Name: determination of the glycogen content in cyanobacteria
Uploaded: 2017-07-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
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저자는 노르딕 에너지 리서치 (AquaFEED, 프로젝트 번호 24), 덴마크 Innovationfonden Denmark (프로젝트 번호 12-131844), Villum Fonden (프로젝트 번호 13363)

1. 준비 <ol><li> 시아 노 박테리아 배양 <ol><li> 성장 Synechocystis sp. 1 % (v / v) CO 2가 보충 된 일정한 공기 공급으로 30 ℃에서 액체 BG11 배지 8 에서 PCC 6803. 50 μmol photon / m 2 / s의 광합성 광자 자속 밀도에서 빛으로 문화를 지속적으로 조명하십시오. </li><li> 성장하는 Synechococcus sp. PCA 7002는 1 % (v / v) CO 2가 보충 된 일정량의 공기가 공급되는 액체 A + 배지 23 (BG11 배지도 사용 가능). 온도는 37 ° C이어야합니다. 150 μmol photon / m 2 / s의 광합성 광자 자속 밀도에서 빛으로 문화를 지속적으로 조명하십시오. </li><li> 1cm의 빛 경로와 함께 큐벳을 사용하여 730 nm에서 문화의 광학 밀도 (OD)를 측정합니다. OD 값이 0.8 이상이면 적절한 희석을하여 th에 비례하는 OD 측정 값을 얻으십시오e 세포 농도. 참고 : 아래 제시된 프로토콜은 액체 배양에 적합하며 OD 730nm 값이 2 이상인 세포 밀도가 있습니다. 전형적으로 1보다 작은 OD 730nm 값을 갖는 지수 성장 단계의 배양 물을 원심 분리 및 완충액 또는 배지에서 재현 탁하여 OD 730nm 값이 2 이상이 되도록 세포 밀도를 농축시킨다. </li></ol></li><li> 완충액 및 시약 <ol><li> pH 8에서 50 mM Tris-HCl 완충액을 만든다. </li><li> pH 5에서 50 mM 나트륨 아세테이트 완충액을 만든다. </li><li> 50 MM 나트륨 아세테이트 완충액 (pH 5)에 8 U / mL amyloglucosidase의 저장 용액을 만든다. </li><li> 50 MM 나트륨 아세테이트 완충액 (pH 5)에 2 U / mL의 α- 아밀라아제의 저장 용액을 만든다. </li><li> 증류수를 사용하여 0 ~ 100 μg / mL 농도의 메이크 루카스 표준 용액을 만듭니다. </li><li> D- 포도당 분석 키트 (GODPOD 형식)에서 GOD-POD 시약 준비, f제조업체의 지시를 따르십시오. </li></ol></li></ol> 2. 세포 건조 중량의 결정 (선택 사항) <ol><li> 배양액 또는 세포 재 현탁액 2 mL (1.1 단계 참조)를 2.0 mL 튜브에 옮기고 6,000 xg 및 4 ° C에서 5 분간 원심 분리한다. 뜨는 물을 버린다. </li><li> 물 1 ML에 펠렛을 Resuspend 및 5 분 6,000 XG 및 4 ° C에서 원심 분리기. 뜨는을 버리고 물 0.5 ML에 세포 펠렛을 resuspend. </li><li> 현가 장치를 미리 무게를 측정 한 알루미늄 트레이에 옮깁니다. 하룻밤 건조 (약 18 시간)하기 위해 트레이를 105 ℃의 건조 오븐으로 옮긴다. 중요 : 손가락에서 재료가 전달되지 않도록 트레이를 집게로 다루는 것이 중요합니다. 동일한 조건에서 비어있는 사전 무게가있는 알루미늄 트레이를 건조시켜 건조 중에 용지함의 중량 손실을 확인합니다. </li><li> 건조 후 오븐에서 트레이를 꺼내어 주변 온도에서 평형을 유지하게하십시오5 분간 정치 한 후 0.0001 g의 정확도로 계량하십시오. 참고 :이 값은 셀 건조 중량 기준으로 글리코겐 함량을 표준화하는 데 사용할 수 있습니다. </li></ol> 3. 시아 노 박테리아 세포의 용해 <ol><li> 배양 물 또는 세포 재 현탁액 (1 단계 참조) 1 mL를 1.5 mL 튜브에 옮기고 6,000 xg 및 4 ° C에서 10 분간 원심 분리한다. 뜨는 물을 버린다. </li><li> 50mM Tris-HCl, pH 8 1 ML에 펠렛을 Resuspend하고 10 분 동안 6,000 XG와 4 ° C에서 원심 분리기. 상층 액을 버리고 Tris-HCl 완충액 1 mL에 세포 펠렛을 재현 탁한다. 