Name: the organoid reconstitution assay (ora) for the functional analysis of intestinal stem and niche cells
Uploaded: 2017-11-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
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この研究はオランダ癌協会 (KWF; からの資金によって可能になったEMCR 2012-5473) と世界がん研究基金国際 (WCRF; プロジェクト号 2014-1181)

すべてのプロシージャは、動物愛護の法律および指針に従って行われました。
1. 楽器、文化、メディア、料理の準備
<ol><li>腸はさみ、通常のはさみや滅菌コンテナーに鉗子のオートクレーブ 1 セット。</li>
	<li>37 ° C でインキュベーターの場所 96 ウェル (フラットボトム) の皿</li>
	<li>材料の表に記載されている試薬を用いる完全な培養液 10 mL を準備します。</li>
	<li>37 ° c 水のお風呂で完全培地を孵化させなさい。</li>
	<li>雪解けは、氷のバケツに置くことで基底膜を再構成しました。再構成の基底膜は 4 ° C で液体になります。</li>
	<li>冷たいリン酸緩衝生理食塩水または省略された PBS (4 ° C) で 4 枚のペトリ皿を埋めます。</li>
</ol>2. 小さな腸陰窩の分離
<ol><li>CO2吸入によって C57BL6/J の背景にLgr5- eGFP IRES クレエt2マウスを犠牲に。縦はさみのペアで腹膜を解剖します。</li>
	<li>生検鉗子で胃を押しながら横方向に半分に切る。</li>
	<li>さあ今から腸のはさみを使用して、腸を引き出し、PBS を含むペトリ皿に配置。 メモ: 腸のはさみがある鋭い、鈍い先端。これらのはさみの鈍い先端は腸を開いている間クリプト絨毛アーキテクチャを損傷しないようにものです。</li>
	<li>胃に鈍い先端を配置することによって起動し、幽門をゆっくりします。はさみで切り、ピンセットで引っ張ってによって進みます。</li>
	<li>全小腸が縦に開かれる、鉗子で保持することによって冷たい PBS で洗い、軽く U 字の動きと PBS ソリューションでリンスします。</li>
	<li>すべての便の残骸がクリアされれば腸内腔側をまな板の上を平らにするのに進みます。内腔側は血管の有無によって、その薄い外観外側の部分と比較するとわかりやすいです。</li>
	<li>スライド ガラスと優しく削って平面的な腸絨毛を削除します。この手順では、組織の全体の長さに沿って 2 回。</li>
	<li>滅菌手術ブレードで 2-5 mm の部分に、小腸を切った</li>
	<li>10 mL の氷冷 PBS を含む 50 mL のチューブで腸の小片を置きます。</li>
	<li>PBS の上下にそれらをピペッティングによる任意の残りの不純物を除去、組織片をクリーンアップします。上澄みを廃棄し、PBS が完全にクリアされるまでこの手順を繰り返します。</li>
	<li>15 mL 冷 PBS、25 mL の PBS の合計の最終巻をさせるを追加します。2 mM エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) を加え、4 ° C でローラーの 45 分間インキュベート</li>
	<li>PBS/EDTA を破棄します。</li>
	<li>10 mL の PBS を追加し、厳しくピペッティング組織片を上下 (3 回以上) で陰窩をデタッチします。上清を収集します。</li>
	<li>2.13 手順を繰り返します 4 回します。50 mL の最終巻に到達するための培養培地を追加します。</li>
	<li>遠心分離 (5 分 300 g x) によって細胞をペレットします。</li>
	<li>培地 10 mL にペレットを再懸濁し、遠心分離 (3 分 80 g x) によって陰窩をペレットします。</li>
</ol>3. 単一セル準備
<ol><li>ペレットの陰窩の上澄みを廃棄し、一緒に 50 μ L 1 mL のトリプシン様酵素でそれらを再懸濁します DNAse (50 μ g/mL)。</li>
	<li>2 分の 32 ° C の水浴中で細胞を孵化させなさい。</li>
	<li>10 mL の培養液を追加します。少なくとも 5 回上下に厳しくピペッティングによる単一細胞に陰窩を切り離して考えます。</li>
	<li>40 μ m ストレーナー (塊と他の不純物を除去する) にソリューションをフィルターと 5 分の 300 x g で単一細胞のペレットします。</li>
</ol>4. 流れの Cytometry とめっき
<ol><li>1 x ハンクのバッファリングされた食塩または HBSS/2% 牛胎児血清 (FCS) ソリューションの 50 mL を準備し、すべての 10 の6セルの 1 mL にペレットを再懸濁します</li>
	<li>細胞懸濁液 BV421 林- (CD31、CD45、TER119) 30 分のための 1: 250 抗体の濃度で 1: 100、および CD24 APC CD117 PE 両方の濃度に追加します。</li>
	<li>並べ替えLgr5+幹細胞と別低にパネート細胞バインド チューブ。並べ替えのためのプロトコルの詳細についてはLgr5+パネート細胞は roth 氏らを参照してください7 Scheweら6<ol>
<li>300 x g で 5 分間で並べ替えられた細胞は、1.3 のように記述されているコンポーネントを 100 μ l 添加培地で細胞を再懸濁します遠心分離機 (材料の表を参照してください)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>パネート細胞の治療 (例えば、化学的または遺伝の修正によって) (n = 2000) またはLgr5+幹細胞 (n = 2000)。<ol>
<li>総量が 100 μ L の培養液の 100 の濃度で小さな干渉 RNA (siRNA) リポソームを介したトランスフェクション試薬の 5 μ L を使用細胞を治療する nM。SiRNA または選択した変更のために必要な時間のための 37 ° C で 30 分間インキュベートします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>500 μ L の培養液中で 2 回洗浄を行う。</li>
	<li>5 分間 300 × g で遠心し、10 μ L の培養液中の細胞を再懸濁します。</li>
