Name: creating and applying a reference to facilitate the discussion and classification of proteins in a diverse group
Uploaded: 2017-08-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
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지속적인 tardigrade 항균 성 펩 티 드 연구는 연구의 중서부 대학 사무실 및 후원 프로그램 (ORSP)에서 교내 자금에 의해 지원 됩니다. ORSP 연구 설계, 데이터 수집, 분석, 해석, 또는 원고 준비에 전혀 역할을 했다.

1. 관심의 단백질 그룹의 정의 기능 결정 <ol><li>상담 그룹의 일부로 간주 하는 데 필요한 기능에 관한 합의 인지 확인 하려면 이전 간행물. 불일치 사항이 나 연구 그룹 간의 의견 차이 숙지 하 고 다른 한 하위 그룹을 차별화 하 역할 수 있는 특성을 포함.</li>
	<li>이전 문학 특성 정의 해결 하지 않습니다 경우 사용 보존된 기능을 식별 하는 출발점으로 그룹의 대표자 이라고 여겨진다 시퀀스.</li>
</ol> 2. 수집 관련 시퀀스 <ol><li>리뷰 작성 되었습니다 하는 경우는 대표 하는 그룹 시퀀스의 분석을 포함, 원시 데이터 집합에서이 시퀀스를 포함. 가입 번호는 문학에서 참조를 사용 하 여 시퀀스를 검색 하 고 편집 프로그램 표준 순서로 저장 (예: EditSeq Lasergene 제품군 이나 많은 수 중에서 무료 온라인).</li>
	<li>문제의 그룹 구조 데이터베이스 중 하나에 정의 된 경우 데이터베이스 목록 승인 번호는 데이터베이스에 제공 된를 사용 하 여 검색 시퀀스 그룹의 일부분인으로 시퀀스를 포함 하 고 표준 시퀀스 편집에서 저장 위의 프로그램. 
	참고: 예를 들어 시퀀스 SCOP 데이터베이스에 CS-αβ (전갈 독 소 같은) superfamily 분류 찾을 수 있습니다 여기: http://scop.mrc-lmb.cam.ac.uk/scop/data/scop.b.h.c.h.html.</li> <li>수행 기본 로컬 맞춤 검색 도구 (폭발) 14 검색 공개, 온라인 데이터베이스 국립 센터에 대 한 생물 공학 정보 (NCBI) 찾을 수 없습니다 포함 된 문학에서 시퀀스를 통해 사용할 수 또는 구조 데이터베이스입니다. 에 대 한 가장 완료 결과, 단백질 폭발 (blastp)를 사용 하 여 번역 폭발 단백질 쿼리 (tblastn) 프로그램; 이들은 둘 다에서 유효 하다: https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi.
	<li>쿼리 시퀀스로 관심 그룹의 일부가 될 것으로 알려져 사용 시퀀스 <ol>. 복사 및 순서는 상단에 검색 상자에 붙여 넣습니다 또는 사용 가능한 경우 은행 승인 번호 또는 gi 식별자를, 제공.</li>
		<li>는 드롭다운 메뉴에서 데이터베이스를 선택합니다. Blastp에 대 한 비중복 단백질 시퀀스 (nr)을 선택 하 고 tblastn에 대 한 시퀀스 태그를 표현.</li>
		<li>유기 체 또는 taxon 이름 입력 하 고 목록에서 선택 하 여 설정 하는 유기 체에 특정 taxa에 결과 대 한 검색에 입력 하는 동안 나타납니다. 추가 유기 체 또는 제외 하는 taxa를 추가 하려면 클릭 합니다 있는 &#34; + &#34; 단추 및 다른 필드에 표시 됩니다. 유기 체 또는 taxon 이름, 입력, 그리고 확인 하는 동안 표시 되는 목록에서 선택을 입력 하 여 유기 체 상자에서 모든 원치 않는 taxa를 제외는 &#34; 제외 &#34; 오른쪽 상자에.</li>
		<li>클릭 하 여 추가 매개 변수를 액세스 &#34; 알고리즘 매개 변수 &#34;는 페이지의 하단 근처. 기본 매개 변수 변경에 대 한 근거는 두고.</li>
		<li>클릭은 &#34; 폭발 &#34; 분석 실행 버튼, 결과 표시를 위한 시간이 좀 걸릴 수 있습니다. 일반적으로, 안타는 기대 가치 (또는 e-값)의 검색 &#34;-05 &#34; 또는 더 나은 및 편집 프로그램 표준 시퀀스에 저장.
		<ol><li>모든 안타가이 임계값 위에 있다면, 모든 관련 시퀀스를 (알고리즘 매개 변수 섹션)에서 대상 시퀀스의 수를 증가 함께 검색을 다시 실행.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>필요한 경우 트림 없는 정보 (예를 들어, CS-αβ 배 성숙한 펩 티 드에만 적용)을 제외 하는 시퀀스. 신호 펩 티 드와 소품 15를 사용 하 여 제거에 대 한 프로-펩 티 드 식별 (사용 가능한 온라인), 또는 더 정교한 신호 펩 티 드 예측 16 SignalP (사용 가능한 온라인).</li>
</ol> 3. 중요 한 기능을 발견 했다를 기반으로 하는 스프레드시트에 대 한 참조를 생성 <ol><li>식별 관심 그룹의 특성을 정의. 예를 들어 A Phormia terraenovae ( 그림 1) 8에서 defensin 곤충의 솔루션 구조에 의해 결정적으로 설립 CS-αβ 배를 사용 하 여.