과정을 반복하십시오. </li><li> 철저히 50 MM 트리스 - HCl 버퍼, 산도 8 500 μL에 펠렛을 resuspend. 중요 : 효율적인 세포 용해를 위해 펠렛을 잘 부유시킵니다. 얼음에 resuspension을 보관하십시오. </li><li> 4에서 resuspended 세포를 lyse ° C ultrasonication의 30주기를 수행하여, 각주기는 최대 진폭과 20 kHz의 주파수에서 30 초 구성된,없이 90 초. 참고 :이 방법은 Synechococcus sp.를 효율적으로 용해 할 수 있습니다. PCC 7002. <ol><li> 또는 세포 resuspension을 나사 캡 튜브로 옮기고 제조업체의 지침에 따라 튜브에 지르코늄 산화물 비즈를 추가하십시오. 조직 homogenizer에 튜브를 설정하고 4에서 세포를 해동 ° C의 두주기를 실행하여 각주기는 5의 주파수 설정에서 5 분으로 구성된 각주기. 참고 :이 방법은 효율적으로 Synechocystis sp. PCC 6803 및 Synechococcus sp. PCC 7002. </li></ol></li><li> 6,000 xg 및 4 ° C에서 10 분 동안 용 해물이 담긴 튜브를 원심 분리하십시오. 참고 : 펠렛은 주로 큰 세포 파편으로 구성되어야합니다. 상당한 수의 끊어지지 않은 셀이 있으면 3.4 단계를 반복하십시오. 얼음에 뜨는 것을 유지하십시오. </li><li> 상용 BCA 단백질 분석 키트를 사용하여 단백질 농도를 결정하십시오. 참고 :이 값은 글리코겐 함량을 표준화하는 데 사용할 수 있습니다단백질 함량 기준. </li></ol> 4. 글리코겐 침강 <ol><li> 96 % (V / V) 에탄올과 1.5 ML 스크류 캡 튜브에서 단계 3.5에서 뜨는의 100 μL의 900 μL를 혼합하여 세포 lysate에서 엽록소 a 를 제거합니다. 뚜껑을 닫은 후 표준 실험실 가열 블록을 사용하여 90 ° C에서 10 분간 가열합니다. </li><li> 30 분 동안 얼음에 튜브를 품어. </li><li> 튜브를 20,000 xg 및 4 ° C에서 30 분간 원심 분리하고 조심스럽게 상등액을 제거합니다. 펠렛은 글리코겐을 함유하고있다. 과량의 에탄올을 제거하기 위해 펠렛을 가볍게 건조시킵니다. 중요 : 펠릿의 과도한 건조는 피해야하며, 그렇지 않으면 단계 5.1에서 용해시키기가 어려워진다. </li><li> 선택적 : 엽록소에게 콘텐츠를 결정하기 위해 664 nm에서의 단계 4.3에서 얻어진 상청액의 흡광도를 측정한다. 84.6 L / g / cm 24 의 흡수 계수를 사용하십시오. 참고 :이 값은 normalize에 사용될 수 있습니다.e 글리코겐 함량. </li></ol> 5. 효소 가수 분해 및 글리코겐 결정 <ol><li> 단계 4.3에서 얻은 펠렛을 50 MM 나트륨 아세테이트 (pH 5) 100 μL에서 용해시키고 8 U / mL 아밀로 글루코시다 아제 50 μL와 2 U / mL α- 아밀라아제 50 μL를 첨가한다. 소용돌이를 사용하여 이러한 물질을 잘 혼합하십시오. 참고 : 글리코겐 펠렛이 점성을 띄기 때문에 피펫 팅을 통한 혼합은 권장하지 않습니다. </li><li> 글루코오스 분자로 glycogen의 소화를 가능하게하기 위해 2 시간 가열 블록에 60 ° C에서 혼합물을 품어. </li><li> 샘플을 10,000 xg에서 5 분간 원심 분리하고 상층 액을 새로운 1.5 mL 튜브로 옮긴다. </li></ol> 6. GOD-POD 시약을 사용하여 총 포도당 함량 측정 <ol><li> GOD-POD 시약을 사용하여 단계 5.3에서 얻은 상청액의 포도당 농도를 측정합니다. 단계 5.3의 상층 액 100 μL를 96- 웰 플레이트의 웰에 옮긴다. 부정적인 통제로서,50 mM sodium acetate (pH 5) 100 μL를 사용하십시오. 검량선을 생성하려면 혈당 표준 용액도 측정하십시오. </li><li> 각 샘플에 GOD-POD 시약 150 μL를 넣고 pipetting으로 신속하게 혼합하십시오. </li><li> 플레이트를 25 ° C에서 30 분 동안 정치한다. 플레이트 판독기를 사용하여 510 nm에서 흡광도 값을 기록하십시오. </li><li> 포도당 표준에서 얻은 검량선을 사용하여 포도당의 농도를 계산하십시오. 참고 : 세포 용 해물의 글리코겐 농도는 글루코스 농도 (μg / mL)로 표시됩니다. </li></ol>