	<li>2 つの細胞成分をプール (パネートまたはLgr5+細胞) の 20 μ l の総ボリュームや 300 x g で室温 5 分間遠心</li>
	<li>共同インキュベート、パネートと室温 10 分間細胞のLgr5+ </li>
	<li>上澄みの 10 μ L を削除し、細胞ペレットを吸い出してに確かに液体のメニスカスを残します。</li>
	<li>40 μ L の総ボリュームのセルを再構成した基底膜の 30 μ L を追加、細胞を再懸濁します、予め温めておいた 96 well プレートのプレートします。10 分後完全培地 200 μ L を追加 (材料の表を参照してください)。変化媒体ごとの 48 時間。</li>
	<li>5 日目でカウントにおける多様性。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+stem+cells+in+small+intestine+and+colon+by+marker+gene+Lgr5.">Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5.</a> Nature. 449, 1003-1007 (2007).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paneth+cells+constitute+the+niche+for+Lgr5+stem+cells+in+intestinal+crypts.">Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts.</a> Nature. 469, 415-418 (2011).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459, 262-265 (2009).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids.">Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165, 1586-1597 (2016).</li><li>Cantrell, M. A., Kuo, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+modeling+for+cancer+precision+medicine.">Organoid modeling for cancer precision medicine.</a> Genome Med. 7, 32 (2015).</li><li>Schewe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secreted+Phospholipases+A2+Are+Intestinal+Stem+Cell+Niche+Factors+with+Distinct+Roles+in+Homeostasis,+Inflammation,+and+Cancer.">Secreted Phospholipases A2 Are Intestinal Stem Cell Niche Factors with Distinct Roles in Homeostasis, Inflammation, and Cancer.</a> Cell Stem Cell. 19, 38-51 (2016).</li><li>Roth, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paneth+cells+in+intestinal+homeostasis+and+tissue+injury.">Paneth cells in intestinal homeostasis and tissue injury.</a> PLoS One. 7, e38965 (2012).</li><li>Rodriguez-Colman, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+between+metabolic+identities+in+the+intestinal+crypt+supports+stem+cell+function.">Interplay between metabolic identities in the intestinal crypt supports stem cell function.</a> Nature. 543, 424-427 (2017).</li><li>Dow, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apc+Restoration+Promotes+Cellular+Differentiation+and+Reestablishes+Crypt+Homeostasis+in+Colorectal+Cancer.">Apc Restoration Promotes Cellular Differentiation and Reestablishes Crypt Homeostasis in Colorectal Cancer.</a> Cell. 161, 1539-1552 (2015).</li><li>Yilmaz, O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTORC1+in+the+Paneth+cell+niche+couples+intestinal+stem-cell+function+to+calorie+intake.">mTORC1 in the Paneth cell niche couples intestinal stem-cell function to calorie intake.</a> Nature. 486, 490-495 (2012).</li><li>Igarashi, M., Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTORC1+and+SIRT1+Cooperate+to+Foster+Expansion+of+Gut+Adult+Stem+Cells+during+Calorie+Restriction.">mTORC1 and SIRT1 Cooperate to Foster Expansion of Gut Adult Stem Cells during Calorie Restriction.</a> Cell. , 436-450 (2016).</li></ol>

