Name: using laser doppler imaging and monitoring to analyze spinal cord microcirculation in rat
Uploaded: 2018-05-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Laser Doppler Imaging and Monitoring to Analyze Spinal Cord Microcirculation in Rat at JoVE.com

저자 아무 승인 있다.

실험 동물 관련 된 동물 프로토콜 여는 국립 보건원 (NIH)을 설립 하는 지침을 따 랐 고 동물 관리 및 사용 위원회의 주요한 의학 대학에 의해 승인 했다.
문화를 도입 하 고 측정 하는 레이저 도플러 장비 아래에 설명 된 사용 하 여 척수의 BF의 절차는 게시 된 연구1에서 사용 되었다.
1입니다. 수술을 위한 준비
<ol><li>염 분에 pentobarbital 나트륨 솔루션 3% (w/v)을 준비 하 고 35 mg/kg의 복용량에서 관리. 주의: pentobarbital 나트륨은 제어 물질 이다. 자세한 레코드를 보관 해야 하 고 안전 하 고 잠긴 위치에 저장 된 솔루션.</li>
	<li>장비를 소독 하 고 수술 영역을 준비 합니다.<ol>
<li>다음 단계와 수술 장비를 청소: 75% 에탄올 청소, 다음 30 분 동안 121 ° C에 고압 다음 건조는 60 ° C 오븐에 하룻밤. 수술 지역 75% 알코올로 소독.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2입니다. 수술에 대 한 쥐의 준비
<ol><li>Pentobarbital 나트륨 (35 mg/kg)의 복 주사와 쥐 anesthetize 전체 절차는 수술, 봉합, BF 측정 등 30-40 분 소요 됩니다.</li>
	<li>목에 허리에서 쥐의 등 영역을 면도. 머리는 가능한 한 짧게 잘라 되어야 합니다. 일정 한 체온을 유지 하기 위해 패드를가 열 하는 40 ° C에 쥐를 놓습니다.</li>
</ol>3. laminectomy 및 척수에 뇌 진 탕
참고: 가짜 그룹에 대해서만 laminectomy를 수행 하려면 다음과 같이 3.1에서 3.6.
<ol><li>최대 동물 등 쪽 위치. 면도 부분 75% 알코올 멸 균 면봉을 사용 하 여 다음 요오드 소독. 흉부 척추 T7 T11 포함 laminectomy 사이트를 통해 메스로 피부 절 개 (4 cm)를 확인 합니다.</li>
	<li>잘라 연결 된 근육 양쪽에 T8에서 노출 하기, spinous 프로세스, 패싯 관절 T10.</li>
	<li>메스를 사용 하 여 T10, T11 사이 접합 분리 절 개를 만들기 위해. 더 신중 하 게 해 부 근육 층 떨어져 뼈를 노출 하 여 접합 하 여 노출 합니다.</li>
	<li>가 위를 사용 하 여 더 작은 자르는와 작은 꽃 자루는 lamina에서 안팎 근육을 취소. T10에서 척추와 T11 사이의 작은 공간 열립니다 (그림 1A). 천천히 그리고 민감하게이 간격으로 한 hemostatic 집게를 삽입 하 고 작은 꽃 자루 (그림 1B) 휴식. 집게의 곡률 코드에서 옆으로, 위치는 항상 다는 것을 확인 하십시오. 다른 측면에서 반복 합니다.</li>
	<li>척수 (그림 1C) 고 신중 하 게 해제 하 고는 lamina를 끊다. 반드시 하지 어떤 무료 또는 가변 뼈 파편을 남겨두고.</li>
	<li>T9와 T8 하기를 더 제거 하는 과정을 반복 합니다.</li>
	<li>충돌 장비 테이블에 동물을 이동 하 고 테이블에 연결 된 Adson 집게의 쌍을 사용 하 여 t 7과 T11, spinous 프로세스에 클램핑 함으로써 동물의 척추를 안정 다음 척추 (그림 1D)을 집게를 조정.</li>
	<li>충돌에서 동물, 파업 막대 노출된 척수의 중심을 목표로 넣고 낮은 척수의 표면의 3-5 mm 이내에 막대.</li>
	<li>충격 힘 같은 충격 매개 변수 설정 (160 KD) 및 유지 시간 (1 s)<ol>
<li>소프트웨어 인터페이스에서 "실험 시작" 버튼을 클릭 하 여 SCI는 유도 다음 영향을 자동으로 시작 하는 다음 인터페이스에 "예"를 클릭 합니다. 충격, 후 소프트웨어 설정된 매개 변수 옆에 있는 영향의 실제 데이터를 표시, 그것은 설정 포인트 (그림 1E) 가까운 되도록 데이터 확인. 참고: 실험의 성공에 대 한 일반적인 표시는 충격 후 무의식적인 꼬리 스윙과 사지 운동의 짧은 기간 이었다. 사지 반사를 확인 하는 꼬리에 자극 또한 할 수 있었다. 그러나, 바소, 비 티, 그리고 Bresnahan (BBB) 운동 규모22,23 등 운동 평가 유도 상해의 효과 결정할 필요가 있다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 레이저 도플러 검사
<ol><li>이 연구에 사용 되는 레이저 도플러 스캐너의 세부 사항에 대 한 테이블의 자료 를 참조 하십시오. 노출 된 척수를 검색 하려면 검정, 비 반사 배경에 쥐 등 쪽을 놓습니다.</li>
	<li>
매개 변수를 검색 설정: 스캐닝 소프트웨어를 열고, "측정"를 측정 그래픽 사용자 인터페이스를 입력 하 여 스캐너 설정 인터페이스를 열 "스캐너 설정" 버튼을 클릭 클릭. 작은 지역 등이 실험을 검색 하려면 "고해상도"는 "스캔 크기 및 표시 옵션에서" 고급 검색 모드에 대 한 더 높은 해상도 (256 × 256 포인트 4 × 10 c m2를 덮고)를 선택 합니다 (그림 2A). 스캐닝 경계 (그림 2B)를 확인 하려면 "이미지 검색" 옵션을 클릭 하십시오.</li>