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프로토콜 내에서 중요한 단계는 글리코겐 침전 및 재 부유입니다. 에탄올 침전 후 원심 분리 후, 글리코겐은 미세 원심 분리 튜브의 벽에 느슨하게 부착되는 반투명 펠렛을 형성한다. 따라서 상등액을 제거 할 때 pellet을 제거하지 않도록 특별한주의가 필요합니다. 글리코겐 펠렛은 끈적 거리며, 건조되면 가용화가 어려울 수 있습니다. 글리코겐 펠렛의 완전한 가용화는 중요하지 않은데, 이는 불?...

남조류는 광합성 광 고정 CO 2에서 탄소의 주요 탄수화물 저장소로서 글리코겐을 축적. 글리코겐은 α-1,6- 연결 글루코 실 결합에 의해 생성 된 가지를 갖는 선형 α-1,4- 결합 글루칸으로 구성된 글리 칸이다. 시아 노 박테리아에서의 글리코겐 생합성은 포스 포 글루코 튜 타제와 ADP- 글루코스 피로 인산화 효소의 순차적 작용을 통해 글루코오스 -6- 인산을 ADP- 글루코스로 전환시키는 것으로 시작한다. ADP- 포도당의 글루코오스 잔기는 하나 이상의 글리코겐 합성 효소 (GlgA)에 의해 글리코겐의 α-1,4- 글루칸 백본의 비 환원 말단으로 전달된다. 이어서, 분지 효소가 α-1,6- 결합 된 글루코 실 결합을 도입하고, 글리코겐 입자를 생성하도록 추가 확장시킨다. 어둠 속에서 글리코겐은 글리코겐 포스 포 릴라 제, 글리코겐 탈 분기 효소, α- 글루 카노 트랜스퍼 라제 및 말토 덱스트린 포스 포 릴라 제에 의해 인산화 된 글루코오스와 유리 글루코스로 분해됩니다. 이러한 피드 int산화성 오탄당 인산 경로, Embden-Meyerhof-Parnas 경로 (glycolysis), Entner-Doudoroff 경로 1 , 2 , 3 , 4를 포함한 이화 경로. 시아 노 박테리아의 글리코겐 대사는 시아 노 박테리아가 햇빛에 의해 화학 물질과 연료를 생산하는 미생물 세포 공장으로 발전 할 가능성이 있기 때문에 최근 몇 년 동안 관심이 증가하고 있습니다. 글리코겐은이 박테리아에서 가장 큰 유연한 탄소 저장고이기 때문에 글리코겐 대사가 생성물의 수율을 높이기 위해 변형 될 수 있습니다. 예는 cyanobacterium Synechococcus sp. 만니톨을 생산하기 위해 유 전적으로 조작 된 PCC 7002; 글리코겐 합성의 유전 파괴는 만니톨 수율 3 ~ 5 배 증가한다. 또 다른 예는 글리코겐이 함유 된 야생에서 바이오 에탄올을 생산하는 것입니다ype Synechococcus sp. PCC 7002 6 . 야생형 세포 글리코겐 함량은 질소 기아 동안 세포의 건조 중량의 60 %까지 될 수 있습니다 6 . 최근 글리코겐 대사와 조절에 대한 우리의 이해 또한 넓어졌습니다. 글리코겐은 빛에 축적되어 어둠 속에서 대사되는 것으로 알려져 있지만, 딜주기 동안의 글리코겐 대사의 상세한 동역학은 최근 Synechocystis sp.에서 드러났다. PCC 6803 7 . 또한, 글리코겐의 축적에 영향을 미치는 몇 가지 유전자가 확인되었습니다. 주목할만한 예는 추정 히스티딘 키나아제 PmgA와 비 암호화 RNA PmgR1이 조절 캐스케이드를 형성하고 글리코겐의 축적을 제어한다는 발견이다. 흥미롭게도, pmgA 및 pmgR1 결실 돌연변이 체는 Synechocystis sp.의 야생형 균주의 2 배의 글리코겐을 축적한다. PCC 68038 , 9 . 기타 규제 요소는 대체 시그마 인자 E와 전사 인자 CyAbrB2 (10), (11)을 포함하여 글리코겐의 축적에 영향을 미치는 것으로 알려져있다. 글리코겐 조절 및 신진 대사에 대한 관심이 증가함에 따라 글리코겐 함량의 결정을 설명하는 상세한 프로토콜이 보증됩니다. 여러 가지 방법이 문헌에서 사용된다. 산에 의한 가수 분해와 펄스에 의한 암페어 검출기 또는 산과 페놀로 처리 한 분광 측정으로 결합 된 고압 음이온 교환 액체 크로마토 그래피를 통한 모노 사카 라이드 함량 측정은 글리코겐 함량 9 , 10 , 12 , 13 을 근사하는 데 널리 사용되는 방법입니다. 그러나, 고압 음이온 교환 액체 크로마토 그래프c기구는 매우 고가이며 일부 시아 노 박테리아 종에 축적되는 것으로 알려진 수크로오스 14 , 글루코 실 글리세롤 15 및 셀룰로오스 16 , 17 , 18 과 같은 다른 글루코오스 - 함유 글리코 콘쥬 게이트로부터 유도 된 것에서 글리코겐 유래의 글루코 구별하지 않는다. 산 - 페놀 방법은 표준 실험실 장비를 사용하여 수행 할 수 있습니다. 그러나, 그것은 매우 독성 시약을 사용하고 다른 glycoconjugates에서 파생 된 포도당을 구별하지 않으며, 당분자, lipopolysaccharides 및 세포 외 매트릭스 12 같은 세포 물질을 구성하는 다른 monosaccharides에서 포도당을 구분하지 않습니다. 특히, 고온 산 - 페놀 분석은 포도당 함량의 특정 측정보다는 총 탄수화물 함량의 측정에 종종 사용됩니다 12 . 효소 적알파 - 아밀로 글루코시다 아제에 의한 글리코겐의 글루코오스로의 효소 - 결합 분석을 통한 글루코스 검출은 글리코겐으로부터 유도 된 글루코스에 매우 민감하고 특이적인 비색계 판독 값을 생성한다. 에탄올 5 , 8 , 19에 의한 세포 용 해물로부터의 글리코겐의 특이 적 침전으로 특이성을 더욱 향상시킬 수있다. 여기에서 가장 널리 연구 된 시아 노 박테리아 종인 Synechocystis sp.에서 글리코겐 함량의 효소 기반 분석을위한 상세한 프로토콜을 설명합니다. PCC 6803 및 Synechococcus sp. PCC 7002, 야생형 및 돌연변이 균주에서. 효율적인 가수 분해를 보장하기 위해 α- 아밀라아제와 α- 아밀로 글루코시다 아제의 칵테일을 사용합니다 8 . Endo-acting α- 아밀라아제는 다양한 글루칸의 α-1,4- 결합을 덱스트린으로 가수 분해하여 더 가수 분해됩니다엑소 아밀 글루코시다 제 20 을 엑소 - 작용하여 포도당을 생성한다. 이러한 효소의 상승 효과는 잘 알려져 있으며 식물 바이오 매스 21 의 셀룰로오스와 같은 다른 당 결합제에 영향을 미치지 않으면 서 글리코겐과 같은 α 결합 글루칸 인 전분의 선택적 가수 분해에 일상적으로 사용됩니다. 방출 된 포도당은 과산화수소에서 산소의 환원과 포도당의 락톤으로의 산화를 촉진하는 포도당 산화 효소와 과산화수소로부터 핑크색 퀴 노니 민 염료를 생성하는 과산화 효소로 구성된 효소 결합 분석법에 따라 정량적으로 검출됩니다. 페놀 화합물, 4- 아미노 안티피린 22 .

