Name: measuring gene expression in bombarded barley aleurone layers with increased throughput
Uploaded: 2018-03-30T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
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저자는 실험, 곡물 균질에 대 한 조언 주 디 돌 및 fluorometry에 대 한 조언 린 Hannum 수행에 대 한 도움 Greyson 버틀러와 마가렛 배 럿을 감사 합니다. 이 작품은 기관 개발 수상 (IDeA는) 국립 과학 연구소에서의 일반 의료 보조금 번호 P20GM0103423, 건강의 국가 학회에 의해 그리고에서 교부 금에 의해 국립 과학 재단 (IOB 0443676)에 의해 지원 되었다 Colby 대학 자연 과학의 사단입니다.

1. 준비 이펙터와 취재 원 유전자의 구성
<ol><li>원하는 열려있는 독서 프레임에서 드라이브 식 제정 발기인 (예: 옥수수 유비퀴틴, UBI)를 사용 하는 이펙터 구조를 빌드하십시오. 예를 들어 드라이브 TaABF15의 강한 제정 식 UBI::TaABF1 를 포함 하는 플라스 미드를 생성 합니다.</li>
	<li>거 스같은 열려있는 독서 프레임의 업스트림 배치 기자 구조 측정, 그 활동은 발기인을 포함 하는 빌드. 예를 들어 HVA1::GUS HVA1 발기인2,5에서 측정을 포함 하는 플라스 미드를 생성 합니다.</li>
	<li>내부 제어 구조를 구축 (예: UBI::luciferase).</li>
	<li>실리 카 바인딩 열을 사용 하 여 프로토콜 ( 재료의 표참조), 각 필요한 유전자 구조에 대 한 높은-품질 플라스 미드를 준비. 자외선 분광학을 사용 하 여 참조 테이블의 재료, 신중 하 게 각 플라스 미드 준비의 농도 측정.</li>
</ol>2입니다. 보 리 곡물의 준비 사격에 대 한
<ol><li>스프레드시트를 설정 (예를 들어 그림 1 참조) 포 격 될 것 이다 플라스 미드, 적절 한 호르몬 치료 및 실험의 일부가 될 것입니다 각 치료에 대 한 기타 관련 정보를 나타내는.</li>
	<li>히말라야 보 리는 (실험에 포함 하는 각 치료에 대 한 40)의 곡물에서 배아를 잘라 절단 보드를 사용 하 여 살 균 면도날. 변색 또는 실질적으로 평균 보다 작은 알갱이 제외 합니다.</li>
	<li>50 mL 튜브에 모든 embryoless 곡물을 놓습니다. 10 분 동안 물과 바위의 40 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>신중 하 게 ()을 피하기 위해 곡물을 잃고 물에 밖으로 부 어과 10% 표 백제의 40 mL를 추가. 20 분 동안 바위입니다.</li>
	<li>표 백제에 밖으로 부 어과 메 마른 물 40 mL를 추가. 5 분 동안 바위입니다. 이 메 마른 물 세척 4 번 더 반복 합니다.</li>
	<li>40 mL Imbibing 솔루션 (20 m m 나트륨 호박, 20 m m 칼슘 염화 물, pH 5.0)의 추가 페니 재고 솔루션 (10 mg/mL)의 40 μ.</li>
	<li>질 석 접시에 튜브에서 Imbibing 솔루션 (페니)의 대부분을 전송 ( 재료의 표참조). 그런 다음 전송 Vermiculite 접시에 젖은 필터 종이의 표면에 곡물. 곡물에 밖으로 균등 하 게 퍼졌다. 충분 한 imbibing 솔루션을 부분적으로 (하지만 완전히)는 곡물을 계속 부 어 침수. 질 석 판 위에 뚜껑을 놓습니다.</li>
	<li>형광 조명에 대해 48 h 24 ° C에서 embryoless 곡물을 품 어. 필요에 따라 추가 Imbibing 솔루션을 추가 합니다.</li>
	<li>90 m m 플라스틱 페 트리 접시를 열고 거꾸로 뚜껑으로 자체와 20 mL 접시에 Imbibing 솔루션의 20 mL를 붓는 다. 각 페니 (10 mg/mL)의 20 μ를 추가 합니다. 알코올에 그들을 담거 서 좋은 포인트 집게의 두 쌍을 소독.</li>
	<li>페 트리 접시의 뚜껑으로 embryoless 곡물의 몇 가지를 놓습니다. 부드럽게는 집게를 사용 하 여 각 곡물에서 (투명) 씨 외 투를 제거 합니다. 곡 식의 부드러운 측면에서 씨 외 투를 제거 하는 동안 기본 (aleurone) 세포를 손상 하지 마십시오. 벗 겨 곡물 Imbibing 솔루션을 포함 하는 배양 접시에 전송.</li>
	<li>모든 곡물의 씨앗 외 투, 필 링 후 Vermiculite 접시에 그들을 반환 합니다. 16-20 시간 24 ° C에서 벗 겨 embryoless 곡물을 품 어.</li>
	<li>그냥 사용 하기 전에 곡물 폭격에 대 한, 페 트리 접시에 필터 논문 사이 그들을 흔들어 표면 수 분을 제거 합니다.</li>
</ol>3입니다. 사격에 대 한 플라스 미드 DNA의 준비
<ol><li>1.5 mL 튜브 사격 실험에 포함 될 각 치료에 대 한 레이블을 지정 합니다. 각 튜브를 유비의 2.5 µ g 추가::luciferase 내부 제어 플라스 미드, 거 스 기자 플라스 미드와 이펙터 플라스 미드의 원하는 금액 (2.5 µ g 일반적으로 0.025 µ g) 2.5 µ g. 총 볼륨 5 µ L을가지고 물을 추가 합니다.</li>
	<li>1.6 µ m 금 microcarriers ( 재료의 표참조)를 준비 다음 게시 프로토콜6.</li>
	<li>각 치료에 대 한 플라스 미드 DNA를 포함 하는 1.5 mL 튜브에 일시 중단 된 microcarriers의 50 µ L를 추가 합니다. 제조 업체의 프로토콜6에 플라스 미드 DNA와 microcarriers를 코트.</li>
	<li>마지막 단계에서 플라스 미드 코팅 microcarriers 48 µ L 100% 에탄올, 5 macrocarriers의 각각에 정지 microcarriers의 피펫으로 8 μ에에서 일시 중단 되 고 공기에 그들을 허용 하는 때 건조.</li>
</ol>4. Embryoless 보 리 곡물의 입자 사격
<ol><li>( 재료의 표참조) 입자 사격 장치 설정6.</li>
	<li>1550 psi 파열 디스크를 고정 캡에 놓고 악기에 마운트 합니다.</li>
	<li>(정지 화면) 함께 원하는 플라스 미드 조합을 포함 하는 macrocarrier microcarrier 실행 어셈블리에 놓습니다. 어셈블리 사격 챔버의 상단 슬롯에 삽입 합니다. 모자 및 표준 거리 (6 m m)에서 macrocarrier 커버 뚜껑 파열 디스크 사이의 거리를 설정 하 고 수 있도록 11 밀리미터 (그림 2A)의 macrocarrier 여행 거리 (표준) 중간 위치에서 정지 화면 지원 장소.</li>
	<li>정렬 꽉 방사형 패턴에서 8 embryoless 곡물 (얇은 끝 안쪽으로 가리키는) 평면 90 mm 페 트리 접시의 뚜껑을 아래로 녹화 필터 종이 동그라미에 ( 그림 2B참조).</li>
	<li>중지 화면에서 6 cm의 거리에서 사격 챔버로 곡물을 가진 접시를 놓습니다.</li>