	<ol><li>시스테인 안정 나선형 (CSH) 17 라는 작은 주제를 포함 하는이 배;이 모티브 CXXXC (여기서 X는 어떤 아미노산)에 의해 식별 두 개의 이황화 결합을 형성 하는 CXC의 업스트림 ( 그림 1 , 고체 라인 핑크). 
		참고: CS αβ 모티브를 완료 하려면 3 이황화 결합 형성 된다 추가 시스테인 CSH 모티브 ( 그림 1, 핑크 라인을 점선)의 각 반 앞에서.</li>
	</ol></li> <li>입력 스프레드시트에 기능을 정의 하십시오. 그림 2를 참조 하십시오.
	<li>보존된 기능에 대 한 이러한 기능 사이의 공간을 나타내는 데 사용 열 <ol>. 숫자에 맞게를 갖도록 그들은 일관 된 폭을 충분히 넓게 열 유지. 사용 하 여 너비 설정에 &#34; 형식 | 열 너비 &#34; 기능 ( 그림 2, 분홍색 화살표).</li>
		<li>시퀀스 이름에 대 한 행을 사용 하 여.</li>
		<li>시퀀스 기능이 때 상자 채우기 함수 ( 그림 2, 핑크 스퀘어)를 사용 하 여 입력 합니다. 기능 사이의 간격에 대 한 사이 상자에 아미노산의 수를 입력 하 고 두고 칠하지. 예를 들어 시퀀스 defensin 곤충을 사용 하 여 정의 된 간격 그리고 c 5와 C6 C2 및 c 3 사이 6 시스테인 포함 된 참조를 제공.</li>
	</ol></li> <li>이전에 설립 된 대표적인 시퀀스 구조 데이터베이스와 문헌에 근거 하는 그룹의 구성원으로 추가. 
	참고: 예를 들어 이전 문학과 SCOP 데이터베이스 식별 포함에 대 한 여러 그룹: 곤충 defensins, 짧은 체인 전갈 독, 긴 체인 전갈 독 소, 초파리에서 drosomycins, 선 충 류 ABFs, 식물 defensins, MGD-1 및 macins입니다. 문학 또한 4 시스테인이 superfamily 18의 상위를 나타내는 수 있는 세균성 시퀀스를 식별 합니다. 이러한 시퀀스 추가 시스테인 10 6에서 참조의 수를 증가 하지만 중요 한 구조적 기능 ( 그림 3)의 맞춤을 유지 합니다.
	<ol><li>시퀀스 (예를 들어 추가 시스테인)의 하위 그룹을 정의할 수 있는 기능을 추가 하려면 사용 된 &#34; 삽입 &#34; 기능 ( 그림 3, 분홍색 화살표).</li>
		<li>경우 주어진된 순서에서 누락 칠하지 상자 기능과 개입 아미노산을 나타내는 상자와 결합. 필요한 경우 병합 병합 및 센터 기능 ( 그림 3, 핑크 상자)를 사용 하 여 셀.</li>
	</ol></li> <li>계속 큰 superfamily의 각 그룹에 있는 변이의 더 나은 사진의 얻을을 시퀀스 그룹을 추가 합니다. 그룹 특성 비교 ( 그림 4)을 촉진 하기 위하여 요약.
	<ol><li>주요 기능 사이의 아미노산의 수는 변화 한다 때 6-12 (6 ~ 12 아미노산), 그리고 중 하나를 나타내는 데 슬래시 같은 범위를 표시 하는 하이픈을 사용 / 또는, 7/10 (7 또는 10 아미노산) 등.</li>
		<li>참조에 포함할 관련 될 수 있지만 자주 발생 하지 않습니다 있는 시퀀스의 기능에 주석을 추가 하는 방법을 선택 합니다. 예를 들어 시스테인이이 superfamily에 중요 한 이기 때문에, 레이블 추가 시스테인 ( 그림 4, 핑크 상자).</li>
	</ol></li> <li>Newl 추가y 식별 가이드로 설립된 시퀀스를 사용 하 여 스프레드시트를 시퀀스. 예를 들어 tardigrades (노란색)에서 시퀀스를 추가 tardigrade 시퀀스 ( 그림 5는 공간을 위해 순서 당 행 대신 요약) superfamily의 몇 가지 다른 그룹으로가 보여줍니다.</li>
	<li>행 ( 그림 6)를 다시 배열 하 여 분류학 그룹 내의 다양성 쇼.</li>
</ol> 4. 아미노산 정렬 수정에 대 한 참조를 사용 하 여 참고: 여러 시퀀스 정렬에 사용할 수 있는 많은 프로그램이 있다 하지만이 데모 분자 진화 유전학 분석 (MEGA6)를 사용 합니다 19 그것은 무료로 다운로드 할 수 있기 때문에.
<ol><li>다운로드 하 고 소프트웨어를 설치 합니다.</li>
	<li>선택 하 여 메가에서 새로운 맞춤 시작 &#34; 편집/빌드 맞춤 &#34; 맞춤 탭 선택에서 &#34; 새로운 맞춤 만들 &#34; 나타나고 클릭 상자에서 &#34; 확인. &#34; 다음 선택 &#34; 단백질. &#34;</li>
	<li>선택 &#34; 파일에서 삽입 순서 &#34;에 &#34; 편집 &#34; 시퀀스를 가져올 메뉴. 
	참고: 시퀀스 메가로 가져오기 위한 FASTA 형태로 될 해야 합니다. 다른 아미노산 종류를 반영 하는 배경 색상은 기본적으로 사용 되지만이 옵션에서 해제할 수 있습니다는 &#34; 표시 &#34; 메뉴.</li>
	<li>중 유연 팔 아이콘을 클릭 하 여 모든 시퀀스를 입력 한 다음 &#34; 정렬 단백질 &#34; 근육 알고리즘 20를 사용 하 여 시퀀스를 정렬 하. 
	참고: ClustalW 사용할 수 이기도합니다.
	<ol><li>아무것도를 선택한 아빠 되었습니다 하 고 모두를 선택 하 라는 메시지가 클릭 &#34; 확인. &#34;</li> <li>참고: 창이 열립니다 하는 몇 가지 매개 변수를 변경할 수 있도록 하지만 그들은 변경만 해야 그렇게 할 이유가. 이 분석은 이전 종이 12에 분석 하는 시퀀스의 하위 집합을 사용.</li>