	<li>"비디오 및 거리" 옵션 라이브 비디오 이미지를 확인을 클릭 합니다. 스캐너 위치 수술 창 고 이동 센터 검색 창 (그림 2C)에 노출 된 척수 동물 배경 위에 10-13 cm.</li>
	<li>"먼 자동" 기능을 사용 하 여 잘 스캔 높이 조정, 스캔의 높이 모든 측정 실험 그림 2C에 걸쳐 일관성이 유지 되어야 한다.</li>
	<li>한 창 nonreflective 커버를 사용 하 여 추가 백그라운드를 최소화 하 고 동물의 방향 표시에 외과 영역을 노출.</li>
	<li>"반복 스캔"을 클릭, 검사 (우리가 사용 8 반복 검사 경우에) 수를 설정 다음 반복 스캔 인터페이스를 열고 "확인"을 클릭 합니다. 검색을 시작 하려면 시작 버튼을 클릭 하 고 전체 과정 (그림 2D) 약 3-4 분 소요 됩니다.</li>
</ol>5. 레이저 도플러 모니터링
<ol><li>우리는 시간이 지남에 BF 등 등등2 VP3 무딘 바늘 끝 배달 프로브 스캐너 모니터를 사용합니다. 모니터링 장비를 설정 하려면 stereotaxic 악기에 수직 레이저 도플러 프로브를 연결 합니다.</li>
	<li>올려 쥐 stereotaxic 기구 등 쪽 측에, 스티로폼 노출된 척수를 필요한 경우의 작은 조각으로 동물 아래에 배치 합니다.</li>
	<li>모니터 BF 척수에 프로브를 낮춥니다. 참고: 단계 5.3는 데이터 수치는 조사에 적용 하는 압력에 민감한 측정의 재현성에 대 한 중요 한, 따라서 여분의 주의 필요를 하지 오버-또는 아래-위치 조사 합니다.<ol>
<li>절 개를 검토 하 고 과도 한 액체 또는 혈액 메 마른 목화 패드를 사용 하 여 제거.</li>
		<li>2 mm rostral 노출된 척수의 중심점에 프로브를 사용 하는 기구의 X 및 Y 축 또는 병 변 고 중앙 정 맥을 방지.</li>
		<li>Z 축을 사용 하 여 천천히 낮은 수준 그냥 감동 척수의 표면에 조사. 프로브는 너무 느슨한 하지에 접점의 측면에서 밝은 빛을 허용 하지만 척수의 표면을 터치 그냥 한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
데이터 기록
	<ol>
<li>데이터 수집 소프트웨어를 열고, 설치 인터페이스를 열고 "새로운 실험" 버튼을 클릭 합니다. "일반" 옵션에서 시스템 구성에 대 한 확인을 클릭 합니다 "" (그림 3A), 디스플레이 설정에서 BF에 대 한 채널을 선택 등2 와 클릭 "다음" (그림 3B).</li>
		<li>파일 정보를 입력 하 고 클릭 합니다 "" (그림 3C) 입력 데이터 기록 인터페이스를 조사 (그림 3D)에서 녹화를 시작 하려면 녹색 삼각형 버튼을 클릭 합니다.</li>
		<li>일단 신호 8 연속 분 안정, 레코드 데이터입니다. 다음 프로브를 들어올리고 절 개를 봉합 하 고 수술 치료로 동물을 넣어 stereotaxic 기구에서 동물을 제거 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 봉합 및 사후 운영 관리
<ol><li>절 개를 봉합: 절 개의 양쪽에 근육 봉합 바늘을 삽입. 조직을 함께 당기고, 그로 인하여 제거 하기의 사이트에 노출 된 척수를 덮고, 스레드를 당겨. 바늘 홀더를 사용 하 여 당겨 양식을 통해 전체 스레드 3 스퀘어 매듭 하 고 가능한 노트 주변으로 스레드를 트림.</li>
	<li>절 개, 봉합으로 같은 방법으로 3-4 광장 매듭을 가진 피부를 봉합 한 다음 노트에서 스레드 약 1 cm 트림.</li>
	<li>수술 사이트와 케이지 바닥 사이의 접촉을 피하고 그것의 감 금에 그것의 사이드에 쥐를 놓습니다. 감 금 소는 난방 패드에 배치 되어야 합니다.</li>
	<li>때까지 아무 수술 후 출혈을 보장 하기 위해 마 취에서 깨어나서는 봉합 폐쇄 남아 있는 동물을 모니터링 합니다.</li>
	<li>수술, 120 mg/kg 1 한 일 동안 벤 질 페니실린 나트륨 쥐에 피하 주사. Intraperitoneally에 1 일에 대 한 수술과 모든 6 시간 후 수술 후 즉시 Buprenorphine (0.05 mg/kg) 주사.</li>
	<li>동물 충분 한 음식과 물에 대 한 액세스 권한이 있는지 확인 하려면, 확장된 spouts와 물 병에 맞게 하 고 감 금 소에는 동물에 가까운 음식을 넣어. 참고: 우리 실시 BBB 등급 규모 0, 위의 bbb 등급 점수와 함께 동물을 제외 하 동물 24 h 후 부상의 hindlimb 운동 기능 평가에 따라서 보장 동물 유도 부상으로 마비 되었다.</li>
	<li>수술 후 필요한 경우 부드럽게 복 부에 압력을 적용 매일 두 번, 오 줌 방광의 수동 빈 제공.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Jing, Y. L., Bai, F., Chen, H., Dong, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meliorating+microcirculatory+with+melatonin+in+rat+model+of+spinal+cord+injury+using+laser+Doppler+flowmetry.">Meliorating microcirculatory with melatonin in rat model of spinal cord injury using laser Doppler flowmetry.</a> Neuroreport. 27 (17), 1248-1255 (2016).</li><li>Jing, Y. 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저자는 공개 없다.