著者ない競合経済的利害関係やその他の利害の関係があります。

又は、2 つの基本的なコンポーネント腸管幹細胞ニッチすなわちLgr5+ 、パネート細胞の洗練された機能解析が可能します。このアプローチは、わずかな変更6,10,11私たちと他の人が以前採用されています。再現性と標準化された実験室のプロトコルとして又は手順を紹介します。また、遺伝子導入の可能性の例としてLgr5+の幹細胞のApcダウンレギュレーションの効果に関する報告 (または生化学的な6) 並べ替えられた細胞成分に変更。総称して、データ表示 siRNA Apcの仲介ノックダウンLgr5+細胞の幹細胞の機能を高めるは、増加における多様性 (図 1 b) によって示される。
腸内の 3 D におけるカルチャを使用していくつかの利点は、既にレビュー4など、クリプト絨毛アーキテクチャの生体内で、それと自分の組織の著しい類似点と比べるとに記載されている、不死化細胞株と標準的な 2次元培養法から建築。ただし、このメソッドの主要な制限の 1 つはほとんどの場合、organoid 文化は腸陰窩から個々 のコンポーネントと機能の解析を許可しないプロセスが確立されて幹とニッチの特に、します。細胞、ここでそれぞれLgr5+ 、パネート細胞によって表されます。
これらの制限を克服して、オラ。茎およびニッチのセルは、別々 に動物からソートし、オルガノイドを生成する再構成することができます。など、このアプローチは特定の遺伝的改変を運ぶか採用マウス ・ モデルにより、これらの 2 つの細胞成分の機能解析または (例えば、DSS および/または特定のダイエット); 特定のストレス要因にさらさまたは直接遺伝子並べ替えセルを変更することによって (siRNA、CRISPR Cas9) または生化学的、オルガノイドを生成するそれらを再構成する前に。多様性、形態、自己複製能力と分化 (および最終的に化生変化の範囲) の結果オルガノイドの範囲は機能読み出しとして用いることができます。SiRNA などの遺伝的操作の場合形態学的効果は、明らかではないときのセルを分析し、興味の mRNA のノックダウンを検証するトランスフェクション後 1 時間。パネートとLgr5+茎およびニッチのセルの異なる変異はこれらの 2 つの細胞型と異なる organoid 相互作用変化につながるかどうか調査する異なる突然変異と遺伝子改変マウスから並べ替えることもできます生成効率および/または形態。
プロトコルの中で重要なステップは、絨毛 (ステップ 2.7) の除去と HBSS/2%FCS (手順 4.1) のセルの再懸濁。絨毛の除去はパネートを豊かにする重要なLgr5+細胞は陰窩と並べ替えの効率を改善するためにより低い三番目に位置します。FACS プロトコルは一般的、PBS/FCS のセルを並べ替えを示唆している、PBS ではなく HBSS の使用は増加し、細胞生存率を並べ替えの時間を通して安定した保持します。その他の重要なステップは、ステップ 4.7 ・ 4.8、物理パネート協会とLgr5+細胞organoids に上昇を与える最終的にフォーム ダブレットにこれらの系統をことができます。

腸上皮は哺乳類の体内で最も急速に自己更新組織で、同定と地下室の下部に存在する大人の幹細胞の機能解析を目的とした研究の茄多のオブジェクトをされていますLieberkühn、 Lgr5遺伝子の発現による目的税とカノニカル Wnt 信号1に依存しています。特に、 Lgr5+幹細胞は並ぶ、専門にされたニッチ細胞、すなわちパネート細胞で、また彼らの成熟2Wnt シグナルに依存によってサポートされています。一緒に、これらの 2 つの細胞型腸上皮の自己複製の根底にあるし、毎日恒常性平衡を保持: Lgr5+幹細胞は急速に分割し、前駆細胞に上昇を与えるより専門的な腸上皮細胞;パネート細胞に不可欠なニッチな要因 (例えば、Dll1 Wnt3、EGF) を提供するLgr5+幹細胞2。メッキ前のヴィヴォ組織と自己の構造を形成する organoids、または「ミニ根性」と呼ばれるとき腸陰窩の能力は、自己更新などのプロセスへの洞察力を提供するために実験的なツールとして悪用されていると分化癌4を含む正常および病的条件。Organoid 文化は、腸、膵臓、肝臓、腎臓、マウスおよびひと試料4からを含むいくつかの組織から確立されています。抽出法およびこれら器官毛細文化を開発する採用の成長因子が組織特異的多系統分化を駆動し、できるだけ元の幹細胞ニッチを模倣するように設計体内。Organoids 遺伝的疾患の治療、がんの治療効果、薬物の毒性の解析または器官培養5研究の評価を含む潜在的なアプリケーションがあります。
全体的にみて、organoid 文化組織サンプルから確立されたときの主な制限は、細胞特異性の欠如です。たとえば、腸陰窩から確立された腸オルガノイドは組織のソースの内で包含される個々 の細胞成分の分析を許可しない (例えば、全体の陰窩を含むLgr5+、パネートと前駆細胞)。
ここでは、手法、オラと呼ばれるの最も基本的なコンポーネント、すなわち幹 (Lgr5+)、ニッチ (Paneth) 細胞の機能解析と腸管における文化の利点を組み合わせたについて述べる。Paneth のユニークな能力を通してそしてLgr5+細胞に物理的に互いの共同培養 organoids2,6,10に上昇を与えるとを関連付けます。我々 はこの機能の利点を取り、オルガノイドを再構成する前に個別に 2 つのセル型が前処理します。その際、各細胞成分はある薬剤、成長因子、生化学的阻害剤、遺伝子組み換え、または再構成と organoid 形成前に化学治療に公開できます。したがって、又は分析を使用すると、特定の薬物治療や遺伝子組み換えが幹細胞またはそのニッチ相手に特定の効果をあるかどうかの決定ができます。

