Name: the organoid reconstitution assay (ora) for the functional analysis of intestinal stem and niche cells
Uploaded: 2017-11-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
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이 연구 (KWF; 네덜란드 암 학회 로부터 자금에 의해 가능 하 게 되었다 EMCR 2012-5473)와 세계 암 연구 기금 국제 (WCRF; 프로젝트 번호 2014-1181)

모든 절차는 로컬 동물 복지 법률과 지침에 따라 수행 되었다.
1. 악기, 문화 미디어, 및 요리 준비
<ol><li>장가 위, 일반가 위, 및 살 균 컨테이너에 집게의 압력솥 1 세트.</li>
	<li>(플랫 바닥) 96 잘 접시 37 ° c.에는 인큐베이터에 배치</li>
	<li>시 약 재료의 테이블에 나열 된 완전 한 문화 매체의 10 mL를 준비 합니다.</li>
	<li>물 욕조에 37 ° C에서 완전 한 매체를 품 어.</li>
	<li>해 동 한 얼음 양동이에 그것을 배치 하 여 지하실 멤브레인을 재구성 된다. 재구성 된 지하실 막 4 ° C에 액체 될 것입니다.</li>
	<li>인산 염 버퍼 차가운 식 염 수 또는 약식된 PBS (4 ° C)로 4 접시를 채우십시오.</li>
</ol>2입니다. 작은 창 자 지하실의 격리
<ol><li>Lgr5-eGFP IRES 있다t2 마우스 C57BL6/J 배경에 CO2 흡입에 의해 희생. 가 위 쌍 복 경도 해 부.</li>
	<li>집게와 위를 누른 종횡 반으로 잘라.</li>
	<li>이제 장가 위를 사용 하 여, 내장을 꺼내 고 PBS를 포함 하는 페 트리 접시에 놓습니다. 참고: 장가 위는 샤 프와 무딘 팁 있다. 무뚝뚝한 끝이가이 위 소장을 여는 동안 토 굴 모 건축을 손상 하지 의미입니다.</li>
	<li>복 부에 무뚝뚝한 끝을 배치 하 여 시작 하 고 부드럽게는 pylorus 통해 밀어. 여는 위로 절단 하 고 당기는 집게와 함께 진행 합니다.</li>
	<li>일단 전체 소장 경도 열는 집게로 잡고 차가운 PBS에서 그것을 세척 하 고 부드럽게 U 모양 움직임으로 PBS 솔루션에 그것을 씻어.</li>
	<li>모든의 자 나머지는 들어가면 절단 보드, luminal 쪽에 내장을 평평 하 게 진행 합니다. Luminal 측면은 쉽게 인식할 수 있는 혈관의 부재 및 외부 부품과 비교 될 때 창백한 모습.</li>
	<li>유리 슬라이드, 부드럽게 제거는 villi 평평된 내장 된다고 하 여. 이 단계는 조직의 전체 길이 따라 두 번 수행 합니다.</li>
	<li>2-5 밀리미터 조각으로 메 마른 외과 블레이드와 소장을 잘라.</li>
	<li>포함 하는 얼음 차가운 PBS의 10 mL 50 mL 튜브에 작은 창 자 조각 놓습니다.</li>
	<li>PBS에서 그들을 아래로 pipetting으로 모든 남아 있는 불순물을 제거 조직 파편을 청소. 상쾌한 삭제 하 고 PBS 완전히 취소 될 때까지이 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>25 ml PBS의 총 최종 볼륨을가지고 15 mL 차가운 PBS를 추가 합니다. 2 mM ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA)를 추가 하 고 4 ° c.에 롤러에 45 분 동안 품 어</li>
	<li>PBS/EDTA를 삭제 합니다.</li>
	<li>PBS의 10 mL을 추가 하 고 거칠게 pipetting 조직 조각을 아래로 (세 번 이상)는 지하실을 분리. 상쾌한을 수집 합니다.</li>
	<li>반복 단계 2.13 4 시간. 문화 매체 도달 50 mL의 최종 볼륨을 추가 합니다.</li>
	<li>원심 (300 x g 5 분)에 의해 셀을 펠 렛.</li>
	<li>문화 매체의 10 mL에 펠 릿을 resuspend 하 고 원심 (80 x g 3 분)으로 지하실을 작은.</li>
</ol>3. 단일 셀 준비
<ol><li>수송과 지하실의 상쾌한 무시 하 고 1 mL의 트립 신 같은-효소 50 µ L 함께 resuspend DNAse (50 µ g/mL).</li>
	<li>2 분 동안 32 ° C에 물 욕조에 셀을 품 어.</li>
	<li>문화 매체의 10 mL를 추가 합니다. 가혹 하 게 아래로 5 번 이상 pipetting으로 단일 셀에는 지하실을 해리.</li>
	<li>40 µ m 여과기 (덩어리 및 기타 불순물 제거)를 통해 솔루션을 필터링 및 5 분에 대 한 300 x g에서 단일 셀을 작은.</li>
</ol>4. flow Cytometry 및 도금
<ol><li>1 x 행 크의 버퍼링 된 소금 솔루션 또는 HBSS/2% 소 태아 혈 청 (FCS) 솔루션 50 mL를 준비 하 고 모든 106 셀 1 mL에 펠 릿 resuspend</li>
	<li>세포 현 탁 액 BV421 린- (CD31, CD45, TER119) 30 분 1: 250 항 체의 농도에서 1: 100, 및 CD24-APC CD117-PE 모두의 농도에 추가 합니다.</li>
	<li>정렬 Lgr5+ 줄기 세포 그리고 Paneth 세포로 별도 낮은 바인딩 튜브. 정렬에 대 한 프로토콜에 대 한 내용은 Lgr5+ 그리고 Paneth 세포, 보십시오 로스 외. 7 과 Schewe 외. 6<ol>
<li>5 분에 대 한 300 x g에서 정렬된 셀 1.3에서 설명 하는 구성 요소와 100 µ L 매체에 셀 Resuspend 원심 분리기 ( 재료의 표참조).</li>
	</ol>
</li>
	<li>(예를 들어, 화학 또는 유전 수정에 의해) Paneth 세포 치료 (n = 2000) 또는 Lgr5+ 줄기 세포 (n = 2000).<ol>
<li>세포 치료를 사용 하 여 transfection liposome 중재 시 약의 5 µ L 100 µ L 문화 매체와 100의 농도에 작은 간섭 RNA (siRNA)의 총 볼륨에 nM. SiRNA 또는 선택한 수정에 필요한 시간 동안 37 ° C에서 30 분 동안 품 어.</li>
	</ol>
