우리 산드라 북 아 일 Manosalvas-Kjono, 푸 림 Ladpli 감사, 장치 설계 및 돌연변이 동물의 세대에서 파라 Memon, Divya Gopisetty, 및 베로니카 산체스에 대 한 지원. 이 연구는 지원 했다 NIH 교부 금 R01EB006745 (BLP)에, (에 MBG) R01NS092099, K99NS089942 (MK)를, (ALN)에 F31NS100318 및 받은 자금 유럽 연합의 지평선 2020 연구 및 혁신 유럽 연구 회의 (ERC)에서 프로그램 ( 부여 계약 번호 715243 MK).

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저자는 공개 없다.

이 프로토콜에서는 미세 칩에 갇혀 거 위 피부에 정확한 기계적 자극을 제공 하는 방법을 보여 줍니다. 그것은 생물학 질문에 응답 하기 위한 물리적 자극의 통합을 촉진 하기 위한 것입니다 그리고 생물학 실험실에서 mechanobiology 연구를 합리화 하는 것을 목표로. 이 메서드는 C. 선 충에 mechanosensory 신경의 기능을 평가 하기 위해 이전 분석을 확장 합니다. 이전 양적 및 반 정량적 기법 힘1,34 및 동작35, 측정 하지만 신경 활동의 고해상도 이미지와 통합 하기 어려웠다. 우리는 따라서이 칩의 사용은 현재 응용 프로그램을 확장 하 고 부드러운 터치에 필요한 신경의 자극에 대 한 성능을 최적화 믿습니다. 우리는 거의 최대한 신경 응답에 도달 하는 충분히 강한 자극에 도달 5 µ m, 액추에이터의 편향 최적화. 약간의 변화, 우리는이 디자인 몸 표면36자극 PVD nociceptors 같은 거친 터치 수용 체를 자극 하는 데 사용 될 수 믿습니다.
수정 및 문제 해결 없는 클린 룸 수 8 석판에 사용할 수 있는 경우에, 벤치탑 깨끗 한 상자 또는 SU-8 소프트 리소 그래피 역과 UV 램프, 프로그래밍 가능한 핫 플레이트, 스핀 coaters 사용할 수 있습니다. 미세 클린 룸 시설 사용을 방지 하는 장치 수의 생산에 대 한 저비용 대안 뒤26.
디자인에서 우리는 기존 트래핑 기법, 미세 채널에서 하나의 동물을 움직이게 구현. 함정 디자인은 웜36에서 후 각 감각을 공부 하는 데 사용 되는 장치에서 적응 하지만 웜 운동을 억제 가능한 유일한 선택은 아닙니다. 다른 전략 미세 장치에서 벌레를 잡아 보고 되었습니다: CO2전기 이동, 및 압축 immobilization11,,3738 사용 되 고 통합 될 수을 수정 디자인입니다.
우리는 상용, 압 전 압력 펌프를 사용 하 여 제어할 수 있는 외부 압력 소스에서 최대 800 kPa를 제공 작동 채널에 압력을 전달. 우리는 ~ 450 kPa를 제공 수 있는 연구 건물, 압축 공기에 펌프를 연결. 압축 공기의 아무 소스를 사용할 수 있는 경우 (예를 들어, N2) 압축된, 불활성 가스의 탱크를 사용 수 있습니다. 이 더 높은 압력을 제공 하 고 큰 개 악, 생성의 추가 혜택을 가질 것 이다 하지만 또한 칩에 압력 컨트롤러에 연결 하는 고압 피팅 필요. 부드럽게 PDMS에서 칩을 날조 증가 압력 유도 개 대체 방법입니다.
이 실험에서 압력 펌프의 출구 1 mm 받는 구멍 (예를 들어, 펀치 구멍)을 통해 언론 맞는 20 G 금속-튜브 PE에 삽입 구성 된 접착제와 양면 interconnectors와 연결 PDMS 칩에 연결 되어 튜빙. 이 700 kPa39까지 압력 저항을 보였다. 그러나 주의 해야 합니다 반복된 삽입 하는 동안, 구멍 주위 PDMS 눈물 따라서 성능이 제한 또는 칩을 사용할 수 없게 만드는 경향이 있다. 이러한 이유로, 금속 튜브 한 번 삽입 하 고 왼쪽 제거 하 고 반복적으로 그것을 삽입 하지 않고는 칩에 연결 했다.
중요 한 단계 자극은 피부를 들여쓰기 가압된 작동 채널에 의해 전달 됩니다. 결과 변형 및 mechanoreceptor 신경 활성화는 광학 형광 현미경 confocal 설정에 높은 해상도와 몇 군데 있습니다. 여러 가지 요인 GCaMP 응답의 탐지를 방해 수 있습니다. 첫째, 선 충 C. TRNs21,23, 파란색 조명 후 세포 활성화를 포함 하 여 많은 뉴런에 블루 빛 수용 체30 표현 (488 nm) 빛. 따라서, 이미징 C. 선 충 유전자 인코딩된 칼슘 센서 GCaMP6s를 사용 하 여 활성화할 것 이다 조명, 칼슘 과도23기계적 자극 의해 활성화를 왜곡 시 그것의 신경. 라이트-1 돌연변이 배경에서 작업 하거나 레드 이동 칼슘 활동 센서를 사용 하 여이 confound를 방지 합니다. 자극 프로필에는 몸의의 감도 일치 하지 않으면 두 번째, 기계적으로 유도 된 칼슘 과도 감지 되지 않을 수도 있습니다. 우리를 높은 진폭 단계 및 경사로, 활성화를 검색 하지 못했습니다 하지만 중간 역학 자극 (예를 들어, 200-kPa 버즈)으로 자극 후 매우 높은 신호를 불러 일으켰다. 마지막으로, 반복 된 자극에 TRNs habituate 짧은 배달 (< 60 s) interstimulus 간격. 따라서, 디자인 자극 시퀀스 요법이 니 공부 하 고 있는 경우에서를 제외 하 고 habituation 최소화 하는 것이 중요 하다.
파편과 먼지는 버퍼에서 쉽게 작은 트래핑 채널을 방해할 수 있습니다으로 모든 솔루션, 필터링 것이 좋습니다. 또한, 동물 나이 동기화 해야 하 고 칩의 디자인; 크기 일치 동물 젊은 성인 보다 작은 것 이다 장치를 통해 슬라이드 또는 구속 될 실패 및 큰 동물 트래핑 채널을 입력할 수 없습니다 붕괴 칩 막힘의 위험에. 막힘의 경우 웜 또는 중력 흐름 입구에 과도 한 압력의 적용 채널, 청소 수 있습니다 하지만 또한 피팅의 실패 이어질 수 있습니다.
결과 섹션에서 설명 했 듯이, 여러 가지 요인 분석 프로그램에 오류가 발생할 수 있습니다. 문제는 컴파일 코드에서 발생 하는 경우 확인 하는 가장 최근의 피지 소프트웨어가 실행 되 고 그 피지 최신 Java 컴파일러를 사용 하는 것이 좋습니다. 프로그램을 실행 하지만 예상 되는 경우 결과 확인 하십시오 실제 기계적 자극 기준선과 배경 형광의 적절 한 평가 보장 하기 위해 수행 하기 전에 기록된 영화는 50 프레임 버퍼. 또한, 보기의 필드 활동-종속 (GCaMP6s) 녹색과 빨간색의, 활동-독립 (tagRFP) 채널 각각 카메라 칩의 위와 더 낮은 반에 예상 간주 됩니다. 광 빔 스플리터 이미지 센서의 왼쪽 및 오른쪽 반 투영, 얻기 위해 녹음 하는 동안 원하는 방향 또는 사전 처리 단계에서 이미지 스택 회전 90 ° 카메라를 켜십시오. 또한, 프로그램의 형광에 의해 신경을 식별 하 고 신호 대 잡음 비율 또는 대비 너무 낮은 경우 실패 합니다. 이 경우에, 자극 강도 및 노출 시간 변경 문제를 해결할 수 있습니다. 신경에 경우 신경 위치 해야 시야의 센터에 새로운 수집을 시작 하기 전에 기록 하는 동안 보기 필드의 경우에 프로그램 중지 됩니다.
기술의 한계 현재의 디자인 PVD nociceptors TRNs, 그러나 벌레의 머리 지역, FLP, 화산재 등을 자극 몸의 하지 같은 몸 벽 mechanoreceptor 뉴런의 자극 수 있습니다. 그것은 압력 제한 < 700 kPa. 큰 압력에 대 한 다른 튜브 피팅 채택 될 필요가 있다. 압력 공급 여기 500 kPa을 초과 하지 않았다, 이후 최대 압력을 적용 하는 450 kPa에 국한 되었다. 칼슘 과도 여기 관찰 예상된 신호의 위쪽 경계를 표시 합니다. 우리의 액츄에이터의 설계를 위한 또 다른 한계는 그들의 가로 세로 비율. 원칙적으로, 얇은 격 막 것 큰 개 악, 있지만 높은 종횡비와 구조는 안정적으로 조작 하기가 어렵습니다. 큰 개는 필수, 경우 넓은 액추에이터 또는 양쪽 모두에서 병렬 변형 유용할 수 있습니다, 조 외 에 의해 발표로 29
우리 다이어 프 램 변형 모니터링할 수 있습니다, 비록 작동 채널의 공 압 자극 동안 적용 하는 힘을 측정 하기 어렵습니다. 원리 한계가 이다 액추에이터의 접촉 영역 잘 정의 되지 않습니다. 액추에이터 자체 이며 탄성 deforming 발동, 편향도 증가 함께 연락처 반지름을 변경 하는 동안 때문입니다. 마음에 이러한 경고와 더불어 우리는 5 µ m 들여쓰기 (빈 칩에 약 300 kPa 작동 압력) Petzold 외 의 웜 뻣 뻣 함 견적에 따르면 벌레에 약 3.8 µN을 적용할 전망 이다 예측할 수 있습니다. 그러나 신경 전류의 힘 의존 이후 34 다릅니다 다른 stiffnesses1,34, 벌레에서, 힘 대신 자극 강도의 측정 권장 들여쓰기를 모니터링.
우리는이 프로토콜의 배포 사용자 C. 선 충 을 사용 하 여 모델 시스템으로 하는 mechanobiology 연구에 대 한 마이크로의 활용 분야에서이 중요 한 주제에 따라서 과학의 발전을 가속 도움이 될 것입니다 바랍니다.