<table><tbody><tr><td>Advanced DMEM F12 *</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax *</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td>Final concentration: 10 mM</td></tr><tr><td>Penicillin/streptomycin *</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>Final concentration: 1%</td></tr><tr><td>Hepes *</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630080</td><td>Final concentration: 10 mM</td></tr><tr><td>Recombinant murine EGF *</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PMG8041</td><td>Final concentration: 50 ng/ml</td></tr><tr><td>Recombinant murine Noggin *</td><td>Peprotech</td><td>250-38</td><td>Final concentration: 100 ng/ml</td></tr><tr><td>y27632 *</td><td>Sigma</td><td>Y0503</td><td>Final concentration: 10 &amp;micro;M</td></tr><tr><td>Jagged-1 *</td><td>Anaspec Bio</td><td>AS-61298</td><td>Final concentration: 1 &amp;micro;M</td></tr><tr><td>Recombinant murine R-spondin *</td><td>R&amp;amp;D systems</td><td>3474-RS-050</td><td>Final concentration: 1 mg/ml</td></tr><tr><td>Flexitube Gene solution siRNA APC</td><td>Qiagen</td><td>GS11789</td><td>Final concentration: 100 nM</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>CD24 APC</td><td>Biolegend</td><td>101814</td><td></td></tr><tr><td>c-kit PE</td><td>Biolegend</td><td>105808</td><td></td></tr><tr><td>BV 421 CD31</td><td>Biolegend</td><td>102424</td><td></td></tr><tr><td>BV 421 CD45</td><td>Biolegend</td><td>103134</td><td></td></tr><tr><td>BV421 TER119</td><td>Biolegend</td><td>116234</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14180046</td><td></td></tr><tr><td>B6.129P2-Lgr5tm1(cre/ERT2)Cle/J</td><td>Jackson Laboratories</td><td>008875</td><td></td></tr><tr><td>Low binding tubes</td><td>Eppendorf</td><td>Z666548-250EA</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>356230</td><td></td></tr><tr><td>* The combination of these reagents constitutes the complete culture medium</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

the organoid reconstitution assay (ora) for the functional analysis of intestinal stem and niche cells

腸の粘膜上皮は、非常に急速な率が特徴です。哺乳類、全体の上皮をリニューアルして、4-5 日以内。成人の腸管幹細胞 Lieberkühn の陰窩の下部に存在するLgr5遺伝子の発現による計上、その増殖率が高い特徴的な1を介して恒常性を維持します。、小腸全体Lgr5+パネート細胞と呼ばれる特殊な分泌細胞と幹細胞が混在しています。パネート細胞は (すなわちリゾチーム、cryptdins/ディフェンシン) 抗菌化合物を分泌して腸内細菌叢の制御の役割を発揮します。もっと最近、パネート細胞、すなわち Wnt3、EGF, および Dll12としていくつかのキー配位子Lgr5+幹細胞ニッチ サポートを提供する能力の新たな機能が発見されています。
腸陰窩が長命に上昇を与えるex vivoを分離すると特定の成長因子と細胞外マトリックス成分の存在下で培養したとクリプト絨毛のような高い organoids と呼ばれる 3 D 構造の自己更新3大人の小腸の上皮のアーキテクチャです。Organoid 文化、全体の陰窩から確立されたとき個々 のコンポーネント、すなわち、 Lgr5+の貢献に対処せず、腸管幹細胞ニッチの分化と自己複製の研究を許可してパネート細胞。
ここでは、Paneth の能力の活用における分析への新しいアプローチについて述べるし、 Lgr5+は関連付けるオルガノイドを形成する細胞と共培養します。このアプローチは、ここで「organoid 再構成法」という (ORA) Paneth の遺伝学的および生化学的な変更をことができますまたはLgr5+幹細胞オルガノイドに再構成が続きます。そのため、腸管幹細胞のニッチの 2 つの主要なコンポーネントの機能解析をことができます。