<table><tbody><tr><td>QSonica Sonicators Q700</td><td>Qsonica, LLC</td><td>NA</td><td>QSonica</td></tr><tr><td>SpectraMax 190 Microplate Reader&amp;nbsp;</td><td>Molecular Devices</td><td>NA</td><td>Eliza plate reader</td></tr><tr><td>Bullet Blender Storm</td><td>Next Advance</td><td>BBY24M-CE</td><td>Beads beater</td></tr><tr><td>Ultrospec 3100 pro UV/Visible Spectrophotometer</td><td>Amersham Biosciences</td><td>NA</td><td>Spectrophotometer</td></tr><tr><td>Tris&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>Buffer</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Merck</td><td>1-00317</td><td>pH adjutment</td></tr><tr><td>Sodium acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32319</td><td>Buffer</td></tr><tr><td>Amyloglycosidase (Rhizopus sp.)</td><td>Megazyme</td><td>E-AMGPU</td><td>Enzyme for glycogen depolymerization</td></tr><tr><td>&amp;alpha;-Amylase, thermostable (Bacillus licheniformis)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3176</td><td>Enzyme for glycogen depolymerization</td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Merch</td><td>8337</td><td>Standard for the glucose assay</td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein assay kit&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>23225</td><td>For determination of protein concentrations</td></tr><tr><td>Aluminum drying trays, disposable</td><td>VWR</td><td>611-1362</td><td>For determination of cell dry weights</td></tr><tr><td>D-Glucose assay kit (GODPOD format)</td><td>Megazyme</td><td>K-GLUC</td><td>For determination of glucose concentrations</td></tr><tr><td>Zirconium oxide breads, 0.15 mm</td><td>Next Advance</td><td>ZrOB015</td><td>Beads for cell lysis in a Bullet Blendar Storm</td></tr><tr><td>RINO tubes</td><td>Next Advance</td><td>NA</td><td>Tubes for cell lysis in a Bullet Blendar Storm</td></tr></tbody></table>

