우리는 그녀의 기술 지원 및이 원고 준비에 대 한 페넬로페 가르시아를 감사합니다. 이 작품은 Loma Linda 대학 (681205-2967)에서 약 학과에서 연구 혁신 그랜트 (RIG)와 XT에 국가 다 발성 경화 증 사회 (PP1685)에서 파일럿 그랜트에 의해 지원 되었다.

모든 실험 기관 동물 관리 및 사용 프로토콜 동물 관리 및 사용 텍사스 대학교 엘 파소 그리고 Loma Linda 대학에 위원회에 의해 승인에 따라 수행 되었다.
1. 단백질의 전체 길이 덮고 OLP 라이브러리의 생성
<ol>
	<li>설계는 OLP 라이브러리는 모든 펩 티 드, 길이 15-메 르 이며 인접 한 펩 티 드 11 아미노산에 의해 중복. 참고: MOG OLP 연구에 MOG 전조 [생쥐]의 시퀀스 검색 NCBI 단백질 데이터베이스에서이 링크를 수행 하 여: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/NP_034944. 집 고 양이 전조 (247 아미노산), 신호 및 성숙한 펩 티 드를 포함, 보고 된 Qa-1 (HLA-E) epitopes의 대부분은 신호 펩 티 드 (예: Qdm1)에 위치 해 있기 때문에 사용 되었다. 그것의 N-말단에서 시작, 15-메 르 펩 티 드의 시퀀스를 두 개의 인접 한 펩 티 드 11 아미노산 (그림 1)에 의해 중첩 확인 되었다. 따라서, 정확 하 게 59 OLPs 247 아미노산 MOG 전조에서 확인 되었다. 그러나, 마지막 OLP 단백질의 길이 따라 15-메 르 12에서 배열할 수 있다. 우리와 다른 것으로 나타났습니다 15-메 르 펩 티 드, 또는 대 식 세포, 모 수석 세포 (DCs)에 추가 될 때 효율적으로 될 수 있기 때문에 15-메 르 라이브러리 선택 하는 또한,+ T14,15 세포 CD8 epitopes 인식으로 처리 .</li>
	<li>상업적으로 각 개별 펩 티 드를 구입. 펩 티 드 당 5 mg 심사에 대 한 충분 해야 합니다. 잘린된 펩 티 드 (단계 6.1) OLPs desalted 펩 티 드 (순도 약 50-70%)를 하실 수 있습니다. 최적의 펩 티 드 (단계 6.2) tetramer의 세대와 미래 생물학 분석 사용 될의 순도 이어야 한다 &#62; 90%. 무 균 조건 하에서 펩 티 드 reconstitute</li>
	<li>100 %DMSO 50 mg/mL 개별 펩 티 드 주식을 확인 합니다. 각 펩 티 드의 5 mg 추가 각 튜브에 DMSO의 100 μ 혼합, 그리고-20 ° c.에 펩 티 드 저장 이러한 주식 CD8의 세대에 대 한 OLP_pool 재고를 확인 하는 데 사용 됩니다+ T 셀 라인 반응 하는 OLP_pool. 또한, 이러한 주식은 또한 만들기 위하여 이용 될 10 mg/mL OLP_pool 반응 CD8에서 Qa 1 제한 반응을 자극 하는 각 개별 펩 티 드의 능력을 결정 하기 위한 개별 펩 티 드 주식+ T 세포 라인.</li>
	<li>신선한 관으로 각 펩 티 드의 동일한 볼륨을 추가 하 여 확인 OLP_pool 주식. 이 OLP_pool 주식 100 %DMSO 포함합니다. 집 고 양이 OLP 연구에서 59 OLPs12했다. 따라서, 농도 OLP_pool에서 각 펩 티 드의 847.46 μ g/mL (50 mg/mL ÷ 59) 이었다.</li>
	<li>희석 (5 x) 10 mg/mL 개별 펩 티 드 주식 하 게 살 균 H2O (이 주식 포함 20 %DMSO) V 하단 96 잘 접시에서 50 mg/mL 주식. 각 개별 펩 티 드의 Qa 1 제한 응답의 결정 96 잘 접시 8 또는 12 채널 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 수행 됩니다 때문에이 주식 96 잘 접시에 확인 합니다. 참고: 모든 펩 티 드, OLPs 및 잘린된 펩 티 드를 포함 하 여 V-하단 96 잘 접시에 희석 해야 합니다 또는 96-잘 샘플 랙 가득 1 mL 튜브 때문에 펩 티 드 라이브러리 심사 96 잘 접시 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 수행 됩니다. 경우에 희석 한 펩 티 드, 펩 티 드를 분해 수 있도록 현명한 1 N NaOH 방울을 추가 하는 것이 어렵습니다.</li>
</ol>
2. 못쓰게 K의b-/- Db-/- CD8+ OLP_pool 펄스 k T 세포b-/- Db-/- 모 수석 세포 (DCs).
참고: 두 개의 주요 Qa 1 대립 유전자에 있다: 하나는 Qa-1는, 그리고 다른 Qa-1b. 학술 연구에 대 한 일반적으로 사용 되는 동물, 이후 예 C57BL/6, Balb/c 마우스, Qa-1b,이 프로토콜 매핑 Qa-1b epitopes는 단백질에 대 한 절차를 설명 합니다. CD8+ T이이 프로토콜에 사용 되는 세포에서에서 순화 된다b-/-Db-/- 는 CD8에 마우스 (C57BL/6 배경)+ T 세포 Qa-1 등 아닌 클래식 Ib MHC 분자에 의해 주로 제한 됩니다.
<ol>
	<li>앞에서 설명한12골 파생 된 Dc를 생성 합니다.
	<ol>
		<li>간단히, RPMI-10 매체 (RPMI 1640 10% 태아 둔감 한 혈 청, 5.5 x 10-5 M 2-mercaptoethanol, 1mm 나트륨 pyruvate, 0.1 m m 불필요 한 아미노산 보충)에 골 수 단일 셀 정지 (1 x 106 셀/mL)를 문화 10 U/mL IL-4를 포함 하는 6-잘 접시 (4 mL/잘) 37 ° C, 5% CO2에서 100 U/mL GM-CSF.</li>
		<li>2 일 후, 신중 하 게 비 부착 한 세포를 제거 하 고 신선한 미디어와 cytokines를 추가 합니다.</li>
		<li>또 다른 2 일 동안 세포를 배양 한 후 신선한 미디어와 cytokines 새로운 6 잘 플레이트에 포함 된 비 부착 한 세포를 전송 합니다.</li>
		<li>또 다른 2 일 셀 문화 및 신선한 미디어와 LPS를 포함 하는 cytokines 보충 (0.1 µ g/mL)는 Dc를 활성화.</li>
		<li>24 시간 후, 실험에 대 한 Dc를 수집 합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>3000 래 드와 Dc 비추는
	<ol>
		<li>또는, 미토마이신 C와 Dc (5 x 107 셀/mL)을 치료 (50 μ g/mL) 20 분에 대 한 37 ° C에서 PBS에 추가할 RPMI-0 (혈 청 없이 RPMI 1640) (~ 12 mL) 튜브를 g. 삭제 supernatants repea x 300에 탁상 원심 분리기에서 10 분에 대 한 셀을 회전 t 세척 절차 두 번 더입니다. 이러한 세 가지 세척은 중요 한 어떤 추적 미토마이신 C 양의 CD8의 응답을 억제 수 있습니다 때문에+ T DC-T 세포 공동 배양 중 세포.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>5 x 106 셀/ml 혈 청 무료 매체 (목표-V 세럼 무료 매체 5.5 x 10-5 M 2-mercaptoethanol, 1mm 나트륨 pyruvate, 0.1 m m 불필요 한 아미노산 보충)에 DC 농도 조정 합니다.</li>
	<li>최종 DMSO 농도 0.5% (200 x) 일 것 이다 그런 Dc에 100 %DMSO 포함 하는 OLP_pool 재고 솔루션을 추가 합니다. 집 고 양이 OLP 연구에는 OLP_pool에서 각 OLP의 농도 847.46 μ g/mL; 따라서 DC 문화에 각 OLP의 최종 농도 4.2 μ g/mL (847.46 μ g/mL ÷ 200) 이었다.</li></ol>그러나,이 농도 세포 배양에서 DMSO 농도 남아 1% 미만으로 100 μ g/mL까지 확장할 수 있습니다.
	<li>3 시간 실 온에서 Dc를 품 어 고 흔들어 셀 부드럽게 매 15 분.</li>
	<li>이 잠복기 동안 CD8 정화+ T 세포 수확된 비장 또는 K의 림프절에서b-/-Db-/- 상업 CD8를 사용 하 여 마우스+ T 세포 정화 키트, 10 x 106 셀/ml에 셀 농도 조정 50 U/mL 인터 루 킨 2 (일리노이-2)와 일리노이-7의 100 U/mL를 포함 하는 혈 청 자유로운 매체.</li>
	<li>자, 추가 CD8 0.5 mL/잘으로 48-잘 접시로+ T 세포 (0.5 mL/OLP_pool 펄스 Dc 단계 2.8는 CD8의 최종 농도에서 추가 후에+ T 세포는 5 x 106 셀/mL을 될 것입니다). 참고: CD8+ T 마우스 비장 및 림프절에서 셀 제조업체에서 제공한 지시를 따라 CD8 긍정적인 격리 키트를 사용 하 여 순화 될 수 있다. CD8+ T 세포 얻은 구슬의 자유롭다.</li>
	<li>2 x 106 셀/ml 혈 청 무료 매체에서 OLP_pool 펄스 Dc OLP_pool 펄스 Dc (300 x g, 10 분) 실시간 Reconstitute에 아래로 회전 하 고는 CD8 포함 48-잘 접시에 0.5 mL/잘 추가+ T 세포 (최종 농도 OLP의 _pool 펄스 Dc 1 x 106 셀/mL, CD8의 최종 농도+ T 세포는 5 x 106 셀/mL, 일리노이-2의 최종 농도 25 U/mL 이며 일리노이-7의 최종 농도 50 U/mL). 37 ° C, 5% CO2셀 문화.</li>
	<li>4 일에 제거 하 고 문화 매체의 약 400 μ를 삭제 한 추가 100 U/mL 일리노이-2와 각 잘 일리노이-7의 100U/mL를 포함 하는 신선한 혈 청 자유로운 매체의 500 μ. 37 ° C, 5% CO2에서 셀을 품 어.</li>
	<li>당일 7 또는 8, 다시 OLP_pool 액 CD8 자극은 OLP_pool와+ T 세포.</li>