</li>
	<li>워시 500 µ L 문화 매체에 두 번 셀.</li>
	<li>5 분 x 300g에 centrifuge 고 10 µ L 문화 매체에 셀 resuspend.</li>
	<li>수영장 2 개의 세포 구성 성분 (Paneth 또는 Lgr5+ 세포)는 20 µ l 총 볼륨에 실시간에 5 분에 대 한 300 x g에서 원심 분리기</li>
	<li>공동은 Paneth 품 어 및 Lgr5+ 셀 실시간에서 10 분</li>
	<li>상쾌한의 10 µ L을 제거 하 고 반드시 셀 펠 릿을 발음 하지 액체의 초승달 모양을 두고.</li>
	<li>40 µ L의 전체 볼륨에 대 한 셀을 재구성된 지하실 막의 30 µ L을 추가 하 고 셀 resuspend는 미리 데워 진 96 잘 접시 접시. 10 분 후 완전 한 매체의 200 µ L 추가 ( 재료의 표참조). 변화 중간 마다 48 h입니다.</li>
	<li>날 5에 organoid 다양성을 계산 합니다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+stem+cells+in+small+intestine+and+colon+by+marker+gene+Lgr5.">Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5.</a> Nature. 449, 1003-1007 (2007).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paneth+cells+constitute+the+niche+for+Lgr5+stem+cells+in+intestinal+crypts.">Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts.</a> Nature. 469, 415-418 (2011).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459, 262-265 (2009).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids.">Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165, 1586-1597 (2016).</li><li>Cantrell, M. A., Kuo, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+modeling+for+cancer+precision+medicine.">Organoid modeling for cancer precision medicine.</a> Genome Med. 7, 32 (2015).</li><li>Schewe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secreted+Phospholipases+A2+Are+Intestinal+Stem+Cell+Niche+Factors+with+Distinct+Roles+in+Homeostasis,+Inflammation,+and+Cancer.">Secreted Phospholipases A2 Are Intestinal Stem Cell Niche Factors with Distinct Roles in Homeostasis, Inflammation, and Cancer.</a> Cell Stem Cell. 19, 38-51 (2016).</li><li>Roth, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paneth+cells+in+intestinal+homeostasis+and+tissue+injury.">Paneth cells in intestinal homeostasis and tissue injury.</a> PLoS One. 7, e38965 (2012).</li><li>Rodriguez-Colman, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+between+metabolic+identities+in+the+intestinal+crypt+supports+stem+cell+function.">Interplay between metabolic identities in the intestinal crypt supports stem cell function.</a> Nature. 543, 424-427 (2017).</li><li>Dow, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apc+Restoration+Promotes+Cellular+Differentiation+and+Reestablishes+Crypt+Homeostasis+in+Colorectal+Cancer.">Apc Restoration Promotes Cellular Differentiation and Reestablishes Crypt Homeostasis in Colorectal Cancer.</a> Cell. 161, 1539-1552 (2015).</li><li>Yilmaz, O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTORC1+in+the+Paneth+cell+niche+couples+intestinal+stem-cell+function+to+calorie+intake.">mTORC1 in the Paneth cell niche couples intestinal stem-cell function to calorie intake.</a> Nature. 486, 490-495 (2012).</li><li>Igarashi, M., Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTORC1+and+SIRT1+Cooperate+to+Foster+Expansion+of+Gut+Adult+Stem+Cells+during+Calorie+Restriction.">mTORC1 and SIRT1 Cooperate to Foster Expansion of Gut Adult Stem Cells during Calorie Restriction.</a> Cell. , 436-450 (2016).</li></ol>

