Name: semi-automated biopanning of bacterial display libraries for peptide affinity reagent discovery and analysis of resulting isolates
Uploaded: 2017-12-06T12:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 49 s
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저자는 미국 육군 연구 실험실 (ARL) 박사 화목 프로그램, 박사 저스틴 P. Jahnke의 약속을 통해, ARL와 오크 릿지 연관 된 대학 계약을 통해 관리의 지원을 인정 하 고 싶습니다. 자금 남은 센서와 전자 장치 스파이 ARL에 의해 제공 되었다. 저자 또한 감사 Daugherty 실험실 UCSB에서 세균성 디스플레이 라이브러리와 YPet 모나 시 약, 닥터 브린 아담스 지원에 ARL, 그의 초기 작품에 대 한 박사 조슈아 Kogot에서 YPet 모나 시 복제에 대 한 복제에 대 한 정보를 공유 하 고 싶습니다, 엣지 우드 화학 고 표현 하 고 abrax를 정화 하는 데 사용 하는 플라스 미드를 공유 하기 위한 생물학 센터의 Alena 진정 세균 디스플레이 라이브러리 및 rivax 단백질의 biopanning PA 바인딩 펩 티 드, Qin Guo의 격리에 대 한 기술 지원에 대 한 브랜디 Dorsey에 훈련 abrax 바인딩 펩 티 드의 격리에 대 한 예비 실험과 박사 제시카 테 럴이이 원고에 관한 유용한 토론에 대 한 기술 지원에 대 한.

