Name: large volume, behaviorally-relevant illumination for optogenetics in non-human primates
Uploaded: 2017-10-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
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LCA는 NDSEG 친교, NSF GRFP과 맥 거 번 연구소의 친구 로부터 자금을 인정 합니다. EP는 해리와 유 니스 Nohara UROP 기금, 1995 UROP 기금의 MIT 클래스와 MIT UROP 기금 자금 인정 합니다. ESB는 NIH 2R44NS070453-03A1, IET 하 비 수상 및 뉴욕 줄기 세포 재단-로버트 슨 상 자금 인정 합니다. RD는 NIH EY017292에서 자금을 인정 합니다. 마이클 윌리엄스는 정리 하 고 촬영 전에 공급 수집 팀을도 왔다.

참고: 모든 동물 절차 NIH 지침에 따라 했다 고 하 여 매사 추세 츠 연구소의 기술 위원회 동물 관리에 승인 했다.
 1. 조명 제조 <ol><li>예리한가 위의 쌍을 사용 하 여 250 µ m 직경 플라스틱 광섬유를 적어도 10 cm 길이 보다 긴 경우 원하는 총 조명 기의 부분을 잘라.</li>
	<li>22 게이지 와이어 스 트리 퍼를 사용 하 여 플라스틱 광섬유의 한쪽 끝에서 제거 하는 폴 리 에틸렌 재킷의 15-20 cm.</li>
	<li>테이블 바이스 클램프에 섬유의 벗겨진된 끝의 대부분 3-5 cm는 원심 보안.</li>
	<li>지속적인 꾸준한 당겨 한 손에 긴장 된 섬유의 외피 끝을 개최. 섬유 부에 수직으로 바닥에 평행 해야 합니다. 난방 및 냉각 (단계 1.5 및 1.6 아래) 되도록 섬유 직선과 긴장 된 그것 가겠다고으로 섬유에이 지속적인 긴장 유지.</li>
	<li>듀얼 온도 열 총 (570/1000 ° F), 가장 낮은 설정을 사용 하 여 열 섬유의 제거 섹션 그것은 직경 60-100 μ m, 또는 사람의 모발의 직경에 대 한 박 형까지.</li>
	<li>하면서 냉각 섬유는 섬유에 일정 한 긴장을 유지 합니다. 긴장을 유지 하기 위해 실패 컬 섬유를 발생할 수 있습니다.</li>
	<li>해 현미경 남았다 팁의 직경을 확인합니다. 또는, 하나는 대신 캘리퍼스를 사용할 수 있습니다.
	<ol><li>섬유 충분히 얇은 경우, 반복 단계 1.4 1.6 통해 원하는 팁 직경을 달성 하는 데 필요한.</li>
		<li>옵션 다시 당기는 경우 작은 마크에 넣어 섬유의 좁은 부분 열 총의 중심 대상 섬유의 좁은 부분을 다시 열 수 것입니다 경우.</li>
		<li>섬유 너무 얇은 경우에, 다시 시작.</li>
	</ol></li> <li>섬유 전체 냉각 하 고 원하는 직경 달성, 양쪽에 섬유 좁은 지점에서 3 cm를 꼬집어. 빠르고와 날카로운 섬유의 축 따라 풀, 테이퍼 팁을 만들 측면을 분리.</li>
	<li>해 부 현미경에 낮은 전력 (예를 들어, 4 X) 아래 테이퍼 팁을 검토합니다. 팁 갈래 ( 그림 1 층) 웅크리고 경우 삭제 섬유.</li>
	<li>테이퍼 팁 떠나는 마지막 5 m m 노출 팁의 끝 근처 랩 테이프의 조각을 배치 하 여 엣지를 준비. 테이프는 빛 방출의 원하는 길이 위에 에칭에서 섬유를 보호합니다. 이 팁 길이 대상 지역에 영장류 피 두께에 따라 선정 되었다. 긴 또는 짧은 길이 조명의 원하는 길이 따라 노출 될 수 있습니다. 랩 테이프의 가장자리 또는 테이퍼 팁에서 가까이 이동 수 다른 엣지 팁 길이 바란다면.</li>
	<li>엄지손가락과 집게손가락 사이 5 μ m 실리콘 카바 이드 연마 시트의 작은 (~ 1 인치 x 2 인치) 광장을 접어. 연마 시트의 두 측면 사이의 섬유의 팁 놓고 엄지와 집게손가락 사이의 BB 롤링 마치 작은 원형의 움직임을 사용 하 여 섬유를 부드럽게 엣지. 모든 측면에 균등 하 게 새겨져 있다 있도록 자주 섬유를 회전 합니다. 섬유 팁 표시 됩니다 &#8220; roughened &#8221; 유엔 에칭 분야는 일반적으로 부드러운 표시 에칭 되어 있다 지역에서 육안으로.</li>
	<li>래핑 시트 3 μ m 알루미늄 산화물과 반복 단계 1.11.</li>
	<li>부착 커넥터 에칭된 팁 반대 조명 기의 끝에. 조명 기는 광 케이블 또는 레이저에 연결할 수 있습니다. 
	참고: 이 방법은 유리를 해결 하기 위한 선호 하는 방법에서 다릅니다 / 깃 봉에서 실리 카 광섬유. 때문에 금속 아무 손상 시킬 수 있습니다 접착 후 섬유와 아무 단위로 연마 플라스틱 광 섬유 보다 더 플라스틱 광섬유 금속 연마 과정에서 생산의 작은 파편으로 평면 죽 습 섬유에 자신을 포함할 수 있습니다.
	<ol><li>22 게이지 와이어 스 트리 퍼를 사용 하 여 조명 기의 반대쪽에서 폴 리 에틸렌 재킷의 약 5mm 제거.</li>
		<li>평면 표면을 반반 하 뜨거운 칼으로 반대쪽 끝을 잘라.</li>