저자는 경쟁 금융 관심 또는 다른 충돌

오 라는 두 가지 필수 구성 요소 장 줄기 세포 틈새의 즉 Lgr5+ 그리고 Paneth 세포의 세련 된 기능 분석을 허용 한다. 이 방법은 이전 우리와 다른 사람에 의해 약간의 수정6,,1011를 고용 하고있다. 여기, 재현할 수 및 표준화 된 실험실 프로토콜 또는 프로시저 선물이. 또한, 우리 유전자 구현의 가능성의 예를 들어 Lgr5+ 줄기 세포, Apc downregulation의 효과에 보고 (또는 생화학6) 정렬된 세포 구성 요소에 대 한 수정. 데이터는 siRNA를 표시 하는, 증가 organoid 복합성 (그림 1B)에 의해 표시 된 대로 Apc 의 중재 최저 Lgr5+ 세포의 줄기 세포 기능을 향상 시킵니다.
장 3D organoid 문화를 사용 하 여 몇 가지 장점이 이미 리뷰4, 특히에 비교 될 때 그 토 굴 모 아키텍처에는 vivo에서, 그들의 조직의 눈에 띄는 닮 았을 포함 한에 나열 되어 있는 불멸 하 게 셀 라인 표준 2 차원 문화 메서드에서 아키텍처. 그러나,이 방법의 주요 한계 중 하나는 대부분의 경우, organoid 문화과, 개별 부품의 기능 분석을 허용 하지 않는 프로세스 전체 장 지하실에서 설립 하는 특히, 줄기 및 틈새의 셀, 여기 Lgr5+ 그리고 Paneth 세포로 표현 하는 각각.
지금 이러한 한계를 극복 한다. 줄기 및 틈새 세포를 별도로 동물에서 정렬 하 고 organoids를 생성 하기 위해 재구성 될 수 있습니다. 따라서,이 이렇게 특정 유전 수정 운반 중 고용 마우스 모델에 의해이 두 세포 구성 성분의 기능 분석을 수 또는 특정 스트레스 요인 (예, DSS 또는 특정 다이어트); 노출 또는 직접 유전자 정렬된 셀을 수정 하 여 (siRNA, CRISPR-Cas9) 또는 화학적, organoids를 생성 하는 그들을 재구성 하기 전에. 다양성, 형태, 자기 갱신 용량 및 차별화 (그리고 결국 metaplastic 변경의 범위)의 결과 organoids의 범위는 기능 지요로 사용할 수 있습니다. 유전자 조작, siRNA, 같은 경우 형태학 효과 분명 때 세포 분석 되어야 합니다 transfection 관심의 mRNA의 최저 유효성을 후 한 시간. Paneth 및 Lgr5+ 또한이 두 세포 유형 및 다른 organoid 간의 상호 작용을 변경된 이어질 줄기 및 틈새 셀에 다른 돌연변이 여부를 공부 하는 다른 돌연변이와 유전자 조작 생쥐에서 분류 될 수 있다 형성 효율 또는 형태학입니다.
프로토콜 내에서 중요 한 단계는 villi (2.7 단계)의 제거 및 물의 resuspension 셀 HBSS/2%FCS (단계 4.1)에 합니다. villi의 제거는 중요 Paneth 풍부 하 고 Lgr5+ 세포와 정렬의 효율을 개선 하는 지하실의 더 낮은 세 번째에 있는. FACS 프로토콜은 일반적으로 PBS/FCS에서 셀 정렬 제안, 비록 HBSS 대신 PBS 사용 하 여 증가 하 고 세포 생존 능력을 정렬 시간에 걸쳐 안정 유지. 다른 중요 한 단계는 4.7과 4.8, 어디에 물리적 Paneth의 협회 및 Lgr5+ 셀 수행 상승 organoids에 게 결국 것입니다 양식 남자를이 계보를 수 있습니다.

장 상피 포유류 몸에 있는 가장 빠르게 자기 갱신 조직 그리고, 따라서, 식별 및 크립 트의 하단에는 성인 줄기 세포의 기능적 특성을 겨냥 하는 연구의 과다의 개체 Lieberkühn, Lgr5 유전자의 표현에 의해 갑니다 고 정식 Wnt 신호1의 특히, Lgr5+ 줄기 세포 형벌 이며 전문된 틈새 세포, 즉 Paneth 세포, 또한 그들의 성숙2Wnt 신호에 의존 하는 의해 지원. 함께, 이러한 두 셀 형식 자체-갱신 창 자 상피 안 대기의 기초 및 일일 homeostatic 균형 유지: Lgr5+ 줄기 세포는 급속 하 게 분할 하 고 뿌리를 및 더 많은 전문 장 상피 셀; Paneth 세포 제공 필수 틈새 요인 (예를 들어, Dll1, Wnt3, EGF) Lgr5+ 줄기 세포2. 장 지하실 때 도금 비보 전 조직과 자체 갱신 구조를 형성 하기 위하여 organoids, 또는 "미니-배 짱", 용량 자체 갱신 등 프로세스에 대 한 통찰력을 제공 하는 실험 도구로 이용 되 고 암4를 포함 하 여 정상 및 병 적인 조건에서 차별화. Organoid 문화 소장, 췌 장, 간, 그리고 신장, 마우스 및 인간의 샘플4에서 포함 하 여 여러 조직에서 설립 되었습니다. 추출 방법 및 성장 요인이 organoid 문화를 개발 하는 조직 및 다중 계보 차별화를 운전 하 고 최대한 원래 줄기 세포 틈새를 모방 하도록 설계 된 vivo에서. Organoids는 유전 질환의 치료, 암에서 치료 효능, 약물 독성의 분석 또는 생체 외에서organogenesis5의 연구의 평가 포함 하 여 잠재적인 응용 프로그램을 할 수 있습니다.
전반적으로, organoid 문화 조직 샘플에서 설립 하는 때의 주요 제한은 세포 특이성의 부족입니다. 예를 들어 장 organoids 전체 장 지하실에서 설립 조직 소스 내 포함 개별 세포 구성 성분의 분석을 허용 하지 않습니다 (예를 들어, 전체 지하실 포함 Lgr5+, Paneth, 그리고 조상 세포)입니다.
여기, 우리 소설 메서드, 오 라로 그것의 가장 기본적인 구성 요소, 즉 줄기 (Lgr5+)와 틈새 (Paneth) 세포의 기능 분석 장 organoid 문화의 장점을 결합 하 여 설명 합니다. 이 Paneth의 독특한 능력을 통해 이루어집니다 그리고 실제로 공동 인 큐베이 팅 및 organoids2,,610을 때 서로 연관 Lgr5+ 세포. 우리는이 기능 활용 하 고 미리 organoids를 다시 구성 하도록 허용 하기 전에 개별적으로 2 개의 세포 유형 취급. 때 이렇게, 특정된 약물, 성장 인자, 생화학 억제제, 유전자 조작, 또는 재구성 및 organoid 형성 전에 화학적 치료 각 셀 구성 요소를 노출 될 수 있습니다. 따라서, 지금 분석 결과 사용 하 여 특정 약물 치료 또는 유전 수정에 줄기 세포 또는 그들의 틈새에 특정 효과 있는지 여부의 결정을 허용할 것 이다.