	<li>95 인민군을 폭격 챔버를 철수 하 고 샘플을도 배.</li>
	<li>진공을 해제 한 후 포 격하 곡물 Imbibing 솔루션 페니의 1 mg/ml를 포함 4 mL를 포함 레이블이 60 m m 페 트리 접시에 전송.</li>
	<li>사격의 모두 완료 될 때까지 반복 합니다. 24 시간 동안 24 ° c (100 rpm에서 떨고 플랫폼)에서 품 어.</li>
</ol>5. 포 격하 곡물에서 수용 성 단백질의 추출
<ol><li>집게를 사용 하 여, 60 mm 페 트리 접시에서 8 포 격하 곡물을 제거 하 고 그들을 종이 타월에 건조 되 리. 나눌 알갱이 두 레이블이 2.0 mL 튜브 (튜브 당 4 곡물) 각 800 μ 연 삭 버퍼 (100 m m 나 인산 염 pH 7.2, 5mm DTT, 10 µ g/mL leupeptin, 20% 글리세롤)와 5 m m 스테인리스 구슬. 포 격하 곡물의 모든에 대해이 프로세스를 반복 합니다.</li>
	<li>(최대 48) 2.0 mL 튜브 비드 균질 화기의 두 개의 선반에 배치 ( 재료의 표참조). 랙에 균질 화기에 탑재 합니다.</li>
	<li>3 분 30 Hz에서 샘플을 흔들어.</li>
	<li>균질 화기에서 균질 화기 선반을 제거 하 고 샘플을 다시 얼음 (5 분)에 그들을 배치.</li>
	<li>균질 화기-반대 방향에서에서 다시 랙에 탑재 합니다. 흔들어 샘플 다시 30 Hz에서 3 분.</li>
	<li>그런 다음 얼음, 랙 냉각 5.5 단계 5.3를 반복. 이 떨고의 12 분의 총에 추가 됩니다.</li>
	<li>10 분간 4 ° C에서 16000 x g에서 곡물 추출 물 원심</li>
	<li>
즉시 후에 원심 분리, microcentrifuge 튜브의 두 번째 세트에 분명 supernatants를 가만히 따르다. 빠른 소용돌이 각 튜브를 제공 합니다. 얼음에 튜브를 저장 합니다.</li>
	<li>세척 하 고 다시 사용할 수 있도록는 상쾌한 전송 후 펠 릿에서 강철 구슬을 복구 합니다.</li>
</ol>6. 곡물 추출 물에서 Luciferase 활동의 측정
<ol><li>분석 수로 곡물 추출의 각 관에 대 한 준비 Luciferase 분석 결과 혼합물의 200 μ를 포함 12 m m x 75 m m 유리 테스트 튜브 (45 m m Tris 황산 pH 7.7, 15 m m MgCl2, 20 mM DTT, 1.5 m m EDTA, 소 1 m m, 1mm ATP).</li>
	<li>첫 번째 분석 결과 튜브를 첫 번째 곡물 추출 물 100 μ를 추가 합니다. 잘 혼합을 신속 하 게 소용돌이. 즉시 는 루미 노의 튜브 홀더 튜브를 삽입 하 고 문을 닫습니다. 측정 완료 되 면 다음 튜브의 배치를 위해 문을 열어두고-루미 노에서 튜브를 제거 합니다.</li>
	<li>이 프로세스를 반복 하 여 모든 샘플 측정 되었습니다.</li>
</ol>7. 곡물 추출 물에서 GUS 활동의 측정
<ol><li>96 잘 접시의 각 음에 거 스 분석 결과 버퍼 (50 m m 나 인산 염 pH 7.2, 2.5 m m 4-methylumbelliferyl-D glucuronide 10mm DTT, 2 mM EDTA, 10 µ g/mL leupeptin, 20% 메탄올, 0.02% 나트륨 아 지 드)의 200 μ를 추가 합니다.</li>
	<li>각 곡물의 장소 50 μ 잘 해당 추출 합니다. 추가 팁과 혼합. 씰링 필름으로 최고 봉인.</li>
	<li>20 시간 동안 어둠 속에서 37 ° C에 96 잘 접시를 품 어.</li>
	<li>96 잘 접시 4 ° C에서 4000 x g에서 10 분간 원심 하 고 얼음에 그것을 배치.</li>
	<li>블랙 96 잘 접시의 각 음에 0.2 M 나2CO3 의 250 μ를 추가 합니다.</li>
	<li>해당 각 centrifuged 거 스 분석 결과 혼합물의 6.25 μ 추가 잘 (포함 0.2 M 나2CO3) 블랙 96 잘 접시. 추가 팁과 혼합. 기준으로 10 μ M, 40 μ M, 그리고 100 μ M 4-methylumbelliferone의 6.25 μ와 웰 스를 포함 한다.</li>
	<li>플레이트 fluorometer에 검은 접시를 놓고 methylumbelliferone의 형광을 읽고. 360의 여기 파장에서 수치를가지고 nm 그리고 460의 방출 파장 nm. 40 μ M 4-methylumbelliferone의 잘 포함 6.25 μ와 0.2 M 나2CO3 의 250 μ 제공 1000 형광 단위의 읽기 같은 악기의 이득을 설정 합니다.</li>
</ol>8. 데이터 분석
<ol><li>스프레드시트에 luciferase 및 거 스 분석 실험에 대 한 값을 입력 합니다. 이 유전자 구조 aleurone 셀에 성공적으로 배달 되지 않은 나타냅니다 모든 샘플의 20000 상대 발광 단위의-1보다 낮은 luciferase 읽기와 고려 대상에서 제외 합니다.</li>
	<li>각 성공적으로 포 격하 곡물 추출 (4 embryoless 곡물의 그룹 대표), 다음과 같이 원시 거 스와 luciferase 데이터에서 정규화 된 거 스 식 계산: 거 스 정규화 = [(거 스 식-거 스 빈) (2000000) x] / (luciferase 식-빈 luciferase)입니다. 참고:이 무슨 2000000의 luciferase 독서를 준 사격에서 관찰 되어 거 스 활동의 금액을 정규화 합니다.</li>
	<li>이펙터 구문 또는 호르몬 치료 이펙터 또는 호르몬의 부재에 식의 수준에 비교 하 여 테스트 되 고 있을 때 특정 기자 구문 식의 상대적 수준을 보고 합니다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Chen, K., An, Y. Q. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+responses+to+gibberellin+and+abscisic+acid+in+barley+aleurone.">Transcriptional responses to gibberellin and abscisic acid in barley aleurone.</a> J. Integ. Plant Biol. 48, 591-612 (2006).</li><li>Lanahan, M. B., Ho, T. H. D., Rogers, S. W., Rogers, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gibberellin+response+complex+in+cereal+alpha-amylase+gene+promoters.">A gibberellin response complex in cereal alpha-amylase gene promoters.</a> Plant Cell. 4, 203-211 (1992).</li><li>Shen, Q., Zhang, P., Ho, T. H. 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저자는 공개 없다.

