장 일반적으로 측정의 한 정자 운동 성.
처음, 그것은 또한 물고기 정자 분석에 사용할 수 있지만이 컴퓨터 기술 포유류 종, 위해 설계 되었습니다. 물고기는 정자 평가 짧은 운동 시간 활성화 후, 경우에 따라 낮은 온도 적응에 영향을 미칠 수 있는 특정 기능을가지고 있습니다. 따라서, 그것은 보다 효율적으로 운동 성 분석 생선 정자 분석을 위한 소프트웨어 및 하드웨어 구성 요소를 수정 하는 데 필요한입니다. 포유류 정자에 대 한 난방 격판덮개는 정 충의 최적의 온도 유지 하는 데 사용 됩니다. 그러나, 일부 어 종에 대 한 그것은 유리를 사용 하 여 낮은 온도 때문에 정자 2 분 미만 대 한 활성 상태로 유지 운동의 기간을 연장. 따라서, 냉각 장치는 일정 온도에서 샘플 분석, 광학 현미경에 포함 하 여의 시간 동안 냉장 보관 하는 데 필요한. 이 프로토콜 물고기 정자 운동 성 정자 분석을 위한 소프트웨어를 사용 하 여 및 새로운 냉각 장치를 최적화 하는 결과의 분석을 설명 합니다.

정자의 운동 성에 시간 효과의 분석
유럽 장 어의 경우 정적 정 충의 비율 15에서 증가 120 s s 후 활성화 (24.4%에서 40.7%), 그리고 모바일 진보적인 정 충의 비율 감소 (36.9%에서 20.9%) (그림 1A 그리고 1B). 속도에 따라, 정 충 세포 감소 (그림 1C 및 1d) 시간이 지남에 속도 감소를 보였다. 빠른 속도와 정 충의 비율 (26.6% 49.4%)에서 약 23% 감소 하 고 정 충 중간 속도 비율이 약 7% 증가.
프레임 속도 계산 챔버의 효과
다른 종 최적의 결과 대 한 다른 프레임 속도 필요합니다. 러시아 철갑 상어 필요 150 초당 프레임 (fps; 그림 2A). 일반적인 잉어 필요 100 fps (그림 2B). 그리고 grayling, 200 fps 아니었다 최적의 운동 결과 (그림 2C)를 얻기 위해 충분 한. 이러한 결과 계산의 깊이에 의존 했다 챔버 시험 (그림 2A-2 C).
정자 모집단 구조
정자 부분 모집단의 식별은 통계 분석을 기반으로 합니다. 첫 번째 단계는 교장의 결정 요소 (주성분 분석; PCA) 운동 데이터의 완전 한 세트에서. 다음, 클러스터링 절차는 PCA 후 얻은 정자 파생 된 인덱스와 함께 수행 됩니다.
이 연구를 위해 사용 하는 명명 된 4 개의 다른 모집단을 보여주는 대서양 연어 정자: 비선형 속도 (낮은 린 STR, VCL), 비선형 (낮은 STR, 높은 VCL), 빠른 빠른 선형 (높은 린, STR과 VCL)와 빠른 선형 (높은 린, STR, VCL). 야생 동물에서 세대 따라 다양 한 이러한 모집단의 분포를 농장 것 (그림 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56823/56823fig1.jpg"> 그림 1 : 누진세에 유럽 장 어 정자의 운동 성 시간 후 활성화의 효과. A와 B) 15 및 120 s 누진세의 비율 각각; 그리고 C와 D) 시간이 지남에 속도에 기반 하는 운동 성의 백분율 (15 및 120 s 후 활성화, 각각). 누진세는 3 명 그룹에서 분할 되었다: 진보적인 운동 세포 (화이트; VCL ± SD 값 의미: 114.5 ± 18.2 및 101.4 34.5 ± µ m/s 15와 120 s 각각), 진보적인 운동 셀 (회색; VCL ± SD 값 의미: 84.8 17.4 ± µ m/s 15 s와 120 84.6 ± 16.5 µ m/s s), 그리고 정적 정 충 (블랙). 정 충 속도 4 그룹으로 분할 되었다: 급속 한 (VCL ± SD 값 의미: 119.3 ± 13.7 µ m/s 15 s와 120 118.9 ± 13.3 µ m/s s; 화이트), 중간 (VCL ± SD 값 의미: 79.7 ± 15.5 15 s와 79.6 ± 15.5 µ m/s 120 µ m/s s; 밝은 회색) 느린 (VCL ± SD 값 의미: 32.9 ± 6.5 µ m/s 15 s와 120 32.6 ± 6.6 µ m/s s; 어두운 회색)과 정적 (블랙). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56823/56823fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56823/56823fig2.jpg"> 그림 2 : 프레임 속도 3 민물 어 종에 세 챔버의 효과: (A) 러시아 철갑 상어 (B) 일반적인 잉어와 Grayling (C). 50, 100, 150에서 정자 분석 되었다 200 프레임, 2 개의 상업적인 계산을 사용 하 여 다른 깊이 (10와 20 µ m)와 챔버와. 검은 동그라미는 각 종족에 대 한 최고의 프레임 속도를 나타냅니다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56823/56823fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56823/56823fig3.jpg"> 그림 3 : 대서양 연어의 3 세대의 정자 모집단 구조: 야생 남성 (F0), 및 포로 (F1, F2)에서 생산 하는 첫 번째 2 세대. 클러스터 분석 후, 4 개의 모집단 관찰 했다: 느린 비선형 정 충 (린, STR 및 소스; 클러스터 1; 블랙), 비선형 정 충 (낮은 STR, 높은 VCL, 클러스터 2, 어두운 회색) 빠른, 빠른 선형 정 충 (높은 린, STR과 VCL; 3; 클러스터 중간 회색) 및 빠른 선형 정 충 (린, STR, 높고 VCL; 클러스터 4, 밝은 회색). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56823/56823fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Supplemental Figure 1" src="/files/ftp_upload/56823/56823figsup1.jpg"> 보충 그림 1. (A) 최고 및 셀 농도 (B) 최악의 유럽 장 어 정자의 운동 성 분석에서 다른 시각 영역. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56823/56823figsup1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Fish Sperm Assessment Using Software and Cooling Devices at JoVE.com