이 프로토콜을 수행할 때 몇 가지 세부 정보를 발견 한다. 첫째, 신속 하 고 우아하게 동물 소개 스트레스를 최소화 하기 위해 가능한 마 취와 수술의 과정 수행 되어야 합니다. 결과에 방해를 줄이기 위해, 동물 상대적으로 평화적이 고 안정적인 상태로 유지. 둘째, 혈액 잠재적으로 읽기를 방해할 수 있기 때문에, 레이저 도플러 장비를 사용 하 여 측정 하는 동안 출혈을 더 많은 주의 지불 합니다. 마지막으로, 데이터 기록 하는 동안 동물 온도 차이 의해 발생 하는 일관 되지 않은 결과 방지 하는 온도 제어 환경에서 유지 되어야 한다.
연구자는 레이저 도플러 검사를 사용할 때 고려해 야 하는 몇 가지 중요 한 요인이 있다. 프로토콜에서 설명 했 듯이, 스캔 거리 비교 결과 대 한 실험에 걸쳐 일관성이 유지 되어야 한다. 작은 영역에 대 한 고해상도를 여러 검사와 BF의 신뢰할 수 있는 데이터를 생성 하는 것이 좋습니다. 또한, 멸 균 거 즈만 추가 배경 최소화를 노출 하는 작은 창으로 외과 영역을 취재 하는 동물의 표시 방향으로 퍼 팅 하는 것이 좋습니다.
프로브 위치 적응 및 모니터링 프로토콜 구현에 중요 한 고려 사항입니다. 프로브 측정된 표면에 수직이 고 과도 한 압력은 피해 야 한다. 이 목표를 달성 하기 쥐 척추 정리 하 고 필요한 경우 스티로폼으로 동물을 underlaying 의해 파괴 장치를 사용 하 여 프로브를 위치 해야 고 있는지 측정 좌표 대략 동일한 지역에서 가져옵니다.
우리의 이전 기사1에서 설명 했 듯이, 절대적인 흐름 및 운동 유물24감도 교정의 장애 등이 기술, 몇 가지 제한이 있습니다. 또 다른 잘 주의 한계는 생물학 제로 신호-즉, BF25,26없이 신호의 존재. 결과에 이러한 제한의 영향을 최소화 하려면 측정가지고 야 한다 반복 하 고 정규화 소요를 감소 시키는 것이 좋습니다.
방사성 스피어 기술과 도플러 초음파 기술 등 다른 기술은 BF 측정을 위해 개발 되었습니다. 그러나, 이전은 하지 실시간으로 때문에 혈액에 방사성 물질을 주입 해야 합니다 고 조직 측정27excised. 대비의 기술에 관해서는 초음파 이미징, 비-침략 적 LDF 처럼, 대비 에이전트 (microbubbles)를 정 맥 주입 해야 합니다 고 jugular 또는 대 퇴의 도관 법은 일관 된 microbubble 주입에 필요한 향상 된 28. 이러한 기술에 비해, LDF는 조직의 microcirculatory 플럭스를 비 접촉 측정.
시간 및 주파수의 다양 한 기능 LDF 신호에 의하여 이루어져 있다. 이러한 기능을 잡으려고, 웨이 블 릿 분석, 푸리에 분석의 방법은 주기적 주파수 변동29,30을 적용 되었을. 이러한 진동 심장 비트, 호흡의 영향, 혈관 평활 근의 본질적인 조직적 활동, 혈관 벽, 및 내 피 관련된 대사 활동31,32neurogenic 활동을 각 성. 임상 응용 및 기초 연구, LDF 얻을 수 없습니다만, BF의 신호 하지만 또한 microvascular BF의 평가 microvascular 손상 하 고, 더 일반적으로,의 병 인을 조사 하는 플랫폼을 제공할 수 있습니다. microvascular 질병입니다.
현재 연구에서 두 방법 모두 LDF의 척수에 BF를 평가에 적용 했다. LDPI의 데이터 제공 주변 관류에 대 한 개요를 준 하 고 다른 위치에 BF의 비교 분석을 수행 하기 위해 가능 하 게 했다 BF의 지리적 분포. 강렬 하지 시간이 지남에 검색 영역 측정, LD 모니터링에서 파생 된 데이터 제공 지역 혈액의 흐름, 스펙트럼 등 심층 분석 및 지역에서 BF의 깊은 이해를 얻기 위해 웨이 블 릿 분석의 자세한 설명 유망한 미래 연구 주제입니다.