3. 끝났다 CD8 restimulation+ T 세포와 대 식 세포는 OLP_pool와 펄스
<ol>
	<li>OLP_pool 액 CD8의 다시 자극 하기 전에 4 일+ T 세포, 2% (v/v) polyacrylamide 비드 솔루션 준비: 20 mL에 두 번 polyacrylamide 구슬의 2 세대를 세척 하 여도 무료 H2O 또는 PBS. 5 분 동안 원심 분리 (400 x g)에 의해 작은 공의 polyacrylamide 구슬 고 100 mL PBS의에서 resuspend. 압력솥에서 15 파운드/m 실 온에서 20 분이 게에 대 한.</li>
	<li>Intraperitoneally 살 균 2 %polyacrylamide 비드 솔루션의 복 막 구멍16에 monocytes/대 식 세포의 마이그레이션 유치 1 mL/마우스와 함께 쥐를 주사.</li>
	<li>4 일 후, CO2 과다 하 여 동물을 희생.
	<ol>
		<li>무 균 조건 하에서 잘라는 작은 여 복 부의 중심에는 오프닝은 충분히 5 mL 전송 피 펫을 전달. 전송 피 펫 RPMI-0와 개방을 통해 복 부 캐비티에 피펫으로 삽입.</li>
		<li>Pipetting으로 복 부 구멍을 씻어. (이들은 복 막 대 식 세포) 무 균 튜브에 복 부 구멍에서 가능한 많은 액체 밖으로 플라스틱. 린스 단계 4-5 회 반복 합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>3000 래 드와 복 막 대 식 세포 비추는
	<ol>
		<li>또는, 미토마이신 C와 복 막 세포 (2.2 단계에에서 설명 된 절차를 따르십시오.) 취급 합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>5 x 106 셀/ml 혈 청 자유로운 매체에 복 막 대 식 세포의 농도 조정 합니다. OLP_pool 재고 (최종 DMSO 농도 1% 미만)와 M-CSF를 추가 (최종 농도 = 100 U/mL). 참고:이 집 고 양이 OLP 연구에서 0.5 %DMSO 사용 우리. 따라서, 집 고 양이 OLP_pool 주식 MOG OLP_Pool 재고 복 막 대 식 세포의 199 μ에 추가 되었습니다 (예: 1 μ) x 희석된 200 했다. 따라서, 각 OLP의 최종 농도 4.2 μ g/mL) 했다.</li>
	<li>48-잘 조직 문화 접시에서 200 μ/잘 (1 x 106 셀/잘)을 추가 하 고 37 ° C 4 h에서 접시를 품 어.</li>
	<li>비 부착 한 세포는과 polyacrylamide 구슬 200 μ/잘 미리 따뜻하게 RPMI-0의 부드러운 세척 하 여 제거 합니다.</li>
	<li>수집 및 수영장은 OLP_pool 액 CD8 단계 2.10에서+ T 세포. 조정 하는 OLP_pool 액 CD8+ 1 x 106 셀/ml 25 U/mL 일리노이-2와 일리노이-7의 50 U/mL를 포함 하는 혈 청 자유로운 매체에 T 세포 농도. OLP_pool 펄스 복 막 대 식 세포를 포함 하는 48-잘 접시를 1 mL/음을 추가 합니다.</li>
	<li>4 일 후, 48-잘 접시에 매체를 보충. 제거 하 고 약 400 μ 48-잘 배양 배지에서 배양의 삭제. 각 우물에 신선한 혈 청 무료 중간 포함 100 U/mL의 일리노이-2 500 μ와 일리노이-7의 100 U/mL를 추가 합니다. 37 ° C, 5% CO2셀 문화.</li>
	<li>3 ~ 4 일 후, 검사 OLP_pool restimulated CD8 효소 연결 된 immunospot 분석 결과 (ELISPOT)에 의해 OLP_pool 전용, Qa 1 제한 응답+ T 세포. 이 시점 후 다시 자극 하는 CD8+ T 세포 모든 7-10 일. 참고: 대 식 세포는 OLP_pool 액 CD8의 다시 자극에 대 한 선호+ T 세포. 우리가 나타났습니다 CD8+ T 세포 대 식 세포에 의해 다시 자극된 Dc 시험관보다 더 성장 했다.</li>
</ol>
4. OLP_pool-특정의 결정, Qa 1 제한 응답 OLP_pool restimulated CD8 T 세포 라인+
참고: OLP_pool 전용, Qa 1 제한 응답 OLP_pool restimulated CD8에서+ T 셀 라인 IFNγ 분 비 자극 C1R 또는 C1R 있을 때 OLP_pool에 의해 다음에 의해 결정 됩니다. Qa-1b 세포 IFNγ ELISPOT 분석 결과 사용 하 여. C1R 셀 상업적으로 얻어질 수 있다. C1R입니다. Qa-1 lentiviral 벡터와 C1R 셀 시험으로 Qa-1b 세포를 생성할 수 있습니다.
<ol>
	<li>추가 캡처 안티-IFN-γ 항 체의 100 μ/잘 ELISPOT 격판덮개의 우물에 코팅 버퍼 (PBS)에 희석 합니다.</li></ol>봉인 하 고 하룻밤 4 ° C에서 접시를 품 어.
	<li>두 번째 날, 캡처 안티-IFN-γ 항 체를 포함 하는 코팅 버퍼를 삭제 하 고 솔루션을 추가 200 μ/잘 blocking (혈 청 무료 매체) 실 온에서 2 h에 대 한 접시를 품 어.</li>
	<li>C1R와 C1R 비추는. 9600 래 드와 Qa-1b 세포.
	<ol>
		<li>또는, C1R와 C1R 취급 합니다. 미토마이신 C 제외 하 고 치료 시간이 30 분 일 것 이다 단계 2.2에 설명 된 대로와 Qa-1b 세포.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>C1R와 C1R 조정 합니다. 4 x 106 셀/mL 혈 청 자유로운 매체에서 Qa-1b 세포.</li>
	<li>접시에 차단 솔루션을 삭제 하 고 C1R와 C1R 추가. Qa-1b 세포 50 μ/잘 (200, 000 셀/잘)와 혼합.</li>
	<li>100 x 50 μ/잘 희석 OLP_pool 주식 (혈 청 무료 매체)에 추가 하 고 제대로 혼합. 2-3 시간 실 온에서 접시를 품 어.</li>
	<li>OLP_pool restimulated CD8 조정+ T 1-일리노이-7의 150 U/mL를 포함 하는 혈 청 자유로운 매체에 106 셀/mL x 2 세포와 50 μ/잘 (50000-100000 셀/잘) 접시에 추가. 5 분 동안 접시 (58 x g) 원심</li>
	<li>37 ° C, 5% CO2 접시를 밤새 품 어.</li>
	<li>세포 현 탁 액 발음 2 번 이온된 (DI) 수 (250 μ/잘)와 웰 스 워시. 웰 스 각 세척 단계에 5 분 동안 담가 수 있습니다.</li>
	<li>세척 우물 3 번 씻어 버퍼 나 (PBS 0.05 %Tween20 포함). 웰 스 각 세척 단계에 1 분 동안 담가 수 있습니다. 워시 버퍼를 삭제 합니다.</li>
	<li>탐지 항 체 희석 버퍼 (PBS 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 포함)에 희석의 100 μ를 추가 합니다.</li>
	<li>2 시간에 대 한 실 온에서 번호판을 품 어.</li>
	<li>삭제 탐지 항 체 솔루션. 워시 3 번으로 각 세척 단계에 1 분 동안 담가 수 250 µ L/잘 씻어 버퍼 I. 허용 우물 우물.</li>
	<li>1: 100 희석 시 희석 버퍼에 희석 효소 공액 (Streptavidin-HRP)의 100 μ/잘 추가 합니다.</li>
	<li>실 온에서 1 h에 대 한 번호판을 품 어.</li>
	<li>효소 어원이 솔루션을 삭제 합니다. 각 세척 단계에 1 분 동안 담가 수 250 µ L/잘 씻어 버퍼 나 수 스와 4 번 웰 스 워시.</li>
	<li>2 번 250 µ L/잘 씻어 버퍼 II (PBS)와 웰 스 워시.</li>
	<li>각 우물에 기판 솔루션 (혼합 1 방울 = 20 µ L의 AEC Chromogen AEC 기판의 1 mL와 함께) 100 µ L를 추가 합니다. 5 ~ 60 분 별색 개발을 모니터링 합니다.</li>
	<li>원하는 결과 표시 시작, 웰 스 증류수로 세척 하 여 기판 반응을 중지 합니다.</li>
	<li>2 h에 대 한 실 온에서 접시를 건조 나 완전히 건조 될 때까지 밤새. 접시 아래 플라스틱 트레이 제거 건조 촉진 한다. 분석 되 고 때까지 어둠 속에 봉인된 된 비닐 봉투에 접시를 저장 합니다.</li>
	<li>수동으로 해 현미경으로 검사 하거나 ELISPOT 플레이트 리더를 사용 하 여 명소를 열거 합니다. 그림 2에 대표적인 결과 참조 하십시오.</li>