<table><tbody><tr><td>Advanced DMEM F12 *</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax *</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td>Final concentration: 10 mM</td></tr><tr><td>Penicillin/streptomycin *</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>Final concentration: 1%</td></tr><tr><td>Hepes *</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630080</td><td>Final concentration: 10 mM</td></tr><tr><td>Recombinant murine EGF *</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PMG8041</td><td>Final concentration: 50 ng/ml</td></tr><tr><td>Recombinant murine Noggin *</td><td>Peprotech</td><td>250-38</td><td>Final concentration: 100 ng/ml</td></tr><tr><td>y27632 *</td><td>Sigma</td><td>Y0503</td><td>Final concentration: 10 &amp;micro;M</td></tr><tr><td>Jagged-1 *</td><td>Anaspec Bio</td><td>AS-61298</td><td>Final concentration: 1 &amp;micro;M</td></tr><tr><td>Recombinant murine R-spondin *</td><td>R&amp;amp;D systems</td><td>3474-RS-050</td><td>Final concentration: 1 mg/ml</td></tr><tr><td>Flexitube Gene solution siRNA APC</td><td>Qiagen</td><td>GS11789</td><td>Final concentration: 100 nM</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>CD24 APC</td><td>Biolegend</td><td>101814</td><td></td></tr><tr><td>c-kit PE</td><td>Biolegend</td><td>105808</td><td></td></tr><tr><td>BV 421 CD31</td><td>Biolegend</td><td>102424</td><td></td></tr><tr><td>BV 421 CD45</td><td>Biolegend</td><td>103134</td><td></td></tr><tr><td>BV421 TER119</td><td>Biolegend</td><td>116234</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14180046</td><td></td></tr><tr><td>B6.129P2-Lgr5tm1(cre/ERT2)Cle/J</td><td>Jackson Laboratories</td><td>008875</td><td></td></tr><tr><td>Low binding tubes</td><td>Eppendorf</td><td>Z666548-250EA</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>356230</td><td></td></tr><tr><td>* The combination of these reagents constitutes the complete culture medium</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

the organoid reconstitution assay (ora) for the functional analysis of intestinal stem and niche cells

장 상피는 매우 빠른 회전 속도 의해 특징입니다. 포유류에서 전체 상피 안 대기는 4-5 일 이내에 갱신 됩니다. 성인 장 줄기 세포 Lieberkühn의 지하실의 하단에, Lgr5 유전자의 표현에 의해 배정 있으며 그들의 특성 높은 증식 속도1통해 항상성 유지. 작은 창 자에 걸쳐 Lgr5+ 줄기 세포 Paneth 세포 라고 하는 특수 분 비 세포와 혼합 된. Paneth 세포 항균 화합물 (즉, lysozyme과 cryptdins/defensins) 분 비와 창 자 식물에 제어 역할을 발휘. 더 최근에, 소설 함수 Paneth 세포, 즉 그들의 용량을 Wnt3, EGF, 및 Dll12로 몇 가지 주요 ligands 통해 Lgr5+ 줄기 세포 틈새 지원 제공에 대 한 발견 되었습니다.
전 비보 를 격리 하 고 특정 성장 인자와 세포 외 기질 구성 요소 존재 양식, 전체 장 지하실을 일으키 긴와 매우 유사한 크립 트 모 organoids 라는 자체 3D 구조를 갱신 성인 소장3의 상피 아키텍처입니다. Organoid 문화, 전체 지하실에서 설치 될 때 비록 그것의 개별 구성 요소, 즉는 Lgr5+ 의 기여를 해결 하지 않고 자기 갱신의 연구와 장 줄기 세포 틈새의 허용 및 Paneth 세포입니다.
여기, organoid 분석 결과 Paneth의 능력을 활용 하는 새로운 접근 방식을 설명 및 Lgr5+ 연결 하 고 organoids 형성을 셀 때 공동 경작. 이 이렇게, 여기 "organoid 재구성 분석 결과" 라고 (오 라), Paneth 유전 그리고 생 화 확 적인 수정할 수 있게 또는 Lgr5+ organoids로 재구성 뒤 줄기 세포. 따라서, 장 줄기 세포 틈새의 두 가지 주요 구성 요소 기능 분석을 수 있습니다.