터치의 감각 동물을 그들의 환경에 대 한 중요 한 정보를 제공합니다. 적용 된 힘에 따라 터치 인식으로 무해 한, 즐거운, 또는 고통 스러운. 터치 하는 동안 조직 변형 전문된 mechanoreceptor 세포는 피부에 포함 된 가장 일반적으로 이온 채널, 수용 체 단백질을 표현 하 여 감지 됩니다. 터치와 고통 중에 이온 채널 활성화를 연결 하는 힘 인식 단계는 완전히 이해 되지 않는다. 심지어 어떻게 피부 조직을 기계적 변형 및 몸의 긴장에 있는 변화를 탐지 여부 필터 또는1,2,3스트레스에 대 한 알려져 있다. 이해에이 간격, 부분적으로, 세포 수준에서 응답을 관찰 하는 동안 정확한 기계적 stimulations 살아있는 동물의 피부 표면에 적용할 적당 한 도구의 부족에서 발생 합니다. 원자 힘 현미경 검사 법 사용 되었습니다 광범위 하 게 적용 하 고 격리 된 셀4,5 에 힘을 측정 하 고 또한 생활에 있는 Piezo1 수용 체를 활성화 하는 반면 세포6을 비슷한 실험 특히 살아있는 동물을 사용 하 여 C. 선 충, 악명 때문에 피사체의 본질적인 이동성 도전 되었습니다. 이 문제는 전통적으로 무력화 한 천 패드1,7,,89에 개별 동물을 동물 또는 외과-급 cyanoacrylate 접착제를 사용 하 여 피할. 이 접근은 생산성, 되었지만 접착 및 기계적 규격에 소프트 한 표면에 의해 동원 정지에 필요한 기술에 관련 된 제한 사항에는. 마이크로 전략 gluing에 연결 하는 합병증 중 일부를 피할 수 있는 무료 대안 이다.
선 충 류 선 충 C. 완전히 매핑된 신 경계를, 동물의 크기 때문에 적합 한 마이크로 기술 유전자 모델 생물 이다. 마이크로-기반 장치 그렇지 않으면 매우 모바일 동물 고해상도 이미징 및 관련 modulatory 신경 자극의 전달을 수행 하는 동안 제 지 될 수 있는 이점 제공 합니다. 미세의 도움으로 기술, 동물 생활 해10,11, 전체 수명12,13 이상 행동 활동의 모니터링 및 고해상도 없이 움직일 수 있습니다. 신경 활동14,15,,1617의 이미지입니다. 또한, 통증의 감각 그들의 생리1,8, 기계4,,1819, 특징 수에 필요한 많은 mechanoreceptor 신경 세포 및 분자 레벨20,,2122.
C. 선 충 6 TRNs, 동물의 앞쪽 (ALML/R 및 AVM) 중 3 개는 자극과 중 3 개는 동물의 후부 (PLML/R와 PVM) 자극을 사용 하 여 그것의 몸 벽에 부드러운 기계적 자극을 감지 합니다. 생 화 확 적인 신호에는 적용 된 힘을 시험에 필요한 이온 채널 분자는 그것의 TRNs8에 광범위 하 게 연구 되었습니다. 이 문서에서는 고정된 C. 선 충 의 피부에 정확한 기계적인 힘을 적용 하는 연구원을 가능 하 게 한 미세 플랫폼23 제공 광학 이미징에 의해 그것의 내부 조직 변형 밖으로 읽는 동안 거 위. 잘 정의 된 기계적 자극을 제시 하는 것 외에도 칼슘 과도 subcellular 해상도 mechanoreceptor 뉴런에 기록 된 고 형태학 및 해 부 기능 연관 될 수 있습니다. 하나의 동물을 보유 하 고 (그림 1 및 그림 2) 6 공 압 작동 채널 옆의 피부를 선물 하는 중앙 트래핑 채널 장치에 의하여 이루어져 있다. 6 채널 각 벌레의 6 TRNs의 기계적 자극을 제공 하는 트래핑 채널에 따라 배치 됩니다. 이러한 채널 트래핑 상공에서 외부 공기 압력 소스 (그림 1)에 의해 구동 될 수 있다 얇은 PDMS 격 막에 의해 구분 됩니다. 우리는 압력에 대해 편향 보정 하 고이 문서에 측정을 제공. 각 액추에이터 개별적으로 해결 하 고 선택의 mechanoreceptor 자극 하는 데 사용 될 수 있습니다. 압 전 구동 압력 펌프를 사용 하 여 압력을 전달 하지만 어떤 다른 장치를 사용할 수 있습니다. 우리 TRNs에서 vivo에서 활성화 하 고 운영 기기 성인 C. 선 충에 기계적 자극을 제공, 장치에 성인 동물을 로드, 칼슘 이미징 수행 입증 하 압력 프로토콜을 사용할 수 있음을 보여합니다 실험, 그리고 결과 분석입니다. 장치 제조 두 가지 주요 단계로 구성 됩니다: 1) 수-8;에서 금형을 만들기 위해 사진 평판 그리고 2) PDMS 장치를 만들기 위해 성형. 간결성, 명확성을 위해 독자 이전 게시 된 기사와 프로토콜24,25 금형 및 장치를 생산 하는 방법에 대 한 지침은 이라고 합니다.