저자 공개할 게 없다

펩 티 드 인식에 대 한 항 체에 대 한 유용한 대안을 제공 하는 특정 조건이 극한 환경에서 안정성 필요할 때 그리고 Biopanning 세균 디스플레이 라이브러리 선호도 시 약의 고립에 성공적인 접근 되었습니다. 이러한 라이브러리의 Biopanning 간소화 되었습니다 여기에, 설명 하는 autoMCS 메서드를 사용 하 여 그리고 상용 autoMCS 플랫폼 훨씬 넓은 청중에 게이 기술을 확장. 전통적인 번갈아 MCS/FACS에 비해 박테리아에 대 한 정렬 방법 라이브러리 표시, 정렬 및 바인딩된 셀을 분리 수 있는 더 비싼 FACS 악기를에서 투자 필요 하지 않습니다 때문에 autoMCS 방법 보다 적게 비싸다 여기에 사용 되는 교류 cytometer 유형의 보다 분석 14수만입니다. AutoMCS에 의해 성공적인 biopanning에 대 한 중요 한 단계는 분리 프로그램 선택, 부정적인 FACS를 사용 하 여 biopanning, 중지 시기를 결정 하는 라이브러리 농축 모니터링 가양성을 줄이기 위해 잠재적 크로스-반응에 대 한 정렬 및 후보자의 수백의 성가신 검열을 피하기 위해 후보 풀의 스마트 분석.
여기에 설명 된 예제 비록 약간 다른 분석 전략의 각 풀에 대 한 펩 티 드 순서에 차이 두 개의 별도 대상, PA 및 abrax, 선택한 세균성 디스플레이 라이브러리의 성공적인 biopanning 설명 biopanning의 4 라운드 후 후보자입니다. PA 순서 분석 펩 티 드 순서 144 식민지에서 한 번 이상 반복에서 분명 트렌드를 보여주는 더 똑 바른 예 이었다. 이 혼자 합의 포함 하는 충분 한 PA 대상에 대 한 합의 순서를 결정 하 고 그 식민지 또는 유사한 시퀀스 streptavidin 부정적인 컨트롤에 바인딩 대 PA에 바인딩의 비율 면에서 최고의 후보자를 했다. 그러나,이 항상 되지 않습니다 경우. Abrax 대상에 대 한 시퀀싱 100 식민지 5 반복 시퀀스 아니라 이러한 시퀀스에서 동향은 향기로운 아미노산 잔류물 및 aspartic 산 또는 아스파라긴을 포함 하는 경향이 다른 불분명. 반복 시퀀스에서 예측된 "합의"만 수 생산 되었고 abrax, 선호도 대 한 검사를 하지만 그 정확한 일치 시퀀스를 포함 하는 아무 부모 시퀀스, 이후 우리 시퀀스 된 식민지의 목록에 반환 관찰 다른 후보가 서로 공통점이 더 많은 동향 했다. 사실, 두 식민지 반복 혼자, (FWAWF 대신 FWDTWF), 트립토판, 페닐알라닌, aspartic 산 성 잔류물의 하지만 다른 간격으로 동일한 추세를 했다에서 "일치"에 유사한 시퀀스 포함. 이러한 펩 티이 드 중 하나는 반복 시퀀스, 하나 아니었다. 유사한 변종 포함 된 세 번째 시퀀스와 함께 이러한 두 시퀀스 상위 5 바인더 abrax에 대 한 선호도 측면에서 테스트 중 이었다. 전반적인 최고 바인더 도끼-A05도 비슷한 추세를 표시 됩니다. Abrax에 대 한 결과 여러 번 시퀀스 분석 및 친 화력과 특이성 분석 사이의 교체는 접근 때로는 선택한 대상에 따라 필요한 것을 보여 줍니다. Abrax 대상에 대 한 결과 또한 매우 비슷한 단백질 (rivax 1,15)를 통해 얻을 수 있는 특이성의 수준을 보여 줍니다.
우리의 연구에 대 한 선정 autoMCS 프로그램 Posselds 및 Posseld, 낮은 주파수, 초기 인구의 5% 미만으로 레이블이 대상 셀의 긍정적인 선택에 대 한 둘 다 있었다. 두 경우 모두, 세포는 두 개의 자석 열 통과. 그러나 Posselds 프로그램의 경우, 셀 통과 더 느리게 증가 노출 시간 41을 첫 번째 열. 상업적인 autoMCS 장치의 제조 업체에 의해 주어진 프로그램 설명 뿐만 아니라 (참조 자료 테이블) 41이 프로그램은 여러 잠재적인 프로그램의 초기 비교 후 선정 됐다. 각 프로그램의 능력 꺼내 부정적인 제어 셀, 균질 문화에서 가양성 방지 하 고 성공적으로 부정적인 통제 세포는 감소와 함께 아군을 포함 하는 혼합된 문화에서 관심의 대상으로 알려진된 바인더를 분리 알려진된 바인더의 비율 비교 되었다. 여기에 설명 된 응용 프로그램에서 크게 벗어난, 비슷한 비교 새로운 응용 프로그램에 대 한 프로그램 선택에 도움이 될 수 있습니다. 그러나, 이전에 PA는 biopanning의 모든 4 라운드에 대 한 이러한 프로그램 중 하나를 사용 하 여 절연과 비슷한 펩 티 드의 지도 보여에 대 한 펩 티 드 선호도 시 약의 분리 (Posseld 및 Posselds)이 두 프로그램을 비교 하는 결과 게시 선호도 및 PA에 대 한 특이성 WXCFTC 합의의 결정. 주요 차이점은 그 Posseld, 그것의 빠른 흐름 속도, 보다 신속 하 게 정렬 및 바인딩 대상에 대 한 선호도 높았다 따라서 biopanning, 두 라운드 동안 biopanning 의 4 라운드 후 더 많은 독특한 시퀀스를 led Posselds를 사용 하 여 14.이 학습 전략 약간 변경 되었습니다 때 모두 혜택을 통합 abrax 바인딩 펩 티 드에 대 한 biopanning: 1 라운드 어디 다양성은 높은, 하지만 다음이 중요 한 단계 더 많은 노출 시간을 허용 하도록 사용 되었다 Posselds는 프로그램 Posseld 라운드 2-4 1,15중 가장 높은 선호도 바인더의 빠른 격리에 대 한 전환 했다. 이 때문에 특히 nMFI 및 백분율 바인딩 둘다 abrax 라운드 4 프로그램 중 하나를 정렬 하는 PA에 비해 4 라운드를 정렬에 대 한 더 높은 abrax, 이상적 될 것으로 보인다 (그림 2 및 그림 3 과 Sarkes 그 외 여러분 2015 14), 하지만 같은 목표와 함께 다른에 대 한 전략을 사용 하 여 직접 비교는 더 결정적인 비교에 필요한 것입니다. 어떤 프로그램은 특정 응용 프로그램에 대 한 최고의 개별 대상, 사용, 정렬 라이브러리 및 여기에 설명 된 조건에 어떤 변화를 달성 하는 펩 티 드 식의 수준에 달려 있습니다.