Organoid 재구성 분석 결과 Apc 유전자의 작은 간섭 RNA (siRNA)에 의해 증명 여기 장 상피의 필수 틈새 및 줄기 세포 구성 요소의 별도 기능 분석을 수 있습니다.
이 목표를 달성 하기 위해 우리는 먼저 형광 활성화 된 세포 분류 (FACS) 타고 난된 C57BL6/J 쥐에서 8000 Lgr5+ 세포와 6000 Paneth 세포를 분리 하 활용. 그림 1a또는 분석 결과의 순서도 그려져 있습니다. Organoid 재구성 용량 siRNA oligonucleotides Apc 의 mRNA에 대 한 감독과 Lgr5+ 세포를 배양 하 여 평가 되었다 또는 컨트롤로 스크램블된 시퀀스 (SCR)을 포괄. 치료 후, 같은 siRNA 치료 Lgr5+ 세포 중 organoid 매체/재구성 지하실 멤브레인에 직접 도금 또는 치료 Paneth 세포의 동등한 수와 함께 알을 품 되었고 그 후 밖으로 도금. 컨트롤, 치료 Lgr5+ 세포는 혼자 도금 했다 (즉, Paneth 세포 없이) 치료 Lgr5+ 세포에서 파생 된 organoids의 수를 확인 하려면. 또한, 추가 컨트롤, Paneth 세포 혼자 Paneth Lgr5 셀 남자 Paneth 세포 게이트 정렬의 오염에서 파생 된 organoid 형성의 배경에 대 한 확인을 도금 했다. Lgr5+ 줄기 세포 (와 정식 Wnt/β-catenin 신호 통로의 결과 활성화) murine Apc 유전자의 siRNA 중재 최저 organoid 다양성에 비해 긍정적인 영향을 예상 했던 대로, 치료 대응 또는 스크램블된 제어 (그림 1B). 제정 Wnt 활성화는 또한 이전에 보고 된1Paneth 세포에 대 한 요구를 구출. 또한, 이러한 organoids 등장으로 속이 빈 구체 (spheroids), Apc에 대 한 설명된 잘 표현 형-돌연변이 또는 Wnt 자극 organoids (그림 1C, 패널 1), Paneth Lgr5 세포에서 얻은 그의 형태와 비교할 때 (그림 1 C, 패널 2) 남자8,9. 샨 다, 이러한 결과 재구성 보여 Paneth 세포와 Lgr5+ 셀 내에서 이러한 두 셀 형식; 세포 특정 메커니즘에 통찰력을 줄 수 있습니다 현미경 검사 법에 의해 organoids의 형태소 분석 유용할 수 있습니다이 점에서 organoids의 형태로 반영 셀 구성 이후 (예를 들어, spheroids에 의해 구성 된다 Lgr5+ 만 셀). 고려 될 또 다른 중요 한 매개 변수 (예를 들어, 암호 신진 이벤트 수) organoid의 복잡성 이다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56329/56329fig1.jpg"> 그림 1입니다. SiRNA의 효력 중재에 Lgr5 Apc 의 최저+ 셀. (A) 실험 절차의 흐름도. Lgr5 EGFP 기자 쥐 (Lgr5EGFP-IRES-creERT2)1 Lgr5+ 의 소스 정렬 줄기 세포로 채택 되었다. Paneth 세포 표시 하 고 앞에서 설명한6,7정렬 했다. (B) Organoid 다양성 관찰 Lgr5+ 줄기 세포 그리고 Paneth의 재구성에 따라 셀. 표시 된 셀은 청소용으로 siRNA oligonucleotides Apc (siRNA Apc)에 대 한 감독 또는 발진 (SCR) 제어 시퀀스. 별표 표시 통계적으로 유의 한 차이 (n = 3, * p < 0.05 * * p < 0.001). 오차 막대 sd (1). Lgr5+ 셀 참조, (2) Lgr5+ 세포 SCR, (3) Lgr5+ 세포 siRNA Apc, (4) Lgr5+ 셀 + Paneth 세포, (5) Lgr5+ 세포 siRNA Apc + Paneth 세포, (6) Paneth 세포. (C) organoids의 대표 이미지 (1) Lgr5+ 세포 siRNA Apc, (2) Lgr5+-Paneth 세포에서에서 파생. 눈금 막대 = 10 µ m. <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56329/56329fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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The Organoid Reconstitution Assay ORA for the Functional Analysis of Intestinal Stem and Niche Cells

장 줄기와 틈새 세포의 기능 분석을 위한 Organoid 재구성 분석 결과 (오 라)

장 organoid 문화 전체 지하실에서 설정 되 고 셀 전용 패션에 자기 갱신과 차별화의 분석을 허용 하지 않습니다. 이 프로토콜에 설명 합니다 정렬 된 줄기 (Lgr5+)의 재구성, 틈새 (Paneth) 세포, 그들의 이전 생 화 확 및 유전 수정 및 기능 분석 하는 동안 organoids을 일으키.

The intestinal epithelium is characterized by an extremely rapid turnover rate. In mammals, the entire epithelial lining is renewed within 4 - 5 days. ...

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Stem Cell Biology And Renewal in Epithelial Tissue

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10.5K 조회수.  Erasmus University Medical Center. 장 organoid 문화 전체 지하실에서 설정 되 고 셀 전용 패션에 자기 갱신과 차별화의 분석을 허용 하지 않습니다. 이 프로토콜에 설명 합니다 정렬 된 줄기 (Lgr5+)의 재구성, 틈새 (Paneth) 세포, 그들의 이전 생 화 확 및 유전 수정 및 기능 분석 하는 동안 organoids을 일으키.