<table><tbody><tr><td>Chrome mask</td><td>Compugraphics (http://www.compugraphics-photomasks.com/)</td><td></td><td>5&#039;&#039;, designed in AutoCAD (Autodesk, Inc.)</td></tr><tr><td>Chrome mask</td><td>Mitani-Micronics (http://www.mitani-micro.co.jp/en/)</td><td></td><td>5&#039;&#039;, designed in AutoCAD (Autodesk, Inc.)</td></tr><tr><td>Chrome mask</td><td>Kuroda-Electric (http://www.kuroda-electric.eu/</td><td></td><td>5&#039;&#039;, designed in AutoCAD (Autodesk, Inc.)</td></tr><tr><td>4&#039;&#039; Silicon wafer (B-test)</td><td>Stanford Nanofabrication Facility</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2002</td><td>MicroChem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2050</td><td>MicroChem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spin-coater</td><td>Laurell Technologies</td><td>WS-400BZ-6NPP/LITE</td><td></td></tr><tr><td>Exposure timer</td><td>Optical Associates, Inc</td><td>OAI 150</td><td></td></tr><tr><td>Illumination controller</td><td>Optical Associates, Inc</td><td>2105C2</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 developer</td><td>MicroChem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A426F-1GAL</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Fisher Scientific</td><td>A18-4</td><td></td></tr><tr><td>Trichloromethylsilane (TCMS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>92361-500ML</td><td>Caution: TCMS is toxic and water-reactive</td></tr><tr><td>Sylgard 184 Elastomer Kit</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>PDMS prepolymer</td></tr><tr><td>Biopsy punch, 1 mm</td><td>VWR</td><td>95039-090</td><td></td></tr><tr><td>Oxygen Plasma Asher</td><td>Branson/IPC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Small metal tubing (0.635 mm OD, 0.4318 mm ID, 12.7 mm long); gage size 23TW</td><td>New England Small Tube Corporation</td><td>NE-1300-01</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene syringe filter, 0.22 &amp;mu;m</td><td>Thermo Scientific</td><td>725-2520</td><td>to filter all solution, small particles would clog the chip</td></tr><tr><td>Polyethylene tubing; 0.9652 mm OD, 0.5842 mm ID</td><td>Solomon Scientific</td><td>BPE-T50</td><td></td></tr><tr><td>Syringe, 1 ml</td><td>BD Scientific</td><td>309628</td><td>for worm trapping and release</td></tr><tr><td>Syringe, 20 ml</td><td>BD Scientific</td><td>309661</td><td>for gravity-based flow</td></tr><tr><td>Gilson Minipuls 3, Peristaltic pump</td><td>Gilson</td><td></td><td>to suck solutions and worms out of the chip</td></tr><tr><td>Microfluidic flow controller, equipped with 0&amp;ndash;800 kPa pressure channel</td><td>Elveflow</td><td>OB1 MK3</td><td>pressure delivery</td></tr><tr><td>Water-Resistant Clear Poly- urethane Tubing, 4 mm ID and 6 mm OD</td><td>McMaster-Carr</td><td>5195 T52</td><td>connection from house air to pressure pump</td></tr><tr><td>Water-Resistant Clear Polyurethane Tubing, 2.6mm ID and 4mm OD</td><td>McMaster-Carr</td><td>5195 T51</td><td>connect pressure pump to small tubng</td></tr><tr><td>Push-to-Connect Tube Fitting for Air</td><td>McMaster-Carr</td><td>5111K468</td><td>metric - imperial converter</td></tr><tr><td>Straight Connector for 6 mm &amp;times; 1/4&amp;Prime; Tube OD</td><td>McMaster-Carr</td><td>5779 K258</td><td></td></tr><tr><td>Leica DMI 4000 B microscopy system</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>63&amp;times;/1.32 NA HCX PL APO oil objective</td><td>Leica</td><td>506081</td><td></td></tr><tr><td>Hamamatsu Orca-Flash 4.0LT digital CMOS camera</td><td>Hamamatsu</td><td>C11440-42U</td><td></td></tr><tr><td>Lumencor Spectra X light engine</td><td>Lumencor</td><td></td><td>With cyan and green/yellow light source</td></tr><tr><td>Excitation beam splitter</td><td>Chroma</td><td>59022bs</td><td>in the microscope</td></tr><tr><td>Hamamatsu W-view Gemini Image splitting optics</td><td>Hamamatsu</td><td>A12801-01</td><td>to split green and red emission and project them on different areas on the camera chip</td></tr><tr><td>Emission beam splitter</td><td>Chroma</td><td>T570lpxr</td><td>in the image splitter</td></tr><tr><td>Emission filters GCamp6s</td><td>Chroma</td><td>ET525/50m</td><td>in the image splitter</td></tr><tr><td>Emission filters mCherry</td><td>Chroma</td><td>ET632/60m</td><td>in the image splitter</td></tr></tbody></table>

using a microfluidics device for mechanical stimulation and high resolution imaging of c. elegans