설명 하지 여기 abiotic 재료로 biopanning에서 잠재적인 결과입니다 하지만 우리는 또한 대량 알루미늄 2에 대 한 biopanning에 대 한 동일한 세균 디스플레이 라이브러리를 사용. 이 연구는 autoMCS를 사용 하 여 수행 되지 않은 하지만 비슷한 연구 자료에서 사용할 수 또는 수에 코팅 또는에, 마그네틱 비드 활용 된 경우 autoMCS를 사용 하 여 달성 될 수 있었다. 대량 알루미늄 연구에서 개별 아미노산 분석 및 이차 구조 모델링 아무 합의 순서 결정된 2이후 어떤 고립 된 펩 티 드의 바인딩 선호도 운전에 유용 했다. 생물 학적 목표와도이 개별 잔류물 주파수 분석 탭을 포함 하는 스프레드시트 "eCPX_Sequencing" 매크로에서 생성 하는 이유는 일부 대상에 대 한 바인딩 선호도 운전 하는 무슨을 이해 하는 데 필요한 수 있습니다. 그러나 없는 반복 시퀀스는 합의의 부족 뿐만 아니라 볼 수 있습니다 잔류물 주파수 패턴을 표시 하는 경우에,, 다른 유형의 분석 해야 합니다. 또한, 추가 라운드를 정렬 원하는 대상에 충분 한 선호도 다운 선택에 대 한 후보자의 훨씬 더 큰 수를 차단 하지 않도록 필요할 수 있습니다.
다음 세대 시퀀싱의 증가 가용성, 선호도 테스트 하기 전에 가장 유망한 후보자를 결정 하 고 biopanning의 각 라운드 후 농축의 정도 결정 하는 더 철저 한 연구를 수행 수 있습니다. 그러나, 쉽게 수십 또는 수백 개의 식민지의 일상적인 식민지 시퀀싱을 충분히 높은 주파수의 없는 경우 복제를 통해 다시 만들어야 시퀀스 바인딩 분석 단계로 이동 할 수 있습니다. 이 기술 발전, 저렴 하 고 더 일상적인 되 고 특히 식민지 격리에 대 한 옵션, 그것은 것입니다 가능성이 있을 biopanning 데이터를 분석 하는 가장 좋은 방법은. 그것은, 진화 방법 개별 시퀀스 및 전체 라이브러리의 이어질 수 있습니다. 또한, 정렬 라이브러리에서 박테리아 빠른 성장 속도와 게놈 단백질에 대 한 디스플레이 비 펩 티 드 식 없이 자료를 바인딩할 수 overexpress 박테리아 세포 쪽으로 정렬 바이어스 수 시간이 지남에 변경할 수 있습니다. 인스턴스입니다. 그 이유로, 유망한 후보자 등장, 일단 그것은 플라스 미드 DNA를 분리, 신선한 대장균, retransforming FACS 통해 펩 티 드 바인딩을 확인 합니다. 셀 무료 형태로 펩 티 드를 사용 하 여 계획 하는 경우 선호도 무료 펩 티 드에 대 한 평가 또한 한다. 예를 들어 대상 셉에 대 한 세균 디스플레이 통해 발견 된 펩 티 드 선호도 시 약 종합적 제작-셀 및 효소 연결 된 immunosorbant 분석 결과 (ELISA), 및 (FACS)를 통해 셀에 셀 오프 같은 더 전통적인 방법으로 분석 된 (ELISA)을 통해 선호도 두 방법 7에 의해 결정 하는 Kds를 사용 하 여 비교 했다.
Biotin streptavidin 상호 작용의 강도 단백질 대상과 바운드 펩 티 드의 캡처에 대 한 이상적인 전략은, 비록 다른 캡처 전략에 대 한이 절차를 수정할 수 있습니다. 에폭시 및 carboxylic 산 구슬 같은 자석 구슬, 단백질의 직접 결합 성공 했다 하 고 바인딩 단계를 제거 합니다. 그러나, 직접 첨부 파일 첨부 파일 전략에 따라 특정 또는 일반적인 방식으로, 잠재적인 바인딩 사이트를 방해 수 있습니다. 추가 streptavidin 비즈를 사용 하 여 장점은 안정적인 단백질 덜 대상 갓 30 분에 biotinylated 일 수 있다 또는 저장 동안 스스로 구슬 cross-linking에 대 한 단백질으로 더 이상 화를 요구 하는 경향이 있으며, 필요한 경우, 냉동 일반적으로 2-8 ° c.에 저장 Biotinylated 단백질의 제안된 시작 농도 대상 여기, 600 nM, 여러 대상에 대 한 성공 했다 하지만이 농도 감소 하는 경우 증가 선호도와 펩 티 드 캡처 시 약을 수 있습니다. 또한,이 메서드를 확장 하 고 다른 세균성 디스플레이 라이브러리와 다른 유기 체에 대 한 수정 될 수 있습니다. 예를 들어 사용할 anaerobes, 산소의 부재에서 또는 독특한 특성을 가진 펩 티 드를 분리 하는 extremophiles와 함께 사용 하기 위해 다른 환경에서 이러한 단계를 수행할 수 있습니다. 펩 티 드 또는 합의 결정에 대 한 관심의 특정 대상 수 있습니다 잠재적으로 사용 셀에 셀에서 생활 소재, 또는 합성으로 생산. 종합적으로 생산된 펩 티 드를 더 성숙 하 더 높은 선호도 및 센서에서 사용 하기 위해 또는 항 체 바인딩을 사용할 수 일반적으로 다른 응용 프로그램에 대 한 더 강력한 단백질 촉매 캡처 (PCC) 에이전트의 개발에 대 한 수 또는 인식 38,55. 분자 모델링 그림 5C 1에 나열 된 abrax 바인딩 펩 티 드 및 합의 대 한 최근 수행 되었다 목표와 펩 티 드의 위치 바인딩 확인 하는 데 사용할 수 있습니다. 전반적으로, 펩 티 드 선호도 시 약에 대 한 biopanning 세균 디스플레이 라이브러리는 인식에 대 한 항 체의 생산, 단백질 목표의 탐지 및이 반자동된 biopanning, 간단, 신속 하 고 강력한 대안 접근 까지 도달 하는 응용 프로그램을 신뢰할 수 있는 결과 생산 하고있다.