척수의 조직 매우 vascularized 이며 매우 민감한 척수 상해 (SCI)에 의해 유도 된 저 산소 증. 우리의 이전 연구 보여주었다 척수의 혈 뇌 진 탕 부상1,2모터 기능의 적자에 관련이 있을 수 있습니다 후 크게 감소 했다. 최근 연구 결과 SCI에 따라 혈관의 무결성은 잘 상관 감각 모터 기능3의 개선 나타났습니다. 그것은 향상 된 vascularity 백색 질, 향상 된 기능4직접 이끌어 구출 수 있습니다 보고 되었습니다. 따라서, 포스트 상해 척수 관류의 유지 보수는 생존 능력 및 기능 유지에 대 한 기본 중요성의 것 처럼 보였다.
SCI 후 관류에 다양 한 치료의 효과 과학5,,67의 실험 모델에서 다양 한 기법을 사용 하 여 수많은 수사에 의해 검사 되어 있다. 레이저 도플러, 잘 설립 된 기술로, 의심할 여 지 없이 여러 인간과 동물 연구8,9,,1011에 관류 측정 하는 유용한 방법. 기술은 조명 빛에 붉은 혈액 세포를 이동 하 여 유도 된 도플러 이동12 측정 기반으로 합니다. 1980 년대 초반에 기술 상용화 이후 큰 진전이 했다 레이저 기술, 광섬유 및 관류 측정을 위한 신호 처리에서 레이저 도플러 기기13을 신뢰할 수 있는 기술에 LDF를 만든.
현재 연구에서 두 방법 모두 레이저 도플러 측정의 진 탕 쥐의 척수에 혈액의 흐름 (BF) 평가에 적용 했다. 기술과 그것의 간단한 설치의 비 침 투 적인 특성상 우리의 프로토콜은 척수의 BF 측정에 대 한 민감한, 신속 하 고 안정적인 방법을 제공 한다. 더 중요 한 것은,이 방법은 각 시간 지점에서 동물 희생 없이 BF 게시물 진 탕 SCI의 종 적 연구를 수 있습니다.
때문에 조직의 BF와 자극 동안 관류의 빠른 변화를 평가 하는 능력, 그것은 대뇌 BF14,15 를 평가 하 고 측정 하는 다른 조직 간16, 등이 프로토콜을 적용 하 17, 피부18,19, 그리고 창 자20. 중간 대뇌 동맥의 일시적인 폐색의 쥐 모델에서 레이저 도플러 신호는 ischemic penumbra14에서 예상 되는 수준으로 BF 속도의 적절 한 감소를 위해 사용 되었다. 중요 한 사지 허 혈 (CLI) 유도 받은 쥐에서 레이저 도플러 검사 및 CLI 절차 후 전과 치료21후 다른 기간 동안 뒷 다리 BF 관찰에 적용 되었습니다. 또한, 생체 이용률 및 일부 약물의 대사 정리 LDF16에 의해 발견 되었다 간 BF에 달려 있었다. 따라서, LDF 실험 모델 pharmacodynamic, 및 pharmacokinetic 평가에서 널리 이용 될 수 있었다.

<table><tbody><tr><td>Laser Doppler Line Scanner</td><td>Moor Instruments</td><td>moorLDLS2</td><td></td></tr><tr><td>Laser Doppler Monitor</td><td>Moor Instruments</td><td>moorVMS-LDF</td><td></td></tr><tr><td>Probe for Monitor</td><td>Moor Instruments</td><td>VP3</td><td>Blunt needle end delivery probe</td></tr><tr><td>Impactor</td><td>Precision Systems and Instrumentation</td><td>IH-0400</td><td></td></tr><tr><td>Phenobarbital sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3761</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B-908</td><td></td></tr><tr><td>Syringe</td><td>Becton Dickinson Medica (s) Pte.Ltd</td><td>300841</td><td></td></tr><tr><td>Surgical suture needles with thread</td><td>Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd</td><td></td><td>18T0329 (batch number) /4-0</td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Operation instrument factory of Shanghai Medical Instrument Co., Ltd.</td><td>J11030 4#</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel blade</td><td>Operation instrument factory of Shanghai Medical Instrument Co., Ltd.</td><td>J12130 20#</td><td></td></tr><tr><td>Ophthalmic forceps</td><td>Operation instrument factory of Shanghai Medical Instrument Co., Ltd.</td><td>JD1040</td><td></td></tr><tr><td>Hemostatic forceps</td><td>Operation instrument factory of Shanghai Medical Instrument Co., Ltd.</td><td>J31050</td><td></td></tr><tr><td>Benzyl penicillin sodium</td><td>North China Pharmaceutical Co., Ltd</td><td></td><td>F6072116 (batch number)</td></tr><tr><td>75% alcohol</td><td>Dezhou Anjie Gaoke disinfection products Co., Ltd</td><td></td><td>150421R (batch number)</td></tr><tr><td>Iodine</td><td>Shandong Lierkang Medical Technology Co., Ltd</td><td></td><td>20170102 (batch number)</td></tr><tr><td>Rat</td><td>Laboratory Animal Center, The Academy of Millitery Medical Sciences</td><td></td><td>Sprague-Dawly (rat strain)</td></tr></tbody></table>

using laser doppler imaging and monitoring to analyze spinal cord microcirculation in rat

레이저 도플러 flowmetry (LDF)를 측정 하는 척수의 microcirculatory 변경 시키는 혈액 흐름 (BF) 측정에 대 한 비 침 투 적인 방법입니다. 이 문서에서는, 우리의 목표 척수 부상 후 BF의 변화를 분석 하 레이저 도플러 영상 및 모니터링을 사용 했다. 레이저 도플러 이미지 스캐너와 프로브/모니터 각 판독을 고용 되 고. LDPI 데이터 부상 사이트 관류에 대 한 개요를 준 하 고 다른 위치 사이에서 BF의 비교 분석에 대 한 접근 했다 BF의 로컬 배포를 제공 합니다. 강렬 하지 시간 동안 검색 영역 측정, 결합 된 프로브 전체 척수 관류와 산소 공급을 보여주는 척수의 BF 및 산소 포화를 동시에 측정 하 사용 되었다. 자체 LDF 신호 감도 운동, 및 생물 학적 0 상대 플럭스, 같은 몇 가지 제한이 있다. 그러나, 기술은 그것의 간단한 설치와 BF의 빠른 측정 실험과 임상 연구에 적용 되었습니다.