Organoid 再構成アッセイでは、 Apc遺伝子の小さな干渉 RNA (siRNA) を行い, ここで、腸上皮の幹細胞のニッチとの基本的なコンポーネントの個別の機能解析をことができます。
この目的を達成するために私たちはまず近交系 C57BL6/J マウスから 8000 Lgr5+細胞と 6000 のパネート細胞を分離する (FACS) を並べ替え蛍光活性化細胞を利用しました。図 1 aでオラ アッセイのフローチャートが描かれています。Organoid 溶解能力はApcの mRNA に対する siRNA オリゴヌクレオチドLgr5+の細胞を培養によって評価されたまたはコントロールとしてスクランブル シーケンス (SCR) を網羅します。治療後、同じ siRNA で処理されたLgr5+細胞どちらか直接 organoid 媒体/再構成した基底膜、メッキまたは未処理のパネート細胞の等しい数と培養, うちメッキ後.コントロールとして、未処理Lgr5+細胞は単独でメッキされた (すなわち、パネート細胞なし) 未処理Lgr5+細胞由来オルガノイドの数を決定します。さらに追加のコントロールとして、パネート細胞単独ではパネート細胞ゲートで並べ替え Lgr5 パネート細胞ダブレットの汚染から派生した organoid 形成の背景を確認するメッキだった。予想通り、 Lgr5+幹細胞 (とカノニカル Wnt/β-カテニン シグナル伝達経路の結果活性化) のマウスのApc遺伝子の siRNA を介したノックダウン プラスにおける多様性と比較した場合の影響を対応する未処理またはスクランブル コントロール (図 1 b)。構成の wnt シグナルの活性化は、以前に報告された1としてパネート細胞の要件を救出しました。さらに、これら organoids 登場として中空球 (回転楕円体)、 Apcの記述表現型-変異体または Wnt 刺激 organoids (図 1パネル 1)、Lgr5 パネート細胞から得られるそれらの形態と比較するとダブレット (図 1 C、パネル 2)8,9。総称して、これらの結果は、それを再構成することを示すパネート細胞とLgr5+細胞はこれらの 2 つのセル型のセル固有メカニズムに洞察力を与えることができます。顕微鏡によるオルガノイドの形態素解析はこの点で貴重なすることができます、オルガノイドの形態はその細胞の組成を反映するので (例えば、回転楕円体は、によって構成され、 Lgr5+細胞)。考慮するべき別の重要なパラメーターは、(例えば、クリプト新進イベント数) organoid の複雑さです。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56329/56329fig1.jpg"> 図 1。SiRNA の効果を介した Lgr5 のApcの+セル。(A)実験手順のフローチャート。Lgr5EGFPレポーター マウス (Lgr5EGFP IRES creERT2)1にLgr5+のソースの幹細胞として用いられました。パネート細胞は、示されていると説明した6,7としてソートされます。((B))における多重度のLgr5+幹細胞およびパネート細胞の再構成時に観察されます。前処理はマス目 siRNA オリゴヌクレオチドはApc (siRNA Apc) に対して指示されるまたは (SCR) 制御シーケンスをスクランブルします。アスタリスクは統計的に有意な違いを示す (n = 3、* p < 0.05 * * p < 0.001)。誤差範囲は、(1) の SD Lgr5+のセルを参照、(2) Lgr5+細胞は SCR、(3) Lgr5+セル siRNA Apc、(4) Lgr5+セル + パネート細胞, (5) Lgr5+siRNA Apc + パネート細胞、(6) のパネート細胞を細胞します。(C)オルガノイドの代表的なイメージは、(1) Lgr5+セル siRNA Apc、(2) Lgr5+- パネート細胞から派生しました。スケール バー = 10 μ m.<a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56329/56329fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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The Organoid Reconstitution Assay ORA for the Functional Analysis of Intestinal Stem and Niche Cells

腸幹とニッチ細胞機能解析における再構成アッセイ (ORA)

腸内における文化は全体の陰窩からされ細胞特異的自己複製と分化の解析を許可しません。このプロトコルを記述する並べ替えられた幹 (Lgr5+) の再構成とその前の生化学的および遺伝性の変更と機能解析を可能にしながらオルガノイドを生じさせる (Paneth) 細胞のニッチします。

The intestinal epithelium is characterized by an extremely rapid turnover rate. In mammals, the entire epithelial lining is renewed within 4 - 5 days. ...

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The Organoid Reconstitution Assay (ORA) for the Functional Analysis of Intestinal Stem and Niche Cells

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Stem Cell Biology And Renewal in Epithelial Tissue

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10.5K ビュー.  Erasmus University Medical Center. 腸内における文化は全体の陰窩からされ細胞特異的自己複製と分化の解析を許可しません。このプロトコルを記述する並べ替えられた幹 (Lgr5+) の再構成とその前の生化学的および遺伝性の変更と機能解析を可能にしながらオルガノイドを生じさせる (Paneth) 細胞のニッチします。

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Three-Dimensional Culture of Murine Colonic Crypts to Study Intestinal Stem Cell Function Ex Vivo