Biopanning은 선호도 시 약 발견을 위한 입증 된 기술, 박테리아와 펩 티 드 선호도 시 약 1,2,3,,45에 대 한 편리한 소스 라이브러리 표시 6,7,,89,10,11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20,,2122,23, 24. 마찬가지로 페이지 표시 25,26 효 모 표시 27,28는 펩 티 드 셀 표면에 노출 되는 biotic 및 abiotic 목표, 이러한 상호 작용을 바인딩할 수 있습니다. 펩 티 드 등뼈와 아미노산 사이드 체인 29의 독특한 특성에 의해 구동. 파지 디스플레이, 달리 박테리아 스스로 자기 복제 되며 바인딩된 페이지의 차입 및 세포의 감염 없이 디스플레이에 필요한 모든 유전 물질을 포함. 효 모 디스플레이, 달리 세균 디스플레이 급속 한 (약 20 분 30) 대장균의 시간을 두 배로 때문에 빠릅니다. 결과 펩 티 드 선호도 시 약을 생산 수 있습니다 감지 플랫폼 16,,1726 의 다양 한에서 사용 하기 위한 셀 오프 있고 사용을 위한 잠재력으로 생활 재료 표시에 셀 2 , 31 , 32. 특정 대상의 인식에 대 한 단일 클론 항 체에 비해 펩 티 드 훨씬 작고 더 유연 하 고, 그리고 펩 티 드 디스플레이 라이브러리 시스테인 33 등 특정 아미노산을 피하려고 DNA 수준에서 쉽게 조작할 수 있습니다 . 펩 티 드 치료제 34,,3536 및 항 체 발견, 재현할 수 합성 (오프-셀의 그들의 용이성으로 인해 활용 될 일반적으로 다른 응용 프로그램에 대 한 악용 하는 점점 더 )의 생산 그리고 우수한 정비 기능 시 약을 제공 하는 높은 온도 또는 냉각 37,38없이 장기 저장에 노출 후에 극한 환경에서 성능. 극한 환경에서 작동 해야 하는 국방부, 예를 들어, 특정 관심의 시 약의 저장을 위해 콜드 체인을 극복 하는 능력이입니다. 열 안정성은 그러므로 선호도 시 약이이 원고에 예제로 주어진 선택한 대상 인식에 대 한 바람직한 기능.
최근, 훨씬 더 간단 하 고 반자동된 마그네틱 활성화 셀 맥 (MCS) 방법 9,,1439정렬 사용 하 여 신뢰할 수 있는 biopanning 세균 디스플레이 라이브러리 되고있다. 이러한 방법 자기 활성화 셀 (autoMACS 또는 autoMCS) 악기 분류 자동 정렬 다른 점으로, 상업적으로 사용할 수를 포함 하 여 플랫폼 여러 유사한를 사용 하 여 생물 학적 대상에 대 한 입증 되어 있다 (표 참조 재료) 1,,1415 와는 일회용 카트리지 7,9 또는 칩 39, 귀중 한 사양에 대 한 샘플을 포함 하는 보다 전문적인된 장치 사용 유기 체 또는 Biosafety 수준 2 (BSL-2) 또는 더 높은7독 소. 이러한 반 자동화 방법 경우는 자료 자석 또는 코팅 자성 구슬에 고 (와 같은 혐 기성 박테리아) 다른 유기 체와 함께 사용할 경우 능력 abiotic 재료에 바인딩할 수 펩 티 드에 대 한 정렬 확장 될 수 있는 정렬 그리고 성장 조건이 변경 될 수 있습니다. 세균성 디스플레이 라이브러리 정렬, 뿐만 아니라 여기 사용 상업 autoMCS 악기도 사용 하 고 일부 효 모, 더 절연 뒤의 화면에 표시 된 인간 단일 체인 항 체 파편의 발견의 초기 단계에 대 한 사용 하는 형광 활성화 된 세포 분류 (FACS) 40. 반 자동화에 주요 이점은 정렬 시간 및 노력, 그리고 더 강력 하 고 재현할 수 제거 자석 구슬에서 언바운드 셀의 세척 단계, 감소 가양성을 선도, 더 적은 필요한 정렬 라운드, 갈수록 감소 복잡 한 다운 스트림 분석 9,14. 상업적인 autoMCS 악기의 경우는 여러 사전 로드 된 프로그램을 다른 응용 프로그램, 음수 전 (고갈), 정렬 등 순수성을 우선 순위, 최종 샘플 볼륨을 최소화 하 고 증가 적합 있을 수 있습니다 또는 드문 셀 41의 격리에 대 한 감도 감소.
이 작품의 초점은 상용 autoMCS 악기를 사용 하 여 세균성 디스플레이 라이브러리 biopanning에 대 한 방법론을 설명 하 고 분석 하 고 후보자의 결과 수영장을 최소화 적용 생각 과정을 상세히 설명 다른 응용 프로그램에 대 한 확장을 용이 하 게 하는 순서입니다. 여기에 사용 하는 디스플레이 라이브러리 (재료의 표 참조) 12,13 포함 약 109-1011 독특한 15-메 르 펩 티 드 세균 외부 막 단백질 OmpX의 수정된 된 버전을 통해 전시에 종합적으로 생산 하는 경우 솔루션에서 무료 펩 티 드의 대표 될 것으로 예상 된다 세포 표면에 무제한 자연. 이 단백질 비 계에는 C-YPet 모나에 바인딩을 통해 식 모니터링에 대 한 긍정적인 제어 P2X 펩 티 드를 또한 포함 되어 있습니다. 그러나, 적당 한 다양성 및 원하는 특정 응용 프로그램에 필요한 다른 특성 구입 또는 새로운 라이브러리를 함께 작동 합니다 마찬가지로 biopanning 절차, 비록 몇 가지 사소한 변경 내용이 필요할 수 있습니다. 이 biopanning 프로토콜의 회로도 그림 1에서 그림입니다. 또한, 프로토콜에 적응 시킬 수 있는 다른 자동화 된 자기 정렬 플랫폼 및 다른 정렬 전략. 벤치탑 자석으로 수동 자기 정렬 성공적으로 입증 되었습니다, 더 복잡 하 고 시간이 걸리는 다운스트림 분석으로 인해 필요한 증가 가양성 14, 이기는 하지만 고 그럼에도 불구 하 고 다른 옵션을 제공 합니다 autoMCS 단계 없는 자동화 된 마그네틱 셀 장치를 정렬 하는 경우 이용하실 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>autoMACS Pro Separator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-545</td><td>Automated cell separator for use with magnetic beads</td></tr><tr><td>Luria Broth, Miller (LB)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1426-500</td><td>Growth medium</td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP904-100</td><td>Antibiotic</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2641-500</td><td>Thickening/geling agent</td></tr><tr><td>eCPX 3.0 Bacterial Display Peptide Library</td><td>Cytomx Therapeutics</td><td>N/A; http://cytomx.com/contact/</td><td>On-cell peptide display library. Provided by collaborators at USCB.</td></tr><tr><td>L-arabinose</td><td>Sigma</td><td>A3256-500G</td><td>Sugar, for induction of protein expression</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline pH 7.4 (PBS)</td><td>Amresco</td><td>0780-10L</td><td>Buffer</td></tr><tr><td>EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin, No-Weigh</td><td>Thermo Scientific</td><td>PI21327</td><td>Adds biotin molecule to primary amines</td></tr><tr><td>Pierce Biotin Quantitation Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>PI28005</td><td>Ensures biotin molecule is covalently bound to protein</td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Strepavidin T1 Beads</td><td>Invitrogen</td><td>65601</td><td>Magnetic beads for capture of biotin-congugated proteins</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A9647-100G</td><td>Protein, used as blocking agent for non-specific binding</td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>Sigma</td><td>G8270-1KG</td><td>Sugar, for growth and impeding inducible protein expression</td></tr><tr><td>Ypet Mona</td><td>UCSB and ARL</td><td>N/A</td><td>Positive control for monitoring expression of eCPX 3.0. Produced by authors and collaborators; see references 12 and 13.</td></tr><tr><td>Dylight 488 NHS Ester</td><td>Thermo Scientific</td><td>46403</td><td>For conjugating protein target to fluorophore</td></tr><tr><td>Streptavidin, R-Phycoerythrin conjugate (SAPE)</td><td>Thermo Scientific</td><td>S866</td><td>Negative control for monitoring non-specific binding to streptavidin</td></tr><tr><td>BD FACSFlow</td><td>Becton, Dickinson, and Company</td><td>342003</td><td>Buffer for running FACS instrument</td></tr><tr><td>autoMACS Columns</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-021-101</td><td>For MACS Separation</td></tr><tr><td>autoMACS Running Buffer &amp;ndash; MACS Separation Buffer</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-091-221</td><td>For autoMACS instrument maintenance. Hazard: contains 0.09% azide.</td></tr><tr><td>autoMACS Pro Washing Solution</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-092-987</td><td>For autoMACS instrument maintenance</td></tr><tr><td>70% Ethanol</td><td>VWR</td><td>E505-4L</td><td>Decontamination of autoMACS</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>G6279-1L</td><td>For bacterial freezer stocks</td></tr><tr><td>Chill 15 rack</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-952</td><td>For MACS Separation</td></tr><tr><td>BD FACSCanto II</td><td>Becton, Dickinson, and Company</td><td>744810; http://www.bdbiosciences.com/us/instruments/research/cell-analyzers/bd-facscanto-ii/m/744810/overview</td><td>For assessment of peptide binding to target</td></tr><tr><td>BD FACSDiva Software</td><td>Becton, Dickinson, and Company</td><td>659523</td><td>For assessment of peptide binding to target</td></tr><tr><td>Dynabeads MPC-S magnetic particle concentrator</td><td>Thermo Scientific</td><td>A13346</td><td>Bench top cell separator for use with magnetic beads</td></tr><tr><td>Colony Sequencing</td><td>Genewiz</td><td>N/A; https://www.genewiz.com/</td><td>DNA and Colony Sequencing Services</td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td>323021400; https://www.microsoftstore.com/store/msusa/en_US/pdp/Excel-2016/productID.323021400</td><td>For use with sequence analysis macro</td></tr><tr><td>Anthrax Protective Antigen (PA)</td><td>List Biological Laboratories, Inc.</td><td>171</td><td>Target protein used as example for representative results.</td></tr><tr><td>Abrax</td><td>ECBC and ARL</td><td>N/A</td><td>Target protein used as example for representative results. Produced by authors and collaborators; see references 1 and 15.</td></tr><tr><td>Rivax</td><td>ECBC and ARL</td><td>N/A</td><td>Target protein used as example for representative results. Produced by authors and collaborators; see references 1 and 15.</td></tr></tbody></table>