determination of the glycogen content in cyanobacteria

시아 노 박테리아는 글리코겐을 광합성 과정에서 주요 세포 내 탄소와 에너지 저장 물질로 축적합니다. 최근의 연구 결과는 생합성 및 이화 과정의 산화 환원 조절, 산화 환원 조절 및 비 암호화 RNA의 관련을 포함한 글리코겐 대사의 복잡한 기전을 강조했다. 동시에, 생산량을 향상시키기 위해 글리코겐의 탄소를 유 전적으로 생산 된 시아 노 박테리아의 바람직한 제품으로 방향을 바꾸려는 노력이 이루어지고 있습니다. 여러 방법이 다양한 정확도와 기술적 복잡성을 지닌 시아 노 박테리아의 글리코겐 함량을 결정하는 데 사용됩니다. 여기, 표준 생명 과학 실험실에서 수행 할 수있는 시아 노 박테리아의 글리코겐 함량을 신뢰할 수있게 결정하기위한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 프로토콜은 세포 lysate에서 글리코겐의 선택적 석출과 글루코스 단량체를 생성하는 글리코겐의 효소 해중합을 포함하며, 이는 글루코스 옥시idase-peroxidase (GOD-POD) 효소 커플 링 분석. 이 방법은 Synechocystis sp. PCC 6803 및 Synechococcus sp. PCC 7002, 신진 대사 공학에서 널리 사용되는 두 개의 모델 시아 노 박테리아 종. 또한,이 방법은 조절 요소 또는 글리코겐 생합성 유전자가 결핍 된 야생형과 돌연변이 체 사이에서 글리코겐 함량의 차이를 성공적으로 나타냈다.

10 mL의 야생형 Synechocystis sp. PCC 6803은 OD 730nm 값이 약 0.8에 도달 할 때까지 광 자기 영양 조건 하에서 성장시켰다. 세포를 수확하고 50 mM Tris-HCl, pH 8에 재현 탁시켰다. OD 730 nm 값을 2-3으로 조정 하였다. 상기 한 프로토콜에 따라 글리코겐 함량을 분석 하였다. OD 730nm 당 글리코겐 함량은 13 ± 1.8 μg / mL / OD 730 nm ( N = 12)이었다. 글리...

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Determination of the Glycogen Content in Cyanobacteria

여기, 시아 노 박테리아 세포에서 글리코겐 함량을 측정하기위한 신뢰할 수 있고 쉬운 분석법을 제시합니다. 이 과정은 침전, 선택 가능한 해중합 및 포도당 잔류 물의 검출을 수반한다. 이 방법은 야생형 및 유 전적으로 변형 된 균주 모두에 적합하며 시아 노 박테리아의 대사 공학을 촉진 할 수 있습니다.

시아 노 박테리아의 글리코겐 함량 측정

Cyanobacteria accumulate glycogen as a major intracellular carbon and energy storage&#160;during photosynthesis. Recent developments in research have ...

determination-of-the-glycogen-content-in-cyanobacteria

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biochemistry

12.9K 조회수.  Carlsberg Research Laboratory.  여기, 시아 노 박테리아 세포에서 글리코겐 함량을 측정하기위한 신뢰할 수 있고 쉬운 분석법을 제시합니다. 이 과정은 침전, 선택 가능한 해중합 및 포도당 잔류 물의 검출을 수반한다. 이 방법은 야생형 및 유 전적으로 변형 된 균주 모두에 적합하며 시아 노 박테리아의 대사 공학을 촉진 할 수 있습니다. 