LDPI 척수, 척수의 rostral 꼬리 축 선형 프로필 (그림 4)를 추출 하 여 계량 했다 BF 측정 하 사용 되었다. 그림 5A 와 그림 5B 가짜 그룹 문화 그룹의 척수의 유출 이미지를 각각 나타냅니다. 그림 5C 및 그림 5D 가짜 그룹 문화 그룹의 척수의 rostral 꼬리 축 변경 BF를 각각 나타냅니다. 그림 5A 와 그림 5B 의 비교 시연 SCI BF의 감소를 유발 진원지의 BF rostral 코드와 꼬리 코드 보다 낮은 했다.
LDPM 시간-도메인 LD 신호 그리고 그래서2 와 그림 6 그림 획득 및 LDPM 데이터의 처리. 데이터가 기록 된 후 지속적인 관심 영역 (ROI) 데이터의 8 분 스트레칭, 선정 되었다는 다음 내장 필터에 의해 필터링은 어떤 생물학적 인 신호를 최소화 하기 위해. 그 후, ROI를 통계적으로 분석 하 고 결과 원시 데이터 형식에 수출 되었다. 그림 7 BF의 주기적 변화를 기록 및 가짜 그룹 및 과학 그룹에서 시간이 지남에 등2 . 그림 7A같이 크게 감소 하는 문화 그룹의 척수 BF 가짜 그룹과 비교. 동시에, 척수의 등2 했다 현저 하 게 낮은 척수 뇌 진 탕 (그림 7B), 부상 후 BF의 변화와 일치 했다. 장애를 줄이기 위해, 측정 찍은 반복적으로 하 고 데이터 표준화 했다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56243/56243fig1.jpg"> 그림 1입니다. Laminectomy 및 척추 뇌 진 탕. (A) T10, T11 사이의 교차점을 분리 합니다. (B)는 작은 꽃 자루를 집게를 삽입 합니다. (C)는 lamina를 휴식 하 고 척수를 노출. (해부학의 도식 스케치) (D) 실험 테이블에 척추를 안정화 합니다. (E) 초기 영향 소프트웨어 확인 데이터를 사용 하 여. <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56243/56243fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56243/56243fig2.jpg"> 그림 2입니다. 레이저 도플러 검사에 대 한 단계적으로 설치. (A) 일반 설정 검색에 대 한. (B) 설치 이미지 스캔 매개 변수에 대 한 인터페이스. (C) 설치 비디오 및 거리에 대 한 인터페이스. (D) 설치 반복 스캔에 대 한 인터페이스. <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56243/56243fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56243/56243fig3.jpg"> 그림 3입니다. 레이저 도플러 모니터링에 대 한 단계적으로 설치. (A) 새로운 실험을 시작 합니다. (B) 채널 표시를 선택 합니다. (C) 주제 세부 정보를 입력 합니다. (D) 데이터 녹음을 시작 합니다. <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56243/56243fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56243/56243fig4.jpg"> 그림 4입니다. 레이저 도플러 관류 영상의 과정. (A) 연속 8 파생 가짜 그룹에서 쥐를 스캔 하 여 검색 합니다. (B) 연속 검사의 평균 이미지. (C, D) 지역 관심 (ROI)의 척추의 중앙 축 강도 프로필을 추출 하는 적외선 이미지에 따라을 선정 되었다. 삽입 된 상자는 투자 수익의 프로 파일링 결과 보여줍니다. 색상 막대 표시 관류 단위 측정 레이저 도플러 스캐너 블루 낮은 값을 나타냅니다과 레드는 가장 높은 값을 나타냅니다. 악기의 관류, 즉 "유출" 상대 가치를 발견 했습니다. <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56243/56243fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56243/56243fig5.jpg"> 그림 5입니다. 척수의 BF 레이저 도플러 관류 이미지를 사용 하 여 발견 되었다. (A, B) 5mm ROI 꼬리 코드는 rostral에서 척추의 축 플럭스 지도에 그려 했다. (C, D) 척수 축을 중심으로 라인을 따라 각 ROI의 강도 프로필 정량화에 대 한 추출 했다.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56243/56243fig6.jpg"> 그림 6입니다. 레이저 도플러 관류 모니터링 과정. (A) 시간 마커 시작점을 표시 하는 원시 데이터의 기록. (B)는 8 분 투자 수익의 선택. (C) 선택 된 데이터 했다 다음 내장 필터에 의해 필터링 됩니다. (D) ROI의 통계 분석. (E) 원시 데이터의 수출. <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56243/56243fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56243/56243fig7.jpg"> 그림 7입니다. 척수 관류 레이저 도플러 관류 모니터링 하 여 평가 되었다. (A) A 15의 가짜 그룹 및 과학 그룹에서 원시 혈액 흐름 출력의 예제. (B) A 15의 가짜 그룹 및 과학 그룹에서 원시 산소 포화 출력의 예제. 레이저 도플러 프로브 중앙 정 맥의 오른쪽에는 척수의 표면 바로 위에 수준에서 2 mm rostrally 중간 지점에 위치 했다. <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56243/56243fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Using Laser Doppler Imaging and Monitoring to Analyze Spinal Cord Microcirculation in Rat

여기 우리 레이저 도플러 관류 (LDPI) 이미징의 조합을 제시 하 고 소개 하는 척수에 대 한 표준화 된 절차 뿐만 아니라 국부 적으로 혈액 흐름과 산소 포화 (2등), 코드 레이저 도플러 관류 모니터링 (LDPM) 척추를 측정 하 쥐에 외상입니다.

레이저 도플러 이미징 및 모니터링을 사용 하 여 쥐에서 척수 미세 분석 하

Laser Doppler flowmetry (LDF) is a noninvasive method for blood flow (BF) measurement, which makes it preferable for measuring microcirculatory ...

using-laser-doppler-imaging-monitoring-to-analyze-spinal-cord

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Behavior

9.9K 조회수.  China Rehabilitation Research Center. 여기 우리 레이저 도플러 관류 (LDPI) 이미징의 조합을 제시 하 고 소개 하는 척수에 대 한 표준화 된 절차 뿐만 아니라 국부 적으로 혈액 흐름과 산소 포화 (2등), 코드 레이저 도플러 관류 모니터링 (LDPM) 척추를 측정 하 쥐에 외상입니다.