이펙터 유전자의 도입 구성 입자 사격을 통해, 해 부 결과 호르몬 조절 유전자와 조지아/ABA 신호에 특정 배우의 역할에 대 한 귀중 한 전략은 과도 식 기자 구문 뒤 식입니다. 그러나, 보 리 aleurone 셀2,3,,45,6 에서 같은 실험 수행에 대 한 기존 프로토콜은 매우 노동 집약 이?...

보 리 aleurone 레이어 식물1호르몬 통제 유전자 발현의 학문을 위한 기초가 튼튼한 모델 시스템입니다. 특히, 스트레스 응답 연관 유전자 abscisic 산 (ABA)에 의해 활성화 되는 동안 발 아 또는 초기 종묘 개발에 필요한 유전자의 수 지 베 렐 린 (GA)에 의해 활성화 됩니다. GA와 ABA 신호 경로 고리로 연결 되었다는, 일부가 활성화 유전자의 표정을 ABA와 반대로1저해로.
조지아/ABA 신호에 특정 배우의 역할 입자 사격, 기자 구문에 효과 허용 하는 과도 식으로 다음을 통해 이펙터 유전자 구조 도입 되었습니다 이해를 위한 중요 한 전략 다운스트림 유전자 식 결정 됩니다. 거 스 (β-glucuronidase) 등 Luciferase 리포터 유전자를 사용 하 여 특별히 이펙터 구조 받은 셀 내에서 유전자 발현의 과민 하 고 양적 측정을 수 있습니다. 예를 들어 녹음 방송 요인 TaABF15,6 인코딩 이펙터 구문의 도입 HVA1 같은 ABA 유발 유전자는 Amy32b 같은 유전자가 유도 하는 동안 TaABF1에 의해 유도 된 설립 억 누른 다. 입자 사격 실험 전략으로 조지아/ABA 신호의 다양 한 측면을 조사 하기 위해 여러 실험실에 의해 사용 되었습니다. 같은 일이 유도2 및 ABA 유도 유전자3, 활성화에 대 한 중요 한 발기인 요소의 식별 하 고 단백질 kinases4 의 발견을 주도하 고 있다 및 녹음 방송 요인5 규제는 이 유전자의 표현입니다.
기존 프로토콜2,3,,45,입자 사격 및 일시적인 유전자 발현의 후속 측정에 대 한6 는 아주 노동 집약, 각 세트의 포 격으로 간신히 곡물은 박격포 및 방 앗 공이에서 손으로 무 균 그리고 효소 분석 실험 개별적으로 수행 됩니다. 이 원고를 보고 부분적으로 자동화 하 고 균질 단계를 능률화 하는 향상 된 프로토콜 및 동일한 실험에서 테스트 하는 치료의 많은 수를 허용 훨씬 더 많은 처리량을 허용 하도록 분석 실험은 거 스는 또는 더 많은 통계적으로 강력한 결과를 얻을 각 치료에 대 한 더 많은 복제의 포함. 대표 결과 GA, ABA, 및 다른 규제 분자 뿐만 아니라 녹음 방송 요인 TaABF1에 의해 통제 하는 HVA1 및 Amy32b 기자 구문, 표현에 대 한 표시 됩니다.

<table><tbody><tr><td>GeneElute HP plasmid Maxiprep kit</td><td>Sigma</td><td>NA0310-1KT</td><td></td></tr><tr><td>UV-vis spectrophotometer</td><td>Nanodrop</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>Himalaya barley grains</td><td>/</td><td>/</td><td>A variety of hulless barley (store in the dark at 4&amp;deg; C)</td></tr><tr><td>sodium succinate</td><td>Sigma</td><td>S2378</td><td>Reagent for Imbibing Solution</td></tr><tr><td>calcium chloride (dihydrate)</td><td>Fisher</td><td>C79-500</td><td>Reagent for Imbibing Solution</td></tr><tr><td>Imbibing Solution</td><td>home made</td><td>/</td><td>20 mM sodium succinate, 20 mM calcium chloride, pH 5.0. Sterilize by autoclaving before use.</td></tr><tr><td>chloramphenicol</td><td>Sigma</td><td>C0378</td><td>Prepare a 10 mg/mL stock solution in 70% ethanol.</td></tr><tr><td>vermiculite</td><td>Fisher</td><td>NC0430369</td><td>Used for vermiculite plates.</td></tr><tr><td>filter paper circles (90 mm)</td><td>Whatman</td><td>1001 090</td><td>Used for vermiculite and for pre-bombardment grain preparation</td></tr><tr><td>Vermiculite Plates</td><td>home made</td><td>/</td><td>Add 50 mL of vermiculite to a glass petri dish. Place a 90 mm paper circle on top of the vermiculite. Autoclave.</td></tr><tr><td>forceps (fine pointed)</td><td>Fisher</td><td>13-812-42</td><td>Used for removing seed coat from barley grains.</td></tr><tr><td>forceps (ultra fine point)</td><td>Fisher</td><td>12-000-122</td><td>Used for removing seed coat from barley grains.</td></tr><tr><td>gold microcarriers (1.6 &amp;mu;m)</td><td>BioRad</td><td>1652264</td><td></td></tr><tr><td>macrocarriers</td><td>BioRad</td><td>1652335</td><td></td></tr><tr><td>calcium chloride (dihydrate)</td><td>Fisher</td><td>C79-500</td><td>Prepare a 2.5 M stock solution and store 1 mL aliquots at -20&amp;deg; C.</td></tr><tr><td>spermidine</td><td>Sigma</td><td>S0266</td><td>Prepare a 100 mM stock solution and store 500 &amp;mu;L aliquots at -20&amp;deg; C (use within 2 months).</td></tr><tr><td>rupture discs (1550 psi)</td><td>BioRad</td><td>1652331</td><td></td></tr><tr><td>stopping screens</td><td>BioRad</td><td>1652336</td><td></td></tr><tr><td>macrocarrier holders</td><td>BioRad</td><td>1652322</td><td></td></tr><tr><td>Biolistic particle delivery system</td><td>BioRad</td><td>PDS-1000/He</td><td></td></tr><tr><td>sodium phosphate monobasic monohydrate</td><td>Sigma</td><td>S9638</td><td>Reagent for 1M sodium phosphate pH 7.2</td></tr><tr><td>sodium phosphate dibasic</td><td>Sigma</td><td>S9763</td><td>Reagent for 1M sodium phosphate pH 7.2</td></tr><tr><td>1M sodium phosphate pH 7.2</td><td>home made</td><td>/</td><td>Combine 6.9 g of sodium phosphate monobasic monohydrate with 7.1 g of sodium phosphate dibasic. Add water to 100 mL. Add NaOH to get pH 7.2.