비디오: The Organoid Reconstitution Assay ORA for the Functional Analysis of Intestinal Stem and Niche Cells

Three-Dimensional Culture of Murine Colonic Crypts to Study Intestinal Stem Cell Function Ex Vivo

The intestinal epithelium regenerates every 5-7 days, and is controlled by the intestinal epithelial stem cell (IESC) population located at the bottom of the crypt region. IESCs include active stem cells, which self-renew and differentiate into various epithelial cell types, and quiescent stem cells, which serve as the reserve stem cells in the case of injury. Regeneration of the intestinal epithelium is controlled by the self-renewing and differentiating capabilities of these active IESCs. In addition, the balance of the crypt stem cell population and maintenance of the stem cell niche are essential for intestinal regeneration. Organoid culture is an important and attractive approach to studying proteins, signaling molecules, and environmental cues that regulate stem cell survival and functions. This model is less expensive, less time-consuming, and more manipulatable than animal models. Organoids also mimic the tissue microenvironment, providing in vivo relevance. The present protocol describes the isolation of colonic crypts, embedding these isolated crypt cells into a three-dimensional gel matrix system and culturing crypt cells to form colonic organoids capable of self-organization, proliferation, self-renewal, and differentiation. This model allows one to manipulate the environment-knocking out specific proteins such as claudin-7, activating/deactivating signaling pathways, etc.-to study how these effects influence the functioning of colonic stem cells. Specifically, the role of tight junction protein claudin-7 in colonic stem cell function was examined. Claudin-7 is vital for maintaining intestinal homeostasis and barrier function and integrity. Knockout of claudin-7 in mice induces an inflammatory bowel disease-like phenotype exhibiting intestinal inflammation, epithelial hyperplasia, weight loss, mucosal ulcerations, epithelial cell sloughing, and adenomas. Previously, it was reported that claudin-7 is required for intestinal epithelial stem cell functions in the small intestine. In this protocol, a colonic organoid culture system is established to study the role of claudin-7 in the large intestine.

Three-Dimensional Culture of Murine Colonic Crypts to Study Intestinal Stem Cell Function Ex Vivo

The present protocol describes establishing a murine colonic organoid system to study the activity and functioning of colonic stem cells in a claudin-7 knockout model.

생체 외 장내 줄기세포 기능을 연구하기 위한 쥐 결장 음와의 3차원 배양

The intestinal epithelium regenerates every 5-7 days, and is controlled by the intestinal epithelial stem cell (IESC) population located at the bottom of ...

연구

암 연구학

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the complexities of the organoid growth characteristics carry significant caveats for the investigator. Specifically, the growth patterns of each individual organoid are highly variable and create a heterogeneous population of epithelial cells in culture. With such caveats, common tissue culture practices cannot be simply applied to the organoid system due to the complexity of the cellular structure. Counting and plating based solely on cell number, which is common for individually separated cells, such as cell lines, is not a reliable method for organoids unless some normalization technique is applied. Normalizing to total protein content is made complex due to the resident protein matrix. These characteristics in terms of cell number, shape and cell type should be taken into consideration when evaluating secreted contents from the organoid mass. This protocol has been generated to outline a simple procedure to culture and treat small intestinal organoids with microbial pathogens and pathogen associated molecular patterns (PAMPs). It also emphasizes the normalization techniques that should be applied when protein analysis are conducted after such a challenge.

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Here, a protocol to harvest, maintain, and treat mouse small intestinal organoids with pathogen associated molecular patterns (PAMPs) and Listeria monocytogenes is described, as well as emphasis on gene expression and proper normalization techniques for protein.

그만큼<em&gt; 전의 VIVO</em마우스 소장 Organoids의&gt; 문화 및 패턴 인식 수용체 자극

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the ...

면역학 및 감염병학

Establishment of Human Epithelial Enteroids and Colonoids from Whole Tissue and Biopsy

The epithelium of the gastrointestinal tract is constantly renewed as it turns over. This process is triggered by the proliferation of intestinal stem cells (ISCs) and progeny that progressively migrate and differentiate toward the tip of the villi. These processes, essential for gastrointestinal homeostasis, have been extensively studied using multiple approaches. Ex vivo technologies, especially primary cell cultures have proven to be promising for understanding intestinal epithelial functions. A long-term primary culture system for mouse intestinal crypts has been established to generate 3-dimensional epithelial organoids. These epithelial structures contain crypt- and villus-like domains reminiscent of normal gut epithelium. Commonly, termed &#8220;enteroids&#8221; when derived from small intestine and &#8220;colonoids&#8221; when derived from colon, they are different from organoids that also contain mesenchyme tissue. Additionally, these enteroids/colonoids continuously produce all cell types found normally within the intestinal epithelium. This in vitro organ-like culture system is rapidly becoming the new gold standard for investigation of intestinal stem cell biology and epithelial cell physiology. This technology has been recently transferred to the study of human gut. The establishment of human derived epithelial enteroids and colonoids from small intestine and colon has been possible through the utilization of specific culture media that allow their growth and maintenance over time. Here, we describe a method to establish a small intestinal and colon crypt-derived system from human whole tissue or biopsies. We emphasize the culture modalities that are essential for the successful growth and maintenance of human enteroids and colonoids.