		<li>폴란드어 연속적으로 미세한 lapping와 평면 반대쪽 시트: 0.3 µ m, 1 μ m, 3 μ m, 5 µ m.</li>
		<li>평면 삽입 끝 260 µ m 내부 직경 스테인리스 아무를 플러시는 아무의 끝까지 반대.</li>
		<li>시각적으로 그 반대쪽은 원활 하 고 균일 하 게 연마 섬유 현미경으로 확인.</li>
		<li>는 깃 봉에서 섬유를 제거 하 고 아래로 가리키는 섬유와 테이블의 가장자리에 수직으로 아무 테이프.</li>
		<li>플라스틱 에폭시 1 mL 주사기를 주사기에 무딘 18 게이지 바늘을 첨부.</li>
		<li>바늘을 사용에 아무로 내려 에폭시를 적용 합니다. 에폭시는 아무를 완전히 채워.</li>
		<li>는 아무 섬유 삽입.</li>
		<li>섬유의 광택된 표면에서 어떤 초과 에폭시 젖은 보풀 지우기 필요한 경우 건조 전에 닦아. 그렇지 않으면, 초과 에폭시 12-24 h. 후 제거 될 수 있다</li>
		<li>교정까지 부드럽게 섬유를 저장 하 고 먼지 모자는 아무 장소.</li>
	</ol></li></ol> 2. 조명 보정 및 품질 관리 참고: 교정에 대 한 이러한 방법을 평가 광 섬유의 끝에서 다른 거리에 비선형 출력. 고르지 못한 광 분포에서 일반적으로 결과 &#8220; 울 퉁 불 퉁 &#8221; 또는 &#8220; 물결 모양 &#8221; 테이퍼.
통합 영역을 사용 하 여 호 ( 그림 2)를 흡수 하는 빛의 상단에 대 한 <ol><li>만들기 빛 차폐 막. 
	참고: 흡수 하는 피부를 방지 하기 위해 호 일 처리 빛 빛 반영 얼룩을 만드는에서 오일 때마다 장갑을 착용 한다.
	<li>배 2 <ol>&#8221; 4 &#8221; 자체는 2를 통해 호를 흡수 하는 빛의 조각 &#8221; x 2 &#8221; 광장. 전송 시각: 다른 방법 2를 삭감 하는 &#8221; x 2 &#8221; 측면을 흡수 한 빛과 반영 하는 측면 (즉, 한 빛 광장 표준 알루미늄 호 일의 측면); 그러나, 접이식 메서드는 다음 단계. 횡 경 막 처리에 대 한 무딘 가장자리를 제공 하기 때문에 안전</li> <li>랩 테이프 또는 전기 테이프로 비 접힌 가장자리를 바인딩할 광장의 가장자리를 따라 접. 이 모두 함께 측면을 보유 하 고 날카로운 모서리에서 상처에 대 한 보호.</li>
		<li>26 게이지 바늘을 사용 하 여 사각형의 중심에 구멍을 찌를.</li>
		<li>통합 영역에서 모자에 큰 나사를 제거 하 고 횡 경 막과 개통을 커버. 센터 구멍을 배치 합니다. 막 빛 흡수 한 측면을 반영 하는 하나의 빛으로 만들어진 경우 배치 측면을 흡수 하는 빛 및 통합 분야의 내부를 직면 하 고 아래로 측면을 반영 하는 빛. 
		참고: 통합 영역에 들어가기에서 먼지와 파편을 방지 하 고 중심 구멍을 유지, 보안 연구소 테이프로 통합 분야의 외부에 횡 경 막.</li>
	</ol></li> <li>측정 빛는 micromanipulator 또는 stereotaxic 팔과 통합 영역을 사용 하 여 500 µ m 단위로 팁 따라 출력. 
	참고: 레이저에 때마다 적절 한 파장의 안전 고글을 착용 한다.
	<ol><li>레이저 또는 빛 섬유의 반대쪽 끝을 연결할 소스, 하지만 아직 출력 하는 빛을 트리거하지 않습니다.</li>
		<li>보안 stereotaxic 홀더 (prefe에 조명 기랩 테이프와 rably) 소유자의 하단 아래 7-10 m m 팁.</li>
		<li>나사에 stereotaxic 올리다 stereotaxic 홀더</li>
		<li>는 Illuminator 횡 경 막의 센터에 있는 구멍의 끝을 맞춥니다. 팁은 횡 경 막으로 정확한 동일한 수준 때는 micromanipulator 0.</li>
		<li>차례 방 불 끄고 통합 영역 0.</li>
		<li>트리거 레이저 (또는 다른 광원)와 총 빛 전원 통합 영역을 사용 하 여 출력을 측정. 
		참고: 가능한 가장 낮은 광 출력을 사용 하 여 교정 테스트.</li>
		<li>통합 영역 및 반복 단계 2.2.6에 섬유 500 µ m 낮은.</li>
		<li>계속 통합 영역으로 섬유를 낮추는 총 빛 전력 레벨에서 500 µ m 단위로 총 광 출력 측정 
		주의: 일단 전체 팁 영역에 총 빛 전원 수준 한다. 낮은 섬유를 계속 하지 않습니다에 에칭 넘어 1-2 m m 이상 길이 팁. 팁 통합 영역 하단의 연락처, 그것 수 있습니다 녹아 및/또는 통합 영역을 망치.</li>
	</ol></li> <li>총 빛 전원으로 얼마나 섬유의 함수는 선형성을 확인 통합 영역으로 하향 조정 되어 출력을 그려서 균등 하 게 에칭된 섬유 확인.</li></ol>
 3. Vivo에서 조명
 참고: 여기, 이러한 방법은 비 인간 영장류 보다는 플라스틱 모델을 사용 하 여 표시 됩니다.
<ol><li>임 플 란 트 25 m m 직경 녹음 실 실험 전에 관심의 뇌 영역에 이식 했다.</li>