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Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

This is a simple protocol for the quantitative determination of phycobiliprotein content in the model cyanobacterium Synechocystis. Phycobiliproteins are the most important components of phycobilisomes, the major light-harvesting antennae in cyanobacteria and several algae taxa. The phycobilisomes of Synechocystis contain two phycobiliproteins: phycocyanin and allophycocyanin. This protocol describes a simple, efficient, and reliable method for the quantitative determination of both phycocyanin and allophycocyanin in this model cyanobacterium. We compared several methods of phycobiliprotein extraction and spectrophotometric quantification. The extraction procedure as described in this protocol was also successfully applied to other cyanobacteria strains such as Cyanothece sp., Synechococcuselongatus, Spirulina sp., Arthrospira sp., and Nostoc sp., as well as to red algae Porphyridium cruentum. However, the extinction coefficients of specific phycobiliproteins from various taxa can differ and it is, therefore, recommended to validate the spectrophotometric quantification method for every single strain individually. The protocol requires little time and can be performed in any standard life science laboratory since it requires only standard equipment.

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

Here, we present a protocol to quantitatively determine phycobiliprotein content in the cyanobacterium Synechocystis using a spectrophotometric method. The extraction procedure was also successfully applied to other cyanobacteria and algae strains; however, due to variations in pigment absorption spectra, it is necessary to test the spectrophotometric equations for each strain individually.

Spectrophotometric Cyanobacterium Synechocystis 에서 Phycobiliprotein 콘텐츠 결정

This is a simple protocol for the quantitative determination of phycobiliprotein content in the model cyanobacterium Synechocystis. Phycobiliproteins are ...

연구

생화학

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. Polysaccharides such as glycogen, glycoproteins, and glycolipids stain bright magenta making it easy to enumerate positive and negative cells within the tissue. In muscle cells PAS staining is used to determine the glycogen content in different types of muscle cells, while in blood cell samples PAS staining has been explored as a diagnostic tool for a variety of conditions. Blood contains a proportion of white blood cells that belong to the immune system. The notion that cells of the immune system possess glycogen and use it as an energy source has not been widely explored. Here, we describe an adapted version of the PAS staining protocol that can be applied on peripheral blood mononuclear immune cells from human venous blood. Small cells with PAS-positive granules and larger cells with diffuse PAS staining were observed. Treatment of samples with amylase abrogates these patterns confirming the specificity of the stain. An alternate technique based on enzymatic digestion confirmed the presence and amount of glycogen in the samples. This protocol is useful for hematologists or immunologists studying polysaccharide content in blood-derived lymphocytes.

Periodic acid Schiff staining is a technique that visualizes the polysaccharide content of tissues. This article demonstrates periodic acid Schiff staining protocol adapted for use on peripheral blood mononuclear cells purified from human venous blood. Such samples are enriched for lymphocytes and other white blood cells of the immune system.

요오드 산 쉬프 염색 말초 혈액 단핵 세포에서 글리코겐을 감지

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

면역학 및 감염병학

Spectrophotometric Methods for the Study of Eukaryotic Glycogen Metabolism

Glycogen is synthesized as a storage form of glucose by a wide array of organisms, ranging from bacteria to animals. The molecule comprises linear chains of &#945;1,4-linked glucose residues with branches introduced through the addition of &#945;1,6-linkages. Understanding how the synthesis and degradation of glycogen are regulated and how glycogen attains its characteristic branched structure requires the study of the enzymes of glycogen storage. However, the methods most commonly used to study these enzyme activities typically employ reagents or techniques that are not available to all investigators. Here, we discuss a battery of procedures that are technically simple, cost-effective, and yet still capable of providing valuable insight into the control of glycogen storage. The techniques require access to a spectrophotometer, operating in the range of 330 to 800 nm, and are described assuming that the users will employ disposable, plastic cuvettes. However, the procedures are readily scalable and can be modified for use in a microplate reader, allowing highly parallel analysis.

Techniques to measure the activity of key enzymes of glycogen metabolism are presented, using a simple spectrophotometer operating in the visible range.

Glycogen is synthesized as a storage form of glucose by a wide array of organisms, ranging from bacteria to animals. The molecule comprises linear chains ...

The Extraction of Liver Glycogen Molecules for Glycogen Structure Determination

Liver glycogen is a hyperbranched glucose polymer that is involved in the maintenance of blood sugar levels in animals. The properties of glycogen are influenced by its structure. Hence, a suitable extraction method that isolates representative samples of glycogen is crucial to the study of this macromolecule. Compared to other extraction methods, a method that employs a sucrose density gradient centrifugation step can minimize molecular damage. Based on this method, a recent publication describes how the density of the sucrose solution used during centrifugation was varied (30%, 50%, 72.5%) to find the most suitable concentration to extract glycogen particles of a wide variety of sizes, limiting the loss of smaller particles. A 10 min boiling step was introduced to test its ability to denature glycogen degrading enzymes, thus preserving glycogen. The lowest sucrose concentration (30%) and the addition of the boiling step were shown to extract the most representative samples of glycogen.