	</ol></li> <li>체크 맞춤 중요 한 기능에 따라, 시퀀스 위의 메뉴 표시줄 아미노산은 완전히 하는 모든 열 표시 됩니다 참고 보존 (*). 참조 그림 7. 초기 정렬 표시만 3 4 개의 보존된 시스테인 ( 그림 7, 핑크 상자); 참조 열 아래를 내려다 보면서, AlCRP 순서는 명확 하 게 고르지 ( 그림 7, 분홍색 화살표).</li>
	<li>I 사이 큰 격차의 제거를 대시 고 보도 강조 보존 c는 &#34; 삭제 &#34; 키. 어떤 아미노산을 강조 하지 마십시오 또는 또한 삭제 됩니다.</li>
	<li>이동 오른쪽 아미노산, 강조 하 고는 스페이스바를 눌러
	<li>메모는 AlCRP 이제 정렬 구조 시스테인은 CXXXC 모티브의 마지막 C 맞춤 ( 그림 8)에 걸쳐 보존은 <ol>. 시퀀스의 가장 중요 한 기능을 우선 순위를 필요에 따라 맞춤 조정.</li>
	</ol></li></ol> 5. 그룹 식별 사용 하 여 계통 발생 분석에서 결과 함께 참조 비교 <ol><li>예비 정렬에서 어떤 시퀀스, 시퀀스의 작은 숫자에 대 한 계통 발생 분석에 포함 되어야 하는 것을 확인,이 단계 수 있습니다 필요한 수.
	<ol><li>모든 시퀀스를 포함 하는 맞춤 파일 유지 하지만 계통 발생 분석에 대 한 시퀀스를 중복 제거 (중복 시퀀스 그림 9, 분홍색 상자 표시 쌍).</li>
		<li>데이터 집합 시퀀스의 많은 수를 포함 하는 경우 예비 분석을 실행 하 고 그룹 선택 대표는 항상 한 clade를 형성.</li>
	</ol></li> <li>최고의 아미노산 대체 모델 결정.
	<ol><li>메가 형식 (아래 데이터 탭) 맞춤 수출.</li>
		<li>모델 메뉴에가 고 선택 &#34; 찾을 최고의 DNA/단백질 모델. &#34;;에 그냥 저장 하는 파일을 선택 하 고 열이 변경할 수 있는 몇 가지 매개 변수가 있는 창이 열립니다.</li>
		<li>그들을 변경 하는 이유가 없다면 기본 매개 변수를 사용 합니다. 클릭 &#34; 계산 &#34; 분석 시작.</li>
	</ol></li> <li>최대 가능성 (ML) 분석을 실행 하는 메가에.
	<ol><li>선택 &#34; 구문/테스트 최대 가능성 트리 &#34; 계통 메뉴에서.</li>
		<li>모델 결정 단계 5.2에서에서 데이터에 대 한 최적 선택 (대체 모델 뿐만 아니라 최고 출력 줄 것 이다 &#34; 사이트 중 &#34; 매개 변수).</li>
		<li>선택 1000 부트스트랩 트리에 대 한 지원의 측정을 얻기 위해 복제.</li>
		<li>클릭 &#34; 계산 &#34; 분석;을 실행 하려면 메가 한 &#34; 트리 탐색기 &#34; 트리 시각화 하.</li>
	</ol></li> <li>베이지안 분석을 실행 하는 MrBayes 오픈 소스 소프트웨어 21. 
	참고: MrBayes 설명서는 또한 사용할 수 있는이 사이트에서. 이 기본 단계를 제공 하기 위한 것입니다 그리고 베이지안 계통 발생 분석에 포괄적인 가이드를 하지 않습니다.
	<ol><li>PAUP (넥서스) 형태로 메가 맞춤 MrBayes 프로그램으로 같은 폴더에 수출.</li>
		<li>오픈 MrBayes 유형과 &#34; exe 파일 이름 &#34; (예를 들어, &#34; exe Alignment.nex &#34;).</li>
		<li>모델 및 분석 매개 변수를 지정합니다. 단계 5.2에서에서 지정한 어느 모델을 선택 하거나 선택 하는 &#34; 혼합 &#34; 다양 한 모델을 시도 하 고 최고의 후부 및 확률 나무에 모델의 주파수를 보고 설정 (prset aamodelpr = 혼합). 유형 &#34; showmodel &#34; 모델의 현재 설정을 보고 하 고 &#34; mcmc 도움이 &#34; 각각의 간략 한 설명과 함께 현재 매개 변수 설정을 보여.</li>
		<li>설정 사용 하 여 세대의 수는 &#34; mcmcp ngen = &#34; 명령 (1 백만 전형적인).</li>
		<li>유형 &#34; mcmc &#34; 분석 시작.</li>
		<li>세대 수가 완료 되 면, 프로그램이 더 많은 세대를 추가 하려면 묻습니다. 분할 주파수의 평균 표준 편차를 사용 하 여 0.1 보다 작으면, 아니요를 입력 합니다. 경우 0.1 이상, 분석 계속가 수 또는 (설명서 참조) 몇 가지 매개 변수를 변경 해야 합니다.</li>
		<li>사용은 &#34; sumt &#34; 트리 파일을 생성 하는 명령을.</li>
		<li>분석이 완료 되 고 합의 트리 생성, 후 나무 기관에서 볼 수 있습니다 (사용 가능한 온라인).</li>
	</ol></li> <li>메서드 생성 일관 된 결과 보러 나무 비교. 
	참고: 일부 시퀀스 정보를 많이 제공 하지 않습니다: 나무 잘 해결 되지 않을 수 있습니다 및 지점 최소 지원 ( 그림 10)를 할 수 있습니다.</li>
	<li>나무 계통 발생 분석 지원이 그룹을 참조 하는 참조를 사용 하 여 식별 하는 그룹을 비교.</li>
</ol>