Fish Sperm Assessment Using Software and Cooling Devices

현재 프로토콜 물고기 정자 평가 정자 컴퓨터 기반 분석을 사용 하 여 및 냉각 장치에의 한 절차를 설명 합니다. 소프트웨어는 신속, 정확 및 재생산 성공을 개선 하 양식 업에 유용한 도구가 될 수 있는 정 충 운동에 따라 생선 정자 품질의 정량 분석을 제공 합니다.

생선 정자 평가 소프트웨어를 사용 하 여 및 냉각 장치

For gamete quality evaluation, there are innovative, rapid, and quantitative techniques that can provide useful data for aquaculture. Computerized systems ...

fish-sperm-assessment-using-software-and-cooling-devices

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

8.7K 조회수.  PROiSER R+D S.L.. 현재 프로토콜 물고기 정자 평가 정자 컴퓨터 기반 분석을 사용 하 여 및 냉각 장치에의 한 절차를 설명 합니다. 소프트웨어는 신속, 정확 및 재생산 성공을 개선 하 양식 업에 유용한 도구가 될 수 있는 정 충 운동에 따라 생선 정자 품질의 정량 분석을 제공 합니다.

비디오: Fish Sperm Assessment Using Software and Cooling Devices

Handling and Treatment of Male European Eels (Anguilla anguilla) for Hormonal Maturation and Sperm Cryopreservation

During the last years, several research groups have been working on the development and improvement of new protocols for the European eel handling and maturation. As of yet, weekly injections of human chorionic gonadotropin (hCG) have proved to maturate males after just 5-6 weeks of treatment, producing high volumes of high-quality sperm during several weeks. In addition, sperm cryopreservation protocols using different extenders, cryoprotectants and cooling and thawing times have been previously described for European eel. Here, we show that Tanaka&#180;s extender solution can be directly used for fertilization or for cryopreservation, making unnecessary the usage of different types of solutions and dilutions. Furthermore, the use of methanol as a cryoprotectant makes this protocol easy to use as methanol has low toxicity and does not activate the sperm. The sperm does not need to be cryopreserved immediately after the addition of the cryoprotectant, and it can be used long after being thawed. Moreover, sperm motility is still high after thawing although it is lower than that of fresh sperm. The aim of this work is to show the best available protocol for European eel handling, maturation, and sperm cryopreservation.