Mechanobiology의 한 중앙 목표 단백질 및 세포에 기계적 스트레스의 상호 효과 이해 하는 것입니다. 그 중요성에도 불구 하 고 세포질 기능에 기계적 스트레스의 영향이 아직도 제대로 이해 된다. 몇 가지 도구를 사용 하면 조직과 세포의 동시 변형, 생체, 세포 활동의 이미지와 달리 매우 모바일 모형 유기 체, 선 충 류 등 운동 성의 효율적 제한 때문에이 기술 격차 존재 하는 부분에서 꼬마 선 충. C. 선 충 의 작은 크기에 게 그들 훌륭한 일치 하는 마이크로-기반 연구 장치, 그리고 동원 정지에 대 한 솔루션 제시 된 미세 장치를 사용 하 여. 이 장치 고해상도 이미징에 대 한 허용, 동물 완전히입니다 (PDMS) 및 기계적 힘 또는 electrophysiological 녹음의 배달에 대 한 물리적 액세스를 제한 하는 유리에 쌌 다. 최근, 우리 고해상도 형광 현미경과 호환 되는 트래핑 디자인 공 압 액츄에이터를 통합 하는 장치를 만들었습니다. 작동 채널 벌레 트랩 채널에서 얇은 PDMS 격 막에 의해 구분 됩니다. 이 다이어 프이 램은 외부 소스에서 압력을 적용 하 여 벌레의 측으로 편향. 장치는 개별 mechanosensitive 신경을 대상 수 있습니다. 이러한 뉴런의 활성화에 몇 군데 유전자 인코딩 칼슘 지표와 고해상도. 이 문서는 그들의 터치 수용 체 신경 (TRNs)에 있는 칼슘-민감한 작동 표시등 (GCaMP6s)를 표현 하는 C. 선 충 종자를 사용 하 여 일반적인 메서드를 제공 합니다. 메서드를 조사로 TRNs도 칼슘 센서에 국한 되지 않습니다 하지만 다른 기계적으로 민감한 세포 또는 센서에 확장 될 수 있다.