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Optimized System for Cerebral Perfusion Monitoring in the Rat Stroke Model of Intraluminal Middle Cerebral Artery Occlusion

The translational potential of pre-clinical stroke research depends on the accuracy of experimental modeling. Cerebral perfusion monitoring in animal models of acute ischemic stroke allows to confirm successful arterial occlusion and exclude subarachnoid hemorrhage. Cerebral perfusion monitoring can also be used to study intracranial collateral circulation, which is emerging as a powerful determinant of stroke outcome and a possible therapeutic target. Despite a recognized role of Laser Doppler perfusion monitoring as part of the current guidelines for experimental cerebral ischemia, a number of technical difficulties exist that limit its widespread use. One of the major issues is obtaining a secure and prolonged attachment of a deep-penetration Laser Doppler probe to the animal skull. In this video, we show our optimized system for cerebral perfusion monitoring during transient middle cerebral artery occlusion by intraluminal filament in the rat. We developed in-house a simple method to obtain a custom made holder for twin-fibre (deep-penetration) Laser Doppler probes, which allow multi-site monitoring if needed. A continuous and prolonged monitoring of cerebral perfusion could easily be obtained over the intact skull.

Cerebral perfusion monitoring has been demonstrated to improve accuracy in ischemic stroke models. Technical difficulties often limit the use of this essential tool for cerebrovascular research. In this video, an optimized system is shown to obtain a single or multi-site hemodynamic monitoring during intraluminal middle cerebral artery occlusion in rats.

Intraluminal 중간 대뇌 동맥 폐색의 쥐 뇌졸중 모델에서 뇌 관류 모니터링에 최적화 된 시스템

The translational potential of pre-clinical stroke research depends on the accuracy of experimental modeling. Cerebral perfusion monitoring in animal ...

연구

의학

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal degeneration. Lack of growth cone formation, regeneration, and loss of additional myelinated axonal projections within the spinal cord greatly limits neurological recovery following injury. To assess how central myelinated axons of the spinal cord respond to injury, we developed an ex vivo living spinal cord model utilizing transgenic mice that express yellow fluorescent protein in axons and a focal and highly reproducible laser-induced spinal cord injury to document the fate of axons and myelin (lipophilic fluorescent dye Nile Red) over time using two-photon excitation time-lapse microscopy. Dynamic processes such as acute axonal injury, axonal retraction, and myelin degeneration are best studied in real-time. However, the non-focal nature of contusion-based injuries and movement artifacts encountered during in vivo spinal cord imaging make differentiating primary and secondary axonal injury responses using high resolution microscopy challenging. The ex vivo spinal cord model described here mimics several aspects of clinically relevant contusion/compression-induced axonal pathologies including axonal swelling, spheroid formation, axonal transection, and peri-axonal swelling providing a useful model to study these dynamic processes in real-time. Major advantages of this model are excellent spatiotemporal resolution that allows differentiation between the primary insult that directly injures axons and secondary injury mechanisms; controlled infusion of reagents directly to the perfusate bathing the cord; precise alterations of the environmental milieu (e.g., calcium, sodium ions, known contributors to axonal injury, but near impossible to manipulate in vivo); and murine models also offer an advantage as they provide an opportunity to visualize and manipulate genetically identified cell populations and subcellular structures. Here, we describe how to isolate and image the living spinal cord from mice to capture dynamics of acute axonal injury.

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability.

<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 레이저에 의한 척수 손상 모델은 실시간으로 축삭 변성의 메커니즘을 평가하기 위해

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

신경과학

Contrast Enhanced Ultrasound Imaging for Assessment of Spinal Cord Blood Flow in Experimental Spinal Cord Injury

Reduced spinal cord blood flow (SCBF) (i.e., ischemia) plays a key role in traumatic spinal cord injury (SCI) pathophysiology and is accordingly an important target for neuroprotective therapies. Although several techniques have been described to assess SCBF, they all have significant limitations. To overcome the latter, we propose the use of real-time contrast enhanced ultrasound imaging (CEU). Here we describe the application of this technique in a rat contusion model of SCI. A jugular catheter is first implanted for the repeated injection of contrast agent, a sodium chloride solution of sulphur hexafluoride encapsulated microbubbles. The spine is then stabilized with a custom-made 3D-frame and the spinal cord dura mater is exposed by a laminectomy at ThIX-ThXII. The ultrasound probe is then positioned at the posterior aspect of the dura mater (coated with ultrasound gel). To assess baseline SCBF, a single intravenous injection (400 &#181;l) of contrast agent is applied to record its passage through the intact spinal cord microvasculature. A weight-drop device is subsequently used to generate a reproducible experimental contusion model of SCI. Contrast agent is re-injected 15 min following the injury to assess post-SCI SCBF changes. CEU allows for real time and in-vivo assessment of SCBF changes following SCI. In the uninjured animal, ultrasound imaging showed uneven blood flow along the intact spinal cord. Furthermore, 15 min post-SCI, there was critical ischemia at the level of the epicenter while SCBF remained preserved in the more remote intact areas. In the regions adjacent to the epicenter (both rostral and caudal), SCBF was significantly reduced. This corresponds to the previously described &#8220;ischemic penumbra zone&#8221;. This tool is of major interest for assessing the effects of therapies aimed at limiting ischemia and the resulting tissue necrosis subsequent to SCI.