	<li>실험 전에 해 부 자기 공명 영상 (MRI)을 수행합니다. 챔버에는 사용자 지정 녹음 그리드를 배치 하 고 메 마른 외과 윤활제 그리드 시각화 및 경질 대상 뇌 구조의 수준 결정에 대 한 수 있도록 그것을 채울.</li>
	<li>각 테스트 세션 전에 타워 마이크로 드라이브를 준비합니다.
	<ol><li>부착 드라이브에 중간과 더 낮은 경사진 팁 25 게이지 가이드 튜브 클램프. 두 개의 클램프는 가이드 튜브에 똑바로 되도록 하는 데 사용 됩니다. 원하는 경우 이러한 클램프의 둘 다 수동으로 이동할 수 있습니다. 
		참고: 가이드 튜브 epoxied 되거나 납땜 하는 클램프.</li>
		<li>같은 드라이브에 위 클램프에 큰 볼륨 조명 기를 보호합니다. 이 클램프는 드라이브 모터에 연결 된.</li>
		<li>가이드 튜브를 통해 대규모 조명 기를 완벽 하 게 스레드 및는 조명 기의 팁 가이드 튜브의 끝 지나서 확장 확인. 
		참고: 가이드 튜브의 끝으로 경질에서 대상 뇌 영역의 아래쪽 여백 까지의 거리와 과거를 확장 하는 조명 기의 길이 통해 MRI 결정.</li>
		<li>가이드 튜브 및 조명 (예, chlorohexidine) 소독 살 균 솔루션에 담가.</li>
	</ol></li> <li>깨끗 한 챔버 내부 사용자 지정 소독된 그리드를 배치 하 고 챔버 측면 나사와 미리 지정 된 방향에서 그것을 확보. 여기에 표시 된 눈금은 1mm 간격; 그러나, 간격 사용자 정의할 수 있습니다 필요에 따라. 
	참고: 이 그리드와 해 부 MRI에서 사용 하는 방향에 동일 해야 합니다.</li>
	<li>미리 정해진된 방향으로 녹음 실에서 정위 적 마이크로 드라이브 홀더 보안.</li>
	<li>살 균, 무뚝뚝한 겸 자 사용 하 여 조명 기를 당겨 가이드 튜브에서 조명 하는 소독된 기를 철회. 조명 기의 팁 가이드 튜브의 끝 위에 5-10 m m 이어야 한다. 
	참고: 조명 가이드 튜브 클램프 사이 바깥쪽으로 인사 합니다. 이 유연한 조명 기를 손상 하지 것입니다.</li>
	<li>마이크로 드라이브는 홀더를 부착 하 고 가이드 튜브 대상 그리드 구멍.</li>
	<li>낮은 마이크로 드라이브 단계 가이드 튜브는 경질의 수준을 통해 때까지. 
	참고: 전극 두 번째 마이크로 드라이브를 스테이지에 배치 하 고 다른 그리드 구멍으로 낮 췄 다 수 있습니다. 이 전극에 잠재적인 로컬 필드 거리 의존 빛 유물, 조명 배치를 확인 하는 데 사용할 수 있습니다 표시 됩니다.</li>
	<li>시도 낮은 조명 기는 수동으로 멸 균 포 셉와 함께.
	<ol><li>어떤 저항 든 지 있는 경우에, 철회는 조명 기 5-10 mm, 조직 정착 하 고 다시 시도 하십시오 수 있도록 10 분을 기다립니다.</li>
		<li>여전히 저항에 경우 두 번째 시도, 접어 야 조명 팁 가이드 튜브, 낮은 가이드 0.25 m m, 튜브 하 고 다시 시도 하십시오.</li>
		<li>어떤 저항 없이 가이드 튜브를 통해 조명 기 슬라이드 때까지 반복.</li>
		<li>낮은 조명 기는 긴장 된 때까지. 
		주의: 강력히 저항에 대 한 조명 기를 밀어 하지 않습니다. 이러한 경우에 가이드 튜브 일반적으로 하지 관통 경질 완전히. 두뇌를 입력 하 고 팁 ( 그림 1 g)를 파괴 하는 가능 하 게 섬유를 방지 자체에 벤드를 하면 섬유를 강력히 추진.</li>
	</ol></li> <li>큰 광학 설정 또는 레이저에는 조명 기의 다른 끝에 아무 연결.</li>
	<li>확인 빛 비 인간 영장류에 게 표시 됩니다.
	<ol><li>블랙 아웃 차폐 하거나 빛을 흡수 하는 완전히 녹음 타워를 포괄 하는 호 일.</li>
		<li>호 일을 흡수 하는 빛의 만든 차폐 봉투에 모든 광학 연결 장소.</li>
		<li>방패 모든 패치 케이블 중 빛을 흡수 하는 포 일 또는 검은 전기 테이프.</li>
		<li>추가 조치로 비 인간 영장류 뒤에 실험에 사용 되는 동일한 빛 색의 미끼 발광 다이오드 (LED) 은행 놓고 2.5 Hz에서 지속적으로 Led 플래시. 이 어둠에 완전히 조정에서 눈을 방지 합니다. 만약 실수로 빛 누설 했다,이 번쩍이는 빛 행동 방 아 쇠로 봉사에서 누설을 방지 하기 위해 도움이 될.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
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Optogenetic 도구는 널리 질병 및 설치류에서 생리학을 공부 하는 데 사용 됩니다, 하지만 계몽 큰 두뇌 볼륨의 기술적 도전 비 인간 영장류에서 optogenetics의 사용을 제한 했다. 아마도 작은 볼륨을 밝히는 큰 빛 전원 밀도 (~ 100 mW/m m2 ~ 20 W/m m2)를 사용 하는 원숭이 연구 개척 &#60; 1 m m3, 그리고 피4, 흥분 성의 opsins 겸손 한 행동 효과 보고 ...