The intestinal epithelium regenerates every 5-7 days, and is controlled by the intestinal epithelial stem cell (IESC) population located at the bottom of the crypt region. IESCs include active stem cells, which self-renew and differentiate into various epithelial cell types, and quiescent stem cells, which serve as the reserve stem cells in the case of injury. Regeneration of the intestinal epithelium is controlled by the self-renewing and differentiating capabilities of these active IESCs. In addition, the balance of the crypt stem cell population and maintenance of the stem cell niche are essential for intestinal regeneration. Organoid culture is an important and attractive approach to studying proteins, signaling molecules, and environmental cues that regulate stem cell survival and functions. This model is less expensive, less time-consuming, and more manipulatable than animal models. Organoids also mimic the tissue microenvironment, providing in vivo relevance. The present protocol describes the isolation of colonic crypts, embedding these isolated crypt cells into a three-dimensional gel matrix system and culturing crypt cells to form colonic organoids capable of self-organization, proliferation, self-renewal, and differentiation. This model allows one to manipulate the environment-knocking out specific proteins such as claudin-7, activating/deactivating signaling pathways, etc.-to study how these effects influence the functioning of colonic stem cells. Specifically, the role of tight junction protein claudin-7 in colonic stem cell function was examined. Claudin-7 is vital for maintaining intestinal homeostasis and barrier function and integrity. Knockout of claudin-7 in mice induces an inflammatory bowel disease-like phenotype exhibiting intestinal inflammation, epithelial hyperplasia, weight loss, mucosal ulcerations, epithelial cell sloughing, and adenomas. Previously, it was reported that claudin-7 is required for intestinal epithelial stem cell functions in the small intestine. In this protocol, a colonic organoid culture system is established to study the role of claudin-7 in the large intestine.

Three-Dimensional Culture of Murine Colonic Crypts to Study Intestinal Stem Cell Function Ex Vivo

The present protocol describes establishing a murine colonic organoid system to study the activity and functioning of colonic stem cells in a claudin-7 knockout model.

腸幹細胞機能をex vivoで研究するためのマウス結腸陰窩の三次元培養

The intestinal epithelium regenerates every 5-7 days, and is controlled by the intestinal epithelial stem cell (IESC) population located at the bottom of ...

がん研究

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the complexities of the organoid growth characteristics carry significant caveats for the investigator. Specifically, the growth patterns of each individual organoid are highly variable and create a heterogeneous population of epithelial cells in culture. With such caveats, common tissue culture practices cannot be simply applied to the organoid system due to the complexity of the cellular structure. Counting and plating based solely on cell number, which is common for individually separated cells, such as cell lines, is not a reliable method for organoids unless some normalization technique is applied. Normalizing to total protein content is made complex due to the resident protein matrix. These characteristics in terms of cell number, shape and cell type should be taken into consideration when evaluating secreted contents from the organoid mass. This protocol has been generated to outline a simple procedure to culture and treat small intestinal organoids with microbial pathogens and pathogen associated molecular patterns (PAMPs). It also emphasizes the normalization techniques that should be applied when protein analysis are conducted after such a challenge.

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Here, a protocol to harvest, maintain, and treat mouse small intestinal organoids with pathogen associated molecular patterns (PAMPs) and Listeria monocytogenes is described, as well as emphasis on gene expression and proper normalization techniques for protein.

ザ<em&gt; ex vivoで</emマウス腸オルガノイドの&gt;文化とパターン認識受容体刺激

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the ...

免疫・感染学

Establishment of Human Epithelial Enteroids and Colonoids from Whole Tissue and Biopsy

The epithelium of the gastrointestinal tract is constantly renewed as it turns over. This process is triggered by the proliferation of intestinal stem cells (ISCs) and progeny that progressively migrate and differentiate toward the tip of the villi. These processes, essential for gastrointestinal homeostasis, have been extensively studied using multiple approaches. Ex vivo technologies, especially primary cell cultures have proven to be promising for understanding intestinal epithelial functions. A long-term primary culture system for mouse intestinal crypts has been established to generate 3-dimensional epithelial organoids. These epithelial structures contain crypt- and villus-like domains reminiscent of normal gut epithelium. Commonly, termed &#8220;enteroids&#8221; when derived from small intestine and &#8220;colonoids&#8221; when derived from colon, they are different from organoids that also contain mesenchyme tissue. Additionally, these enteroids/colonoids continuously produce all cell types found normally within the intestinal epithelium. This in vitro organ-like culture system is rapidly becoming the new gold standard for investigation of intestinal stem cell biology and epithelial cell physiology. This technology has been recently transferred to the study of human gut. The establishment of human derived epithelial enteroids and colonoids from small intestine and colon has been possible through the utilization of specific culture media that allow their growth and maintenance over time. Here, we describe a method to establish a small intestinal and colon crypt-derived system from human whole tissue or biopsies. We emphasize the culture modalities that are essential for the successful growth and maintenance of human enteroids and colonoids.

We describe a method to establish human enteroids from small intestinal crypts and colonoids from colon crypts collected from both surgical tissue and biopsies. In this methodological article, we present the culture modalities that are essential for the successful growth and maintenance of human enteroids and colonoids.

全組織生検からヒト上皮EnteroidsとColonoidsの確立

The epithelium of the gastrointestinal tract is constantly renewed as it turns over. This process is triggered by the proliferation of intestinal stem ...