Contrast Enhanced Ultrasound imaging is a reliable in-vivo tool for quantifying spinal cord blood flow in an experimental rat spinal cord injury model. This paper contains a comprehensive protocol for application of this technique in association with a contusion model of thoracic spinal cord injury.

실험 척수 부상에서 척수 혈액 흐름의 평가를위한 향상된 초음파 이미징 대비

Reduced spinal cord blood flow (SCBF) (i.e., ischemia) plays a key role in traumatic spinal cord injury (SCI) pathophysiology and is accordingly an ...

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

Spinal cord injury (SCI) causes significant vascular disruption at the site of injury. Vascular pathology occurs immediately after SCI and continues throughout the acute injury phase. In fact, endothelial cells appear to be the first to die after a contusive SCI. The early vascular events, including increased permeability of the blood-spinal cord barrier (BSCB), induce vasogenic edema and contribute to detrimental secondary injury events caused by complex injury mechanisms. Targeting the vascular disruption, therefore, could be a key strategy to reduce secondary injury cascades that contribute to histological and functional impairments after SCI. Previous studies were mostly performed on postmortem samples and were unable to capture the dynamic changes of the vascular network. In this study, we have developed an in vivo duo-color two-photon imaging method to monitor acute vascular dynamic changes following contusive SCI. This approach allows detecting blood flow, vessel diameter, and other vascular pathologies at various sites of the same rat pre- and post-injury. Overall, this method provides an excellent venue for investigating vascular dynamics.

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

We introduce an in vivo imaging method using two different fluorescent dyes to track dynamic spinal vascular changes following a contusive spinal cord injury in adult Sprague-Dawley rats.

에 비보 듀오 컬러 이미징 혈관 역학 Contusive 척수 상해를 따르는 방법

Spinal cord injury (SCI) causes significant vascular disruption at the site of injury. Vascular pathology occurs immediately after SCI and continues ...

Evaluation of Vascular Control Mechanisms Utilizing Video Microscopy of Isolated Resistance Arteries of Rats

This protocol describes the use of in vitro television microscopy to evaluate vascular function in isolated cerebral resistance arteries (and other vessels), and describes techniques for evaluating tissue perfusion using Laser Doppler Flowmetry (LDF) and microvessel density utilizing fluorescently labeled Griffonia simplicifolia (GS1) lectin. Current methods for studying isolated resistance arteries at transmural pressures encountered in vivo and in the absence of parenchymal cell influences provide a critical link between in vivo studies and information gained from molecular reductionist approaches that provide limited insight into integrative responses at the whole animal level. LDF and techniques to selectively identify arterioles and capillaries with fluorescently-labeled GS1 lectin provide practical solutions to enable investigators to extend the knowledge gained from studies of isolated resistance arteries. This paper describes the application of these techniques to gain fundamental knowledge of vascular physiology and pathology in the rat as a general experimental model, and in a variety of specialized genetically engineered &#34;designer&#34; rat strains that can provide important insight into the influence of specific genes on important vascular phenotypes. Utilizing these valuable experimental approaches in rat strains developed by selective breeding strategies and new technologies for producing gene knockout models in the rat, will expand the rigor of scientific premises developed in knockout mouse models and extend that knowledge to a more relevant animal model, with a well understood physiological background and suitability for physiological studies because of its larger size.

This manuscript describes in vitro video microscopy protocols for evaluating vascular function in rat cerebral resistance arteries. The manuscript also describes techniques for evaluating microvessel density with fluorescently labeled lectin and tissue perfusion using Laser Doppler Flowmetry.

쥐의 고립 된 저항 동맥의 비디오 현미경을 이용 하 여 혈관 제어 메커니즘의 평가

This protocol describes the use of in vitro television microscopy to evaluate vascular function in isolated cerebral resistance arteries (and other ...

Evaluation of Cerebral Blood Flow Autoregulation in the Rat Using Laser Doppler Flowmetry

When investigating the body&#39;s mechanisms for regulating cerebral blood flow, a relative measurement of microcirculatory blood flow can be obtained using laser Doppler flowmetry (LDF). This paper demonstrates a closed skull preparation that allows cerebral blood flow to be assessed without penetrating the skull or installing a chamber or cerebral window. To evaluate autoregulatory mechanisms, a model of controlled blood pressure reduction via graded hemorrhage can be utilized while simultaneously employing LDF. This enables the real time tracking of the relative changes in the blood flow in response to reductions in arterial blood pressure produced by the withdrawal of circulating blood volume. This paradigm is a valuable approach to study cerebral blood flow autoregulation during reductions in arterial blood pressure and, with minor modifications in the protocol, is also valuable as an experimental model of hemorrhagic shock. In addition to evaluating autoregulatory responses, LDF can be used to monitor the cortical blood flow when investigating metabolic, myogenic, endothelial, humoral, or neural mechanisms that regulate cerebral blood flow and the impact of various experimental interventions and pathological conditions on cerebral blood flow.

This article demonstrates the use of laser Doppler flowmetry to evaluate the ability of the cerebral circulation to autoregulate its blood flow during reductions in arterial blood pressure.

레이저 도플러 흐름 측정을 사용하여 쥐에 대뇌 혈액 흐름 자동 조절의 평가

When investigating the body&#39;s mechanisms for regulating cerebral blood flow, a relative measurement of microcirculatory blood flow can be obtained ...

Laser Doppler Perfusion Imaging in the Mouse Hindlimb

Blood flow recovery is a critical outcome measure after experimental hindlimb ischemia or ischemia-reperfusion. Laser Doppler perfusion imaging (LDPI) is a common, noninvasive, repeatable method for assessing blood flow recovery. The technique calculates overall blood flow in the sampled tissue from the Doppler shift in frequency caused when a laser hits moving red blood cells. Measurements are expressed in arbitrary perfusion units, so the contralateral non-intervened upon leg is usually used to help control measurements. Measurement depth is in the range of 0.3-1 mm; for hindlimb ischemia, this means that dermal perfusion is assessed. Dermal perfusion is dependent on several factors&#8212;most importantly skin temperature and anesthetic agent, which must be carefully controlled to result in reliable readings. Furthermore, hair and skin pigmentation can alter the ability of the laser to either reach or penetrate to the dermis. This article demonstrates the technique of LDPI in the mouse hindlimb.