semi-automated biopanning of bacterial display libraries for peptide affinity reagent discovery and analysis of resulting isolates

Biopanning 세균 디스플레이 라이브러리는 biotic 및 abiotic 목표의 인식에 대 한 펩 티 드 선호도 시 약 발견을 위한 입증 된 기술입니다. 펩 티 드 선호도 시 약 등 감지 치료제, 항 체와 비슷한 응용 프로그램에 사용할 수 있습니다 하지만 더 강력 하 고 더 극단적인 환경에서 수행할 수 있습니다. 관심의 대상 단백질에 펩 티 드 캡처 에이전트의 특정 농축 바인딩 개선 단계를 세척 하 고 따라서 거짓 긍정적인 바인더의 발생을 감소 반자동된 정렬 방법을 사용 하 여 향상 된입니다. 반자동된 정렬 방법은 상용 자동된 활성화 자기 셀 임의의 15-메 르 펩 티 드를 표현 하는 라이브러리를 정렬 무제한 세균성 디스플레이 장치를 정렬 여기 사용에 대 한 설명 이다. 약간의 수정이 메서드는 다른 연장 자동 장치, 다른 정렬 라이브러리 및 다른 유기 체. 이 작품의 주요 목표는 포괄적인 방법론을 제공 하 여 분석 하 고 후보자의 결과 수영장을 최소화 적용 생각 과정을 상세히 설명입니다. 이 기술을 형광 활성화 된 세포 (FACS), 정렬를 사용 하 여 정렬 하는 동안 및 개별 후보자, 비교에 친 화력과 특이성을 평가 하는 셀에 바인딩 분석 등 펩 티 드의 분석 시퀀스 동향을 파악 하 고 이해 하 고 잠재적으로 선호도 관심의 대상에 대 한 특이성을 개선 합의 시퀀스.