</td></tr><tr><td>dithiothrietol (DTT)</td><td>Sigma</td><td>43819</td><td>Dissolve in water to 1 M. Store at -20&amp;deg; in 1 mL aliquots.</td></tr><tr><td>leupeptin</td><td>Sigma</td><td>L2884</td><td>Dissolve in water to 10 mg/mL. Store at -20&amp;deg; C.</td></tr><tr><td>glycerol</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td>Prepare a 50% solution in water.</td></tr><tr><td>Grinding Buffer</td><td>home made</td><td>/</td><td>Combine 10 mL of 1 M sodium phosphate pH 7.2, 500 &amp;mu;L of 1 M DTT, 100 &amp;mu;L of 10 mg/mL leupeptin, and 40 mL of 50% glycerol. Add water to 100 mL.</td></tr><tr><td>stainlesss steel beads (5 mm)</td><td>Qiagen</td><td>69989</td><td></td></tr><tr><td>2.0 mL tubes</td><td>Eppendorf</td><td>22363352</td><td>This specific model of tube is recommended for use with the homogenizer.</td></tr><tr><td>bead homogenizer (TissueLyser)</td><td>Qiagen</td><td>85210</td><td></td></tr><tr><td>12mm x 75 mm glass test tubes</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>luciferin</td><td>Goldbio</td><td>LUCK-100</td><td>Prepare a 25 mM stock solution and store 1 mL aliquots at -20&amp;deg; C.</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma</td><td>A7699</td><td>Prepare a 100 mM stock solution and store 250 &amp;mu;L aliquots at -20&amp;deg;&amp;nbsp;C.</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td>Reagent for 1M Tris sulfate pH 7.7.</td></tr><tr><td>sulfuric acid</td><td>Sigma</td><td>258105</td><td>Reagent for 1M Tris sulfate pH 7.7.</td></tr><tr><td>1M Tris sulfate pH 7.7</td><td>home made</td><td>/</td><td>Dissolve 12.1 g Tris base in 100 mL of water. Adjust pH to 7.7 with sulfuric acid.</td></tr><tr><td>magnesium chloride</td><td>Sigma</td><td>M9397</td><td>Dissolve in water to 2 M.</td></tr><tr><td>Luciferase Assay Buffer (LAB)</td><td>home made</td><td>/</td><td>Combine 3 mL of 1 M Tris sulfate pH 7.7, 500 &amp;mu;L of 2 M magnesium chloride, 1 mL of 1 M DTT, and 200 &amp;mu;L of 0.5 M EDTA. Add water to 50&amp;nbsp;mL.</td></tr><tr><td>Luciferase Assay Mixture</td><td>home made</td><td>/</td><td>Combine 15 mL of LAB, 800 &amp;mu;L of 25 mM luciferin, 200 &amp;mu;L of 100 mM ATP, and 4 mL of water. This makes enough assay mixture (20&amp;nbsp;mL) for 100 luciferase assays.</td></tr><tr><td>luminometer (Sirius)</td><td>Berthold</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>4-methylumbelliferyl-&amp;beta;-D-glucuronide (MUG)</td><td>Goldbio</td><td>MUG1</td><td>Dissolve in DMSO to 100 mM.</td></tr><tr><td>sodium azide</td><td>Sigma</td><td>S8032</td><td>Prepare a 2% stock solution in water and store 1 mL aliquots at -20&amp;deg; C.</td></tr><tr><td>96 well plates (standard)</td><td>Fisher</td><td>12565501</td><td></td></tr><tr><td>GUS assay buffer</td><td>home made</td><td>/</td><td>Combine 2.5 mL of MUG, 5 mL of 1 M sodium phosphate pH 7.2, 400 &amp;mu;L of 0.5 M EDTA, 1 mL of 1 M DTT, 100 &amp;mu;L of 10 mg/ml leupeptin, 20 mL of methanol, and 1 mL of 2% sodium azide. Add water to 100 mL.</td></tr><tr><td>TempPlate sealing film</td><td>USA Scientific</td><td>2921-1000</td><td></td></tr><tr><td>96 well plates (black)</td><td>Costar</td><td>3916</td><td></td></tr><tr><td>sodium carbonate</td><td>Sigma</td><td>S7795</td><td>Prepare a 200 mM solution in water.</td></tr><tr><td>4-methylumbelliferone</td><td>Sigma</td><td>M1381</td><td>Prepare a 100 &amp;mu;M solution in water. Freeze 1 mL aliquots at -20&amp;deg;&amp;nbsp;C.</td></tr><tr><td>microplate fluouresence reader</td><td>Bio-Tek</td><td>FLX-800</td><td></td></tr></tbody></table>