Here, we present a protocol that demonstrates the technique and necessary controls for Laser Doppler perfusion imaging to measure blood flow in the mouse hindlimb.

마우스 힌드림에 있는 레이저 도플러 관류 화상 진찰

Blood flow recovery is a critical outcome measure after experimental hindlimb ischemia or ischemia-reperfusion. Laser Doppler perfusion imaging (LDPI) is ...

Real-Time Assessment of Spinal Cord Microperfusion in a Porcine Model of Ischemia/Reperfusion

Spinal cord injury is a devastating complication of aortic repair. Despite developments for the prevention and treatment of spinal cord injury, its incidence is still considerably high and therefore, influences patient outcome. Microcirculation plays a key role in tissue perfusion and oxygen supply and is often dissociated from macrohemodynamics. Thus, direct evaluation of spinal cord microcirculation is essential for the development of microcirculation-targeted therapies and the evaluation of existing approaches in regard to spinal cord microcirculation. However, most of the methods do not provide real-time assessment of spinal cord microcirculation. The aim of this study is to describe a standardized protocol for real-time spinal cord microcirculatory evaluation using laser-Doppler needle probes directly inserted in the spinal cord. We used a porcine model of ischemia/reperfusion to induce deterioration of the spinal cord microcirculation. In addition, a fluorescent microsphere injection technique was used. Initially, animals were anesthetized and mechanically ventilated. Thereafter, laser-Doppler needle probe insertion was performed, followed by the placement of cerebrospinal fluid drainage. A median sternotomy was performed for exposure of the descending aorta to perform aortic cross-clamping. Ischemia/reperfusion was induced by supra-celiac aortic cross-clamping for a total of 48 min, followed by reperfusion and hemodynamic stabilization. Laser-Doppler Flux was performed in parallel with macrohemodynamic evaluation. In addition, automated cerebrospinal fluid drainage was used to maintain a stable cerebrospinal pressure. After completion of the protocol, animals were sacrificed, and the spinal cord was harvested for histopathological and microsphere analysis. The protocol reveals the feasibility of spinal cord microperfusion measurements using laser-Doppler probes and shows a marked decrease during ischemia as well as recovery after reperfusion. Results showed comparable behavior to fluorescent microsphere evaluation. In conclusion, this new protocol might provide a useful large animal model for future studies using real-time spinal cord microperfusion assessment in ischemia/reperfusion conditions.

Spinal cord microcirculation plays a pivotal role in spinal cord injury. Most methods do not allow real-time assessment of spinal cord microcirculation, which is essential for the development of microcirculation-targeted therapies. Here, we propose a protocol using Laser-Doppler-Flow Needle probes in a large animal model of ischemia/reperfusion.

허혈/재관류의 돼지 모델에서 척수 미세 퍼퍼퓨전의 실시간 평가

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<meta charset="utf8"></head><body>설치류의 MCAO 유발 허혈성 뇌졸중에 대한 안와 주변 레이저 도플러 유량계

Periorbital Placement of a Laser Doppler Probe for Cerebral Blood Flow Monitoring Prior to Middle Cerebral Artery Occlusion in Rodent Models

Middle cerebral artery occlusion (MCAO) is the gold-standard method for preclinical modeling of ischemic stroke in rodents. However, successful occlusion is not guaranteed by even the most skilled surgical hands. Errors primarily occur when the filament is not placed at the correct depth and include instances of either no infarction or vessel perforation, which can cause death. Laser Doppler flowmetry (LDF) is a reliable technique that provides real-time feedback on regional cerebral blood flow (CBF) during the MCAO procedure. Here we demonstrate a rapid technique for periorbital placement of a laser Doppler probe for measurement of CBF in both mice and rats. Our rationale was to simplify LDF implementation, encouraging widespread usage for improved surgical reliability. The technique eliminates the need for skull thinning and specialized equipment, with placement at the periorbital region rather than dorsal placement, promoting efficiency and ease of adoption. The protocol described here encompasses presurgical preparations, periorbital Doppler probe placement, and post-operative care. Representative results include visual depictions of procedural elements along with representative LDF tracings illustrating successful MCAO surgeries, with instances of unsuccessful filament placement leading to complications. The protocol illustrates LDF in confirming proper filament placement and offers a simplified procedure compared to alternative methods.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: 설치류 모델에서 국소 대뇌 혈류의 안와 주위 도플러 모니터링을 통한 뇌졸중 연구 발전

A minimally invasive surgical procedure is shown here, which involves placing the laser Doppler probe onto the skull over the distal region of the middle cerebral artery (MCA), a periorbital location suitable for rats and mice, to assess blood flow during transient MCA occlusion.

설치류 모델에서 중뇌동맥 폐색 전 대뇌 혈류 모니터링을 위한 레이저 도플러 프로브의 안와 주변 배치

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레이저 도플러 이미징 및 모니터링을 사용 하 여 쥐에서 척수 미세 분석 하

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Intraluminal 중간 대뇌 동맥 폐색의 쥐 뇌졸중 모델에서 뇌 관류 모니터링에 최적화 된 시스템

실험 척수 부상에서 척수 혈액 흐름의 평가를위한 향상된 초음파 이미징 대비

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설치류 모델에서 중뇌동맥 폐색 전 대뇌 혈류 모니터링을 위한 레이저 도플러 프로브의 안와 주변 배치

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