수-8 리소 그래피와 칩 본딩 리소 그래피 프로토콜 및 PDMS 성형 표준 절차를 따릅니다. 자세한 내용은 다른23,,2425,26찾을 수 있습니다. PDMS는 경화 후 문제 없이 웨이퍼를 벗기다 한다. 수-8 기능 PDMS 필 링 하는 동안 벗어 버리고, 경우 SU-8 접착 레이어 또는 silanization는 충분 하지 않았다. 경우 유리 coverslips 및 PDMS 칩의 플라즈마-활성화 약한 결합 트래핑 채널 또는 성능이 저하 되 고 자극의 부재에서 발생 하는 공 압 액추에이터 누설 될 수 있습니다 충분 하지 않습니다. 유체 누설은 분명, 칩 사용 되지 않습니다.
액츄에이터 성능 PDMS 액츄에이터 및 공기 저수지에 칩을 연결 하는 튜브의 모든 제대로 격 막의 적절 한 공 압 작동 되도록 봉인 해야 합니다. 반복된 삽입 및 제거 PE 튜브 (배관)의 PDMS 구멍 손상 되며 압력에 있는 감소에 지도. 이러한 압력 손실 액추에이터 편향과 고정된 동물의 피부에 적용 되는 힘을 제한 합니다. 횡 경 막의 편향 된 빈 칩 (동물 존재)를 사용 하 여 원하는 압력으로 여러 작동 사이클을 수행 하 고 이론적인 예측 양적 값을 비교 하 여 측정할 수 있습니다. 멤브레인 및 웜 경계 시각화 하기 어렵기 때문에 횡 경 막의 편향 되지 트랩 채널에서 동물의 존재에 측정 했다. 이것은 덫을 놓은 동물 정밀 교정 불가능 합니다. 표 1 압력의 기능으로 예상된 편향을 나열합니다. 이러한 값은 탄성 판 이론을 사용 하 여 계산 된 및 Nekimken 외 에 세부 정보를 찾을 수 있습니다. 23 이 관계 칩 주조 및 칩 및 유리 및 물개 압력 소스에 칩을 연결 사이 결합의 무결성 등 다른 요인 중에 생성 된 격 막 두께에 차이 따라 달라질 전망 이다. 여기, 값 1 µ m에서 450 kPa의 압력을 초과 하지 않는 약간의 변형으로 재현 했다. 우리는 모든 3 개의 다른 자극 프로필에 대 한 격 막의 성능 특징 고 Nekimken 외에 관심이 있는 독자를 참조 하십시오. 23 요약, 거기에은 값은 표 1에서 이탈 하는 경우 고려해 야 할 몇 가지 요소: 1) 튜브 또는 튜브 커넥터에 누출, 2)는 PDMS는 베이스 폴리머 경화제의 다른 비율에서 발생할 수 있습니다, 다른 탄성 또는 3)는 PDMS는 세 고 crosslink 시간이 지남에. 따라서, 응용 프로그램의 한 달 안에 준비 된 칩의 사용을 권장 합니다.
트랩핑 성능 칩의 입구에는 벌레를 삽입 한 후 주사기와 부드러운 압력 트래핑 채널 안에 하나의 단일 동물을 배치 하 고 6 액츄에이터 (그림 1)와 함께 그것의 피부를 선물 해야 합니다. 중요 한 것은, 동물의 코 않습니다 반드시 필요가 없습니다 버퍼 저수지로 내 다. 대신, 그런은 neurite은 가까운 액추에이터와 그것의 세포 체는 현미경의 시야 내에서 동물의 위치를 더 중요 하다. 최적의 신경 활성화를 달성 하기는 액추에이터의 셀 몸 앞쪽 거짓말 액추에이터 몸과 셀 사이의 거리를 조정 한다. 우리의 경험에서는, 신경 세포 체를 후부, 아무 활성화도 걸릴 것 이다 장소 및 칼슘 자극된 과도 됩니다 결 석. 적절 한 동원 정지 젊은 성인 또는 1 일 오래 된 광고에 나온 것 (두 나가에 대 한 최적화 된 장치 같은 마스크에 사용할 수 있습니다) 달성 될 수 있다. 작은 동물 컬렉션 저수지에 또는 트래핑 채널 내 옆으로 이동. 너무 큰 동물 TRNs mechanoreceptor 과도 검색 후속 실패의 조기 활성화 될 수 있습니다 채널에 압착 될 것입니다. 또한, 큰 벌레의 제거는 도전, 동물의 죽음에 지도 및/또는 장치의 막힘. 이 디자인으로, PLM 신경 일반적으로 수 없습니다 될 움직일 수 완전히, 그래서 그것은 수평 및 수직으로 이동 하 게 자유롭게. 비록 우리가 성공적으로 PLM 신경 활성화, 꼬리의 수직 운동으로 인해 어렵습니다 이러한 신경 세포에서 칼슘 과도 기록. 또 다른 트랩 디자인은 PLM33에서 사용 되었습니다.
칼슘 과도 및 분석의 이미징 한 번에, 동물 6 액추에이터 중 하나를 사용 하 여 자극 될 수 있습니다. 6 액츄에이터는 각각 6 TRNs의 기계적 자극을 제공 하는 위치가 결정 됩니다. 미세 유량 450 kPa 사내 압력 소스에 연결 자극 프로토콜 2-s 275 kPa 단계, 2-s 0-275 kPa 램프 및 2-s 버즈 (75 kPa, 275 kPa 단계와 겹쳐 10 Hz 사인)의 구성 된 동물을 제공 하는 데 사용 되었다 각 10-s 대기 기간으로 구분. 칼슘 과도 동시에 기록 된 이미지 시퀀스는 피지, 우리의 GitHub 계정 (위 참조 및 https://github.com/HFehlauer/Poking-Analyzer)에 사용할 수 있는 사용자 작성 소프트웨어를 사용 하 여 분석 되었다. 우리는 압력 경사로 압력 단계 활성화 TRNs 자극 400 kPa 이상 압력을 달성 하는 경우에 발견. 대조적으로, 모든 TRNs 압력 < 275 kPa에서 정현파, 10 Hz 버즈를 사용 하 여 자극된의 강력한 활성화 (그림 4) 관찰 되었다. 일반적으로, TRNs 간단한 정현파 자극에 더 나은 응답 (전화 '버즈'), 다른 방법론1,9를 사용 하 여 이전 보고서와 일치 하 여. 버즈와 함께 자극은 고효율, 선도 ~ 시련과 모든 뉴런에는 활성화의 90% 테스트 (그림 4). 놀랍게도, 강한 상관 관계가 여부 자극은 등 또는 복 부 측에 적용 된 고 셀 바디와는 neurite에 자극 위치 사이의 거리의 독립에 관찰 했다. 미래 연구는 최대 응답의 지연/자극 거리와 관련이 있는지 여부를 조사 해야 합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56530/56530fig1.jpg"> 그림 1: 칩 설계의 개요. (A)는 포토 마스크 및 모든 커넥터가 표시 결과 칩의 회로도 레이아웃. 6 개폐 손가락, 3 중앙 트래핑 채널의 각 측면에 있다. 눈금 막대 = 3 m m. (B) 미세 소자의 PDMS와는 coverslip에 접착 사진과 웜 입구와 웜 콘센트에서 배관에 연결. 반면 다른 다섯은 하지 작동 손가락의 단 하나 압력 소스에 연결 됩니다. 그림의 부분 참조23 크리에이 티브 공통 라이센스에서 재현 되어 있다. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56530/56530fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56530/56530fig2.jpg"> 그림 2: 근접 중앙 트래핑 채널 및 트래핑 절차의. 트래핑 채널의 그림 (A) 회로도 벌레 입구 쪽에서 기둥 동양 벌레와 동물의 로드를 용이 하 게 도움이. 개폐 손가락 가압 수 고 갇혀 견본에는 얇은 막 들여쓰기. 눈금 막대 = 200 µ m. (B) 대표 비디오 프레임의 수평 채널에 갇혀 되는 벌레. 채널은 벌레 6 공 압 액추에이터 걸쳐 누워 온다 되도록 설계 되었습니다. 꼬리는 왼쪽으로, 오른쪽 머리입니다. 개별 터치 수용 체 신경 (TRNs)의 위치는 화살표로 표시 하 고 그림에 표시 된. 눈금 막대 (모든 패널)에서 100 µ m =. 그림의 부분 참조23 크리에이 티브 공통 라이센스에서 재현 되어 있다. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56530/56530fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56530/56530fig3.jpg"> 그림 3: 칼슘 성분이 프로토콜 인수 분석 제공된 피지 플러그인의 개요. 소프트웨어는 그래픽 사용자 인터페이스를 시작합니다. 사용자 인터페이스의 첫 번째 탭 ("열려 있는 비디오") 단추 비디오를, 경로 열린된 비디오의 첫 번째 프레임을 표시 합니다. 두 번째 탭 ("정의 ROIs") 버튼 정의 터치 수용 체 신경, "정의 액추에이터" 버튼과 "정의 액추에이터" 버튼을 활성화 하기 위한 확인란을 포함 합니다. 하단 부분에는 비디오의 첫 번째 프레임이 표시 됩니다. 세 번째 탭 (이 하 "분석")의 상단 부분에서 이미지 분석을 위한 조정 가능한 매개 변수가 표시 됩니다. 중간 부분 "분석 시작" 버튼을 보여 줍니다. 아래 부분에 진행률 표시줄 현재 분석의 진행 상황을 보여 줍니다. 4 탭, "결과", 결과 시간이 지남에 상대적 형광 강도의 그래프로 표시 됩니다. 아래 부분에서는 결과 테이블을 저장 하는 버튼입니다. "도움말", 다섯 번째 탭에서 도움말 텍스트 분석 소프트웨어와 교육에 대 한 요구 사항을 사용 하는 방법에 보여주는 표시 됩니다. 그림 참조23 크리에이 티브 공통 라이센스 아래에서 적응. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56530/56530fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56530/56530fig4.jpg"> 그림 4: 기계적 자극에 응답 하는 개별 뉴런. 버즈와 함께 기계적 자극 전후 AVM 터치 수용 체 신경 이라고 표시 된 GCamP6s의 (A) 대표 형광 현미경 사진. 눈금 막대 = 10 µ m. 색 눈금 1500-3500 회색 값을 =. (B) 자극 프로토콜 2 s 격 막 여기 275 kPa 단계, 275 kPa 램프 및 275 kPa 단계 (버즈) 겹쳐 사인 (75 kPa, 10 Hz) 대표를 포함 하 여. (C) 정규화 GCamP6s 강도 추적 AVM 자극된에서 야생 유형 동물의 B에 표시 된 프로필 기록 (음영된 지역으로 ± sem의 의미) (녹색, n = 14) 및 동물 돌연변이 mechanoreceptor 채널 소 단위 멕-4 (블루, n = 10), 즉 기계적 스트레스에 대 한 응답을 촉진 하기 위하여 알려진입니다. 이 과도 적용된 기계적 자극에 의해 유도 되는 나타냅니다. 그림의 부분 참조23 크리에이 티브 공통 라이센스에서 재현 되어 있다. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56530/56530fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>압력 (kPa)</td>
			<td>편향 (µ m)를 의미</td>
			<td>SD</td>
			<td>예상된 편향 (µ m)</td>
		</tr>
<tr>
<td>0</td>
			<td>-0.01</td>
			<td>0.01</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>50</td>
			<td>0.77</td>
			<td>0.26</td>
			<td>0.607143</td>
		</tr>
<tr>
<td>100</td>
			<td>1.57</td>
			<td>0.58</td>
			<td>1.21429</td>
		</tr>
<tr>
<td>150</td>
			<td>2.32</td>
			<td>0.65</td>
			<td>1.82143</td>
		</tr>
<tr>
<td>200</td>
			<td>3.13</td>
			<td>0.74</td>
			<td>2.42857</td>
		</tr>
<tr>
<td>250</td>
			<td>3.86</td>
			<td>0.79</td>
			<td>3.03571</td>
		</tr>
<tr>
<td>300</td>
			<td>4.61</td>
			<td>0.79</td>
			<td>3.64286</td>
		</tr>
<tr>
<td>350</td>
			<td>5.3</td>
			<td>0.82</td>
			<td>4.25</td>
		</tr>
<tr>
<td>400</td>
			<td>5.92</td>
			<td>0.82</td>
			<td>4.85714</td>
		</tr>
<tr>
<td>450</td>
			<td>6.43</td>
			<td>0.75</td>
			<td>5.46429</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 0-450에서 배열 하는 적용 된 압력에 대 한 실험적인 편향 값 예상 kPa와 그들의 이론적인 예측. 데이터 단계 자극에 대 한 파생. 의미 ± sd. 이러한 데이터는 빈 트래핑 채널 인수 했다.