We describe a method to establish human enteroids from small intestinal crypts and colonoids from colon crypts collected from both surgical tissue and biopsies. In this methodological article, we present the culture modalities that are essential for the successful growth and maintenance of human enteroids and colonoids.

전체 조직과 조직 검사에서 인간 상피 Enteroids과 Colonoids 설립

The epithelium of the gastrointestinal tract is constantly renewed as it turns over. This process is triggered by the proliferation of intestinal stem ...

의학

Generation, Maintenance, and Characterization of Human Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal and Colonic Organoids

Intestinal regional specification describes a process through which unique morphology and function are imparted to defined areas of the developing gastrointestinal (GI) tract. Regional specification in the intestine is driven by multiple developmental pathways, including the bone morphogenetic protein (BMP) pathway. Based on normal regional specification, a method to generate human colonic organoids (HCOs) from human pluripotent stem cells (hPSCs), which include human embryonic stem cells (hES) and induced pluripotent stem cells (iPSCs), was developed. A three-day induction of BMP signaling sufficiently patterns mid/hindgut tube cultures into special AT-rich sequence-binding protein 2 (SATB2)-expressing HCOs containing all of the main epithelial cell types present in human colon as well as co-developing mesenchymal cells. Omission of BMP (or addition of the BMP inhibitor NOGGIN) during this critical patterning period resulted in the formation of human intestinal organoids (HIOs). HIOs and HCOs morphologically and molecularly resemble human developing small intestine and colon, respectively. Despite the utility of HIOs and HCOs for studying human intestinal development, the generation of HIOs and HCOs is challenging. This paper presents methods for generating, maintaining, and characterizing HIOs and HCOs. In addition, the critical steps in the protocol and troubleshooting recommendations are provided.

Here, detailed methods for generating, maintaining, and characterizing human pluripotent stem cell-derived small intestinal and colonic organoids are described. These methods are designed to improve reproducibility, expand scalability, and decrease the working time required for plating and passaging of organoids.

Intestinal regional specification describes a process through which unique morphology and function are imparted to defined areas of the developing ...

발생학

Combining Human Organoids and Organ-on-a-Chip Technology to Model Intestinal Region-Specific Functionality

The intestinal mucosa is a complex physical and biochemical barrier that fulfills a myriad of important functions. It enables the transport, absorption, and metabolism of nutrients and xenobiotics while facilitating a symbiotic relationship with microbiota and restricting the invasion of microorganisms. Functional interaction between various cell types and their physical and biochemical environment is vital to establish and maintain intestinal tissue homeostasis. Modeling these complex interactions and integrated intestinal physiology in vitro is a formidable goal with the potential to transform the way new therapeutic targets and drug candidates are discovered and developed.
Organoids and Organ-on-a-Chip technologies have recently been combined to generate human-relevant intestine chips suitable for studying the functional aspects of intestinal physiology and pathophysiology in vitro. Organoids derived from the biopsies of the small (duodenum) and large intestine are seeded into the top compartment of an organ chip and then successfully expand&#160;as monolayers while preserving the distinct cellular, molecular, and functional features of each intestinal region. Human intestine tissue-specific microvascular endothelial cells are incorporated in the bottom compartment of the organ chip to recreate the epithelial-endothelial interface. This novel platform facilitates luminal exposure to nutrients, drugs, and microorganisms, enabling studies of intestinal transport, permeability, and host-microbe interactions.
Here, a detailed protocol is provided for the establishment of intestine chips representing the human duodenum (duodenum chip) and colon (colon chip), and their subsequent culture under continuous flow and peristalsis-like deformations. We demonstrate methods for assessing drug metabolism and CYP3A4 induction in duodenum chip using prototypical inducers and substrates. Lastly, we provide a step-by-step procedure&#160;for the in vitro modeling of interferon gamma (IFN&#947;)-mediated barrier disruption (leaky gut syndrome) in a colon chip, including methods for evaluating the alteration of paracellular permeability, changes in cytokine secretion, and transcriptomic profiling of the cells within the chip.

Biopsy-derived intestinal organoids and organ-on-a-chips technologies are combined into a microphysiological platform to recapitulate region-specific intestinal functionality.

인간 오가노이드와 장기 온 칩 기술을 결합하여 장 영역별 기능 모델링

The intestinal mucosa is a complex physical and biochemical barrier that fulfills a myriad of important functions. It enables the transport, absorption, ...

생체공학

Organoid-Derived Epithelial Monolayer: A Clinically Relevant In Vitro Model for Intestinal Barrier Function

In the past, intestinal epithelial model systems were limited to transformed cell lines and primary tissue. These model systems have inherent limitations as the former do not faithfully represent original tissue physiology, and the availability of the latter is limited. Hence, their application hampers fundamental and drug development research. Adult stem-cell-based organoids (henceforth referred to as organoids) are miniatures of normal or diseased epithelial tissue from which they are derived. They can be established very efficiently from different gastrointestinal (GI) tract regions, have long-term expandability, and simulate tissue- and patient-specific responses to treatments in vitro. Here, the establishment of intestinal organoid-derived epithelial monolayers has been demonstrated along with methods to measure epithelial barrier integrity, permeability and transport,&#160;antimicrobial protein secretion, as well as histology. Moreover, intestinal organoid-derived monolayers can be enriched with proliferating stem and transit-amplifying cells as well as with key differentiated epithelial cells. Therefore, they represent a model system that can be tailored to study the effects of compounds on target cells and their mode of action. Although organoid cultures are technically more demanding than cell lines, once established, they can reduce failures in the later stages of drug development as they truly represent in vivo epithelium complexity and interpatient heterogeneity.