An optimal sucrose concentration was determined for the extraction of liver glycogen using sucrose density gradient centrifugation. The addition of a 10 min boiling step to inhibit glycogen-degrading enzymes proved beneficial.

글리코겐 구조 측정을 위한 간 글리코겐 분자 추출

Liver glycogen is a hyperbranched glucose polymer that is involved in the maintenance of blood sugar levels in animals. The properties of glycogen are ...

Quantification of Subcellular Glycogen Distribution in Skeletal Muscle Fibers using Transmission Electron Microscopy

With the use of transmission electron microscopy, high-resolution images of fixed samples containing individual muscle fibers can be obtained. This enables quantifications of ultrastructural aspects such as volume fractions, surface area to volume ratios, morphometry, and physical contact sites of different subcellular structures. In the 1970s, a protocol for enhanced staining of glycogen in cells was developed and paved the way for a string of studies on the subcellular localization of glycogen and glycogen particle size using transmission electron microscopy. While most analyses interpret glycogen as if it is homogeneously distributed within the muscle fibers, providing only a single value (e.g., an average concentration), transmission electron microscopy has revealed that glycogen is stored as discrete glycogen particles located in distinct subcellular compartments. Here, the step-by-step protocol from tissue collection to the quantitative determination of the volume fraction and particle diameter of glycogen in the distinct subcellular compartments of individual skeletal muscle fibers is described. Considerations on how to 1) collect and stain tissue specimens, 2) perform image analyses and data handling, 3) evaluate the precision of estimates, 4) discriminate between muscle fiber types, and 5) methodological pitfalls and limitations are included.

A modified post-fixation procedure increases the contrast of glycogen particles in tissue. This paper provides a step-by-step protocol describing how to handle the tissue, conduct the imaging, and use stereological methods to obtain unbiased and quantitative data on fiber type-specific subcellular glycogen distribution in skeletal muscle.

투과 전자 현미경을 이용한 골격근섬유의 세포하 글리코겐 분포의 정량화

With the use of transmission electron microscopy, high-resolution images of fixed samples containing individual muscle fibers can be obtained. This ...

Determination of Glucan Chain Length Distribution of Glycogen Using the Fluorophore-Assisted Carbohydrate Electrophoresis (FACE) Method

Glycogen particles are branched polysaccharides composed of linear chains of glucosyl units linked by &#945;-1,4 glucoside bonds. The latter are attached to each other by &#945;-1,6 glucoside linkages, referred to as branch points. Among the different forms of carbon storage (i.e., starch, &#946;-glucan), glycogen is probably one of the oldest and most successful storage polysaccharides found across the living world. Glucan chains are organized so that a large amount of glucose can quickly be stored or fueled in a cell when needed. Numerous complementary techniques have been developed over the last decades to solve the fine structure of glycogen particles. This article describes Fluorophore-Assisted Carbohydrate Electrophoresis (FACE). This method quantifies the population of glucan chains that compose a glycogen particle. Also known as chain length distribution (CLD), this parameter mirrors the particle size and the percentage of branching. It is also an essential requirement for the mathematical modeling of glycogen biosynthesis.

Determination of Glucan Chain Length Distribution of Glycogen Using the Fluorophore-Assisted Carbohydrate Electrophoresis FACE Method

In the present protocol, the Fluorophore-Assisted Carbohydrate Electrophoresis (FACE) technique is used to determine the chain length distribution (CLD) and the average chain length (ACL) of glycogen.

형광단 보조 탄수화물 전기영동(FACE) 방법을 이용한 글리코겐의 글루칸 사슬 길이 분포 결정

Glycogen particles are branched polysaccharides composed of linear chains of glucosyl units linked by &#945;-1,4 glucoside bonds. The latter are attached ...

Biochemical Titration of Glycogen In vitro

Glycogen is the main energetic polymer of glucose in vertebrate animals and plays a crucial role in whole body metabolism as well as in cellular metabolism. Many methods to detect glycogen already exist but only a few are quantitative. We describe here a method using the Abcam Glycogen assay kit, which is based on specific degradation of glycogen to glucose by glucoamylase. Glucose is then specifically oxidized to a product that reacts with the OxiRed probe to produce fluorescence. Titration is accurate, sensitive and can be achieved on cell extracts or tissue sections. However, in contrast to other techniques, it does not give information about the distribution of glycogen in the cell. As an example of this technique, we describe here the titration of glycogen in two cell lines, Chinese hamster lung fibroblast CCL39 and human colon carcinoma LS174, incubated in normoxia (21% O2) versus hypoxia (1% O2). We hypothesized that hypoxia is a signal that prepares cells to synthesize and store glycogen in order to survive1.