measuring gene expression in bombarded barley aleurone layers with increased throughput

보 리 곡물의 aleurone 레이어 식물에서 호르몬 통제 유전자 발현에 대 한 중요 한 모델 시스템입니다. Aleurone 세포에서 유전자 발 아에 필요한 또는 스트레스 응답 연관 유전자 abscisic 산 (ABA)에 의해 활성화 되는 동안 초기 종묘 개발 지 베 렐 린 (GA)에 의해 활성화 됩니다. GA와 ABA 신호 메커니즘은 효소 분석 실험을 사용 하 여 측정 결과 과도 식으로 입자 사격을 통해 aleurone 세포로 리포터 유전자 구조를 도입 하 여 심문 수 있습니다. 향상 된 프로토콜을 부분적으로 자동화 하 고 간소화 곡물 균질 단계 및 효소 분석 실험 보고는 기존의 방법 보다 훨씬 더 많은 처리량을 허용. 균질 곡물 샘플 자동된 조직 균질 화기를 사용 하 여 밖으로 실행 되 고 거 스 (β-glucuronidase) 분석 실험 96 잘 접시 시스템을 사용 하 여 실시 됩니다. 프로토콜을 사용 하 여 대표 결과 phospholipase D 활동 ABA, 녹음 방송 요인 TaABF1 통해 HVA1 유전자 식의 활성화에 중요 한 역할을 재생할 수 있습니다 것이 좋습니다.