밀리초 정밀, 빛 기반 신경 제어를 허용 하는 Optogenetic 도구 기능 생리학 및 설치류 및 무척 추 동물 행동 연구에 널리 사용 됩니다. 그러나, 기술 과제는 설치류 뇌 1보다 큰 x 볼륨 ~ 100 비 인간 영장류 뇌에서 optogenetics의 사용을 제한 했다.
비 인간 영장류에서 optogenetics 연구를 촉진 하는 조명 기 두 경쟁 목표를 해결 하도록 설계 되었습니다: 큰 볼륨 조명 및 최소한의 침투 손상. 이러한 우려 중 하나는 주소 이전 하려고 다른 비싼에 왔습니다. 번들 섬유 조명 더 큰 볼륨의 하지만 증가 직경, 및, 따라서, 손상2,3. 테이퍼 유리 섬유 하지만 좁게 초점 빛을 발광 표면 침투 손상을 감소 &#60; 100 µ m2 4,5. 외부 뇌 경질에 창문을 통해 침투 손상의 도전 circumvents 조명과 큰 볼륨 조명, 대 한 수 있지만 몇 가지 피상적인 뇌 분야6만 사용할 수 있습니다.
대규모, 작은 직경 조명 (그림 1a)를 만들려면 플라스틱 광 섬유 열 테이퍼 이며 코어와 클 래 딩의 팁 에칭 (그림 1bc). 좁은 지점에 빛을 집중 하는 다른 테이퍼 섬유, 달리는 에칭 팁, 따라서, (그림 1의 de) 큰 영역 빛을 광범위 하 게 배포 하는 방법의 측면에 밖으로 균등 하 게 탈출 하는 빛을 수 있습니다. 때문에 침투 손상을 침투 직경에 비례,이 조명 기는 기존의 섬유 보다 더 침투 손상 아직 그것은 &#62; 발광 표면 영역 및 제공 빛 더 광범위 하 게 1 x 100/100 빛 전원 뇌 팬텀 (1.75 %agarose)의 밀도 (그림 1e). 몬테 카를로 모델 (그림 1 층) 그들은 그들의 발광 표면으로 동등한 빛 전원 밀도가지고 기존의 섬유와 대용량 조명 빛 확산에 차이 보여 줍니다. 각 조명 기는 개별적으로 (그림 2a, b) 팁 (그림 2c) 따라도 빛을 분배를 보장 하기 위해 통합 영역을 사용 하 여 보정 됩니다.
이 큰 볼륨 조명 기는 optogenetic 조작 동작 및 비 인간 영장류에 신경 발포의 유효성이 검증 되었습니다. 어떤 뇌 영역을 각 동물의 개별 수용 필드 지도 섬유 팁 길이 사용자 지정할 수 있습니다. 조명 조명의 길이 걸쳐 있는 신경 녹음에 대 한 관통 전극와 쌍 수 있습니다. 또한, 섬유는 가시 광선의 색상을 가져올 수 있다, 때문에 그것은 사용할 수 사용 가능한 optogenetic 분자의와 결합 될 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Plastic optical fiber</td><td>Industrial fiber optics</td><td>SK-10</td><td>250 micron diameter, Super Eska line</td></tr><tr><td>Wire stripper</td><td>Klein Tools</td><td>11047</td><td>22 gauge</td></tr><tr><td>Vise Clamp</td><td>Wilton</td><td>11104</td><td>Generic table mount vice clamp</td></tr><tr><td>Dual temperature heat gun</td><td>Milwaukee</td><td>8975-6</td><td>570 / 1,000 &amp;deg;F</td></tr><tr><td>Lab marker</td><td>VWR</td><td>52877</td><td></td></tr><tr><td>Dissection microscope</td><td>VistaVision</td><td>82027-156</td><td>Stereo microscope w/ dual incandescent light, 2X/4X magnification, available from VWR</td></tr><tr><td>Lab tape</td><td>VWR</td><td>89097-972</td><td>4 pack of violet color; however, tape color does not matter</td></tr><tr><td>Silicon carbide lapping sheet</td><td>ThorLabs</td><td>LF5P</td><td>5 micron grit, 10 pack</td></tr><tr><td>Aluminum oxide lapping sheet</td><td>ThorLabs</td><td>LF3P</td><td>3 micron grit, 10 pack</td></tr><tr><td>Aluminum oxide lapping&amp;nbsp; sheet</td><td>ThorLabs</td><td>LF1P</td><td>1 micron grit, 10 pack</td></tr><tr><td>Calcined alumina lapping sheet</td><td>ThorLabs</td><td>LF03P</td><td>0.3 micron grit, 10 pack</td></tr><tr><td>Hot knife</td><td>Industrial fiber optics</td><td>IF370012</td><td>60 Watt, heavy duty</td></tr><tr><td>Fiber inspection scope</td><td>ThorLabs</td><td>FS201</td><td>optional</td></tr><tr><td>Stainless Steel Ferrule</td><td>Precision fiber optics</td><td>MM-FER2003SS-265</td><td>265 micron inner diameter</td></tr><tr><td>1 mL syringe</td><td>BD</td><td>14-823-30</td><td>Luer-lok tip is preferable to reduce risk of leakage, but not strictly needed</td></tr><tr><td>Plastic epoxy</td><td>Industrial fiber optics</td><td>40 0005</td><td></td></tr><tr><td>18 gauge blunt needle</td><td>BD</td><td>305180</td><td>1.5 inch length</td></tr><tr><td>Lint-free wipe (KimWipe)</td><td>ThorLabs</td><td>KW32</td><td>available from many vendors</td></tr><tr><td>Light absorbing foil</td><td>ThorLabs</td><td>BKF12</td><td></td></tr><tr><td>Electrical tape</td><td>3M</td><td>Temflex 1700</td><td>Optional, may substitute other brands / models</td></tr><tr><td>26 gauge sharp needle&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>305111</td><td>0.5 inch length</td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Siskiyou</td><td>70750000E</td><td>may substitute other brands/models</td></tr><tr><td>Steretactic arm</td><td>Kopf</td><td>1460</td><td>may substitute other brands/models</td></tr><tr><td>Laser safety goggles</td><td>KenTeK</td><td>KCM-6012</td><td>must be selected based on the color of laser used, example given here</td></tr><tr><td>Laser or other light source</td><td>vortran</td><td>Stradus 473-50</td><td>example of blue laser</td></tr><tr><td>Integrating sphere</td><td>ThorLabs</td><td>S142C</td><td>Attached power meter, also available from ThorLabs, item #PM100D</td></tr><tr><td>Ultem recording chamber</td><td>Crist instrument company</td><td>6-ICO-J0</td><td>Customized with alignment notch</td></tr><tr><td>Tower microdrive with clamps</td><td>NAN</td><td>DRTBL-CMS</td><td></td></tr><tr><td>Guide tube</td><td>Custom</td><td>N/A</td><td>Made from 25 gauge spinal needle (BD) or blunt tubing</td></tr><tr><td>NAN driver system</td><td>NAN</td><td>NANDrive</td><td></td></tr><tr><td>Custom grid design</td><td>custom</td><td>custom</td><td>plans available upon request</td></tr><tr><td>Blunt forceps</td><td>FischerScientific</td><td>08-875-8A</td><td>generic stainless steel blunt forceps</td></tr><tr><td>Digital calipers</td><td>Neiko</td><td>01407A</td><td>available on amazon.com. May select a finer resolution caliper for more precise measurements.</td></tr><tr><td>Patch cable</td><td>ThorLabs</td><td>FG200LCC-custom</td><td>This is one example of many possible patch cables. As long as the fiber diameter is less than or equal to the fiber diameter of the large volume illuminator and as long as the connectors interface, any patch cable (glass or plastic, vendor purchased or made in the lab) is fine for this application.</td></tr><tr><td>Clear plastic dust caps</td><td>ThorLabs</td><td>CAPF</td><td>Package of 25</td></tr><tr><td>ceramic split mating sleeve</td><td>Precision Fiber Products, Inc.</td><td>SM-CS1140S</td><td></td></tr></tbody></table>