Biochemical Titration of Glycogen In vitro

We describe here an accurate, reproducible and convenient biochemical method for titration of glycogen in vitro. This technique uses the Abcam Glycogen assay kit and is based on successive hydrolysis of glycogen to glucose and glucose titration by fluorescence.

글리코겐의 생화학 적정<em&gt; 체외</em

Glycogen is the main energetic polymer of glucose in vertebrate animals and plays a crucial role in whole body metabolism as well as in cellular ...

생물학

A Non-Degradative Extraction Method for Molecular Structure Characterization of Bacterial Glycogen Particles

Currently, there exist a variety of glycogen extraction methods, which either damage glycogen spatial structure or only partially extract glycogen, leading to the biased characterization of glycogen fine molecular structure. To understand the dynamic changes of glycogen structures and the versatile functions of glycogen particles in bacteria, it is essential to isolate glycogen with minimal degradation. In this study, a mild glycogen isolation method is demonstrated by using cold-water (CW) precipitation via sugar density gradient ultra-centrifugation (SDGU-CW). The traditional trichloroacetic acid (TCA) method and potassium hydroxide (KOH) method were also performed for comparison. A commonly used lab strain, Escherichia coli BL21(DE3), was used as a model organism in this study for demonstration purposes. After extracting glycogen particles using different methods, their structures were analyzed and compared through size exclusion chromatography (SEC) for particle size distribution and fluorophore-assisted capillary electrophoresis (FACE) for linear chain length distributions. The analysis confirmed that glycogen extracted via SDGU-CW had minimal degradation.

<meta charset="utf8"></head><body>박테리아 글리코겐 입자의 분자 구조 특성화를 위한 비분해성 추출 방법

Bacterial glycogen structure is greatly impacted by extraction methods which may result in molecular degradation and/or biased sampling. It is essential to develop methods to minimize these problems. Here, four extraction methods have been compared using size distribution and chain length distribution as key criteria for minimizing extraction artifacts.

박테리아 글리코겐 입자의 분자 구조 특성화를 위한 비분해성 추출 방법

Currently, there exist a variety of glycogen extraction methods, which either damage glycogen spatial structure or only partially extract glycogen, ...

Isolation and Characterization of Intact Phycobilisome in Cyanobacteria

In cyanobacteria, phycobilisome is a vital antenna protein complex that harvests light and transfers energy to photosystem I and II for photochemistry. Studying the structure and composition of phycobilisome is of great interest to scientists because it reveals the evolution and divergence of photosynthesis in cyanobacteria. This protocol provides a detailed and optimized method to break cyanobacterial cells at low cost by a bead-beater efficiently. The intact phycobilisome can then be isolated from the cell extract by sucrose gradient ultracentrifugation. This method has demonstrated being suitable for both model and non-model cyanobacteria with different cell types. A step-by-step procedure is also provided to confirm the integrity and property of phycobiliproteins by 77K fluorescence spectroscopy and SDS-PAGE stained by zinc sulfate and Coomassie Blue. The isolated phycobilisome can also be subjected to further structural and compositional analyses. Overall, this protocol provides a helpful starting guide that allows researchers unfamiliar with cyanobacteria to quickly isolate and characterize intact phycobilisome.

The current protocol details the isolation of phycobilisomes from cyanobacteria by centrifugation through a discontinuous sucrose density gradient. The fractions of intact phycobilisomes are confirmed by 77K fluorescent emission spectrum and SDS-PAGE analysis. The resulting phycobilisome fractions are suitable for negative staining of TEM and mass spectrometry analysis.

시아노박테리아의 피코빌리좀의 격리 및 특성화

In cyanobacteria, phycobilisome is a vital antenna protein complex that harvests light and transfers energy to photosystem I and II for photochemistry. ...

시아 노 박테리아의 글리코겐 함량 측정

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Spectrophotometric Cyanobacterium Synechocystis 에서 Phycobiliprotein 콘텐츠 결정

요오드 산 쉬프 염색 말초 혈액 단핵 세포에서 글리코겐을 감지

Spectrophotometric Methods for the Study of Eukaryotic Glycogen Metabolism

글리코겐 구조 측정을 위한 간 글리코겐 분자 추출

투과 전자 현미경을 이용한 골격근섬유의 세포하 글리코겐 분포의 정량화

형광단 보조 탄수화물 전기영동(FACE) 방법을 이용한 글리코겐의 글루칸 사슬 길이 분포 결정

글리코겐의 생화학 적정

박테리아 글리코겐 입자의 분자 구조 특성화를 위한 비분해성 추출 방법

박테리아 글리코겐 입자의 분자 구조 특성화를 위한 비분해성 추출 방법

시아노박테리아의 피코빌리좀의 격리 및 특성화