Handling and Treatment of Male European Eels Anguilla anguilla for Hormonal Maturation and Sperm Cryopreservation

Protocols for European eel maturation and sperm cryopreservation have been improved over the last years. This article describes the best protocol available using human chorionic gonadotropin (hCG) for inducing maturation and methanol as cryoprotectant.

처리와 치료의 남성 유럽 뱀장어 (앵귈라 앵귈라) 호르몬 성숙 및 정자 Cryopreservation

During the last years, several research groups have been working on the development and improvement of new protocols for the European eel handling and ...

연구

발생학

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to the original protocol that both streamline the procedure and increase sample uniformity.  First, we normalize all sperm volumes using freezing media that does not contain the cryoprotectant. Second, cryopreserved sperm are stored in cryovials instead of capillary tubes.  The rates of sperm freezing and thawing (&delta;&deg;C/time) are probably the two most critical variables to control in this procedure.  For this reason, do not substitute different tubes for those specified.  Working in teams of 2 it is possible to freeze the sperm of 100 males per team in ~2 hrs.  Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility (measured as the number of viable embryos generated in an in vitro fertilization divided by the total number of eggs fertilized) and this percent fertility is stable over many years.

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a high-throughput sperm cryopreservation protocol for zebrafish. Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility in subsequent vitro fertilization and is stable over many years.

높은 처리량 Zebrafish의 정자 Cryopreservation에 대한 방법과 체외에서 수정

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to ...

생물학

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic process in the parents. In human males, these errors can lead to the production of spermatozoa with numerical chromosome abnormalities which represent an increased risk of transmitting these anomalies to the offspring.
For this reason, the technique of fluorescence in situ hybridization (FISH) on sperm nuclei has become a protocol widely incorporated in the context of clinical diagnosis. This practice provides an estimate of the frequencies of numerical chromosome abnormalities in the gametes of the patients that seek for genetic reproductive advice.
To date, the chromosomes most frequently included in sperm FISH analysis are chromosomes X, Y, 13, 18 and 21.
This video-article describes, step by step, how to process and fix a human semen sample, how to decondense and denature the sperm chromatin, how to proceed to obtain sperm FISH preparations, and how to visualize the results at the microscope. Special remarks of the most relevant steps are given to achieve the best results.

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

This video-article describes, step by step, how to process a semen sample to achieve good-quality fluorescence in situ hybridization on human spermatozoa. Preparations obtained can be used for aneuploidy screening in the context of clinical diagnosis.

형광 현장에서</em인간의 정자에서> 하이브리드화 (물고기) 프로토콜

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

Fluorimetric Techniques for the Assessment of Sperm Membranes

Standard spermiograms describing sperm quality are mostly based on the physiological and visual parameters, such as ejaculate volume and concentration, motility and progressive motility, and sperm morphology and viability. However, none of these assessments is good enough to predict the semen quality. Given that maintenance of sperm viability and fertilization potential depends on membrane integrity and intracellular functionality, evaluation of these parameters might enable a better prediction of sperm fertilization competence. Here, we describe three feasible methods to evaluate sperm quality using specific fluorescent probes combined with fluorescence microscopy or flow cytometry analyses. Analyses assessed plasma membrane integrity using 4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) and propidium iodide (PI), acrosomal membrane integrity using fluorescein isothiocyanate-conjugated Pisum sativum agglutinin (FITC-PSA) and mitochondrial membrane integrity using 5,5&#39;,6,6&#39;-tetra-chloro-1,1&#39;,3,3&#39;-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine iodide (JC-1). Combinations of these methods are also presented. For instance, use of annexin V combined with PI fluorochromes enables assessing apoptosis and calculating the proportion of apoptotic sperm (apoptotic index). We believe that these methodologies, which are based on examining spermatozoon membranes, are very useful for the evaluation of sperm quality.

Here, we present methodologies to evaluate spermatozoan membrane integrity, a cellular feature associated with sperm fertilization competence. We describe three techniques for the fluorimetric assessment of sperm membranes: simultaneous staining with specific fluorescent probes, fluorescence microscopy, and advanced sperm-dedicated flow cytometry. Examples of combining the methodologies are also presented.