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Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. elegans

Mechanobiology 연구에 대 한 새로운 도구 어떻게 기계적 스트레스를 이해 하는 데 필요한 생화학 경로 활성화 하 고 elicits 생물학 응답. 여기, 우리 세포 응답의 고해상도 이미지를 수 있도록 미세 트랩으로 움직이지 동물의 선택적 기계적 자극에 대 한 새로운 방법을 전시.

기계적 자극 및 높은 해상도 C. 선 충 의 이미징에 대 한 마이크로 장치를 사용 하 여

One central goal of mechanobiology is to understand the reciprocal effect of mechanical stress on proteins and cells. Despite its importance, the ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. elegans

9.8K 조회수.  Stanford University. Mechanobiology 연구에 대 한 새로운 도구 어떻게 기계적 스트레스를 이해 하는 데 필요한 생화학 경로 활성화 하 고 elicits 생물학 응답. 여기, 우리 세포 응답의 고해상도 이미지를 수 있도록 미세 트랩으로 움직이지 동물의 선택적 기계적 자극에 대 한 새로운 방법을 전시.

비디오: Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. elegans

Assaying &beta;-amyloid Toxicity using a Transgenic C. elegans Model

Accumulation of the &beta;-amyloid peptide (A&beta;) is generally believed to be central to the induction of Alzheimer's disease, but the relevant mechanism(s) of toxicity are still unclear. A&beta; is also deposited intramuscularly in Inclusion Body Myositis, a severe human myopathy. The intensely studied nematode worm Caenorhabditis elegans can be transgenically engineered to express human A&beta;. Depending on the tissue or timing of A&beta; expression, transgenic worms can have readily measurable phenotypes that serve as a read-out of A&beta; toxicity. For example, transgenic worms with pan-neuronal A&beta; expression have defects is associative learning (Dosanjh et al. 2009), while transgenic worms with constitutive muscle-specific expression show a progressive, age-dependent paralysis phenotype (Link, 1995; Cohen et al. 2006). One particularly useful C. elegans model employs a temperature-sensitive mutation in the mRNA surveillance system to engineer temperature-inducible muscle expression of an A&beta; transgene, resulting in a reproducible paralysis phenotype upon temperature upshift (Link et al. 2003). Treatments that counter A&beta; toxicity in this model [e.g., expression of a protective transgene (Hassan et al. 2009) or exposure to Ginkgo biloba extracts (Wu et al. 2006)] reproducibly alter the rate of paralysis induced by temperature upshift of these transgenic worms. Here we describe our protocol for measuring the rate of paralysis in this transgenic C. elegans model, with particular attention to experimental variables that can influence this measurement.

Assaying &#946;-amyloid Toxicity using a Transgenic C. elegans Model

The intensely studied nematode worm Caenorhabditis elegans can be transgenically engineered to express the human &beta;-amyloid peptide (A&beta;). Induced expression of A&beta; in C. elegans muscle leads to a rapid, reproducible paralysis phenotype that can be used to monitor treatments that modulate A&beta; toxicity.

유전자 변형을 사용하여 시금 β - 아밀로이드 독성 C. 엘레간스 모델

Accumulation of the &beta;-amyloid peptide (A&beta;) is generally believed to be central to the induction of Alzheimer's disease, but the relevant ...

연구

신경과학

Combining Transcranial Magnetic Stimulation and fMRI to Examine the Default Mode Network

The default mode network is a group of brain regions that are active when an individual is not focused on the outside world and the brain is at "wakeful rest."1,2,3 It is thought the default mode network corresponds to self-referential or "internal mentation".2,3
It has been hypothesized that, in humans, activity within the default mode network is correlated with certain pathologies (for instance, hyper-activation has been linked to schizophrenia 4,5,6 and autism spectrum disorders 7 whilst hypo-activation of the network has been linked to Alzheimer's and other neurodegenerative diseases 8). As such, noninvasive modulation of this network may represent a potential therapeutic intervention for a number of neurological and psychiatric pathologies linked to abnormal network activation. One possible tool to effect this modulation is Transcranial Magnetic Stimulation: a non-invasive neurostimulatory and neuromodulatory technique that can transiently or lastingly modulate cortical excitability (either increasing or decreasing it) via the application of localized magnetic field pulses.9
In order to explore the default mode network's propensity towards and tolerance of modulation, we will be combining TMS (to the left inferior parietal lobe) with functional magnetic resonance imaging (fMRI). Through this article, we will examine the protocol and considerations necessary to successfully combine these two neuroscientific tools.

In this article, we examine the methodology and considerations relevant to the combination of TMS and fMRI to examine the effects of brain stimulation on the default network.

기본 모드 네트워크를 검사하기 위해 Transcranial 자석 자극과 fMRI를 결합

The default mode network is a group of brain regions that are active when an individual is not focused on the outside world and the brain is at "wakeful ...

TMS: Using the Theta-Burst Protocol to Explore Mechanism of Plasticity in Individuals with Fragile X Syndrome and Autism

Fragile X Syndrome (FXS), also known as Martin-Bell Syndrome, is a genetic abnormality found on the X chromosome.1,2 Individuals suffering from FXS display abnormalities in the expression of FMR1 - a protein required for typical, healthy neural development.3 Recent data has suggested that the loss of this protein can cause the cortex to be hyperexcitable thereby affecting overall patterns of neural plasticity.4,5
In addition, Fragile X shows a strong comorbidity with autism: in fact, 30% of children with FXS are diagnosed with autism, and 2 - 5% of autistic children suffer from FXS.6
Transcranial Magnetic Stimulation (a non-invasive neurostimulatory and neuromodulatory technique that can transiently or lastingly modulate cortical excitability via the application of localized magnetic field pulses 7,8) represents a unique method of exploring plasticity and the manifestations of FXS within affected individuals. More specifically, Theta-Burst Stimulation (TBS), a specific stimulatory protocol shown to modulate cortical plasticity for a duration up to 30 minutes after stimulation cessation in healthy populations, has already proven an efficacious tool in the exploration of abnormal plasticity.9,10 
Recent studies have shown the effects of TBS last considerably longer in individuals on the autistic spectrum - up to 90 minutes.11 This extended effect-duration suggests an underlying abnormality in the brain's natural plasticity state in autistic individuals - similar to the hyperexcitability induced by Fragile X Syndrome.
In this experiment, utilizing single-pulse motor-evoked potentials (MEPs) as our benchmark, we will explore the effects of both intermittent and continuous TBS on cortical plasticity in individuals suffering from FXS and individuals on the Autistic Spectrum.

In this article, we examine the effects of Theta-Burst TMS stimulation on cortical plasticity in individuals suffering from Fragile X syndrome and individuals on the autistic spectrum.

TMS : 연약한 X 증후군 및 자폐증과 개인의 소성의 Mechasnism를 탐험하는 세타 - 버스트 프로토콜을 사용하여

Fragile X Syndrome (FXS), also known as Martin-Bell Syndrome, is a genetic abnormality found on the X chromosome.1,2 Individuals suffering from FXS ...