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Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

Biopanning 세균 디스플레이 라이브러리는 항 체에 대 한 강력한 대안 펩 티 드 선호도 시 약의 발견에 대 한 검증 된 기술입니다. 여기에 반자동된 정렬 방법 biopanning 잘못 된 반응의 발생을 감소 간소화 했다. 여기 우리가 생각 과정 및 후보자를 평가 하 고 최소화 다운스트림 분석에 적용 되는 기술을 설명 합니다.

펩 티 드 선호도 시 약 검색 및 분석 결과 분리의 세균성 디스플레이 라이브러리의 반자동된 Biopanning

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

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Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the excitability of neurons. The subcellular distribution of these channels in pyramidal neurons of hippocampal area CA1 is regulated by tetratricopeptide repeat-containing Rab8b interacting protein (TRIP8b), an auxiliary subunit. Genetic knockout of HCN pore forming subunits or TRIP8b, both lead to an increase in antidepressant-like behavior, suggesting that limiting the function of HCN channels may be useful as a treatment for Major Depressive Disorder (MDD). Despite significant therapeutic interest, HCN channels are also expressed in the heart, where they regulate rhythmicity. To circumvent off-target issues associated with blocking cardiac HCN channels, our lab has recently proposed targeting the protein-protein interaction between HCN and TRIP8b in order to specifically disrupt HCN channel function in the brain. TRIP8b binds to HCN pore forming subunits at two distinct interaction sites, although here the focus is on the interaction between the tetratricopeptide repeat (TPR) domains of TRIP8b and the C terminal tail of HCN1. In this protocol, an expanded description of a method for purifying TRIP8b and executing a high throughput screen to identify small molecule inhibitors of the interaction between HCN and TRIP8b, is described. The method for high throughput screening utilizes a Fluorescence Polarization (FP) -based assay to monitor the binding of a large TRIP8b fragment to a fluorophore-tagged eleven amino acid peptide corresponding to the HCN1 C terminal tail. This method allows &#39;hit&#39; compounds to be identified based on the change in the polarization of emitted light. Validation assays are then performed to ensure that &#39;hit&#39; compounds are not artifactual.

The interaction between HCN channels and their auxiliary subunit has been identified as a therapeutic target in Major Depressive Disorder. Here, a fluorescence polarization-based method for identifying small molecule inhibitors of this protein-protein interaction, is presented.

방법 및 HCN1 TRIP8b 간의 단백질 - 단백질 상호 작용의 작은 분자 억제제 식별

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

연구

생화학

Bacterial Inner-membrane Display for Screening a Library of Antibody Fragments

Antibodies engineered for intracellular function must not only have affinity for their target antigen, but must also be soluble and correctly folded in the cytoplasm. Commonly used methods for the display and screening of recombinant antibody libraries do not incorporate intracellular protein folding quality control, and, thus, the antigen-binding capability and cytoplasmic folding and solubility of antibodies engineered using these methods often must be engineered separately. Here, we describe a protocol to screen a recombinant library of single-chain variable fragment (scFv) antibodies for antigen-binding and proper cytoplasmic folding simultaneously. The method harnesses the intrinsic intracellular folding quality control mechanism of the Escherichia coli twin-arginine translocation (Tat) pathway to display an scFv library on the E. coli inner membrane. The Tat pathway ensures that only soluble, well-folded proteins are transported out of the cytoplasm and displayed on the inner membrane, thereby eliminating poorly folded scFvs prior to interrogation for antigen-binding. Following removal of the outer membrane, the scFvs displayed on the inner membrane are panned against a target antigen immobilized on magnetic beads to isolate scFvs that bind to the target antigen. An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)-based secondary screen is used to identify the most promising scFvs for additional characterization. Antigen-binding and cytoplasmic solubility can be improved with subsequent rounds of mutagenesis and screening to engineer antibodies with high affinity and high cytoplasmic solubility for intracellular applications.

We provide a method to simultaneously screen a library of antibody fragments for binding affinity and cytoplasmic solubility by using the Escherichia coli twin-arginine translocation pathway, which has an inherent quality control mechanism for intracellular protein folding, to display the antibody fragments on the inner membrane.

항체 단편의 라이브러리를 스크리닝에 대한 세균 내부 멤브레인 디스플레이

Antibodies engineered for intracellular function must not only have affinity for their target antigen, but must also be soluble and correctly folded in ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling cascades during homeostasis and disease, and as such represent prime therapeutic targets. Despite their relevance, these interaction networks remain significantly underrepresented in current databases; therefore, most extracellular proteins have no documented binding partner. This discrepancy is primarily due to the challenges associated with the study of the extracellular proteins, including expression of functional proteins, and the weak, low affinity, protein interactions often established between cell surface receptors. The purpose of this method is to describe the printing of a library of extracellular proteins in a microarray format for screening of protein-protein interactions. To enable detection of weak interactions, a method based on multimerization of the query protein under study is described. Coupled to this microbead-based multimerization approach for increased multivalency, the protein microarray allows robust detection of transient protein-protein interactions in high throughput. This method offers a rapid and low sample consuming-approach for identification of new interactions applicable to any extracellular protein. Protein microarray printing and screening protocol are described. This technology will be useful for investigators seeking a robust method for discovery of protein interactions in the extracellular space.