정자 세포 막의 평가 대 한 Fluorimetric 기법

Standard spermiograms describing sperm quality are mostly based on the physiological and visual parameters, such as ejaculate volume and concentration, ...

Two Types of Assays for Detecting Frog Sperm Chemoattraction

Sperm chemoattraction in invertebrates can be sufficiently robust that one can place a pipette containing the attractive peptide into a sperm suspension and microscopically visualize sperm accumulation around the pipette1. Sperm chemoattraction in vertebrates such as frogs, rodents and humans is more difficult to detect and requires quantitative assays. Such assays are of two major types - assays that quantitate sperm movement to a source of chemoattractant, so-called sperm accumulation assays, and assays that actually track the swimming trajectories of individual sperm.
Sperm accumulation assays are relatively rapid allowing tens or hundreds of assays to be done in a single day, thereby allowing dose response curves and time courses to be carried out relatively rapidly. These types of assays have been used extensively to characterize many well established chemoattraction systems - for example, neutrophil chemotaxis to bacterial peptides and sperm chemotaxis to follicular fluid. Sperm tracking assays can be more labor intensive but offer additional data on how chemoattractancts actually alter the swimming paths that sperm take. This type of assay is needed to demonstrate the orientation of sperm movement relative to the chemoattrractant gradient axis and to visualize characteristic turns or changes in orientation that bring the sperm closer to the egg.
Here we describe methods used for each of these two types of assays. The sperm accumulation assay utilized is called a "two-chamber" assay. Amphibian sperm are placed in a tissue culture plate insert with a polycarbonate filter floor having 12 &mu;m diameter pores. Inserts with sperm are placed into tissue culture plate wells containing buffer and a chemoatttractant carefully pipetted into the bottom well where the floor meets the wall (see Fig. 1). After incubation, the top insert containing the sperm reservoir is carefully removed, and sperm in the bottom chamber that have passed through the membrane are removed, pelleted and then counted by hemocytometer or flow cytometer.
The sperm tracking assay utilizes a Zigmond chamber originally developed for observing neutrophil chemotaxis and modified for observation of sperm by Giojalas and coworkers2,3. The chamber consists of a thick glass slide into which two vertical troughs have been machined. These are separated by a 1 mm wide observation platform. After application of a cover glass, sperm are loaded into one trough, the chemoattractant agent into the other and movement of individual sperm visualized by video microscopy. Video footage is then analyzed using software to identify two-dimensional cell movements in the x-y plane as a function of time (xyt data sets) that form the trajectory of each sperm.

Eggs and the extracellular coatings around eggs frequently release peptides, proteins and small molecules that communicate with sperm to guide them to the egg thereby promoting fertilization. Using frog sperm we describe and compare two classes of assays used to detect sperm chemoattraction &#x2013; sperm accumulation assays and sperm tracking assays.

감지 개구리 정자 Chemoattraction에 대한 Assays 두 종류의

Sperm chemoattraction in invertebrates can be sufficiently robust that one can place a pipette containing the attractive peptide into a sperm suspension ...

Cryopreservation of Zebrafish Spermatogonia by Whole Testes Needle Immersed Ultra-Rapid Cooling

Current trends in science and biotechnology lead to creation of thousands of new lines in model organisms thereby leading to the necessity for new methods for safe storage of genetic resources beyond the common practices of keeping breeding colonies. The main purpose of this study was to adapt the needle immersed vitrification (NIV) procedure to cryopreserve whole zebrafish testes. Cryopreservation of early-stage germ cells by whole testes NIV offers possibilities for the storage of zebrafish genetic resources, especially since after transplantation they can mature into both male and female gametes. Testes were excised, pinned on an acupuncture needle, equilibrated in two cryoprotective media (equilibration solution containing 1.5 M methanol and 1.5 M propylene glycol; and vitrification solution containing 3 M dimethyl sulfoxide and 3 M propylene glycol) and plunged into liquid nitrogen. Samples were warmed in a series of three consequent warming solutions. The main advantages of this technique are (1) the lack of spermatozoa after digestion of warmed testes thus facilitating downstream manipulations; (2) ultra-rapid cooling enabling the optimal exposure of tissues to liquid nitrogen therefore maximizing the cooling and reducing the required concentration of cryoprotectants, thereby reducing their toxicity; (3) synchronous exposure of several testes to cryoprotectants and liquid nitrogen; and (4) repeatability demonstrated by obtaining viability of above 50% in five different zebrafish strains.