医学

Generation, Maintenance, and Characterization of Human Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal and Colonic Organoids

Intestinal regional specification describes a process through which unique morphology and function are imparted to defined areas of the developing gastrointestinal (GI) tract. Regional specification in the intestine is driven by multiple developmental pathways, including the bone morphogenetic protein (BMP) pathway. Based on normal regional specification, a method to generate human colonic organoids (HCOs) from human pluripotent stem cells (hPSCs), which include human embryonic stem cells (hES) and induced pluripotent stem cells (iPSCs), was developed. A three-day induction of BMP signaling sufficiently patterns mid/hindgut tube cultures into special AT-rich sequence-binding protein 2 (SATB2)-expressing HCOs containing all of the main epithelial cell types present in human colon as well as co-developing mesenchymal cells. Omission of BMP (or addition of the BMP inhibitor NOGGIN) during this critical patterning period resulted in the formation of human intestinal organoids (HIOs). HIOs and HCOs morphologically and molecularly resemble human developing small intestine and colon, respectively. Despite the utility of HIOs and HCOs for studying human intestinal development, the generation of HIOs and HCOs is challenging. This paper presents methods for generating, maintaining, and characterizing HIOs and HCOs. In addition, the critical steps in the protocol and troubleshooting recommendations are provided.

Here, detailed methods for generating, maintaining, and characterizing human pluripotent stem cell-derived small intestinal and colonic organoids are described. These methods are designed to improve reproducibility, expand scalability, and decrease the working time required for plating and passaging of organoids.

Intestinal regional specification describes a process through which unique morphology and function are imparted to defined areas of the developing ...

発生生物学

Combining Human Organoids and Organ-on-a-Chip Technology to Model Intestinal Region-Specific Functionality

The intestinal mucosa is a complex physical and biochemical barrier that fulfills a myriad of important functions. It enables the transport, absorption, and metabolism of nutrients and xenobiotics while facilitating a symbiotic relationship with microbiota and restricting the invasion of microorganisms. Functional interaction between various cell types and their physical and biochemical environment is vital to establish and maintain intestinal tissue homeostasis. Modeling these complex interactions and integrated intestinal physiology in vitro is a formidable goal with the potential to transform the way new therapeutic targets and drug candidates are discovered and developed.
Organoids and Organ-on-a-Chip technologies have recently been combined to generate human-relevant intestine chips suitable for studying the functional aspects of intestinal physiology and pathophysiology in vitro. Organoids derived from the biopsies of the small (duodenum) and large intestine are seeded into the top compartment of an organ chip and then successfully expand&#160;as monolayers while preserving the distinct cellular, molecular, and functional features of each intestinal region. Human intestine tissue-specific microvascular endothelial cells are incorporated in the bottom compartment of the organ chip to recreate the epithelial-endothelial interface. This novel platform facilitates luminal exposure to nutrients, drugs, and microorganisms, enabling studies of intestinal transport, permeability, and host-microbe interactions.
Here, a detailed protocol is provided for the establishment of intestine chips representing the human duodenum (duodenum chip) and colon (colon chip), and their subsequent culture under continuous flow and peristalsis-like deformations. We demonstrate methods for assessing drug metabolism and CYP3A4 induction in duodenum chip using prototypical inducers and substrates. Lastly, we provide a step-by-step procedure&#160;for the in vitro modeling of interferon gamma (IFN&#947;)-mediated barrier disruption (leaky gut syndrome) in a colon chip, including methods for evaluating the alteration of paracellular permeability, changes in cytokine secretion, and transcriptomic profiling of the cells within the chip.

Biopsy-derived intestinal organoids and organ-on-a-chips technologies are combined into a microphysiological platform to recapitulate region-specific intestinal functionality.

ヒトオルガノイドと臓器オンチップ技術を組み合わせて腸領域特異的機能をモデル化

The intestinal mucosa is a complex physical and biochemical barrier that fulfills a myriad of important functions. It enables the transport, absorption, ...

生物工学

Organoid-Derived Epithelial Monolayer: A Clinically Relevant In Vitro Model for Intestinal Barrier Function

In the past, intestinal epithelial model systems were limited to transformed cell lines and primary tissue. These model systems have inherent limitations as the former do not faithfully represent original tissue physiology, and the availability of the latter is limited. Hence, their application hampers fundamental and drug development research. Adult stem-cell-based organoids (henceforth referred to as organoids) are miniatures of normal or diseased epithelial tissue from which they are derived. They can be established very efficiently from different gastrointestinal (GI) tract regions, have long-term expandability, and simulate tissue- and patient-specific responses to treatments in vitro. Here, the establishment of intestinal organoid-derived epithelial monolayers has been demonstrated along with methods to measure epithelial barrier integrity, permeability and transport,&#160;antimicrobial protein secretion, as well as histology. Moreover, intestinal organoid-derived monolayers can be enriched with proliferating stem and transit-amplifying cells as well as with key differentiated epithelial cells. Therefore, they represent a model system that can be tailored to study the effects of compounds on target cells and their mode of action. Although organoid cultures are technically more demanding than cell lines, once established, they can reduce failures in the later stages of drug development as they truly represent in vivo epithelium complexity and interpatient heterogeneity.