State-Dependency Effects on TMS:  A Look at Motive Phosphene Behavior

Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a non-invasive neurostimulatory and neuromodulatory technique that can transiently or lastingly modulate cortical excitability (either increasing or decreasing it) via the application of localized magnetic field pulses.1,2 Within the field of TMS, the term state dependency refers to the initial, baseline condition of the particular neural region targeted for stimulation. As can be inferred, the effects of TMS can (and do) vary according to this primary susceptibility and responsiveness of the targeted cortical area.3,4,5

In this experiment, we will examine this concept of state dependency through the elicitation and subjective experience of motive phosphenes. Phosphenes are visually perceived flashes of small lights triggered by electromagnetic pulses to the visual cortex. These small lights can assume varied characteristics depending upon which type of visual cortex is being stimulated. In this particular study, we will be targeting motive phosphenes as elicited through the stimulation of V1/V2 and the V5/MT+ complex visual regions.6

In this article, we examine the effects of visually relevant state dependency on TMS induced motive phosphenic presentations.

TMS의 국가 종속성 효과 : 동기 Phosphene 동작 좀보세요

Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a non-invasive neurostimulatory and neuromodulatory technique that can transiently or lastingly modulate ...

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are available for microfluidic devices using soft lithography techniques 1-3. Microfluidic devices have been used for sub-cellular imaging 4,5, in vivo laser microsurgery 2,6 and cellular imaging 4,7. In vivo imaging requires immobilization of organisms. This has been achieved using suction 5,8, tapered channels 6,7,9, deformable membranes 2-4,10, suction with additional cooling 5, anesthetic gas 11, temperature sensitive gels 12, cyanoacrylate glue 13 and anesthetics such as levamisole 14,15. Commonly used anesthetics influence synaptic transmission 16,17 and are known to have detrimental effects on sub-cellular neuronal transport 4. In this study we demonstrate a membrane based poly-dimethyl-siloxane (PDMS) device that allows anesthetic free immobilization of intact genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans (C. elegans), Drosophila larvae and zebrafish larvae. These model organisms are suitable for in vivo studies in microfluidic devices because of their small diameters and optically transparent or translucent bodies. Body diameters range from ~10 &mu;m to ~800 &mu;m for early larval stages of C. elegans and zebrafish larvae and require microfluidic devices of different sizes to achieve complete immobilization for high resolution time-lapse imaging. These organisms are immobilized using pressure applied by compressed nitrogen gas through a liquid column and imaged using an inverted microscope. Animals released from the trap return to normal locomotion within 10 min.
We demonstrate four applications of time-lapse imaging in C. elegans namely, imaging mitochondrial transport in neurons, pre-synaptic vesicle transport in a transport-defective mutant, glutamate receptor transport and Q neuroblast cell division. Data obtained from such movies show that microfluidic immobilization is a useful and accurate means of acquiring in vivo data of cellular and sub-cellular events when compared to anesthetized animals (Figure 1J and 3C-F 4).
Device dimensions were altered to allow time-lapse imaging of different stages of C. elegans, first instar Drosophila larvae and zebrafish larvae. Transport of vesicles marked with synaptotagmin tagged with GFP (syt.eGFP) in sensory neurons shows directed motion of synaptic vesicle markers expressed in cholinergic sensory neurons in intact first instar Drosophila larvae. A similar device has been used to carry out time-lapse imaging of heartbeat in ~30 hr post fertilization (hpf) zebrafish larvae. These data show that the simple devices we have developed can be applied to a variety of model systems to study several cell biological and developmental phenomena in vivo.

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

A simple microfluidic device has been developed to perform anesthetic free in vivo imaging of C. elegans, intact Drosophila larvae and zebrafish larvae. The device utilizes a deformable PDMS membrane to immobilize these model organisms in order to perform time lapse imaging of numerous processes such as heart beat, cell division and sub-cellular neuronal transport. We demonstrate the use of this device and show examples of different types of data collected from different model systems.

에 대한 간단한 마이크로 유체 장치<em&gt; 생체 내</em의&gt; 이미징<em&gt; C. elegans</em&gt;<em&gt; Drosophila</em&gt;와 Zebrafish

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are ...

생체공학

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion

The nematode Caenorhabditis elegans is a versatile model organism for biomedical research because of its conservation of disease-related genes and pathways as well as its ease of cultivation. Several C. elegans disease models have been reported, including neurodegenerative disorders such as Parkinson's disease (PD), which involves the degeneration of dopaminergic (DA) neurons 1. Both transgenes and neurotoxic chemicals have been used to induce DA neurodegeneration and consequent movement defects in worms, allowing for investigations into the basis of neurodegeneration and screens for neuroprotective genes and compounds 2,3.
Screens in lower eukaryotes like C. elegans provide an efficient and economical means to identify compounds and genes affecting neuronal signaling. Conventional screens are typically performed manually and scored by visual inspection; consequently, they are time-consuming and prone to human errors. Additionally, most focus on cellular level analysis while ignoring locomotion, which is an especially important parameter for movement disorders.
We have developed a novel microfluidic screening system (Figure 1) that controls and quantifies C. elegans' locomotion using electric field stimuli inside microchannels. We have shown that a Direct Current (DC) field can robustly induce on-demand locomotion towards the cathode ("electrotaxis") 4. Reversing the field's polarity causes the worm to quickly reverse its direction as well. We have also shown that defects in dopaminergic and other sensory neurons alter the swimming response 5. Therefore, abnormalities in neuronal signaling can be determined using locomotion as a read-out. The movement response can be accurately quantified using a range of parameters such as swimming speed, body bending frequency and reversal time.
Our work has revealed that the electrotactic response varies with age. Specifically, young adults respond to a lower range of electric fields and move faster compared to larvae 4. These findings led us to design a new microfluidic device to passively sort worms by age and phenotype 6.
We have also tested the response of worms to pulsed DC and Alternating Current (AC) electric fields. Pulsed DC fields of various duty cycles effectively generated electrotaxis in both C. elegans and its cousin C. briggsae 7. In another experiment, symmetrical AC fields with frequencies ranging from 1 Hz to 3 KHz immobilized worms inside the channel 8.
Implementation of the electric field in a microfluidic environment enables rapid and automated execution of the electrotaxis assay. This approach promises to facilitate high-throughput genetic and chemical screens for factors affecting neuronal function and viability.

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion

A semi-automated micro-electro-fluidic method to induce on-demand locomotion in Caenorhabditis elegans is described. This method is based on the neurophysiologic phenomenon of worms responding to mild electric fields (&#x201C;electrotaxis&#x201D;) inside microfluidic channels. Microfluidic electrotaxis serves as a rapid, sensitive, low-cost, and scalable technique to screen for factors affecting neuronal health.

의 주문형 정량 분석​​을위한 미세 유체 기반 Electrotaxis<em&gt; Caenorhabditis의 엘레</em&gt; &#39;로코

The nematode Caenorhabditis elegans is a versatile model organism for biomedical research because of its conservation of disease-related genes and ...