<ol>
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저자는 공개 상관이 있다.

그룹 내에서 단백질을 명명에 대 한 기준 명확 해야 하지만 이것은 항상 사실이 아니다. CS-αβ 접어 있는 시퀀스는 다양 한 유기 체를 사용 하 여, 명명법의 다른 시스템에 결과 뿐만 아니라 다양 한 수준의 특성화의 많은 실험실에서 연구 되었습니다. 완전히 새로운 명명법을 부과 하려고 무리 하다 고 이전 문학을 컨설팅 할 때 혼란의 큰 거래 귀 착될 것입니다. 번호 시스템 참조는 superfamily 상대?...

단백질의 이름 특성 및 다른 단백질에 관계는 반영 해야 한다. 불행 하 게도, 이름을 발견의 때에 일반적으로 할당 하 고, 연구를 계속, 더 큰 맥락의 이해 변경 될 수 있습니다. 이 여러 이름 단백질은 독립적으로 이상의 실험실, 변화 명칭 또는 특성 이름을 할당할 때 확실 한 것으로 생각 하 고 더 이상 충분히 단백질을 차별화 하는 이름으로 식별 된 경우 발생할 수 없습니다. 다른 사람.
무척 추 동물 defensins 명명법과 분류에 변성의 좋은 예를 제공합니다. 첫 번째 무척 추 동물 defensins 곤충에서 보고 되었다 그리고는 이름 "곤충 defensin" 포유류 defensins1,2에 인식된 상 동에 따라 제안 했다. 아직도 사용 되는 용어 defensin, 비록 그것은 이제 분명 그 무척 추 동물 및 포유류 defensins 공통 조상3,4를 공유 하지 않습니다. 수 종에 따라 "defensin"는 무척추동물 6 또는 8 개의 시스테인 (3 개 또는 4 개의 이황화 결합을 형성) 하 고 항균 성 활동의 다양 한 있을 수 있습니다. 하 꼬마 remanei5에서 최근 확인 된 cremycins 같은 상황, 같은 특성을 가진 단백질 이라고 defensins 하지 항상 "defensins," 복잡 했다. 또한, 무척 추 동물 큰 defensins 진화론 척추 β-defensins 보다 다른 무척 추 동물 defensins6에 관련 된 더 높습니다. 그럼에도 불구 하 고, 연구자는 때때로 이름 "defensin" 분석에 포함 되어야 하는 순서를 결정할 때에 의존 합니다.
구조 연구 곤충 defensins와 전갈 독 소7, 사이의 유사성 그리고 CS-αβ 배 이후 곤충 defensins8의 구조적 특성을 정의로 설립 되었다. 이 배는 구조 분류의 단백질 (SCOP) 데이터베이스9, 현재 다섯 가족을 포함 전갈 독 소 같은 (CS αβ) superfamily 정의: 곤충 defensins, 짧은 체인 전갈 독, 긴 체인 전갈 독 소, MGD-1 (연체 동물), 그리고 식물 defensins. 이 superfamily 최근 설명된 cis defensins4 와 Superfamily 3.30.30.10 선배/유전자 3D 데이터베이스10,11에 동의어 이다. 무척 추 동물 taxa, 식물 및 균 류 쇼는이 배를 포함 하는 단백질의 이름을 명확 하 게 관련이 없는 시스테인 번호 또는 결합 패턴, 항균 성 활동, 또는 진화 역사12의 다양 한에서 연구.
일관성 및 명확한 기준의 부족 이름을 지정 하 고 새로 식별 된 시퀀스가이 superfamily 분류에 도전 할. 단백질이이 superfamily에 비교 하는 주요 장애물은 시스테인 각 개별 시퀀스 (각 시퀀스의 첫 번째 시스테인은 C1), 구조 역할에 대 한 계정 수 없습니다와 관련 하 여 매겨집니다. 즉, 시스테인의 동일한 수만 시퀀스를 비교할 수 있습니다. 정렬 및 계통 발생 분석을 어렵게 만드는 CS-αβ 배를 형성 하는 시스테인 이외의 작은 순서 보존이입니다. 구조 기능을 우선순위 번호 매기기 시스템을 개발 하 여 superfamily 시퀀스 수 있습니다 더 쉽게 비교 되며 정렬. 보존된 기능으로 정의 하는 하위 그룹은 신속 하 게 구상 될 수 있다 그리고 새로운 시퀀스 보다 쉽게 적절 한 상황에 놓일 수 있다.
이 문서 번호 시스템 CS-αβ superfamily에 대 한 참조를 생성 하는 스프레드시트 소프트웨어 (예: Excel)을 사용 합니다. 그것은 방법을 보여 줍니다이 시퀀스 간의 비교를 명확히 식별 tardigrades에서 새로운 CS-αβ 시퀀스에 적용 됩니다. CS-αβ superfamily를 사용 하 여 예를 들어, 프로토콜 작성 되었습니다 관심;의 시퀀스를 사용 하 여 지침을 제공 그러나, 그것은 아닙니다이 superfamily 또는 시스테인-부자 시퀀스에 특정. 이 방법은 다른 taxa에서 독립적으로 연구 되어 있다 작은 전반적인 순서 상 동, 분자 분석 소프트웨어에 의해 쉽게 인식 될 수 있습니다 개별 특성을 있는 단백질의 그룹에 대 한 가장 유용 하 게 됩니다. 이 방법은 중요 한 기능이 없는 확인 하는 경우 제한 된 유틸리티의 것 중요 한 기능에 관한 몇 가지 선험적으로 결정을 필요 합니다. 기본 목표는 순서 관계의 간단한 시각화를 얻을 수 있는 방법을 보여주는 것입니다. 이 시퀀스 정렬 분석, 정보를 사용할 수 있습니다 하지만 정렬 및 분석 기본 목표는, 만약 바코드 메서드 자동화13에 대 한 더 많은 용량을가지고 적당 한 대체 될 것 이라고. 현재 메서드는 3 차원 구조의 직접 시각화에 대 한 도움이 되지 않을 것 이다 그래서 선형 형태로 각 펩 티 드의 기능을 표시 합니다.