The main purpose of this study was to adapt the needle immersed vitrification (NIV) procedure to cryopreserve whole zebrafish testes. Additionally, the repeatability of the method in five different zebrafish strains was tested.

Zebrafish Spermatogonia 전체 Testes 바늘의 cryopreservation 몰입 울트라-빠른 냉각

Current trends in science and biotechnology lead to creation of thousands of new lines in model organisms thereby leading to the necessity for new methods ...

Sperm Collection of Differential Quality Using Density Gradient Centrifugation

In sexual reproduction, a male gamete or sperm cell fuses with a female gamete to bring about fertilization. However, a large number of sperm cells with fertilizing ability are required to interact with a female gamete to ensure fertilization. As such, the fertilizing ability of individual sperm cells is critical for successful reproduction. Density gradient centrifugation has been utilized for several decades as a reproducible, fast, efficient, effective and extremely adaptable method to collect only high-quality sperm to be used in assisted reproductive technology. The protocols we described herein focus on the utilization of the discontinuous Percoll density gradient centrifugation (PDGC) technique to isolate three distinct populations of rooster sperm by their quality. We were able to collect low-, medium- and high-quality sperm. We also describe reproducible protocols that entail determining fertility potential of sperm by assessing their viability, mobility and penetrability. Collection of sperm by their quality using PDGC technique would be useful to accurately and thoroughly characterize sperm with differential fertility potential.

In this paper, we aim to describe the performance of the density gradient centrifugation technique and its application in sperm physiology research.

조밀도 기온 변화도 원심 분리를 사용 하 여 차동 품질의 정자 컬렉션

In sexual reproduction, a male gamete or sperm cell fuses with a female gamete to bring about fertilization. However, a large number of sperm cells with ...

Functional Assessment of Kinesin-7 CENP-E in Spermatocytes Using In Vivo Inhibition, Immunofluorescence and Flow Cytometry

In eukaryotes, meiosis is essential for genome stability and genetic diversity in sexual reproduction. Experimental analyses of spermatocytes in testes are critical for the investigations of spindle assembly and chromosome segregation in male meiotic division. The mouse spermatocyte is an ideal model for mechanistic studies of meiosis, however, the effective methods for the analyses of spermatocytes are lacking. In this article, a practical and efficient method for the in vivo inhibition of kinesin-7 CENP-E in mouse spermatocytes is reported. A detailed procedure for testicular injection of a specific inhibitor GSK923295 through abdominal surgery in 3-week-old mice is presented. Furthermore, described here is a series of protocols for tissue collection and fixation, hematoxylin-eosin staining, immunofluorescence, flow cytometry and transmission electron microscopy. Here we present an in vivo inhibition model via abdominal surgery and testicular injection, that could be a powerful technique to study male meiosis. We also demonstrate that CENP-E inhibition results in chromosome misalignment and metaphase arrest in primary spermatocytes during meiosis I. Our in vivo inhibition method will facilitate mechanistic studies of meiosis, serve as a useful method for genetic modifications of male germ lines, and shed a light on future clinical applications.

Functional Assessment of Kinesin-7 CENP-E in Spermatocytes Using In Vivo Inhibition, Immunofluorescence and Flow Cytometry

This article reports an in vivo inhibition of CENP-E through abdominal surgery and testicular injection of GSK923295, a valuable model for male meiotic division. Using the immunofluorescence, flow cytometry and transmission electron microscopy assays, we show that CENP-E inhibition results in chromosome misalignment and genome instability in mouse spermatocytes.

In Vivo Inhibition, Immunofluorescence 및 Flow Cytometry를 이용한 정자 세포 내 Kinesin-7 CENP-E의 기능 평가

In eukaryotes, meiosis is essential for genome stability and genetic diversity in sexual reproduction. Experimental analyses of spermatocytes in testes ...