large volume, behaviorally-relevant illumination for optogenetics in non-human primates

이 프로토콜 비 인간 영장류 뇌에서 optogenetic 조작에 대 한 개발 된 대규모 조명 기를 설명 합니다. 조명 기는 에칭 팁, 수정 된 플라스틱 광섬유 발광 표면적은 &#62; 100 종래의 섬유의 x. 큰 볼륨 조명 기의 건설을 설명, 뿐만 아니라이 프로토콜도 빛을 분배를 보장 하는 데 사용 하는 품질 관리 교정을 자세히 설명 합니다. 또한,이 프로토콜 삽입 하 고 제거 하는 큰 볼륨 조명에 대 한 기술을 설명 합니다. 표면 기도 하 고 깊은 구조를 조명 수 있습니다. 이 큰 볼륨 조명 기, 전극에 물리적으로 결합 될 필요는 없습니다 그리고 플라스틱, 유리 하지는 조명 때문에 그것은 것입니다 단순히 구 부 상황에서 전통적인 광학 섬유 깨지는 것 이다 때. 이 조명 기는 기존의 광섬유 보다 큰 침투 손상으로 행동-관련 조직 볼륨 (≈ 10 m m3) 빛을 제공 한다, 때문에 그것은 비 인간 영장류에서 optogenetics를 사용 하 여 행동 연구를 촉진 한다.

비 인간 영장류에서 큰 두뇌 볼륨의 조명 행동-관련 optogenetic 조작 가능합니다. 애 커 외. 레드 이동 Halorhodopsin, 턱 7 두 붉은 털 원숭이에 메모리 기반 saccades 정면 눈 분야 (들)의 임시 기여 공부 하 (2016) 사용이 큰 볼륨 조명 기. 특히, 들 신경 턱을 포함 하는 바이러스 성 벡터와 주입 되었고 대상 프레 젠 테이 션, 지연 기간 또는 메모리 기반 saccade 작업의 모터 준비 기간 동...