<table><tbody><tr><td>BLAST webpage</td><td></td><td></td><td>https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi</td></tr><tr><td>EditSeq (Lasergene suite)</td><td>DNASTAR</td><td></td><td>https://www.dnastar.com/t-allproducts.aspx</td></tr><tr><td>Excel 2013</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FigTree</td><td></td><td></td><td>&amp;nbsp;http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/</td></tr><tr><td>MEGA</td><td></td><td></td><td>www.megasoftware.net</td></tr><tr><td>MrBayes</td><td></td><td></td><td>http://mrbayes.sourceforge.net/</td></tr><tr><td>SCOP database</td><td></td><td></td><td>http://scop.mrc-lmb.cam.ac.uk/scop/</td></tr></tbody></table>

creating and applying a reference to facilitate the discussion and classification of proteins in a diverse group

다양 한 유기 체를 사용 하 여 다른 실험실에서 연구 관련된 단백질 전체 그룹을 논의 하 고 적절 한 문맥에 새 시퀀스를 어렵게 명명법과 분류의 획 일 한 체계를 부족 수 있습니다. 구조에 관련 된 중요 한 시퀀스 기능을 우선 참조를 개발 하거나 활동 설립된 이름 단백질의 다양 한 그룹에 몇 가지 일관성을 추가 하려면 사용할 수 있습니다. 이 문서를 사용 하 여 알파-헬릭스 (CS αβ) 시스테인 안정 superfamily 예제로 보여 어떻게 스프레드 시트 소프트웨어에서 생성 된 참조 superfamily, 기존 단백질 사이의 관계를 명확 하 게 뿐만 아니라 수의 추가 용이 하 게 새로운 시퀀스입니다. 그것은 또한 참조 계통 발생 분석의 유효성에 영향을 일반적으로 사용 되는 소프트웨어에서 생성 하는 시퀀스 정렬 수정 하는 데 도움이 수 어떻게 보여 줍니다. 대 한 참조를 사용 하 여 가장 광범위 한 기능을 적절 하 게 캡처되지 않는 분자 분석에 의해 taxa에서에서 높은 분기 시퀀스를 포함 하는 단백질 그룹에 대 한 도움이 됩니다.

문학에서 보고 된 CS-αβ superfamily 시퀀스의 그룹은 그림 4에 나와 있습니다. 시스테인 쌍 각 시퀀스에 대 한 번호 매기기에 따라 다섯 가지 기본 그룹을 (표 1가운데 열) 것이 좋습니다. 그룹 1은 3 개의 이황화에서 채권 및 곤충, 거미, 연체 동물, 선 충, 그리고 곰 팡이에서 시퀀스를 포함 하는 6 개의 시스테인. 그룹 2, 3, 및 4는 4 개의 이황?...

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Creating and Applying a Reference to Facilitate the Discussion and Classification of Proteins in a Diverse Group

만들기 및 적용 촉진 토론 및 다양 한 그룹에 있는 단백질의 분류에 대 한 참조

이 프로토콜의 목표는 명명법과 분류에 대 한 일관 된 기준 부족 그룹에서 분기 단백질에 대 한 참조를 개발 하는 것입니다. 이 기준 분석과 전체적으로 그룹의 토론을 촉진 하며 설립된 이름을 사용할 수 있습니다.