5. 결정 개별 펩 티 드의는 OLP_pool에는 OLP_pool 전용 CD8에서 Qa 1 제한 IFN-γ 분 비를 자극 하는+ T 셀 라인
<ol>
	<li>결정 개별 펩 티 드 OLP_pool 전용, OLP_pool 전용 CD8에서 Qa-1-restrictred IFN-γ 분 비를 자극 하는+ 위의 사용 하 여 T 세포 선 IFN-γ ELISPOT 분석 결과 (최종 농도 사용 각 개별 펩 티 드의 설명 ELISOPT에 대 한 분석 결과가 이다 10 μ g/mL). 그림 3에 대표적인 결과 참조 하십시오. 참고: OLP-특정, Qa-1-restircted 응답 C1R 존재 응답의 적어도 세 번은 응답으로 정의 됩니다. Qa-1b 세포는 OLP 없이. 집 고 양이 OLP 연구, OLP68, OLP96, 및 OLP105에서 모두이 기준을 만났다. 따라서, 모든 3 개의 OLPs는 잠재적으로 Qa 1 epitopes12 (그림 3)를 포함합니다. 그러나, OLP105는 일관 되 게 강한 응답; 준 따라서 우리는 OLP105의 상세한 분석을 수행 (그림 4 및 그림 5)12.</li>
</ol>
6. 신분증 OLP_pool 전용 CD8에 피토 프 전용, Qa 1 제한 응답을 자극 하는 15-메 르 OLP에 최적의 Qa 1 Epitope의+ T 셀 라인
<ol>
	<li>C-와 N-말기 잘린 그림 4와 같이 15-메 르 OLP의 펩 티 드를 음성 합성.</li>
	<li>OLP 특정 CD8에서 IFN-γ 분 비 검사+ 자극 하는 CD8 T 세포 라인+ T C1R 또는 C1R 있을 때 부모의 15-메 르 OLP 잘린된 펩 티 드의 각 세포. 위의 사용 하 여 Qa-1b 셀 IFN-γ ELISPOT 분석 결과 설명 합니다. 각 개별 펩 티 드 ELISPOT 분석 결과 대 한 사용의 최종 농도 10 μ g/mL 이다. 펩 티 드 경우 최적의 Qa 1 epitope로 정의 된다 펩 티 드: 1) 일관 되 게 원래 15 메 펩타이드, C1R 존재에 비해 비슷하거나 더 강한 IFN-γ 응답을 제공. Qa-1b 세포; 2)는 8-10 메 르 (9-메 르 펩타이드 선호) 사이 MHC에 바인딩된 펩 티 드 길이-나 분자15,17. 대표 결과 그림5에서를 참조 하십시오.</li>
</ol>

<ol>
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저자는 충돌의 관심을 선언합니다.

여기, 우리는 Qa-1 단백질에 epitopes를 분석 하기 위한 프로토콜을 설명 했습니다. 이 프로토콜에 관하여 여러 가지 다른 전략 또한 이전 보고 했다. 첫째, 수용자 CD8+ T 세포와 클론 Qdm1의 식별을 위해 사용 되었다. 둘째, Qdm의 분석에서 상 상속 Qa 1 바인딩 모티브 HSP60p216-224와 TCRBV8.1 epitope9,18의 식별을 위해 사용 되었다. 단백질에서 셋째, 개별 겹치는 펩 티 드 면역 동물을 사용 했다. 그 후, CD8+ T 세포 면역된 동물에서 분리 된 TCRBV8.2 펩 티 드 p42-50 Qa-16,,1019바인딩 확인 이후에 식별 하기 위해 사용 되었다. 넷째, 기능 CD8+ T 세포 cDNA 디스플레이 라이브러리와 함께에서 라인 FL9 Qa-1 epitope4의 식별을 위해 사용 되었다.
이전 기술, 수용자 CD8의 사용에 관하여+ T 세포 선 및 5 월 클론 생리 적 면역 반응 동안 제시 Qa 1 epitopes를 분석 하는 데 적합 하지 않을. 또한, 축적 데이터는 앞에서 설명한 바인딩 모티브 Qa-1 분자의 펩 티 드-바인딩 용량을 표시 부분적 으로만 수 있습니다 것이 좋습니다. 따라서, 정확한 Qa 1 바인딩 모티브는 여전히 알 수 없습니다4. 또한, 예방 접종 Qa 1 epitopes의 식별에 대 한 개별 펩타이드와 힘 드는입니다. 마지막으로, cDNA 디스플레이 라이브러리 전략 수행 세포 transfection에 대 한 다른 펩 티 드 길이 많은 벡터의 건축을 포함 한다. 여기에 설명 된 OLP 라이브러리 전략 간단 하 고 매핑된 펩 티 드 Qa 1 제한 CD8 자극으로 알려져 있습니다 반대로,+ T 세포. 따라서, 우리의 전략 독특한 장점이 있습니다.
설명 하는 전략은 여기 OLP_pool 전용 CD8 사용 하 여+ T 세포는 체 외에서 못쓰게 하 고 restimulation에 의해 생성 됩니다. CD8의 대안 소스+ T 세포 림프 노드 k의 배수에서 수b-/-Db-/- 소스 단백질20접종은 마우스. 이러한 면역 CD8+ T 세포 다음 IFN-γ 응답 OLPs 및 Qa 1 epitopes의 식별을 위해 잘린된 펩 티 드에 대 한 시험 될 수 있다. 이론적으로는 비보에 면역 CD8+ T 세포는 가까이 생리 조건 보다는 생체 외에서 생성 된 CD8+ T 세포. 그러나, 우리는 면역 CD8 응답 발견+ T 세포 면역된 생쥐에서 직접 정화는 약하고 자주 필요한 생체 외에서 restimulations 심사 결과 만족 스러운 펩 티 드에 대 한. 또한,이 프로토콜은 HLA-E epitopes 점에서 vivo에서 예방 접종은 실용적의 인간 연구에 미래 번역을 위해 설계 되었습니다.
기술적으로,이 프로토콜의 중요 한 부분 이다 CD8 세대 라인+ T 세포는 OLP_pool 또는 개별 OLP에 대 한 특정. 때문에 Qa 1/펩 티 드 복합물은 후 항 원 제시 세포는 OLPs 또는 펩 티 드 펄스는 고아 한 MHC-나/펩 티 드 복합물21에 비해 불안정, 펄스 셀 광범위 하 게 세척 하지 해야 합니다. 우리는 펩 티 드 펄스 셀, 광범위 하 게, 세척 하는 경우 손실 또는 CD8 자극 하는 능력을 크게 줄일 발견+ T 세포. 따라서, 즉시 전에 그들은 CD8와 공동 경작 한 번 세포 항 원 펩 티 드 펄스 제시 세척이 좋습니다+ T 세포.
또한, Qa 1/펩 티 드 복합물의 불안정성이 좋습니다 펩 티 드 펄스에 대 한 혈 청 자유로운 매체의 사용과 CD8 자극+ T 세포. 또한, 정기적으로 CD8 동안 50 U/mL 일리노이-7의 추가+ T 세포 배양으로 동안 IFN-γ ELISPOT 분석 결과. 일리노이-7의 목적은 생존 CD8의 기능을 유지 하기 위해+ T 세포. 일리노이-7 자체적으로 CD8를 자극 하지 않습니다+ T 세포가 IFN-γ를 생산.
마찬가지로 모든 전략, Qa 1 epitopes이이 전략에 또한 필요 추가 조사 생물학 의미 합니다. 예를 들어 하나의 중요 한 질문은 매핑된 epitope를 생리학적으로 제공 될 수 있는 여부. 이 문제를 해결 하려면 DCs lentiviral 벡터를 표현 하는 epitope 소스 단백질 (예: MOG OLP에 MOG 연구)으로 불리고 있습니다. Epitope 특정 CD8의 응답 후,+ T 세포 transduced Dc로 검사 됩니다. 긍정적인 응답 제안 하는 epitope 수 순수 처리 하 고 Dc에 의해 제시 합니다. 또한, CD8에 의해 epitope 인식 결과로 기능 결과+ T 세포를 더 조사 해야 합니다. 이와 관련, Qdm과 FL9 Qa-1 epitopes의 분석은 Qa 1 분자는 면역 감시1,4에 대 한 중요 한 결론에 이르렀다. 또한, HSP60p216, TCRBV8.1 펩 티 드의 연구와 p42-50 그 Qa 1 제한 CD8 결론에 지도+ T 세포 병원 성 CD4 타겟팅을 통해 면역 반응 조절+ T 세포 6,7 ,,919. 또한, MOG196 의 연구는 처음으로 공개 하는 Qa 1 제한 CD8+ T 세포 직접 잠재적으로 병원 성 면역 세포12에 의해 손상에서 그것을 방지 하기 위해 조직을 대상으로 면역 반응 조절 수 . 마지막으로, 피토 프 전용, Qa 1 제한 CD8의 기능 분석+ T 셀 tetramer에 의해 지원 될 수 있습니다. 이러한 tetramer NIH tetramer 핵심 시설 (http://tetramer.yerkes.emory.edu/) 또는 회사에서 생산 수 있습니다. tetramer의 생성을 요청 하나 Qa 1 tetramer의 세대에 대 한 그들의 승인을 위해 새로 매핑된 최적의 Qa 1 epitope Qa-1 단백질의 바인딩을 지원 기능 데이터를 보낼 수 있습니다.
끝으로, 이전 학문은 설명 했다 그 Qa 1 제한 CD8+ T 세포12현지 면역 반응 규칙에서 중요 한 역할. 이와 관련, 조직 손상 면역 반응을 직접 대상 조직에 의해 발생할 수 있습니다. 또한, 부수적인 손해는 침입 병원 체는 면역 반응에 의해 발생할 수 있습니다. 따라서,+ T이 두에서 세포 CD8 Qa 1 제한의 역할을 이해 다른 조직 손상의 임상 응용 프로그램에 대 한 중요 하다.이 위해 Qa-1 자기 조직 또는 침입 병원 체에서 epitopes의 철저 한 분석 필요 하다. 이 프로토콜은 이러한 분석에 대 한 적절 한 될 것입니다.