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Large Volume, Behaviorally-relevant Illumination for Optogenetics in Non-human Primates

최소한의 직경이 큰 볼륨에 빛을 전달 하기 위한 조직 침투 조명 기 구축 프로토콜 제공 됩니다.

큰 볼륨, 비 인간 영장류에서 Optogenetics에 대 한 행동-관련 조명

This protocol describes a large-volume illuminator, which was developed for optogenetic manipulations in the non-human primate brain. The illuminator is a ...

large-volume-behaviorally-relevant-illumination-for-optogenetics-non

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Behavior

8.0K 조회수.  Massachusetts Institute of Technology. 최소한의 직경이 큰 볼륨에 빛을 전달 하기 위한 조직 침투 조명 기 구축 프로토콜 제공 됩니다.

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Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells in the walls of the lateral ventricle give rise to neuroblasts that migrate for several millimeters along the rostral migratory stream (RMS) to reach and incorporate into the olfactory bulb. To study the different steps and the impact of adult-born neuron integration into preexisting olfactory circuits, it is necessary to selectively label and manipulate the activity of this specific population of neurons. The recent development of optogenetic technologies offers the opportunity to use light to precisely activate this specific cohort of neurons without affecting surrounding neurons4,5. Here, we present a series of procedures to virally express Channelrhodopsin2(ChR2)-YFP in a temporally restricted cohort of neuroblasts in the RMS before they reach the olfactory bulb and become adult-born neurons. In addition, we show how to implant and calibrate a miniature LED for chronic in vivo stimulation of ChR2-expressing neurons.

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Adult-born neurons of the olfactory bulb can be optogenetically controlled using Channelrhodopsin2-expressing lentiviral injection in the rostral migratory stream and chronic photostimulation with an implanted miniature LED.

만성에 대한 성인 태어나 강한 뉴런의 선택 바이러스성 전달 생체내에 Optogenetic의 자극

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

연구

신경과학

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

Optogenetic methods have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity underlying a diverse set of behaviors across a broad range of species. Optogenetic tools of microbial origin consist of light-sensitive membrane proteins that are able to activate (e.g., channelrhodopsin-2, ChR2) or silence (e.g., halorhodopsin, NpHR) neural activity ingenetically-defined cell types over behaviorally-relevant timescales. We first demonstrate a simple approach for adeno-associated virus-mediated delivery of ChR2 and NpHR transgenes to the dorsal subiculum and prelimbic region of the prefrontal cortex in rat. Because ChR2 and NpHR are genetically targetable, we describe the use of this technology to control the electrical activity of specific populations of neurons (i.e., pyramidal neurons) embedded in heterogeneous tissue with high temporal precision. We describe herein the hardware, custom software user interface, and procedures that allow for simultaneous light delivery and electrical recording from transduced pyramidal neurons in an anesthetized in vivo preparation. These light-responsive tools provide the opportunity for identifying the causal contributions of different cell types to information processing and behavior.

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

The recent development of neuroscience tools that combine genetics and optics, termed "optogenetics", enables control over neural circuit activity with an unprecedented level of spatial and temporal resolution. Here we provide a protocol for integrating in vivo recording with optogenetic manipulation of genetically-defined subsets of prefrontal cortical and subicular pyramidal neurons.

개별 피라미드 뉴런의 고 충실도 Optogenetic 제어하는​​ 방법<em&gt; 생체 내</em

Optogenetic methods  have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity  underlying a diverse set of behaviors across a broad range ...

Two Different Real-Time Place Preference Paradigms Using Optogenetics within the Ventral Tegmental Area of the Mouse

Understanding how neuronal activation leads to specific behavioral output is fundamental for modern neuroscience. Combining optogenetics in rodents with behavioral testing in validated paradigms allows the measurement of behavioral consequences upon stimulation of distinct neurons in real-time with high spatial and temporal selectivity, and thus the establishment of causal relationships between neuronal activation and behavior. Here, we describe a step-by-step protocol for a real-time place preference (RT-PP) paradigm, a modified version of the classical conditioned place preference (CPP) test. The RT-PP is performed in a three-compartment apparatus and can be utilized to answer if optogenetic stimulation of a specific neuronal population is rewarding or aversive. We also describe an alternative version of the RT-PP protocol, the so-called neutral compartment preference (NCP) protocol, which can be used to confirm aversion. The two approaches are based on extensions of classical methodology originating from behavioral pharmacology and recent implementation of optogenetics within the neuroscience field. Apart from measuring place preference in real time, these setups can also give information regarding conditioned behavior. We provide easy-to-follow step-by-step protocols alongside examples of our own data and discuss important aspects to consider when applying these types of experiments.

Here we present two easy-to-follow step-by-step protocols for place preference paradigms using optogenetics in mice. Using these two different setups, preference and avoidance behaviors can be solidly assessed within the same apparatus with high spatial and temporal selectivity, and in a straightforward manner.

마우스의 복부 테그멘탈 영역 내에서 광유전학을 사용하는 두 가지 실시간 장소 선호 패러다임

Understanding how neuronal activation leads to specific behavioral output is fundamental for modern neuroscience. Combining optogenetics in rodents with ...