Related proteins that have been studied in different labs using varying organisms may lack a uniform system of nomenclature and classification, making it ...

creating-applying-reference-to-facilitate-discussion-classification

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Behavior

7.0K 조회수.  Midwestern University. 이 프로토콜의 목표는 명명법과 분류에 대 한 일관 된 기준 부족 그룹에서 분기 단백질에 대 한 참조를 개발 하는 것입니다. 이 기준 분석과 전체적으로 그룹의 토론을 촉진 하며 설립된 이름을 사용할 수 있습니다.

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Investigating Protein Sequence-structure-dynamics Relationships with Bio3D-web

We demonstrate the usage of Bio3D-web for the interactive analysis of biomolecular structure data. The Bio3D-web application provides online functionality for: (1) The identification of related protein structure sets to user specified thresholds of similarity; (2) Their multiple alignment and structure superposition; (3) Sequence and structure conservation analysis; (4) Inter-conformer relationship mapping with principal component analysis, and (5) comparison of predicted internal dynamics via ensemble normal mode analysis. This integrated functionality provides a complete online workflow for investigating sequence-structure-dynamic relationships within protein families and superfamilies.

A protocol for the online investigation of protein sequence-structure-dynamics relationships using Bio3D-web is presented.

Bio3D-web을 이용한 단백질 염기 서열 구조 역학 관계 조사

We demonstrate the usage of Bio3D-web for the interactive analysis of biomolecular structure data. The Bio3D-web application provides online functionality ...

연구

생화학

mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional gene regulation (PTGR) of messenger RNAs (mRNAs). In the past few years, a number of mRNA-bound proteomes from yeast and mammalian cell lines have been successfully isolated through the use of a novel method called &#34;mRNA interactome capture,&#34; which allows for the identification of mRNA-binding proteins (mRBPs) directly from a physiological environment. The method is composed of in vivo ultraviolet (UV) crosslinking, pull-down and purification of messenger ribonucleoprotein complexes (mRNPs) by oligo(dT) beads, and the subsequent identification of the crosslinked proteins by mass spectrometry (MS). Very recently, by applying the same method, several plant mRNA-bound proteomes have been reported simultaneously from different Arabidopsis tissue sources: etiolated seedlings, leaf tissue, leaf mesophyll protoplasts, and cultured root cells. Here, we present the optimized mRNA interactome capture method for Arabidopsis thaliana leaf mesophyll protoplasts, a cell type that serves as a versatile tool for experiments that include various cellular assays. The conditions for optimal protein yield include the amount of starting tissue and the duration of UV irradiation. In the mRNA-bound proteome obtained from a medium-scale experiment (107 cells), RBPs noted to have RNA-binding capacity were found to be overrepresented, and many novel RBPs were identified. The experiment can be scaled up (109 cells), and the optimized method can be applied to other plant cell types and species to broadly isolate, catalog, and compare mRNA-bound proteomes in plants.

Here, we present an interactome capture protocol applied to Arabidopsis thaliana leaf mesophyll protoplasts. This method critically relies on in vivo UV crosslinking and allows for the isolation and identification of plant mRNA-binding proteins from a physiological environment.

식물 원형질에서 mRNA Interactome 캡처

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional ...

Mass Spectrometry-Based Proteomics Analyses Using the OpenProt Database to Unveil Novel Proteins Translated from Non-Canonical Open Reading Frames

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame (ORF) annotation impose two arbitrary criteria: a minimum length of 100 codons and a single ORF per transcript. However, a growing number of studies report expression of proteins from allegedly non-coding regions, challenging the accuracy of current genome annotations. These novel proteins were found encoded either within non-coding RNAs, 5' or 3' untranslated regions (UTRs) of mRNAs, or overlapping a known coding sequence (CDS) in an alternative ORF. OpenProt is the first database that enforces a polycistronic model for eukaryotic genomes, allowing annotation of multiple ORFs per transcript. OpenProt is freely accessible and offers custom downloads of protein sequences across 10 species. Using OpenProt database for proteomic experiments enables novel proteins discovery and highlights the polycistronic nature of eukaryotic genes. The size of OpenProt database (all predicted proteins) is substantial and need be taken in account for the analysis. However, with appropriate false discovery rate (FDR) settings or the use of a restricted OpenProt database, users will gain a more realistic view of the proteomic landscape. Overall, OpenProt is a freely available tool that will foster proteomic discoveries.

OpenProt is a freely accessible database that enforces a polycistronic model of eukaryotic genomes. Here, we present a protocol for the use of OpenProt databases when interrogating mass spectrometry datasets. Using OpenProt database for analysis of proteomic experiments allows for discovery of novel and previously undetectable proteins.

질량 분석 기반 Proteomics 분석 소설 단백질을 공개할 OpenProt 데이터베이스를 사용 하 여 비 정식 열려있는 독서 프레임에서 번역

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame ...

유전학

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in solution, is a relative technique that relies on the elution volume of the analyte to estimate molecular weight. When the protein is not globular or undergoes non-ideal column interactions, the calibration curve based on protein standards is invalid, and the molecular weight determined from elution volume is incorrect. Multi-angle light scattering (MALS) is an absolute technique that determines the molecular weight of an analyte in solution from basic physical equations. The combination of SEC for separation with MALS for analysis constitutes a versatile, reliable means for characterizing solutions of one or more protein species including monomers, native oligomers or aggregates, and heterocomplexes. Since the measurement is performed at each elution volume, SEC-MALS can determine if an eluting peak is homogeneous or heterogeneous and distinguish between a fixed molecular weight distribution versus dynamic equilibrium. Analysis of modified proteins such as glycoproteins or lipoproteins, or conjugates such as detergent-solubilized membrane proteins, is also possible. Hence, SEC-MALS is a critical tool for the protein chemist who must confirm the biophysical properties and solution behavior of molecules produced for biological or biotechnological research. This protocol for SEC-MALS analyzes the molecular weight and size of pure protein monomers and aggregates. The data acquired serve as a foundation for further SEC-MALS analyses including those of complexes, glycoproteins and surfactant-bound membrane proteins.