Here, we present a protocol to screen extracellular protein microarrays for identification of novel receptor-ligand interactions in high throughput. We also describe a method to enhance detection of transient protein-protein interactions by using protein-microbead complexes.

세포 외 단백질 Microarray 기술은 낮은 친 화력 수용 체 Ligand 상호 작용의 높은 처리량 검색

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

Protein dimerization events that occur only in the presence of a small-molecule ligand enable the development of small-molecule biosensors for the dissection and manipulation of biological pathways. Currently, only a limited number of chemically induced dimerization (CID) systems exist and engineering new ones with desired sensitivity and selectivity for specific small-molecule ligands remains a challenge in the field of protein engineering. We here describe a high throughput screening method, combinatorial binders-enabled selection of CID (COMBINES-CID), for the de novo engineering of CID systems applicable to a large variety of ligands. This method uses the two-step selection of a phage-displayed combinatorial nanobody library to obtain 1) &#34;anchor binders&#34; that first bind to a ligand of interest and then 2) &#34;dimerization binders&#34; that only bind to anchor binder-ligand complexes. To select anchor binders, a combinatorial library of over 109 complementarity-determining region (CDR)-randomized nanobodies is screened with a biotinylated ligand and hits are validated with the unlabeled ligand by bio-layer interferometry (BLI). To obtain dimerization binders, the nanobody library is screened with anchor binder-ligand complexes as targets for positive screening and the unbound anchor binders for negative screening. COMBINES-CID is broadly applicable to select CID binders with other immunoglobulin, non-immunoglobulin, or computationally designed scaffolds to create biosensors for in vitro and in vivo detection of drugs, metabolites, signaling molecules, etc.

Creating chemically induced protein dimerization systems with desired affinity and specificity for any given small molecule ligand would have many biological sensing and actuation applications. Here, we describe an efficient, generalizable method for de novo engineering of chemically induced dimerization systems via the stepwise selection of a phage-displayed combinatorial single-domain antibody library.

결합 단일 도메인 항체 라이브러리의 단계별 파지 선택에 의해 고도로 특이적 화학적으로 유도된 단백질 이분화 시스템 생성

Protein dimerization events that occur only in the presence of a small-molecule ligand enable the development of small-molecule biosensors for the ...

Scalable High Throughput Selection From  Phage-displayed Synthetic Antibody Libraries

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. However, it is apparent that traditional monoclonal technologies are not alone up to this task. This has led to the development of alternate methods to satisfy the demand for high quality and renewable affinity reagents to all accessible elements of the proteome. Toward this end, high throughput methods for conducting selections from phage-displayed synthetic antibody libraries have been devised for applications involving diverse antigens and optimized for rapid throughput and success. Herein, a protocol is described in detail that illustrates with video demonstration the parallel selection of Fab-phage clones from high diversity libraries against hundreds of targets using either a manual 96 channel liquid handler or automated robotics system. Using this protocol, a single user can generate hundreds of antigens, select antibodies to them in parallel and validate antibody binding within 6-8 weeks. Highlighted are: i) a viable antigen format, ii) pre-selection antigen characterization, iii) critical steps that influence the selection of specific and high affinity clones, and iv) ways of monitoring selection effectiveness and early stage antibody clone characterization. With this approach, we have obtained synthetic antibody fragments (Fabs) to many target classes including single-pass membrane receptors, secreted protein hormones, and multi-domain intracellular proteins. These fragments are readily converted to full-length antibodies and have been validated to exhibit high affinity and specificity. Further, they have been demonstrated to be functional in a variety of standard immunoassays including Western blotting, ELISA, cellular immunofluorescence, immunoprecipitation and related assays. This methodology will accelerate antibody discovery and ultimately bring us closer to realizing the goal of generating renewable, high quality antibodies to the proteome.

A method is described with visual accompaniment for conducting scalable, high throughput selections from phage-displayed combinatorial synthetic antibody libraries against hundreds of antigens simultaneously. Using this parallel approach, we have isolated antibody fragments that exhibit high affinity and specificity for diverse antigens that are functional in standard immunoassays.

파지 - 표시 합성 항체 라이브러리의 확장 성 높은 처리량 선택

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. ...

면역학 및 감염병학

Biosensor-based High Throughput Biopanning and Bioinformatics Analysis Strategy for the Global Validation of Drug-protein Interactions

Receptors and enzyme proteins are important biomolecules that act as binding targets for bioactive small molecules. Thus, the rapid and global validation of the drug-protein interactions is highly desirable for not only understanding the molecular mechanisms underlying therapeutic efficacy but also for assessing drug characteristics, such as adsorption, distribution, metabolism, excretion, and toxicity (ADMET) for clinical use. Here, we present a biosensor-based high throughput strategy for the biopanning of T7 phage-displayed short peptides that can be easily displayed on the phage capsid. Subsequent analysis of the amino acid sequences of peptides containing short segments, as &#34;broken relics&#34;, of the drug-binding sites using bioinformatics programs in receptor ligand contact (RELIC) suite, is also shown. By applying this method to two clinically approved drugs, an anti-tumor irinotecan, and an anti-flu oseltamivir, the detailed process for collecting the drug-recognizing peptide sequences and highlighting the drug-binding sites of the target proteins are explained in this paper. The strategy described herein can be applied for any small molecules of interest.