행동분석학

Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity to Modulate Behavior in Freely Moving Mice

Optogenetic modulation of neuronal circuits in freely moving mice affects acute and long-term behavior. This method is able to perform manipulations of single neurons and region-specific transmitter release, up to whole neuronal circuitries in the central nervous system, and allows the direct measurement of behavioral outcomes. Neurons express optogenetic tools via an injection of viral vectors carrying the DNA of choice, such as Channelrhodopsin2 (ChR2). Light is brought into specific brain regions via chronic optical implants that terminate directly above the target region. After two weeks of recovery and proper tool-expression, mice can be repeatedly used for behavioral tests with optogenetic stimulation of the neurons of interest.
Optogenetic modulation has a high temporal and spatial resolution that can be accomplished with high cell specificity, compared to the commonly used methods such as chemical or electrical stimulation. The light does not harm neuronal tissue and can therefore be used for long-term experiments as well as for multiple behavioral experiments in one mouse. The possibilities of optogenetic tools are nearly unlimited and enable the activation or silencing of whole neurons, or even the manipulation of a specific receptor type by light.
The results of such behavioral experiments with integrated optogenetic stimulation directly visualizes changes in behavior caused by the manipulation. The behavior of the same animal without light stimulation as a baseline is a good control for induced changes. This allows a detailed overview of neuronal types or neurotransmitter systems involved in specific behaviors, such as anxiety. The plasticity of neuronal networks can also be investigated in great detail through long-term stimulation or behavioral observations after optical stimulation. Optogenetics will help to enlighten neuronal signaling in several kinds of neurological diseases.

With optogenetic manipulation of specific neuronal populations or brain regions, behavior can be modified with high temporal and spatial resolution in freely moving animals. By using different optogenetic tools in combination with chronically implanted optical fibers, a variety of neuronal modulations and behavioral testing can be performed.

자유롭게 움직이는 마우스에 있는 행동을 조절하기 위하여 신경 활동의 광유전학 조작

Optogenetic modulation of neuronal circuits in freely moving mice affects acute and long-term behavior. This method is able to perform manipulations of ...

Bioluminescent Optogenetics 2.0: Harnessing Bioluminescence to Activate Photosensory Proteins In Vitro and In Vivo

Bioluminescence - light emitted by a luciferase enzyme oxidizing a small molecule substrate, a luciferin - has been used in vitro and in vivo to activate light-gated ion channels and pumps in neurons. While this bioluminescent optogenetics (BL-OG) approach confers a chemogenetic component to optogenetic tools, it is not limited to use in neuroscience. Rather, bioluminescence can be harnessed to activate any photosensory protein, thus enabling the manipulation of a multitude of light-mediated functions in cells. A variety of luciferase-luciferin pairs can be matched with photosensory proteins requiring different wavelengths of light and light intensities.
Depending on the specific application, efficient light delivery can be achieved by using luciferase-photoreceptor fusion proteins or by simple co-transfection. Photosensory proteins based on light-dependent dimerization or conformational changes can be driven by bioluminescence to effect cellular processes from protein localization, regulation of intracellular signaling pathways to transcription. The protocol below details the experimental execution of bioluminescence activation in cells and organisms and describes the results using bioluminescence-driven recombinases and transcription factors. The protocol provides investigators with the basic procedures for carrying out bioluminescent optogenetics in vitro and in vivo. The described approaches can be further extended and individualized to a multitude of different experimental paradigms.

Bioluminescent Optogenetics 2.0: Harnessing Bioluminescence to Activate Photosensory Proteins In Vitro and In Vivo

Bioluminescence-light emitted by a luciferase enzyme oxidizing a small-molecule substrate, a luciferin-can be harnessed to activate photosensory proteins, thereby adding another dimension to light stimulation and enabling the manipulation of a multitude of light-mediated functions in cells across temporal and spatial scales.

생체 발광 광유전학 2.0 : 생체 발광을 활용하여 체외 및 생체 내에서 광감각 단백질을 활성화 합니다.

Bioluminescence - light emitted by a luciferase enzyme oxidizing a small molecule substrate, a luciferin - has been used in vitro and in vivo to activate ...

생화학

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

설치류 중추 신경계의 생체 Optogenetic 자극

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

A Guide to In vivo Single-unit Recording from Optogenetically Identified Cortical Inhibitory Interneurons

A major challenge in neurophysiology has been to characterize the response properties and function of the numerous inhibitory cell types in the cerebral cortex. We here share our strategy for obtaining stable, well-isolated single-unit recordings from identified inhibitory interneurons in the anesthetized mouse cortex using a method developed by Lima and colleagues1. Recordings are performed in mice expressing Channelrhodopsin-2 (ChR2) in specific neuronal subpopulations. Members of the population are identified by their response to a brief flash of blue light. This technique &#8211; termed &#8220;PINP&#8221;, or Photostimulation-assisted Identification of Neuronal Populations &#8211; can be implemented with standard extracellular recording equipment. It can serve as an inexpensive and accessible alternative to calcium imaging or visually-guided patching, for the purpose of targeting extracellular recordings to genetically-identified cells. Here we provide a set of guidelines for optimizing the method in everyday practice. We refined our strategy specifically for targeting parvalbumin-positive (PV+) cells, but have found that it works for other interneuron types as well, such as somatostatin-expressing (SOM+) and calretinin-expressing (CR+) interneurons.

A Guide to In vivo Single-unit Recording from Optogenetically Identified Cortical Inhibitory Interneurons

Here we describe our strategy for obtaining stable, well-isolated single-unit recordings from identified inhibitory interneurons in the anesthetized mouse cortex. Neurons expressing ChR2 are identified by their response to blue light. The method uses standard extracellular recording equipment, and serves as an inexpensive alternative to calcium imaging or visually-guided patching.