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering SEC-MALS

This protocol describes the combination of size exclusion chromatography with multi-angle light scattering (SEC-MALS) for absolute characterization of proteins and complexes in solution. SEC-MALS determines the molecular weight and size of pure proteins, native oligomers, heterocomplexes and modified proteins such as glycoproteins.

다각형 광 산란에 결합된 크기 배제 크로마토그래피에 의한 단백질의 특성 (SEC-MALS)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view of the impact of a disease, treatment, or other condition on the proteome as a whole. This report provides a detailed protocol for the extraction, quantification, precipitation, digestion, labeling, and subsequent data analysis of protein samples. Our optimized TMT labeling protocol requires a lower tag-label concentration and achieves consistently reliable data. We have used this protocol to evaluate protein expression profiles in a variety of mouse tissues (i.e., heart, skeletal muscle, and brain) as well as cells cultured in vitro. In addition, we demonstrate how to evaluate thousands of proteins from the resulting dataset.

We present an optimized tandem mass tag (TMT) labeling protocol that includes detailed information for each of the following steps: protein extraction, quantification, precipitation, digestion, labeling, submission to a proteomics facility, and data analyses.

프로테오믹스 시설 제출 및 후속 데이터 분석을 위한 TMT 샘플 준비

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

JUMPn: A Streamlined Application for Protein Co-Expression Clustering and Network Analysis in Proteomics

With recent advances in mass spectrometry-based proteomics technologies, deep profiling of hundreds of proteomes has become increasingly feasible. However, deriving biological insights from such valuable datasets is challenging. Here we introduce a systems biology-based software JUMPn, and its associated protocol to organize the proteome into protein co-expression clusters across samples and protein-protein interaction (PPI) networks connected by modules (e.g., protein complexes). Using the R/Shiny platform, the JUMPn software streamlines the analysis of co-expression clustering, pathway enrichment, and PPI module detection, with integrated data visualization and a user-friendly interface. The main steps of the protocol include installation of the JUMPn software, the definition of differentially expressed proteins or the (dys)regulated proteome, determination of meaningful co-expression clusters and PPI modules, and result visualization. While the protocol is demonstrated using an isobaric labeling-based proteome profile, JUMPn is generally applicable to a wide range of quantitative datasets (e.g., label-free proteomics). The JUMPn software and protocol thus provide a powerful tool to facilitate biological interpretation in quantitative proteomics.

We present a systems biology tool JUMPn to perform and visualize network analysis for quantitative proteomics data, with a detailed protocol including data pre-processing, co-expression clustering, pathway enrichment, and protein-protein interaction network analysis.

JUMPn: 프로테오믹스의 단백질 공동 발현 클러스터링 및 네트워크 분석을 위한 간소화된 응용 프로그램

With recent advances in mass spectrometry-based proteomics technologies, deep profiling of hundreds of proteomes has become increasingly feasible. ...

An Optimized Quantitative Pull-Down Analysis of RNA-Binding Proteins Using Short Biotinylated RNA

Protein-RNA interactions regulate gene expression and cellular functions at transcriptional and post-transcriptional levels. For this reason, identifying the binding partners of an RNA of interest remains of high importance to unveil the mechanisms behind many cellular processes. However, RNA molecules might interact transiently and dynamically with some RNA-binding proteins (RBPs), especially with non-canonical ones. Hence, improved methods to isolate and identify such RBPs are greatly needed.
To identify the protein partners of a known RNA sequence efficiently and quantitatively, we developed a method based on the pull-down and characterization of all interacting proteins, starting from cellular total protein extract. We optimized the protein pull-down using biotinylated RNA pre-loaded on streptavidin-coated beads. As a proof of concept, we employed a short RNA sequence known to bind the neurodegeneration-associated protein TDP-43 and a negative control of a different nucleotide composition but the same length. After blocking the beads with yeast tRNA, we loaded the biotinylated RNA sequences on the streptavidin beads and incubated them with the total protein extract from HEK 293T cells. After incubation and several washing steps to remove nonspecific binders, we eluted the interacting proteins with a high-salt solution, compatible with the most commonly used protein quantification reagents and with sample preparation for mass spectrometry. We quantified the enrichment of TDP-43 in the pull-down performed with the known RNA binder compared to the negative control by mass spectrometry. We used the same technique to verify the selective interactions of other proteins computationally predicted to be unique binders of our RNA of interest or of the control. Finally, we validated the protocol by western blot via the detection of TDP-43 with an appropriate antibody. 
This protocol will allow the study of the protein partners of an RNA of interest in near-to-physiological conditions, helping uncover unique and unpredicted protein-RNA interactions.

Here, we present an optimized in vitro method to uncover, quantify, and validate protein interactors of specific RNA sequences, using total protein extract from human cells, streptavidin beads coated with biotinylated RNA, and mass spectrometry analysis.

짧은 비오티닐화 RNA를 사용한 RNA 결합 단백질의 최적화된 정량적 풀다운 분석

Protein-RNA interactions regulate gene expression and cellular functions at transcriptional and post-transcriptional levels. For this reason, identifying ...