여기에 설명 된 기술은 보 리 곡물의 aleurone 세포로 어떤 테스트 유전자 구조를 소개 사용할 수 있습니다. 테스트 유전자 발현의 수준 다음 있을 수 있습니다 (그림 2)를 편리 하 게 측정. 높은 처리량 프로토콜 크게 여기에 설명 된 연 삭 씨앗과 효소 분석 실험 단계의 효율성을 증가 합니다. 이 방법은 HVA17ABA 유도 유전자 표현?...

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Measuring Gene Expression in Bombarded Barley Aleurone Layers with Increased Throughput

향상 된 프로토콜은 입자 사격 후 보 리 aleurone 세포에서 기자 구문에서 일시적인 유전자 발현의 측정에 대 한 제공 됩니다. 96 잘 접시 효소 분석 실험 연 삭 자동화 된 곡물의 조합을 절차에 대 한 높은 처리량을 제공 합니다.

포 격하 보 리 Aleurone 레이어 증가 처리량에서 유전자 발현을 측정

The aleurone layer of barley grains is an important model system for hormone-regulated gene expression in plants. In aleurone cells, genes required for ...

measuring-gene-expression-bombarded-barley-aleurone-layers-with

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Genetics

6.4K 조회수.  Colby College. 향상 된 프로토콜은 입자 사격 후 보 리 aleurone 세포에서 기자 구문에서 일시적인 유전자 발현의 측정에 대 한 제공 됩니다. 96 잘 접시 효소 분석 실험 연 삭 자동화 된 곡물의 조합을 절차에 대 한 높은 처리량을 제공 합니다.

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Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

Complex changes in gene expression typically mediate a large portion of a cellular response. Each gene may change expression with unique kinetics as the gene is regulated by the particular timing of one of many stimuli, signaling pathways or secondary effects. In order to capture the entire gene expression response to hypoxia in the yeast S. cerevisiae, RNA-seq analysis was used to monitor the mRNA levels of all genes at specific times after exposure to hypoxia. Hypoxia was established by growing cells in ~100% N2 gas. Importantly, unlike other hypoxic studies, ergosterol and unsaturated fatty acids were not added to the media because these metabolites affect gene expression. Time points were chosen in the range of 0 - 4 h after hypoxia because that period captures the major changes in gene expression. At each time point, mid-log hypoxic cells were quickly filtered and frozen, limiting exposure to O2 and concomitant changes in gene expression. Total RNA was extracted from cells and used to enrich for mRNA, which was then converted to cDNA. From this cDNA, multiplex libraries were created and eight or more samples were sequenced in one lane of a next-generation sequencer. A post-sequencing pipeline is described, which includes quality base trimming, read mapping and determining the number of reads per gene. DESeq2 within the R statistical environment was used to identify genes that change significantly at any one of the hypoxic time points. Analysis of three biological replicates revealed high reproducibility, genes of differing kinetics and a large number of expected O2-regulated genes. These methods can be used to study how the cells of various organisms respond to hypoxia over time and adapted to study gene expression during other cellular responses.

Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

Here, we present a protocol using RNA-seq to monitor mRNA levels over time during the hypoxic response of S. cerevisiae cells. This method can be adapted to analyze gene expression during any cellular response.

효 모 S. cerevisiae Hypoxic 응답 하는 동안 시간이 지남에 mRNA 수준 측정

Complex changes in gene expression typically mediate a large portion of a cellular response. Each gene may change expression with unique kinetics as the ...

연구

유전학

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in mRNA synthesis has been shown to be compensated by a simultaneous decrease in mRNA degradation to restore normal steady-state levels. Hence, the genome-wide quantification of mRNA synthesis, independently from mRNA decay, is the best direct reflection of RNA polymerase II transcriptional activity. Here, we discuss a method using non-perturbing metabolic labeling of nascent RNAs in Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). Specifically, the cells are cultured for 6 min with a uracil analog, 4-thiouracil, and the labeled newly transcribed RNAs are purified and quantified to determine the synthesis rates of all individual mRNA. Moreover, using labeled Schizosaccharomyces pombe cells as internal standard allows comparing mRNA synthesis in different S. cerevisiae strains. Using this protocol and fitting the data with a dynamic kinetic model, the corresponding mRNA decay rates can be determined.

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

The protocol described here is based on the genome-wide quantification of newly synthesized mRNA purified from yeast cells labeled with 4-thiouracil. This method allows to measure mRNA synthesis uncoupled from mRNA decay and, thus, provides an accurate measurement of RNA polymerase II transcription.

Saccharomyces cerevisiae 4-thiouracil와의 정량화로 대사 새로 합성 mRNA로 RNA 중 합 효소 II 활동에 대 한 프록시

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in ...

Isolation of High Purity Tissues from Developing Barley Seeds

Understanding the mechanisms regulating the development of cereal seeds is essential for plant breeding and increasing yield. However, the analysis of cereal seeds is challenging owing to the minute size, the liquid character of some tissues, and the tight inter-tissue connections. Here, we demonstrate a detailed protocol for dissection of the embryo, endosperm, and seed maternal tissues at early, middle, and late stages of barley seed development. The protocol is based on a manual tissue dissection using fine-pointed tools and a binocular microscope, followed by ploidy analysis-based purity control. Seed maternal tissues and embryos are diploid, while the endosperm is triploid tissue. This allows the monitoring of sample purity using flow cytometry. Additional measurements revealed the high quality of RNA isolated from such samples and their usability for high-sensitivity analysis. In conclusion, this protocol describes how to practically dissect pure tissues from developing grains of cultivated barley and potentially also other cereals.