This study aimed to present a strategy for identifying drug-peptide interactions. The strategy involves the biopanning of drug-recognizing short peptides based on a quartz-crystal microbalance (QCM) biosensor, followed by bioinformatics analysis for quantitatively assessing the information obtained for the drug recognition and annotation of the drug-binding sites on proteins.

약물 단백질 상호 작용의 글로벌 검증을 위한 바이오센서 기반 고처리량 바이오패닝 및 생물정보학 분석 전략

Receptors and enzyme proteins are important biomolecules that act as binding targets for bioactive small molecules. Thus, the rapid and global validation ...

생체공학

Bacterial Peptide Display for the Selection of Novel Biotinylating Enzymes

Biotin is an attractive post-translational modification of proteins that provides a powerful tag for the isolation and detection of protein. Enzymatic biotinylation by the E. coli biotin-protein ligase BirA is highly specific and allows for the biotinylation of target proteins in their native environment; however, the current usage of BirA mediated biotinylation requires the presence of a synthetic acceptor peptide (AP) in the target protein. Therefore, its application is limited to proteins that have been engineered to contain the AP. The purpose of the present protocol is to use the bacterial display of a peptide derived from an unmodified target protein to select for BirA variants that biotinylates the peptide. The system is based on a single plasmid that allows for the co-expression of BirA variants along with a scaffold for the peptide display on the bacterial surface. The protocol describes a detailed procedure for the incorporation of the target peptide into the display scaffold, creation of the BirA library, selection of active BirA variants and initial characterization of the isolated BirA variants. The method provides a highly effective selection system for the isolation of novel BirA variants that can be used for the further directed evolution of biotin-protein ligases that biotinylate a native protein in complex solutions.

Here we present a method to select for novel variants of the E. coli biotin-protein ligase BirA that biotinylates a specific target peptide. The protocol describes the construction of a plasmid for the bacterial display of the target peptide, generation of a BirA library, selection and characterization of BirA variants.

새로운 생물항제 효소 선택을 위한 박테리아 펩타이드 디스플레이

Biotin is an attractive post-translational modification of proteins that provides a powerful tag for the isolation and detection of protein. Enzymatic ...

A Protocol for Phage Display and Affinity Selection Using Recombinant Protein Baits

Using recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules is an efficient means to discover interactions. The technique has largely been used to discover protein-protein interactions but the bait molecule to be challenged need not be restricted to proteins. The protocol presented here has been optimized to allow a modest number of baits to be screened in replicates to maximize the identification of independent clones presenting the same protein. This permits greater confidence that interacting proteins identified are legitimate interactors of the bait molecule. Monitoring the phage titer after each affinity selection round provides information on how the affinity selection is progressing as well as on the efficacy of negative controls. One means of titering the phage, and how and what to prepare in advance to allow this process to progress as efficiently as possible, is presented. Attributes of amplicons retrieved following isolation of independent plaque are highlighted that can be used to ascertain how well the affinity selection has progressed. Trouble shooting techniques to minimize false positives or to bypass persistently recovered phage are explained. Means of reducing viral contamination flare up are discussed.

Phage display is a powerful technique to capture proteins or protein moieties that interact with an immobilized molecule of interest. Once a decision of the type of phage cDNA library to create and screen has been made, the protocol described here permits efficient affinity selection leading to identification of interactors.

재조합 단백질의 미끼를 사용 파지 디스플레이와 궁합 선택을위한 프로토콜

Using  recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by  a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules ...

생물학

A Peptide Microarray Technology for Specificity Profiling of Antibodies

Source: Cornett, E. M., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/55912">Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays.</a> J. Vis. Exp. (2017).
This video demonstrates a technique that applies peptide microarray technology to profile the specificity of antibodies recognizing post-translational modifications (PTMs) on histone peptides. A microarray slide containing immobilized fluorophore-conjugated histone peptides with known PTM combinations is treated with target PTM-specific antibodies. This process helps identify the antibody&#39;s specificity for the target and its potential cross-reactivity with non-target PTMs.

항체의 특이성 프로파일링을 위한 펩타이드 마이크로어레이 기술

1. Designing the Array Slide and Source Plate Layout

	Under the &#39;Plan a slide layout&#39; heading on the ArrayNinja interface, click on the link that ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

Antibody-Based Technologies

Characterization and Functional Analysis

Quartz-Crystal Microbalance Biosensor-Based Biopanning to Study Protein-Drug Interactions

Source: Takakusagi, Y. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/61873">Biosensor-based High Throughput Biopanning and Bioinformatics Analysis Strategy for the Global Validation of Drug-protein Interactions.</a> J. Vis. Exp. (2020)
This video demonstrates a method to study protein-drug interactions using QCM biosensor-based biopanning of the T7 phage-displayed peptide library. The biopanning of phages displaying a specific peptide on the QCM biosensor allows specific isolation of high-affinity peptides, followed by amino acid sequencing, which helps to identify specific interaction sites on the target protein.