A Protocol for Computer-Based Protein Structure and Function Prediction

Genome sequencing projects have ciphered millions of protein sequence, which require knowledge of their structure and function to improve the understanding of their biological role. Although experimental methods can provide detailed information for a small fraction of these proteins, computational modeling is needed for the majority of protein molecules which are experimentally uncharacterized. The I-TASSER server is an on-line workbench for high-resolution modeling of protein structure and function. Given a protein sequence, a typical output from the I-TASSER server includes secondary structure prediction, predicted solvent accessibility of each residue, homologous template proteins detected by threading and structure alignments, up to five full-length tertiary structural models, and structure-based functional annotations for enzyme classification, Gene Ontology terms and protein-ligand binding sites. All the predictions are tagged with a confidence score which tells how accurate the predictions are without knowing the experimental data. To facilitate the special requests of end users, the server provides channels to accept user-specified inter-residue distance and contact maps to interactively change the I-TASSER modeling; it also allows users to specify any proteins as template, or to exclude any template proteins during the structure assembly simulations. The structural information could be collected by the users based on experimental evidences or biological insights with the purpose of improving the quality of I-TASSER predictions. The server was evaluated as the best programs for protein structure and function predictions in the recent community-wide CASP experiments. There are currently &gt;20,000 registered scientists from over 100 countries who are using the on-line I-TASSER server.

Guidelines for computer based structural and functional characterization of protein using the I-TASSER pipeline is described. Starting from query protein sequence, 3D models are generated using multiple threading alignments and iterative structural assembly simulations. Functional inferences are thereafter drawn based on matches to proteins with known structure and functions.

컴퓨터 기반의 단백질 구조 및 기능 예측을위한 프로토콜

Genome sequencing projects have ciphered millions of protein sequence, which require knowledge of their structure and function to improve the ...

생물학

Interactome-Seq: A Protocol for Domainome Library Construction, Validation and Selection by Phage Display and Next Generation Sequencing

Folding reporters are proteins with easily identifiable phenotypes, such as antibiotic resistance, whose folding and function is compromised when fused to poorly folding proteins or random open reading frames. We have developed a strategy where, by using TEM-1 &#946;-lactamase (the enzyme conferring ampicillin resistance) on a genomic scale, we can select collections of correctly folded protein domains from the coding portion of the DNA of any intronless genome. The protein fragments obtained by this approach, the so called &#34;domainome&#34;, will be well expressed and soluble, making them suitable for structural/functional studies.
By cloning and displaying the &#34;domainome&#34; directly in a phage display system, we have showed that it is possible to select specific protein domains with the desired binding properties (e.g., to other proteins or to antibodies), thus providing essential experimental information for gene annotation or antigen identification.
The identification of the most enriched clones in a selected polyclonal population can be achieved by using novel next-generation sequencing technologies (NGS). For these reasons, we introduce deep sequencing analysis of the library itself and the selection outputs to provide complete information on diversity, abundance and precise mapping of each of the selected fragment. The protocols presented here show the key steps for library construction, characterization, and validation.

The protocols described allow the construction, characterization and selection (against the target of choice) of a &#34;domainome&#34; library made from any DNA source. This is achieved by a research pipeline that combines different technologies: phage display, a folding reporter and next generation sequencing with a web tool for data analysis.

위하여-Seq: Domainome 라이브러리 건설, 유효성 검사 및 페이지 표시 및 다음 세대 시퀀싱 선택 프로토콜

Folding reporters are proteins with easily identifiable phenotypes, such as antibiotic resistance, whose folding and function is compromised when fused to ...

An Integrated Approach for Microprotein Identification and Sequence Analysis

Next-generation sequencing (NGS) has propelled the field of genomics forward and produced whole genome sequences for numerous animal species and model organisms. However, despite this wealth of sequence information, comprehensive gene annotation efforts have proven challenging, especially for small proteins. Notably, conventional protein annotation methods were designed to intentionally exclude putative proteins encoded by short open reading frames (sORFs) less than 300 nucleotides in length to filter out the exponentially higher number of spurious noncoding sORFs throughout the genome. As a result, hundreds of functional small proteins called microproteins (&#60;100 amino acids in length) have been incorrectly classified as noncoding RNAs or overlooked entirely.
Here we provide a detailed protocol to leverage free, publicly available bioinformatic tools to query genomic regions for microprotein-coding potential based on evolutionary conservation. Specifically, we provide step-by-step instructions on how to examine sequence conservation and coding potential using Phylogenetic Codon Substitution Frequencies (PhyloCSF) on the user-friendly University of California Santa Cruz (UCSC) Genome Browser. Additionally, we detail steps to efficiently generate multiple species alignments of identified microprotein sequences to visualize amino acid sequence conservation and recommend resources to analyze microprotein characteristics, including predicted domain structures. These powerful tools can be used to help identify putative microprotein-coding sequences in noncanonical genomic regions or to rule out the presence of a conserved coding sequence with translational potential in a noncoding transcript of interest.

The protocol described here provides detailed instructions on how to analyze genomic regions of interest for microprotein-coding potential using PhyloCSF on the user-friendly UCSC Genome Browser. Additionally, several tools and resources are recommended to further investigate sequence characteristics of identified microproteins to gain insight into their putative functions.

마이크로단백질 동정 및 서열 분석을 위한 통합 접근법

Next-generation sequencing (NGS) has propelled the field of genomics forward and produced whole genome sequences for numerous animal species and model ...