Qa-1 쥐에서 (MHC-Ib) 분자 비 고전 중요 한 조직 적합성 복잡 한 1b의 그룹에 속한다. 그것의 인간 상 동 기관이 이다 HLA. 이전 증거 Qa 1 분자는 중요 한 생물 학적 기능을 시연 하고있다. 첫째, Qa-1 분자 셀 구조 및 기능적 무결성에 대 한 조사에서 중요 한 역할을 한다. 이와 관련, Qa-1 분자는 세포의 정상적인 기능을 모니터링 하는 몇 가지 전략을 진화 했다. 이러한 전략 중 하나는 Qa-1 분자를와 처리 지도자 펩 티 드 (epitope), 즉 Qa-1 결정 한정자 (Qdm) 바인딩과 그물1에 고아 한 MHC i a 분자에서 처리 되는 양식 단지를 수 있습니다. Qa-1/Qdm 단지 나중 세포의 표면에 표시 하 고 바인딩합니다 NK 세포에 금지 NKG2A 수용 체를 억제 하는 활동2를 죽이 NK. Ia MHC 분자의 표현을 손실 됩니다, 셀 (예: 악성 셀)2를 죽이 NK에 민감한 됩니다. 다른 전략 Qa 1 분자를 탭 (항 원 처리와 관련 된 전송)의 결핍은 세포의 표면에 새로운 Qa-1/epitope 복합물을 형성 수 있습니다3 또는 ERAAP (바인딩과 그물 aminopeptidase와 관련 된 항 원 처리)4 (둘 다 결핍이 자주 악성 세포에 발생). 표현 하는 이러한 새로운 Qa-1/epitope 단지 셀 수 다음 인식 하 고 피토 프 전용 CD8 Qa 1 제한에 의해 제거+ T 세포. 둘째, Qa-1 분자 면역 규칙5유도. 이와 관련, Qa-1/epitope 단지 표시 되었습니다 CD8 자극+ 자체 조직6,,78 의 면역 중재 손상의 예방에 대 한 중요 한 규제 T (Treg) 셀 ,910. 셋째, Qa 1 제한 CD8+ Treg 세포 바이러스 감염11에 대 한 면역 반응 제한 표시 되었습니다.
따라서, 특정 확대 epitope 관련 Qa-1-restrictred CD8의+ T 세포는 비정상적인 세포의 제거, 면역 조절의 향상 및의 크기의 제어 잠재적으로 유망한 전략 바이러스-유도 된 면역 응답입니다. 동안 여부 결정 되지 않은 확대 epitope 관련 Qa 1 제한 CD8의+ T 셀 수 면역 감시를 강화 하 고 면역 반응을 유도 하는 바이러스를 제한, 우리의 실험실과 다른 사람 명확 하 게 증명 하는 Qa 1 epitopes와 예방접종 CD8 Qa 1 제한의 기능을 강화할 수 있습니다+ Treg 세포 병원 성 면역 CD4에 대 한 특정+ T 세포, CD4의 효율적인 제어를 선도+ T 세포 중재 면역 질환에는 실험적인 알레르기 성 뇌 (인간 다 발성 경화 증 동물 모델)6,10, 콜라겐 유도 관절염 (인간 류 마티스 관절염 동물 모델)7, 등 다양 한 동물 모델 및 비만 아닌 당뇨병 (인간 타입-1 당뇨병의 동물성 모형)8. 또한, 우리는 면역 조직 관련 Qa 1 epitope와 CD8의 확대를 통해 그 조직에 염증 면역 중재의 특정 컨트롤에 리드 발견+ Treg 세포12. 전 임상 연구의 위의 성공을 나타내는 Qa 1 epitope 접종 및 잠재적으로 수돗물에 결핍과 관련 된 다른 질병의 치료에 대 한 조직의 특정 면역 중재 질병의 치료에 대 한 완전 한 평가 대 한 필요와 ERAAP입니다.
따라서, 안정적이 고 신속 하 게 Qa-1 단백질에 epitopes 분석할 수 있는 기술에 대 한 수요가 있다. 이와 관련, 제한 된 수의 생물학으로 중요 한 Qa 1 epitopes 설명 하고있다. 대부분 이러한 Qa 1 epitopes의 CD8의 연구 기간 동안 serendipitously 발견 했다+ T 세포 박테리아13, 셀 탭3결핍, 셀 ERAAP4, 결핍 및 EAE6, 발생 하는 셀에 대 한 응답 9. 따라서, 높은 처리량 기술 정의 된 단백질의 생물학으로 중요 한 Qa 1 epitopes의 식별을 위해 바람직합니다. 다음, 우리를 사용 하 여 Qa-1-resrticted CD8 단백질에서 기능 Qa 1 epitopes는 겹치는 펩 티 드 (OLP) 라이브러리 전략 설명+ T 세포 단백질의 OLP 풀 (OLP_pool)에 대 한 특정 라인.