Here, we describe the preparation of human organoid-derived intestinal epithelial monolayers for studying intestinal barrier function, permeability, and transport. As organoids represent original epithelial tissue response to external stimuli, these models combine the advantages of expandability of cell lines and the relevance and complexity of primary tissue.

오가노이드 유래 상피 단층: 장 장벽 기능을 위한 임상적으로 관련된 시험관내 모델

In the past, intestinal epithelial model systems were limited to transformed cell lines and primary tissue. These model systems have inherent limitations ...

생물학

Culture Methods to Study Apical-Specific Interactions using Intestinal Organoid Models

The lining of the gut epithelium is made up of a simple layer of specialized epithelial cells that expose their apical side to the lumen and respond to external cues. Recent optimization of in vitro culture conditions allows for the re-creation of the intestinal stem cell niche and the development of advanced 3-dimensional (3D) culture systems that recapitulate the cell composition and the organization of the epithelium. Intestinal organoids embedded in an extracellular matrix (ECM) can be maintained for long-term and self-organize to generate a well-defined, polarized epithelium that encompasses an internal lumen and an external exposed basal side. This restrictive nature of the intestinal organoids presents challenges in accessing the apical surface of the epithelium in vitro and limits the investigation of biological mechanisms such as nutrient uptake and host-microbiota/host-pathogen interactions. Here, we describe two methods that facilitate access to the apical side of the organoid epithelium and support the differentiation of specific intestinal cell types. First, we show how ECM removal induces an inversion of the epithelial cell polarity and allows for the generation of apical-out 3D organoids. Second, we describe how to generate 2-dimensional (2D) monolayers from single cell suspensions derived from intestinal organoids, comprised of&#160;mature and differentiated cell types. These techniques provide novel tools to study apical-specific interactions of the epithelium with external cues in vitro and promote the use of organoids as a platform to facilitate precision medicine.

Here we present two protocols that allow the modeling of intestinal apical-specific interactions. Organoid-derived intestinal monolayers and Air-Liquid Interface (ALI) cultures facilitate the generation of well-differentiated epithelia accessible from both luminal and basolateral sides, whereas polarity-inverted intestinal organoids expose their apical side and are amenable to high throughput assays.

장 관성 오르가노이드 모델을 사용하여 정법별 상호 작용을 연구하는 문화 방법

The lining of the gut epithelium is made up of a simple layer of specialized epithelial cells that expose their apical side to the lumen and respond to ...

Murine Intestinal Crypts 및 Single Stem Cell의 오가노이드 3D 배양

The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research

At present, organoid culture represents an important tool for in vitro studies of different biological aspects and diseases in different organs. Murine small intestinal crypts can form organoids that mimic the intestinal epithelium when cultured in a 3D extracellular matrix. The organoids are composed of all cell types that fulfill various intestinal homeostatic functions. These include Paneth cells, enteroendocrine cells, enterocytes, goblet cells, and tuft cells. Well-characterized molecules are added into the culture medium to enrich the intestinal stem cells (ISCs) labeled with leucine-rich repeats containing G protein-coupled receptor 5 and are used to drive differentiation down specific lineages; these molecules include epidermal growth factor, Noggin (a bone morphogenetic protein), and R-spondin 1. Additionally, a protocol to generate organoids from a single erythropoietin-producing hepatocellular receptor B2 (EphB2)-positive ISC is also detailed. In this methods article, techniques to isolate small intestinal crypts and a single ISC from tissues and ensure the efficient establishment of organoids are described.

저자 스포트라이트: The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research (오가노이드 연구를 위한 쥐 장낭화낭수에서 오가노이드의 3D 배양 및 단일 줄기 세포)  

We describe a protocol to isolate murine small intestinal crypts and culture intestinal 3D organoids from the crypts. Additionally, we describe a method to generate organoids from a single intestinal stem cell in the absence of a sub-epithelial cellular niche.

쥐 장 선와에서 오가노이드와 오가노이드 연구를 위한 단일 줄기 세포의 3D 배양

At present, organoid culture represents an important tool for in vitro studies of different biological aspects and diseases in different organs. Murine ...

장 줄기와 틈새 세포의 기능 분석을 위한 Organoid 재구성 분석 결과 (오 라)

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생체 외 장내 줄기세포 기능을 연구하기 위한 쥐 결장 음와의 3차원 배양

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전체 조직과 조직 검사에서 인간 상피 Enteroids과 Colonoids 설립

Generation, Maintenance, and Characterization of Human Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal and Colonic Organoids

인간 오가노이드와 장기 온 칩 기술을 결합하여 장 영역별 기능 모델링

오가노이드 유래 상피 단층: 장 장벽 기능을 위한 임상적으로 관련된 시험관내 모델

장 관성 오르가노이드 모델을 사용하여 정법별 상호 작용을 연구하는 문화 방법

쥐 장 선와에서 오가노이드와 오가노이드 연구를 위한 단일 줄기 세포의 3D 배양

쥐 장 선와에서 오가노이드와 오가노이드 연구를 위한 단일 줄기 세포의 3D 배양

쥐 장 선와에서 오가노이드와 오가노이드 연구를 위한 단일 줄기 세포의 3D 배양