Here we present a protocol for high purity manual isolation and quality control of embryo, endosperm and seed maternal tissues during entire barley seed development.

Understanding the mechanisms regulating the development of cereal seeds is essential for plant breeding and increasing yield. However, the analysis of ...

Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling

The characterization of gene expression is dependent on RNA quality. In germinating, developing and mature cereal seeds, the extraction of high-quality RNA is often hindered by high starch and sugar content. These compounds can reduce both the yield and the quality of the extracted total RNA. The deterioration in quantity and quality of total RNA can subsequently have a significant impact on the downstream transcriptomic analyses, which may not accurately reflect the spatial and/or temporal variation in the gene expression profile of the samples being tested. In this protocol, we describe an optimized method for extraction of total RNA with sufficient quantity and quality to be used for whole transcriptome analysis of cereal grains. The described method is suitable for several downstream applications used for transcriptomic profiling of developing, germinating, and mature cereal seeds. The method of transcriptome profiling using a microarray platform is shown. This method is specifically designed for gene expression profiling of cereals with described genome sequences. The detailed procedure from microarray handling to final quality control is described. This includes cDNA synthesis, cRNA labelling, microarray hybridization, slide scanning, feature extraction, and data quality validation. The data generated by this method can be used to characterize the transcriptome of cereals during germination, in various stages of grain development, or at different biotic or abiotic stress conditions. The results presented here exemplify high-quality transcriptome data amenable for downstream bioinformatics analyses, such as the determination of differentially expressed genes (DEGs), characterisation of gene regulatory networks, and conducting transcriptome-wide association study (TWAS).

A method for transcriptome profiling of cereals is presented. The microarray-based gene expression profiling starts with the isolation of high-quality total RNA from cereal grains and continues with the generation of cDNA. After cRNA labelling and microarray hybridization, recommendations are given for signal detection and quality control.

유전자 발현 프로파일링을 위한 수정된 방법으로 시리얼 씨앗에서 고품질 전사 데이터 획득

The characterization of gene expression is dependent on RNA quality. In germinating, developing and mature cereal seeds, the extraction of high-quality ...

생화학

Global Gene Expression Analysis Using a Zebrafish Oligonucleotide Microarray Platform

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray technology is used in numerous biological disciplines in a variety of applications including global gene expression analysis in relation to developmental stage, to a disease state, and in toxic responses. Herein, we include a demonstration of global gene expression analysis using a comprehensive zebrafish-specific oligonucleotide microarray platform. The zebrafish expression microarray platform contains 385,000 probes, 60 base pairs in length, interrogating 37,157 targets with up to 12 probes per target. For this platform, all cDNA and genomic information available for the zebrafish was collected from various genomic databases including Ensembl (http://www.ensembl.org), VEGA (http://vega.sanger.ac.uk), UCSC (http://genome.ucsc.edu), and ZFIN (http://www.zfin.org). As a result this expression array provides complete coverage of the current zebrafish transcriptome. The zebrafish expression microarray was printed by Roche NimbleGen (Madison, WI). This technical demonstration includes the fluorescent labeling of a cDNA product, hybridization of the labeled cDNA product to the microarray platform, and array scanning for signal acquisition using the one color analysis strategy.  

Gene microarrays are powerful tools in gene expression profiling at a genome-wide level. This technology has application in a variety of biological disciplines including developmental biology and toxicology. In this video, we detail a protocol for global gene expression analysis using a comprehensive oligonucleotide microarray platform for the zebrafish.

Zebrafish Oligonucleotide Microarray의 플랫폼을 사용하여 글로벌 유전자 발현 분석

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray ...

생물학

Robotics and Dynamic Image Analysis for Studies of Gene Expression in Plant Tissues

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods presented here utilize the green fluorescent protein (gfp) gene for continual monitoring of gene expression in the same pieces of tissues, over time. The gfp gene was placed under regulatory control of different promoters and introduced into lima bean cotyledonary tissues via particle bombardment. Cotyledons were then placed on a robotic image collection system, which consisted of a fluorescence dissecting microscope with a digital camera and a 2-dimensional robotics platform custom-designed to allow secure attachment of culture dishes. Images were collected from cotyledonary tissues every hour for 100 hours to generate expression profiles for each promoter. Each collected series of 100 images was first subjected to manual image alignment using ImageReady to make certain that GFP-expressing foci were consistently retained within selected fields of analysis. Specific regions of the series measuring 300 x 400 pixels, were then selected for further analysis to provide GFP Intensity measurements using ImageJ software. Batch images were separated into the red, green and blue channels and GFP-expressing areas were identified using the threshold feature of ImageJ. After subtracting the background fluorescence (subtraction of gray values of non-expressing pixels from every pixel) in the respective red and green channels, GFP intensity was calculated by multiplying the mean grayscale value per pixel by the total number of GFP-expressing pixels in each channel, and then adding those values for both the red and green channels. GFP Intensity values were collected for all 100 time points to yield expression profiles. Variations in GFP expression profiles resulted from differences in factors such as promoter strength, presence of a silencing suppressor, or nature of the promoter. In addition to quantification of GFP intensity, the image series were also used to generate time-lapse animations using ImageReady. Time-lapse animations revealed that the clear majority of cells displayed a relatively rapid increase in GFP expression, followed by a slow decline. Some cells occasionally displayed a sudden loss of fluorescence, which may be associated with rapid cell death. Apparent transport of GFP across the membrane and cell wall to adjacent cells was also observed. Time lapse animations provided additional information that could not otherwise be obtained using GFP Intensity profiles or single time point image collections.