<table><tbody><tr><td>The protein to be analyzed</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Sequence of the protein can be obtained from NCBI</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat#: D2650 SIGMA</td><td>DMSO should be sterile and cell culture tested.</td></tr><tr><td>K&lt;sup&gt;b-/-&lt;/sup&gt;D&lt;sup&gt;b-/-&lt;/sup&gt; mice</td><td>The Lackson Laboratory</td><td>Stock#: 019995</td><td>We used Taconic H2-K&lt;sup&gt;b&lt;/sup&gt;H2-D&lt;sup&gt;b&lt;/sup&gt; doube knockout mice (Cat#: 4215-F and 4215-M) which however are not available anymore.</td></tr><tr><td>AIM V Serum Free Medium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat#: 12055091</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat#: 21985023</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat#: 11360070</td><td></td></tr><tr><td>Nonessential Amino Acids</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat#: 11140076</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads CD8 Positive Isolation Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat#: 11333D</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Gel P-100</td><td>Bio-Rad</td><td>Cat#: 150-4171</td><td></td></tr><tr><td>Phoshate Balanced Solution (PBS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat#: 20012027</td><td></td></tr><tr><td>Trasfer pipette</td><td>Globe Scientific</td><td>Mfg#: 137238</td><td></td></tr><tr><td>Murine M-CSF</td><td>PeproTech</td><td>Cat#: 315-02</td><td></td></tr><tr><td>48-well tissue culture plates</td><td>USA Scientific</td><td>Cat#: CC7682-7548</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar TC-treated Multiple well Plates, 96-well, V-shaped bottom</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat#: Z372129 Sigma</td><td></td></tr><tr><td>1ml deep 06-well PP plate, sterile</td><td>USA Scientific</td><td>Item#: 1896-1110</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant murine IL-2</td><td>PeproTech</td><td>Cat#: 212-12</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant murine IL-7</td><td>PeproTech</td><td>Cat#L: 217-17</td><td></td></tr><tr><td>Capture anti-IFN-&amp;gamma; antibody</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat#: 551881</td><td></td></tr><tr><td>ELISPOT plate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat#: S2EM004M99</td><td></td></tr><tr><td>C1R</td><td>ATCC</td><td>Cat#: ATCC CRL-1993</td><td></td></tr><tr><td>C1R.Qa-1&lt;sup&gt;b&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td><td>Custom made (GenBank access#: NM_010398.3)</td></tr><tr><td>Qa-1 lentiviral vector</td><td>GeneCopoeia</td><td>Product#: Mm02955</td><td></td></tr><tr><td>Detection anti-IFN-&amp;gamma; antibody</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat#: 551881</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat#: P9416</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin-HRP</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat#: BD557630</td><td></td></tr><tr><td>AEC substrate</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat#: 551951</td><td></td></tr><tr><td>ImmunoSpot Analyzer</td><td>ImmunoSpot</td><td></td><td>Any immunoSpot analyer should work for this purpose.</td></tr></tbody></table>

overlapping peptide library to map qa-1 epitopes in a protein

Qa-1 (HLA-E 인간) (MHC-Ib) 분자 비 고전 중요 한 조직 적합성 복잡 한 1b의 그룹에 속한다. 최근 데이터 품질-1 분자 구조 및 기능적 무결성에 대 한 셀과 유도 하는 면역 조절, 제한 하는 바이러스 감염에 면역 반응에 중요 한 역할 놀이 것이 좋습니다. 또한, Qa 1 제한 CD8의 기능 확대 epitope를 통해+ T 세포 면역 여러 자가 면역 질환 동물 모델, 예를 들면 실험적인 알레르기 성 뇌에에서 치료 효과 보이고 있다 콜라겐 유도 관절염, 그리고 비 뚱뚱한 당뇨병. 따라서, 효율적이 고 신속 하 게 단백질의 기능적인 Qa 1 epitopes 식별할 수 있는 방법에 대 한 긴급 한 필요가 있다. 여기, 우리가 Qa 1 제한 CD8 사용 프로토콜 설명+ T 셀 라인 Qa-1 단백질에 epitopes를 결정 하기 위한 중복 펩 티 드 (OLP) 라이브러리에 대 한 특정. 이 OLP 라이브러리 포함 15-메 르 겹치는 펩 티 드, 단백질의 전체 길이 커버 하 고 인접 한 펩 티 드 11 아미노산에 의해 중복. 이 프로토콜을 사용 하 여, 최근 myelin oligodendrocyte 당단백질 (MOG)에서 9-메 르 Qa 1 epitope 파악. 이 새로 매핑된 MOG Qa-1 epitope epitope 관련, Qa 1 제한 CD8 유도 표시 했다+ T 세포는 향상 된 myelin 특정 면역 규칙. 따라서,이 프로토콜은 소설 대상의 미래 조사 및 Qa 1 제한 CD8의 기능을 위한 유용한+ T 세포.