Here, we describe the preparation of human organoid-derived intestinal epithelial monolayers for studying intestinal barrier function, permeability, and transport. As organoids represent original epithelial tissue response to external stimuli, these models combine the advantages of expandability of cell lines and the relevance and complexity of primary tissue.

オルガノイド由来の上皮単分子膜:腸管バリア機能のための臨床的に関連するインビトロモデル

In the past, intestinal epithelial model systems were limited to transformed cell lines and primary tissue. These model systems have inherent limitations ...

生物学

Culture Methods to Study Apical-Specific Interactions using Intestinal Organoid Models

The lining of the gut epithelium is made up of a simple layer of specialized epithelial cells that expose their apical side to the lumen and respond to external cues. Recent optimization of in vitro culture conditions allows for the re-creation of the intestinal stem cell niche and the development of advanced 3-dimensional (3D) culture systems that recapitulate the cell composition and the organization of the epithelium. Intestinal organoids embedded in an extracellular matrix (ECM) can be maintained for long-term and self-organize to generate a well-defined, polarized epithelium that encompasses an internal lumen and an external exposed basal side. This restrictive nature of the intestinal organoids presents challenges in accessing the apical surface of the epithelium in vitro and limits the investigation of biological mechanisms such as nutrient uptake and host-microbiota/host-pathogen interactions. Here, we describe two methods that facilitate access to the apical side of the organoid epithelium and support the differentiation of specific intestinal cell types. First, we show how ECM removal induces an inversion of the epithelial cell polarity and allows for the generation of apical-out 3D organoids. Second, we describe how to generate 2-dimensional (2D) monolayers from single cell suspensions derived from intestinal organoids, comprised of&#160;mature and differentiated cell types. These techniques provide novel tools to study apical-specific interactions of the epithelium with external cues in vitro and promote the use of organoids as a platform to facilitate precision medicine.

Here we present two protocols that allow the modeling of intestinal apical-specific interactions. Organoid-derived intestinal monolayers and Air-Liquid Interface (ALI) cultures facilitate the generation of well-differentiated epithelia accessible from both luminal and basolateral sides, whereas polarity-inverted intestinal organoids expose their apical side and are amenable to high throughput assays.

腸オルガノイドモデルを用いたアプリカル特異的相互作用を研究する培養法

The lining of the gut epithelium is made up of a simple layer of specialized epithelial cells that expose their apical side to the lumen and respond to ...

マウス腸陰窩および単一幹細胞からのオルガノイドの3D培養

The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research

At present, organoid culture represents an important tool for in vitro studies of different biological aspects and diseases in different organs. Murine small intestinal crypts can form organoids that mimic the intestinal epithelium when cultured in a 3D extracellular matrix. The organoids are composed of all cell types that fulfill various intestinal homeostatic functions. These include Paneth cells, enteroendocrine cells, enterocytes, goblet cells, and tuft cells. Well-characterized molecules are added into the culture medium to enrich the intestinal stem cells (ISCs) labeled with leucine-rich repeats containing G protein-coupled receptor 5 and are used to drive differentiation down specific lineages; these molecules include epidermal growth factor, Noggin (a bone morphogenetic protein), and R-spondin 1. Additionally, a protocol to generate organoids from a single erythropoietin-producing hepatocellular receptor B2 (EphB2)-positive ISC is also detailed. In this methods article, techniques to isolate small intestinal crypts and a single ISC from tissues and ensure the efficient establishment of organoids are described.

著者スポットライト:オルガノイド研究のためのマウス腸管陰窩からのオルガノイドと単一幹細胞の3D培養  

We describe a protocol to isolate murine small intestinal crypts and culture intestinal 3D organoids from the crypts. Additionally, we describe a method to generate organoids from a single intestinal stem cell in the absence of a sub-epithelial cellular niche.

オルガノイド研究のためのマウス腸陰窩および単一幹細胞からのオルガノイドの3D培養

At present, organoid culture represents an important tool for in vitro studies of different biological aspects and diseases in different organs. Murine ...

腸幹とニッチ細胞機能解析における再構成アッセイ (ORA)

要約

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腸幹細胞機能をex vivoで研究するためのマウス結腸陰窩の三次元培養

ザ

全組織生検からヒト上皮EnteroidsとColonoidsの確立

Generation, Maintenance, and Characterization of Human Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal and Colonic Organoids

ヒトオルガノイドと臓器オンチップ技術を組み合わせて腸領域特異的機能をモデル化

オルガノイド由来の上皮単分子膜:腸管バリア機能のための臨床的に関連するインビトロモデル

腸オルガノイドモデルを用いたアプリカル特異的相互作用を研究する培養法

オルガノイド研究のためのマウス腸陰窩および単一幹細胞からのオルガノイドの3D培養

オルガノイド研究のためのマウス腸陰窩および単一幹細胞からのオルガノイドの3D培養

オルガノイド研究のためのマウス腸陰窩および単一幹細胞からのオルガノイドの3D培養