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved useful as a convenient live imaging platform providing capabilities for precise control of experimental conditions in real time. In this article, we demonstrate live imaging of individual worms employing WormSpa, a previously-published custom microfluidic device. In the device, multiple worms are individually confined to separate chambers, allowing multiplexed longitudinal surveillance of various biological processes. To illustrate the capability, we performed proof-of-principle experiments in which worms were infected in the device with pathogenic bacteria, and the dynamics of expression of immune response genes and egg laying were monitored continuously in individual animals. The simple design and operation of this device make it suitable for users with no previous experience with microfluidic-based experiments. We propose that this approach will be useful for many researchers interested in longitudinal observations of biological processes under well-defined conditions.

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

In this article, we demonstrate live imaging of individual worms employing a custom microfluidic device. In the device, multiple worms are individually confined to separate chambers, allowing multiplexed longitudinal surveillance of various biological processes.

꼬마 선 충 에 경도 이미징을 위한 미세 플랫폼

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved ...

Immobilization of Live Caenorhabditis elegans Individuals Using an Ultra-thin Polydimethylsiloxane Microfluidic Chip with Water Retention

Radiation is widely used for biological applications and for ion-beam breeding, and among these methods, microbeam irradiation represents a powerful means of identifying radiosensitive sites in living organisms. This paper describes a series of on-chip immobilization methods developed for the targeted microbeam irradiation of live individuals of Caenorhabditis elegans. Notably, the treatment of the polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic chips that we previously developed to immobilize C. elegans individuals without the need for anesthesia is explained in detail. This chip, referred to as a worm sheet, is resilient to allow the microfluidic channels to be expanded, and the elasticity allows animals to be enveloped gently. Also, owing to the self-adsorption capacity of the PDMS, animals can be sealed in the channels by covering the surface of the worm sheet with a thin cover film, in which animals are not pushed into the channels for enclosure. By turning the cover film over, we can easily collect the animals. Furthermore, the worm sheet shows water retention and allows C. elegans individuals to be subjected to microscopic observation for long periods under live conditions. In addition, the sheet is only 300 &#181;m thick, allowing heavy ions such as carbon ions to pass through the sheet enclosing the animals, thus allowing the ion particles to be detected and the applied radiation dose to be measured accurately. Because selection of the cover films used for enclosing the animals is very important for successful long-term immobilization, we conducted the selection of the suitable cover films and showed a recommended one among some films. As an application example of the chip, we introduced imaging observation of muscular activities of animals enclosing the microfluidic channel of the worm sheet, as well as the microbeam irradiation. These examples indicate that the worm sheets have greatly expanded the possibilities for biological experiments.

Immobilization of Live Caenorhabditis elegans Individuals Using an Ultra-thin Polydimethylsiloxane Microfluidic Chip with Water Retention

A series of immobilization methods has been established to allow the targeted irradiation of live Caenorhabditis elegans individuals using a recently developed ultra-thin polydimethylsiloxane microfluidic chip with water retention. This novel on-chip immobilization is also adequate for imaging observations. The detailed treatment and application examples of the chip are explained.

물 유지와 울트라입니다 미세 칩을 사용 하 여 라이브 꼬마 선 충 의 동원 정지

Radiation is widely used for biological applications and for ion-beam breeding, and among these methods, microbeam irradiation represents a powerful means ...

Using an Adapted Microfluidic Olfactory Chip for the Imaging of Neuronal Activity in Response to Pheromones in Male C. Elegans Head Neurons

The use of calcium indicators has greatly enhanced our understanding of neural dynamics and regulation. The nematode Caenorhabditis elegans, with its completely mapped nervous system and transparent anatomy, presents an ideal model for understanding real-time neural dynamics using calcium indicators. In combination with microfluidic technologies and experimental designs, calcium-imaging studies using these indicators are performed in both free-moving and trapped animals. However, most previous studies utilizing trapping devices, such as the olfactory chip described in Chronis et al., have devices designed for use in the more common hermaphrodite, as the less common male is both morphologically and structurally dissimilar. An adapted olfactory chip was designed and fabricated for increased efficiency in male neuronal imaging with using young adult animals. A turn was incorporated into the worm loading port to rotate the animals and to allow for the separation of the individual neurons within a bilateral pair in 2D imaging. Worms are exposed to a controlled flow of odorant within the microfluidic device, as described in previous hermaphrodite studies. Calcium transients are then analyzed using the open-source software ImageJ. The procedure described herein should allow for an increased amount of male-based C. elegans calcium imaging studies, deepening our understanding of the mechanisms of sex-specific neuronal signaling.

Using an Adapted Microfluidic Olfactory Chip for the Imaging of Neuronal Activity in Response to Pheromones in Male C. Elegans Head Neurons

The use of an adapted &#34;olfactory chip&#34; for the efficient calcium imaging of C. elegans males is described here. Studies of male exposure to glycerol and a pheromone are also shown.

남성 선 충 C. 머리 신경에 있는 페로몬에 대 한 응답에서 신경 활동의 이미징에 대 한 적응된 미세 후 각 칩을 사용 하 여

The use of calcium indicators has greatly enhanced our understanding of neural dynamics and regulation. The nematode Caenorhabditis elegans, with its ...

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) have proved to be a valuable model system for studying developmental and cell biological processes. Understanding these biological processes often requires long-term and repeated imaging of the same animal. Long recovery times associated with conventional immobilization methods done on agar pads have detrimental effects on animal health making it inappropriate to repeatedly image the same animal over long periods of time. This paper describes a microfluidic chip design, fabrication method, on-chip C. elegans culturing protocol, and three examples of long-term imaging to study developmental processes in individual animals. The chip, fabricated with polydimethylsiloxane and bonded on a cover glass, immobilizes animals on a glass substrate using an elastomeric membrane that is deflected using nitrogen gas. Complete immobilization of C. elegans enables robust time-lapse imaging of cellular and sub-cellular events in an anesthetic-free manner. A channel geometry with a large cross-section allows the animal to move freely within two partially sealed isolation membranes permitting growth in the channel with a continuous food supply. Using this simple chip, imaging of developmental phenomena such as neuronal process growth, vulval development, and dendritic arborization in the PVD sensory neurons, as the animal grows inside the channel, can be performed. The long-term growth and imaging chip operates with a single pressure line, no external valves, inexpensive fluidic consumables, and utilizes standard worm handling protocols that can easily be adapted by other laboratories using C. elegans.

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

The protocol describes a simple microfluidic chip design and microfabrication methodology used to grow C. elegans in presence of a continuous food supply for up to 36 h. The growth and imaging device also enables intermittent long-term high-resolution imaging of cellular and sub-cellular processes during development for several days.

Caenorhabditis elegans의 장기 성장 및 이미징을위한 간단한 미세 유체 칩

Caenorhabditis elegans (C. elegans) have proved to be a valuable model system for studying developmental and cell biological processes. Understanding ...

기계적 자극 및 높은 해상도 C. 선 충 의 이미징에 대 한 마이크로 장치를 사용 하 여

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TMS : 연약한 X 증후군 및 자폐증과 개인의 소성의 Mechasnism를 탐험하는 세타 - 버스트 프로토콜을 사용하여

TMS의 국가 종속성 효과 : 동기 Phosphene 동작 좀보세요

에 대한 간단한 마이크로 유체 장치

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