단백질의 전체 길이 덮고 OLP 라이브러리의 디자인
단백질의 N-말단에서 시작, 각 펩 티 드 15 아미노산 (15-메 르)입니다. 따라서, 첫 번째 펩 티 드 15 위치로 1 위치에 걸쳐. 두 번째 펩 티 드의 N-말단 겹치면 11 아미노산에 의해 첫 번째 펩 티 드의 C-터미널. 따라서, 두 번째 펩 티 드에 걸쳐 위치 19에 위치 5. (그림 1) 단백질의 C-말단의 끝에는 펩 티 드의 나머지 부분을 디자인 합니다. 우리는 우리와 다른 것으로 나타났습니다 15-메 르 펩 티 드, 또는 대 식 세포, 모 수석 세포 (DCs)에 추가 될 때 효율적으로 될 수 있기 때문에 15-메 르 라이브러리 선택+ T14,15세포 CD8 epitopes 인식으로 처리. 라이브러리에 있는 OLPs의 수는 단백질의 길이에 따라 달라 집니다. 또한, 마지막 OLP 단백질의 길이 따라 15-메 르 12에서 배열할 수 있다. 예를 들어 myelin oligodendrocyte 당단백질 (MOG) 247 아미노산의 길이 있다. 집 고 양이 OLP 라이브러리 포함 59 OLPs12. 이 원고에 제시 하는 대표적인 결과 MOG OLP 라이브러리의 분석에서.
OLP_pool 자극 CD8에서 OLP_pool 관련, Qa 1 제한 응답의+ T 셀 라인
우리는 CD8 생성+ k 액은 T 세포 라인b-/-Db-/- Dc MOG OLP_pool (MOG_pool)와 펄스와 펄스 MOG_pool k restimulatedb-/-Db-/- 에 설명 된 대로 복 막 대 식 세포는 위에서 언급 한 프로토콜 (프로토콜 1, 2, 및 3). 이 CD8에 잠재적인 MOG_pool 전용, Qa 1 제한 응답을 확인 하려면+ T 셀 라인, 우리 시험이 CD8의 응답+ C1R 또는 C1R 존재 MOG_pool에 T 세포 라인. Qa-1b 세포 IFN-γ ELISPOT 분석 결과 (그림 2) (4 단계 프로토콜)를 사용 하 여. 우리의 데이터 MOG_pool 자극 CD8 보여주었다+ T 세포 선 분 비 C1R 존재 IFN-γ의 낮은 수준. Qa-1b 세포 (세포 또는 SFCs를 형성 하는 32 자리) 하지만 하지 C1R 셀 (SFCs 2),+ T 세포는 Qa 1 바인딩 epitopes C1R 셀 (C1R 셀은 인간의 B lymphoblastoid 세포)에서 파생 된 응답 CD8의 존재를 제안. SFCs는 MOG_pool C1R 셀 (78 SFCs), 포함 된 우물에 추가 될 때 증가 했다+ T 세포는 비-Qa-1 epitopes 응답 CD8의 존재를 제안. SFCs는 MOG_pool C1R 포함 된 우물에 추가 될 때에 극적으로 증가 했다. Qa-1b 세포 (320 SFCs), CD8의 존재를 제안+ T 세포는 Qa 1 바인딩 펩 티 드에 응답. 데이터는 또한 Qa 1 바인딩 epitope(s)는 MOG_pool에 포함 되어 있음을 보여 줍니다.
결정 개별 펩 티 드의는 OLP_pool에서 OLP_pool-반응성 CD8에서 Qa 1 제한 IFN-γ 분 비에 공헌 하는+ T 셀 라인
MOG_pool-반응성 CD8에 Qa 1 제한 IFN-γ 분 비를 자극 하는 OLP_pool에서 펩 티 드를 확인 하려면+ T 셀 라인, 우리 MOG_pool 반응 CD8 자극 중 C1R 존재 개별 59 OLPs와+ T 세포 또는 C1R입니다. Qa-1b 세포 (그림 3) (프로토콜 단계 5). 우리의 데이터는 몇 SFCs C1R 전지와 OLPs를 포함 하는 우물에서 관찰 되었다 보여주었다. 대조적으로, SFCs C1R 포함 모든 우물에서 증가 했다. Qa-1b 세포와는 OLPs. 그림 2에서 우리가 배운 CD8 C1R 존재+ T 세포. Qa-1b 혼자는 또한 SFCs를 형성 했다. 따라서, 대부분 스에서 증가 SFCs는 Qa-1 분자에 의해 C1R 세포에서 세포내 단백질에서 파생 된 Qa 1 epitopes의 프레 젠 테이 션으로 인해 일반적인 자극 때문일 수 있었다. 그러나, 그림 3C (B8, D12, 그리고 E9), 3 일치 3 프레임된 우물에 OLPs 그림 3A (OLP68, OLP96, 및 OLP105)에 OLPs을 강조, OLP 관련, Qa 1 제한 IFN-γ 응답으로 정의 하기 위한 기준 충족 프로토콜 단계 5.112에서 설명합니다. 데이터 품질-1 epitope(s) 3 OLPs 포함 하는 것이 좋습니다. 이후는 OLP105는 일관 되 게 가장 높은 응답을 생산, 우리는 OLP10512의 상세한 분석을 수행.
15-메 르 OLP에 대 한 잘린된 펩타이드 라이브러리의 디자인
OLP_pool-반응성 CD8에서 Qa 1 제한 IFN-γ 분 비를 자극 하 결정 되었습니다 15-메 르 OLP+ T 셀 라인, 잘린된 펩타이드 라이브러리를 사용 하 여 최적의 epitope에 대 한 분석 필요. 이러한 잘림된 펩타이드 라이브러리는 점차적으로 1 아미노산에는 N-와 C-테르미니 (그림 4)에 의해 15-메 르 OLP를 잘라내기에 의해 설계 되었습니다. 다른 비슷한 MHC 종류 I 분자, Qa-1 분자는 주로 8-10 메 르 펩 티 드를 바인딩할. 따라서, 짧은 잘린된 펩타이드는 길이 6-메 르 하는 것이 좋습니다.
OLP_pool-반응성 CD8에서 Qa 1 제한 IFN-γ 분 비를 자극 하는 15-메 르 OLP에 최적의 Qa 1 epitope의+ T 셀 라인
펩 티 드 위의 N-와 C-말기 잘리지는 CD8에서 IFN-γ 분 비를 자극의 강도 대 한 테스트는+ 는 OLP_pool 또는 위에서 설명한 IFN-γ ELISPOT를 사용 하 여 15-메 르 OLP에 대 한 특정 T 세포 라인. 집 고 양이12Qa 1 epitopes의 연구에서 우리는 CD8 생성+ MOG OLP105에 대 한 특정 T 셀 라인 (그림 5A). 추가 분석 하는 N-말기 잘린된 9 메 르 펩 티 드로 최적의 epitope에 대 한 두 가지 조건 프로토콜 단계 6.2 (그림 5B)에 설명 된 시연 했다. 따라서, 우리는 N-말기 9 메 잘린 결론 펩 티 드 최적의 Qa 1 epitope를 했다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56401/56401fig1.jpg"> 
그림 1: 단백질의 전체 길이 덮고 OLP 라이브러리의 디자인. N-말단에서 시작, 펩 티 드 아미노산 (15-메 르) 길이 15의 확인 되었다.11 아미노산 이전 펩 티 드의 C terminus와 겹쳐지는 경우 첫 번째 펩 티 드를 제외한 각 펩 티 드의 N terminus.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56401/56401fig2.jpg"> 
그림 2: MOG_pool 자극 CD8+ T 세포 했다 부분적으로 MOG_pool 특정 및 Qa 1 제한12. 생체 외에서 CD8+ T 세포 MOG OLP_pool (MOG_pool)에 의해 자극된 응답 C1R 또는 C1R 있을 때 MOG_pool 조사 했다. Qa-1b 세포 항 원 제시 하는 IFN-γ ELISPOT 분석 결과 사용 하 여 셀으로. 대표 ELISPOT 이미지 표시 됩니다. 숫자의 자리를 형성 세포 (SFCs) 각의 왼쪽된 상단 모서리에 표시 됩니다. CD8+ T 세포: 50, 000 셀/잘. C1R 또는 C1R입니다. Qa-1b 세포: 200, 000 셀/잘.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56401/56401fig3.jpg"> 
그림 3: Qa-1에 대 한 책임은 MOG_pool에서 OLPs의 분석 응답 제한. (A) 사이트 10 mg/mL를 포함 하는 V-하단 96 잘 접시의 개별 MOG OLPs. 우물에 숫자 표현 OLP Id. 강조 표시 된 3 웰 스 포함 프로토콜 단계 5.112의 설명 대로 OLP 관련, Qa 1 제한 IFN-γ 대응에 대 한 조건을 충족 하는 OLPs. (B) 대표 SFCs는 OLP에 포함 된 각 잘에서 (최종 농도 = 4.2 μ g/mL, OLP ID 일치 하는 "A"), MOG_pool-반응성 CD8+ T 세포 (50, 000 셀/잘), 그리고 C1R 셀 (200, 000 셀/잘). (C) 대표 SFCs는 OLP에 포함 된 각 잘에서 (최종 농도 = 4.2 μ g/mL, OLP ID 일치 하는 "A"), MOG_pool-반응성 CD8+ T 세포 (50, 000 셀/잘), 그리고 C1R. Qa-1b 세포 (200, 000 셀/잘). 3 프레임된 웰 스는 OLP 관련, Qa 1 제한 IFN-γ 응답12에 대 한 조건을 충족 하는 OLPs 포함 되어 있습니다. 그림 참조12에서 적응 되었습니다. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56401/56401fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56401/56401fig4.jpg"> 
그림 4: 15-메 르 펩 티 드의 잘린된 펩 티 드의 디자인. 15-메 르 펩 티 드 6-메 르를 1 아미노산에 의해에서 그것의 N-와 C-테르미니 잘렸습니다 점차적으로. 15-메 르와 그 잘린된 펩 티 드 합성 후 했다. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56401/56401fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56401/56401fig5.jpg"> 
그림 5:는 OLP105에서 최적의 Qa 1 epitope의 분석. (A) OLP105 자극 CD8+ T 셀 라인 OLP68, OLP96, 및 OLP105 C1R 또는 C1R 존재에 대 한 응답에 대 한 조사 되었다. Qa-1b 세포는 IFN-γ ELISPOT 분석 결과 사용 하 여. 대표 IFN-γ SFCs (왼쪽된 상단 모서리에 번호) 표시 됩니다. (B) OLP105 전용 CD8+ T 셀 라인, (A)와 같이 조사 되었다 응답 개별 N-와 C-말기 잘립니다 펩을 그림 4, C1R 존재. Qa-1b 세포 IFN-γ ELISPOT 분석 결과 사용 하 여. OLP105: 15-메 르 OLP입니다. N6-14: N 말기 OLP105 펩 티 드를 잘립니다. C 6-14: C 말기 OLP105 펩 티 드를 잘립니다. CD8+ T 세포: 50, 000 셀/잘. C1R입니다. Qa-1b 세포: 200, 000 셀/잘. 숫자 50000 CD8 당 SFCs+ 은 모서리를 왼쪽 상단에 T 세포. 빨간색 사각형 표시 6.2 프로토콜 단계에 설명 된 대로 OLP에 최적의 Qa 1 epitope를 정의 하기 위한 조건에 잘. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56401/56401fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Overlapping Peptide Library to Map Qa-1 Epitopes in a Protein

Qa-1 단백질에 Epitopes를 매핑할 겹치는 펩타이드 라이브러리

Qa-1 (인간에서 HLA-E) 비 고전 중요 한 조직 적합성 복잡 한 1b 분자의 그룹에 속한다. Qa-1-바인딩 epitopes와 면역 조직 특정 면역 규칙을 증강 하 고 여러 자가 면역 질환 개선에 표시 되었습니다. 여기는 Qa-1 단백질에 epitopes의 식별에 겹치는 펩타이드 라이브러리 전략에 설명합니다.

Qa-1 (HLA-E in human) belongs to a group of non-classical major histocompatibility complex 1b (MHC-Ib) molecules. Recent data suggest that Qa-1 molecules ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

6.8K 조회수.  Loma Linda University. Qa-1 (인간에서 HLA-E) 비 고전 중요 한 조직 적합성 복잡 한 1b 분자의 그룹에 속한다. Qa-1-바인딩 epitopes와 면역 조직 특정 면역 규칙을 증강 하 고 여러 자가 면역 질환 개선에 표시 되었습니다. 여기는 Qa-1 단백질에 epitopes의 식별에 겹치는 펩타이드 라이브러리 전략에 설명합니다.

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Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. Peptide affinity reagents can be used for similar applications to antibodies, including sensing and therapeutics, but are more robust and able to perform in more extreme environments. Specific enrichment of peptide capture agents to a protein target of interest is enhanced using semi-automated sorting methods which improve binding and wash steps and therefore decrease the occurrence of false positive binders. A semi-automated sorting method is described herein for use with a commercial automated magnetic-activated cell sorting device with an unconstrained bacterial display sorting library expressing random 15-mer peptides. With slight modifications, these methods are extendable to other automated devices, other sorting libraries, and other organisms. A primary goal of this work is to provide a comprehensive methodology and expound the thought process applied in analyzing and minimizing the resulting pool of candidates. These techniques include analysis of on-cell binding using fluorescence-activated cell sorting (FACS), to assess affinity and specificity during sorting and in comparing individual candidates, and the analysis of peptide sequences to identify trends and consensus sequences for understanding and potentially improving the affinity to and specificity for the target of interest.