Sperm Collection and Computer-Assisted Sperm Analysis in the Teleost Model Japanese Medaka (Oryzias latipes)

Japanese medaka (Oryzias latipes) is a teleost fish and&#160;an emerging vertebrate model for ecotoxicology, developmental, genetics, and physiology research. Medaka is also used extensively to investigate vertebrate reproduction, which is an essential biological function as it allows a species to perpetuate. Sperm quality is an important indicator of male fertility and, thus, reproduction success. Techniques for extracting sperm and sperm analysis are well documented for many species, including teleost fish. Collecting sperm is relatively simple in larger fish but can be more complicated in small model fish as they produce less sperm and are more delicate. This article, therefore, describes two methods of sperm collection in the small model fish, Japanese medaka: testes dissection and abdominal massage. This paper demonstrates that both approaches are feasible for medaka and shows that abdominal massage can be performed a repeated number of times as the fish quickly recover from the procedure. This article also describes a protocol for computer-assisted sperm analysis in medaka to objectively assess several important indicators of medaka sperm quality (motility, progressivity, duration of motility, relative concentration). These procedures, specified for this useful small teleost model, will greatly enhance understanding of the environmental, physiological, and genetic factors influencing fertility in vertebrate males.

Sperm Collection and Computer-Assisted Sperm Analysis in the Teleost Model Japanese Medaka Oryzias latipes

This article describes two quick and efficient methods for collecting sperm from the small model fish medaka (Oryzias latipes), as well as a protocol for reliably assessing sperm quality using computer-assisted sperm analysis (CASA).

Teleost 모델의 정자 수집 및 컴퓨터 보조 정자 분석 일본 메다 카 (Oryzias latipes)

Japanese medaka (Oryzias latipes) is a teleost fish and&#160;an emerging vertebrate model for ecotoxicology, developmental, genetics, and physiology ...

U-Shaped Horizontal Swimming Technique for Preparing High-Quality Sperm with Low DNA Fragmentation Index

Human semen is a complex mixture comprising progressively motile spermatozoa, non-progressively motile spermatozoa, immotile spermatozoa, cell debris, and viscous seminal plasma. High-quality sperm refers to progressively motile spermatozoa with normal morphology, which often exhibit a lower DNA fragmentation index (DFI) and higher fertilization potential. Preparing high-quality sperm is a critical step in human-assisted reproductive technology. The traditional sperm preparation method, discontinuous density gradient centrifugation (DGC), is time-consuming and labor-intensive. Repeated centrifugation can damage sperm DNA, thereby affecting subsequent fertilization and embryo development. This study introduces a U-shaped horizontal swimming (UHS) method for preparing intracytoplasmic sperm injection (ICSI) sperm, which significantly eliminates the detrimental effects of&#160;centrifugation on sperm DNA.&#160;The UHS method involves creating a UHS lane using a fertilization medium within an ICSI operating dish. A 10 &#181;L fertilization medium microdroplet is placed at the starting point on the left side of the UHS lane to hold the semen. Two additional 10 &#181;L fertilization medium buffer droplets are positioned at intervals along the left middle section of the lane, with all droplets connected by fertilization medium. The dish is then covered with culture oil and incubated overnight at 37 &#176;C with 6% CO2 to equilibrate. Subsequently, 3 &#181;L of semen is added to the microdroplet at the starting point. High-quality spermatozoa swim to the right side of the UHS lane, facilitating their suction into the ICSI injection needle. Dead sperm, cell debris, and other viscous impurities largely remain at the initial point or in the buffer droplets. We simultaneously processed 21 semen samples using both UHS and DGC techniques and compared their DFI. The results demonstrated that the DFI in the DGC group was 5.5% &#177; 3.2%, whereas the DFI in the UHS group was 1.7% &#177; 1.1%. The difference between the two groups was statistically significant (P &#60; 0.05).

This protocol describes a method for screening high-quality sperm with a low DNA fragmentation index by utilizing sperm motility characteristics and thigmotaxis. The method employs a U-shaped horizontal swimming lane, enabling high-quality sperm to reach the opposite side through buffer droplets, while dead sperm, cell debris, and impurities are excluded.

낮은 DNA 단편화 지수로 고품질 정자를 준비하기 위한 U자형 수평 수영 기술

Human semen is a complex mixture comprising progressively motile spermatozoa, non-progressively motile spermatozoa, immotile spermatozoa, cell debris, and ...