에 가이드<em&gt; 생체</emOptogenetically 확인 된 대뇌 피질의 억제의 interneurons에서&gt; 단일 단위 기록

A major challenge in neurophysiology has been to characterize the response properties and function of the numerous inhibitory cell types in the cerebral ...

A MRI-Based Toolbox for Neurosurgical Planning in Nonhuman Primates

In this paper, we outline a method for surgical preparation that allows for the practical planning of a variety of neurosurgeries in NHPs solely using data extracted from magnetic resonance imaging (MRI). This protocol allows for the generation of 3D printed anatomically accurate physical models of the brain and skull, as well as an agarose gel model of the brain modeling some of the mechanical properties of the brain. These models can be extracted from MRI using brain extraction software for the model of the brain, and custom code for the model of the skull. The preparation protocol takes advantage of state-of-the-art 3D printing technology to make interfacing brains, skulls, and molds for gel brain models. The skull and brain models can be used to visualize brain tissue inside the skull with the addition of a craniotomy in the custom code, allowing for better preparation for surgeries directly involving the brain. The applications of these methods are designed for surgeries involved in neurological stimulation and recording as well as injection, but the versatility of the system allows for future expansion of the protocol, extraction techniques, and models to a wider scope of surgeries.

The method outlined below aims to provide a comprehensive protocol for the preparation of nonhuman primate (NHP) neurosurgery using a novel combination of three-dimensional (3D) printing methods and MRI data extraction.

비인간 영장류의 신경 외과 계획을위한 MRI 기반 도구 상자

In this paper, we outline a method for surgical preparation that allows for the practical planning of a variety of neurosurgeries in NHPs solely using ...

생체공학

Convection Enhanced Delivery of Optogenetic Adeno-associated Viral Vector to the Cortex of Rhesus Macaque Under Guidance of Online MRI Images

In non-human primate (NHP) optogenetics, infecting large cortical areas with viral vectors is often a difficult and time-consuming task. Here, we demonstrate the use of magnetic resonance (MR)-guided convection enhanced delivery (CED) of optogenetic viral vectors into primary somatosensory (S1) and motor (M1) cortices of macaques to obtain efficient, widespread cortical expression of light-sensitive ion channels. Adeno-associated viral (AAV) vectors encoding the red-shifted opsin C1V1 fused to yellow fluorescent protein (EYFP) were injected into the cortex of rhesus macaques under MR-guided CED. Three months post-infusion, epifluorescent imaging confirmed large regions of optogenetic expression (&#62;130 mm2) in M1 and S1 in two macaques. Furthermore, we were able to record reliable light-evoked electrophysiology responses from the expressing areas using micro-electrocorticographic arrays. Later histological analysis and immunostaining against the reporter revealed widespread and dense optogenetic expression in M1 and S1 corresponding to the distribution indicated by epifluorescent imaging. This technique enables us to obtain expression across large areas of the cortex within a shorter period of time with minimal damage compared to the traditional techniques and can be an optimal approach for optogenetic viral delivery in large animals such as NHPs. This approach demonstrates great potential for network-level manipulation of neural circuits with cell-type specificity in animal models evolutionarily close to humans.&#160;

Here, we demonstrate magnetic resonance (MR)-guided convection enhanced delivery (CED) of viral vectors into the cortex as an efficient and simplified approach for achieving optogenetic expression across large cortical areas in the macaque brain.

대류 온라인 MRI 이미지의 지도하에 Rhesus Macaque의 피질에 광유전학 아데노 관련 바이러스 벡터의 향상된 납품

In non-human primate (NHP) optogenetics, infecting large cortical areas with viral vectors is often a difficult and time-consuming task. Here, we ...

NHP 신경외과 계획을 위한 MRI의 자동화된 3D 뇌 및 두개골 모델링

A Neural Implant Design Toolbox for Nonhuman Primates

This paper describes an in-house method of 3D brain and skull modeling from magnetic resonance imaging (MRI) tailored for nonhuman primate (NHP) neurosurgical planning. This automated, computational software-based technique provides an efficient way of extracting brain and skull features from MRI files as opposed to traditional manual extraction techniques using imaging software. Furthermore, the procedure provides a method for visualizing the brain and craniotomized skull together for intuitive, virtual surgical planning. This generates a drastic reduction in time and resources from those required by past work, which relied on iterative 3D printing. The skull modeling process creates a footprint that is exported into modeling software to design custom-fit cranial chambers and headposts for surgical implantation. Custom-fit surgical implants minimize gaps between the implant and the skull that could introduce complications, including infection or decreased stability. By implementing these pre-surgical steps, surgical and experimental complications are reduced. These techniques can be adapted for other surgical processes, facilitating more efficient and effective experimental planning for researchers and, potentially, neurosurgeons.

저자 스포트라이트: NHP 연구에서 향상된 신경외과 계획을 위한 간소화된 뇌 및 두개골 모델링

This paper outlines automated processes for nonhuman primate neurosurgical planning based on magnetic resonance imaging (MRI) scans. These techniques use procedural steps in programming and design platforms to support customized implant design for NHPs. The validity of each component can then be confirmed using three-dimensional (3D) printed life-size anatomical models.

큰 볼륨, 비 인간 영장류에서 Optogenetics에 대 한 행동-관련 조명

요약

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만성에 대한 성인 태어나 강한 뉴런의 선택 바이러스성 전달 생체내에 Optogenetic의 자극

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생체 발광 광유전학 2.0 : 생체 발광을 활용하여 체외 및 생체 내에서 광감각 단백질을 활성화 합니다.

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비인간 영장류를 위한 신경 임플란트 설계 툴박스

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