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for discovery of peptide affinity reagents, a robust alternative to antibodies. The semi-automated sorting method herein has streamlined biopanning to decrease the occurrence of false positives. Here we illustrate the thought process and techniques applied in evaluating candidates and minimizing downstream analysis.

펩 티 드 선호도 시 약 검색 및 분석 결과 분리의 세균성 디스플레이 라이브러리의 반자동된 Biopanning

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

연구

생화학

Personalized Peptide Arrays for Detection of HLA Alloantibodies in Organ Transplantation

In organ transplantation, the function and longevity of the graft critically rely on the success of controlling immunological rejection reactivity against human leukocyte antigens (HLA). Histocompatibility guidelines are based on laboratory tests of anti-HLA immunity, which presents either as pre-existing or de novo generated HLA antibodies that constitute a major transplantation barrier. Current tests are built on a single-antigen beads (SAB) platform using a fixed set of ~100 preselected recombinant HLA antigens to probe transplant sera. However, in humans there exist a far greater variety of HLA types, with no two individuals other than identical twins who can share the same combination of HLA sequences. While advanced technologies for HLA typing and direct sequencing can precisely capture any mismatches in DNA sequence between a donor's and recipient's HLA, the SAB assay, due to its limited variety in sequence representation, is unable to precisely detect alloantibodies specifically against the donor HLA mismatches. We sought to develop a complementary method using a different technology to detect and characterize anti-donor HLA antibodies on a personalized basis. The screening tool is a custom peptide array of donor HLA-derived sequences for probing post-transplant sera of the organ recipient to assess the risk for antibody-mediated rejection. On a single array for one donor-recipient pair, up to 600 unique peptides are made based on the donor's HLA protein sequences, each peptide carrying at least one mismatched residue in a 15-amino acid sequence. In our pilot experiments to compare antigen patterns for pre- and post-transplant sera on these arrays, we were able to detect anti-HLA signals with the resolution that also allowed us to pinpoint the immune epitopes involved. These personalized antigen arrays allow high-resolution detection of donor-specific HLA epitopes in organ transplantation.

Mismatches in human leukocyte antigen (HLA) sequences between organ donor and recipient pairs are the major cause of antibody-mediated rejection in organ transplantation. Here we present the use of custom antigen arrays that are based on individual donors' HLA sequences to probe anti-donor HLA alloantibodies in organ recipients.

장기 이식에서 HLA Alloantibodies의 검출에 대 한 펩 티 드 배열 맞춤

In organ transplantation, the function and longevity of the graft critically rely on the success of controlling immunological rejection reactivity against ...

A Fast and Quantitative Method for Post-translational Modification and Variant Enabled Mapping of Peptides to Genomes

Cross-talk between genes, transcripts, and proteins is the key to cellular responses; hence, analysis of molecular levels as distinct entities is slowly being extended to integrative studies to enhance the understanding of molecular dynamics within cells. Current tools for the visualization and integration of proteomics with other omics datasets are inadequate for large-scale studies. Furthermore, they only capture basic sequence identify, discarding post-translational modifications and quantitation. To address these issues, we developed PoGo to map peptides with associated post-translational modifications and quantification to reference genome annotation. In addition, the tool was developed to enable the mapping of peptides identified from customized sequence databases incorporating single amino acid variants. While PoGo is a command line tool, the graphical interface PoGoGUI enables non-bioinformatics researchers to easily map peptides to 25 species supported by Ensembl genome annotation. The generated output borrows file formats from the genomics field and, therefore, visualization is supported in most genome browsers. For large-scale studies, PoGo is supported by TrackHubGenerator to create web-accessible repositories of data mapped to genomes that also enable an easy sharing of proteogenomics data. With little effort, this tool can map millions of peptides to reference genomes within only a few minutes, outperforming other available sequence-identity based tools. This protocol demonstrates the best approaches for proteogenomics mapping through PoGo with publicly available datasets of quantitative and phosphoproteomics, as well as large-scale studies.

Here we present the proteogenomic tool PoGo and protocols for fast, quantitative, post-translational modification and variant enabled mapping of peptides identified through mass spectrometry onto reference genomes. This tool is of use to integrate and visualize proteogenomic and personal proteomic studies interfacing with orthogonal genomics data.

포스트 번역 상 수정 및 변형에 대 한 신속 하 고 양적 방법 사용의 펩 티 드 유전자에 매핑

Cross-talk between genes, transcripts, and proteins is the key to cellular responses; hence, analysis of molecular levels as distinct entities is slowly ...

유전학

Immunopeptidomics: Isolation of Mouse and Human MHC Class I- and II-Associated Peptides for Mass Spectrometry Analysis

Immunopeptidomics is an emerging field that fuels and guides the development of vaccines and immunotherapies. More specifically, it refers to the science of investigating the composition of peptides presented by major histocompatibility complex (MHC) class I and class II molecules using mass spectrometry (MS) technology platforms. Among all the steps in an MS-based immunopeptidomics workflow, sample preparation is critically important for capturing high-quality data of therapeutic relevance. Here, step-by-step instructions are described to isolate MHC class I and II-associated peptides by immunoaffinity purification from quality control samples, from mouse (EL4 and A20), and human (JY) cell lines more specifically. The various reagents and specific antibodies are thoroughly described to isolate MHC-associated peptides from these cell lines, including the steps to verify the beads-binding efficiency of the antibody and the elution efficiency of the MHC-peptide complexes from the beads. The protocol can be used to establish and standardize an immunopeptidomics workflow, as well as to benchmark new protocols. Moreover, the protocol represents a great starting point for any non-experts in addition to foster the intra- and inter-laboratory reproducibility of the sample preparation procedure in immunopeptidomics.

Here, we present a protocol for the purification of MHC class I and class II peptide complexes from mouse and human cell lines providing high-quality immunopeptidomics data. The protocol focuses on sample preparation using commercially available antibodies.

면역 펩티도믹스: 질량 분광분석 분석을 위한 마우스 및 인간 MHC 급 I-및 II 관련 펩타이드의 격리

Immunopeptidomics is an emerging field that fuels and guides the development of vaccines and immunotherapies. More specifically, it refers to the science ...

Peptide Scanning-assisted Identification of a Monoclonal Antibody-recognized Linear B-cell Epitope

The identification of an antigenic epitope by the immune system allows for the understanding of the protective mechanism of neutralizing antibodies that may facilitate the development of vaccines and peptide drugs. Peptide scanning is a simple and efficient method that straightforwardly maps the linear epitope recognized by a monoclonal antibody (mAb). Here, the authors present an epitope determination methodology involving serially truncated recombinant proteins, synthetic peptide design, and dot-blot hybridization for the antigenic recognition of nervous necrosis virus coat protein using a neutralizing mAb. This technique relies on the dot-blot hybridization of synthetic peptides and mAbs on a polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane. The minimum antigenic region of a viral coat protein recognized by the RG-M56 mAb can be narrowed down by step-by-step trimmed peptide mapping onto a 6-mer peptide epitope. In addition, alanine scanning mutagenesis and residue substitution can be performed to characterize the binding significance of each amino acid residue making up the epitope. The residues flanking the epitope site were found to play critical roles in peptide conformation regulation. The identified epitope peptide may be used to form crystals of epitope peptide-antibody complexes for an x-ray diffraction study and functional competition, or for therapeutics.

Here, the authors present a simple and efficient protocol to define a linear antigenic epitope using a purified monoclonal antibody and peptide scanning through dot-blot hybridization. The identified epitope can then be used in therapeutic and diagnostic applications.

펩타이드 모노클로 날 항체 인식 선형 B 세포 에피토프의 확인을 스캔 보조

The identification of an antigenic epitope by the immune system allows for the understanding of the protective mechanism of neutralizing antibodies that ...

면역학 및 감염병학

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in quantitation, are associated with a high cost, long lead time, and are fraught with drawbacks (e.g. heterophilic antibodies, autoantibody interference, 'hook-effect').1 An alternative technique is affinity enrichment of peptides coupled with quantitative mass spectrometry, commonly referred to as SISCAPA (Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies).2 In this technique, affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution and detection by selected/multiple reaction monitoring mass spectrometry (SRM/MRM-MS) provides quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. SRM/MRM-MS is well established for accurate quantitation of small molecules 3, 4 and more recently has been adapted to measure the concentrations of proteins in plasma and cell lysates.5-7 To achieve quantitation of proteins, these larger molecules are digested to component peptides using an enzyme such as trypsin. One or more selected peptides whose sequence is unique to the target protein in that species (i.e. "proteotypic" peptides) are then enriched from the sample using anti-peptide antibodies and measured as quantitative stoichiometric surrogates for protein concentration in the sample. Hence, coupled to stable isotope dilution (SID) methods (i.e. a spiked-in stable isotope labeled peptide standard), SRM/MRM can be used to measure concentrations of proteotypic peptides as surrogates for quantification of proteins in complex biological matrices. The assays have several advantages compared to traditional immunoassays. The reagents are relatively less expensive to generate, the specificity for the analyte is excellent, the assays can be highly multiplexed, enrichment can be performed from neat plasma (no depletion required), and the technique is amenable to a wide array of proteins or modifications of interest.8-13 In this video we demonstrate the basic protocol as adapted to a magnetic bead platform.

Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies (SISCAPA) couples affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution mass spectrometry (MRM-MS) to provide quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. Here we describe the protocol using magnetic particles in a partially automated format.

펩타이드 면역 친 화성 농축을 사용하여 단백질의 양을 정함은 질량 분광법과 함께

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

생물학

Biosensor-based High Throughput Biopanning and Bioinformatics Analysis Strategy for the Global Validation of Drug-protein Interactions

Receptors and enzyme proteins are important biomolecules that act as binding targets for bioactive small molecules. Thus, the rapid and global validation of the drug-protein interactions is highly desirable for not only understanding the molecular mechanisms underlying therapeutic efficacy but also for assessing drug characteristics, such as adsorption, distribution, metabolism, excretion, and toxicity (ADMET) for clinical use. Here, we present a biosensor-based high throughput strategy for the biopanning of T7 phage-displayed short peptides that can be easily displayed on the phage capsid. Subsequent analysis of the amino acid sequences of peptides containing short segments, as &#34;broken relics&#34;, of the drug-binding sites using bioinformatics programs in receptor ligand contact (RELIC) suite, is also shown. By applying this method to two clinically approved drugs, an anti-tumor irinotecan, and an anti-flu oseltamivir, the detailed process for collecting the drug-recognizing peptide sequences and highlighting the drug-binding sites of the target proteins are explained in this paper. The strategy described herein can be applied for any small molecules of interest.

This study aimed to present a strategy for identifying drug-peptide interactions. The strategy involves the biopanning of drug-recognizing short peptides based on a quartz-crystal microbalance (QCM) biosensor, followed by bioinformatics analysis for quantitatively assessing the information obtained for the drug recognition and annotation of the drug-binding sites on proteins.

약물 단백질 상호 작용의 글로벌 검증을 위한 바이오센서 기반 고처리량 바이오패닝 및 생물정보학 분석 전략

Receptors and enzyme proteins are important biomolecules that act as binding targets for bioactive small molecules. Thus, the rapid and global validation ...

생체공학

A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or design1,2. Here, a peptide-MHC II binding assay is scaled to 384-well format. The scaled down protocol reduces reagent costs by 75% and is higher throughput than previously described 96-well protocols1,3-5. Specifically, the experimental design permits robust and reproducible analysis of up to 15 peptides against one MHC II allele per 384-well ELISA plate. Using a single liquid handling robot, this method allows one researcher to analyze approximately ninety test peptides in triplicate over a range of eight concentrations and four MHC II allele types in less than 48 hr. Others working in the fields of protein deimmunization or vaccine design and development may find the protocol to be useful in facilitating their own work. In particular, the step-by-step instructions and the visual format of JoVE should allow other users to quickly and easily establish this methodology in their own labs.

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or design. &#160;Here, a peptide-MHC II binding assay scaled to 384-well plates is described. This cost effective format should prove useful in the fields of protein deimmunization and vaccine design and development.

펩티드 에피토프의 정량 분석​​을위한 높은 처리량 MHC II 결합 분석

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or ...

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may result in disease, making protein interactions important drug targets. It is thus highly important to understand these interactions at the molecular level. Protein interactions are studied using a variety of techniques ranging from cellular and biochemical assays to quantitative biophysical assays, and these may be performed either with full-length proteins, with protein domains or with peptides. Peptides serve as excellent tools to study protein interactions since peptides can be easily synthesized and allow the focusing on specific interaction sites. Peptide arrays enable the identification of the interaction sites between two proteins as well as screening for peptides that bind the target protein for therapeutic purposes. They also allow high throughput SAR studies. For identification of binding sites, a typical peptide array usually contains partly overlapping 10-20 residues peptides derived from the full sequences of one or more partner proteins of the desired target protein. Screening the array for binding the target protein reveals the binding peptides, corresponding to the binding sites in the partner proteins, in an easy and fast method using only small amount of protein.
In this article we describe a protocol for screening peptide arrays for mapping the interaction sites between a target protein and its partners. The peptide array is designed based on the sequences of the partner proteins taking into account their secondary structures. The arrays used in this protocol were Celluspots arrays prepared by INTAVIS Bioanalytical Instruments. The array is blocked to prevent unspecific binding and then incubated with the studied protein. Detection using an antibody reveals the binding peptides corresponding to the specific interaction sites between the proteins.

Peptide array screening is a high throughput assay for identifying protein-protein interaction sites. This allows mapping multiple interactions of a target protein and can serve as a method for identifying sites for inhibitors that target a protein. Here we describe a protocol for screening and analyzing peptide arrays.

펩타이드 배열을 사용하여 단백질 - 단백질 상호 작용 사이트를 확인

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...

A Peptide Microarray Technology for Specificity Profiling of Antibodies

Source: Cornett, E. M., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/55912">Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays.</a> J. Vis. Exp. (2017).
This video demonstrates a technique that applies peptide microarray technology to profile the specificity of antibodies recognizing post-translational modifications (PTMs) on histone peptides. A microarray slide containing immobilized fluorophore-conjugated histone peptides with known PTM combinations is treated with target PTM-specific antibodies. This process helps identify the antibody&#39;s specificity for the target and its potential cross-reactivity with non-target PTMs.

항체의 특이성 프로파일링을 위한 펩타이드 마이크로어레이 기술

1. Designing the Array Slide and Source Plate Layout

	Under the &#39;Plan a slide layout&#39; heading on the ArrayNinja interface, click on the link that ...

Qa-1 단백질에 Epitopes를 매핑할 겹치는 펩타이드 라이브러리

요약

더 많은 비디오 탐색

이 비디오의 챕터

펩 티 드 선호도 시 약 검색 및 분석 결과 분리의 세균성 디스플레이 라이브러리의 반자동된 Biopanning

장기 이식에서 HLA Alloantibodies의 검출에 대 한 펩 티 드 배열 맞춤

포스트 번역 상 수정 및 변형에 대 한 신속 하 고 양적 방법 사용의 펩 티 드 유전자에 매핑

면역 펩티도믹스: 질량 분광분석 분석을 위한 마우스 및 인간 MHC 급 I-및 II 관련 펩타이드의 격리

펩타이드 모노클로 날 항체 인식 선형 B 세포 에피토프의 확인을 스캔 보조

펩타이드 면역 친 화성 농축을 사용하여 단백질의 양을 정함은 질량 분광법과 함께

약물 단백질 상호 작용의 글로벌 검증을 위한 바이오센서 기반 고처리량 바이오패닝 및 생물정보학 분석 전략

펩티드 에피토프의 정량 분석을위한 높은 처리량 MHC II 결합 분석

펩타이드 배열을 사용하여 단백질 - 단백질 상호 작용 사이트를 확인

항체의 특이성 프로파일링을 위한 펩타이드 마이크로어레이 기술

Qa-1 단백질에 Epitopes를 매핑할 겹치는 펩타이드 라이브러리

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펩 티 드 선호도 시 약 검색 및 분석 결과 분리의 세균성 디스플레이 라이브러리의 반자동된 Biopanning

장기 이식에서 HLA Alloantibodies의 검출에 대 한 펩 티 드 배열 맞춤

포스트 번역 상 수정 및 변형에 대 한 신속 하 고 양적 방법 사용의 펩 티 드 유전자에 매핑

면역 펩티도믹스: 질량 분광분석 분석을 위한 마우스 및 인간 MHC 급 I-및 II 관련 펩타이드의 격리

펩타이드 모노클로 날 항체 인식 선형 B 세포 에피토프의 확인을 스캔 보조

펩타이드 면역 친 화성 농축을 사용하여 단백질의 양을 정함은 질량 분광법과 함께

약물 단백질 상호 작용의 글로벌 검증을 위한 바이오센서 기반 고처리량 바이오패닝 및 생물정보학 분석 전략

펩티드 에피토프의 정량 분석​​을위한 높은 처리량 MHC II 결합 분석

펩타이드 배열을 사용하여 단백질 - 단백질 상호 작용 사이트를 확인

항체의 특이성 프로파일링을 위한 펩타이드 마이크로어레이 기술

펩티드 에피토프의 정량 분석을위한 높은 처리량 MHC II 결합 분석