We report a method for introduction, tracking and quantitative analysis of GFP expression in plant cells. This method utilizes a custom-designed robotics system for semi-continuous image collection from large numbers of samples, over time. We also demonstrate the use of ImageJ and ImageReady for analysis of image series.

로보틱스 및 식물 조직에서 유전자 발현의 연구 동적 이미지 분석

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods ...

A Cell-to-cell Macromolecular Transport Assay in Planta Utilizing Biolistic Bombardment

Here, we present a simple and rapid protocol to detect and assess the extent of cell-to-cell macromolecular transport in planta. In this protocol, a fluorescently tagged-protein of interest is transiently expressed in plant tissue following biolistic delivery of its encoding DNA construct. The intra- and intercellular distribution of the tagged protein is then analyzed by confocal microscopy. We describe this technology in detail, providing step-by-step protocols to assay and evaluate the extent of symplastic protein transport in three plant species, Arabidopsis thaliana, Nicotiana benthamiana and N. tabacum (tobacco).

A Cell-to-cell Macromolecular Transport Assay in Planta Utilizing Biolistic Bombardment

Macromolecular trafficking between plant cells can be assessed by transiently expressing a fluorescently-tagged protein of interest and analyzing its intra- and intercellular distribution by confocal microscopy.

휴대 전화의 Macromolecular 교통 분석 Planta에 Biolistic 포격을 활용

Here, we present a simple and rapid protocol to detect and assess the extent of cell-to-cell macromolecular transport in planta. In this protocol, a ...

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily. The tempo of these advances is accelerating, promising greater depth and breadth. In light of these extraordinary advances, the need for fast, parallel methods to define gene function becomes ever more important. Collections of genome-wide deletion mutants in yeasts and E. coli have served as workhorses for functional characterization of gene function, but this approach is not scalable, current gene-deletion approaches require each of the thousands of genes that comprise a genome to be deleted and verified. Only after this work is complete can we pursue high-throughput phenotyping. Over the past decade, our laboratory has refined a portfolio of competitive, miniaturized, high-throughput genome-wide assays that can be performed in parallel. This parallelization is possible because of the inclusion of DNA 'tags', or 'barcodes,' into each mutant, with the barcode serving as a proxy for the mutation and one can measure the barcode abundance to assess mutant fitness. In this study, we seek to fill the gap between DNA sequence and barcoded mutant collections. To accomplish this we introduce a combined transposon disruption-barcoding approach that opens up parallel barcode assays to newly sequenced, but poorly characterized microbes. To illustrate this approach we present a new Candida albicans barcoded disruption collection and describe how both microarray-based and next generation sequencing-based platforms can be used to collect 10,000 - 1,000,000 gene-gene and drug-gene interactions in a single experiment.

We have developed comprehensive, unbiased genome-wide screens to understand gene-drug and gene-environment interactions. Methods for screening these mutant collections are presented.

Barcoded 효모 게놈 라이브러리의 경쟁력 화면

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

High Throughput Yeast Strain Phenotyping with Droplet-Based RNA Sequencing

The powerful tools available to edit yeast genomes have made this microbe a valuable platform for engineering. While it is now possible to construct libraries of millions of genetically distinct strains, screening for a desired phenotype remains a significant obstacle. With existing screening techniques, there is a tradeoff between information output and throughput, with high-throughput screening typically being performed on one product of interest. Therefore, we present an approach to accelerate strain screening by adapting single cell RNA sequencing to isogenic picoliter colonies of genetically engineered yeast strains. To address the unique challenges of performing RNA sequencing on yeast cells, we culture isogenic yeast colonies within hydrogels and spheroplast prior to performing RNA sequencing. The RNA sequencing data can be used to infer yeast phenotypes and sort out engineered pathways. The scalability of our method addresses a critical obstruction in microbial engineering.

A bottleneck in the &#8216;design-build-test&#8217; cycle of microbial engineering is the speed at which we can perform functional screens of strains. We describe a high-throughput method for strain screening applied to hundreds to thousands of yeast cells per experiment that utilizes droplet-based RNA sequencing.

액적 기반 RNA 시퀀싱을 통한 높은 처리량 효모 균주 현상태핑

The powerful tools available to edit yeast genomes have made this microbe a valuable platform for engineering. While it is now possible to construct ...

생체공학

Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells

The quantification of gene expression at the single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements performed at the population level. Two methods based on microscopy and flow cytometry are presented to demonstrate how such data can be acquired. The expression of a fluorescent reporter induced upon activation of the high osmolarity glycerol MAPK pathway in yeast is used as an example. The specific advantages of each method are highlighted. Flow cytometry measures a large number of cells (10,000) and provides a direct measure of the dynamics of protein expression independent of the slow maturation kinetics of the fluorescent protein. Imaging of living cells by microscopy is by contrast limited to the measurement of the matured form of the reporter in fewer cells. However, the data sets generated by this technique can be extremely rich thanks to the combinations of multiple reporters and to the spatial and temporal information obtained from individual cells. The combination of these two measurement methods can deliver new insights on the regulation of protein expression by signaling pathways.

Two complementary methods based on flow cytometry and microscopy are presented which enable the quantification, at the single cell level, of the dynamics of gene expression induced by the activation of a MAPK pathway in yeast.

단일 효모 세포에서 MAPK 유도 표현의 시간적 정량화

The quantification of gene expression at the  single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements  performed at the population ...