Name: chromatin immunoprecipitation (chip) in mouse t-cell lines
Uploaded: 2017-06-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
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탁월한 기술 지원에 대해 P. Käse와 T. Schmidt-Wöll에게 감사드립니다. 이 연구는 DFG (독일 연구 재단)의 공동 연구 보조금 TRR81 및 Heisenberg 프로그램 (BO 1639 / 5-1), Freiburg의 Max Planck Society 및 EXC 294, Cardio Pulmonary System의 우수 클러스터 (ECCPS) - Giessen에서 TB까지

참고 :이 프로토콜에 사용 된 모든 버퍼와 매체는 표 1 에 나열되어 있습니다. 1 일과 2 일 1. 셀과 가교 결합하기 <ol><li> 6 잘 접시에서 50 ML 튜브와 4 분 5 분 동안 원심 분리기에서 마우스 T - 세포를 전송 ° C와 ~ 271 X G. IMDM 세포 배양 배지 30 ML에 세포 펠렛을 Resuspend하고 Neubauer 챔버를 사용하여 셀을 계산합니다. </li><li> 새로운 50 mL 튜브에 20 x 10 6 세포의 분취 량을 수집하십시오. </li><li> 포름 알데히드 (FMA)를 세포 배양 배지에 1 % 최종 농도로 첨가하고 10 분 동안 실온에서 배양하십시오. 주의 : 흡입하면 FMA가 유독하므로 흄 후드 아래에서 작업하고 적절한 보호 장비를 착용하십시오. 또한 호스트 기관의 규정에 따라 FMA 폐기물을 처리하십시오. </li><li> 1/8 볼륨의 1M 글리신 (pH 7.0)을 넣고 실온에서 5 분간 품어 둔다. </li><li> 5 일 동안 원심 분리하여 세포를 펠렛 화4 ° C 및 ~ 271 xg에서 10 분간 인산 완충 식염수 (PBS) 10 mL로 세척한다. </li><li> PBS 1 ML 및 1.5 ML 튜브로 전송 세포 펠렛을 씻으십시오. </li></ol> 2. 세포 용해 및 크로 마틴 절단 <ol><li> SDS 용해 버퍼 1 ML에 세포 펠렛을 Resuspend하고 10 분 동안 얼음에 품어. </li><li> 각 샘플을 초음파 처리 튜브로 옮기고 표 2 에 표시된 설정에 따라 집중된 초음파기를 사용하여 전단을 수행하십시오 . </li><li> 전단 후, 샘플을 1.5 mL 튜브에 옮기고 4 ℃에서 10 분간 원심 분리하고 ~ 18,000 x g. </li><li> 상층 액을 새 튜브로 옮긴다. </li><li> 50 μL를 수집하여 3 단계에 따라 전단 효율을 결정하고 전단 된 용해 액을 액체 질소로 스냅 프리즈하십시오. lysate를 -80 ° C에서 단일 사용 분취 량으로 보관하십시오. </li></ol> 3. 전단 효율의 결정 <ol><li> 50 &amp; amp;각각의 전단 된 용 해물을 181 ㎕ 씩 넣고 흔들어 주면서 밤새 65 ℃에서 배양한다. </li><li> TE 완충액 100 μL와 10 MG / ML RNase A (0.2 μg / μL 최종 농도) 4 μL를 추가합니다. 37 ° C에서 2 시간 동안 혼합하고 품어, 흔들어 섞으십시오. </li><li> 2 μL의 20 mg / mL proteinase K (0.2 μg / μL 최종 농도)를 각 시료에 첨가하고 55 ° C에서 2 시간 동안 배양하고 흔들어 섞으십시오. </li><li> 각 샘플을 페놀 / 클로로포름 / 이소 아밀 알코올 추출에 적합한 겔 튜브로 옮긴다. 제조업체의 지침에 따라 취급하십시오. </li><li> 페놀 / 클로로포름 / 이소 아밀 알코올 (25 : 24 : 1) 200 μL를 넣고 튜브를 흔든다. 24 ° C 및 ~ 16,000 XG에서 5 분간 원심 분리하고 상층을 새로운 튜브로 옮긴다. 주의 : 페놀, 클로로포름, 이소 아밀 알코올은 흡입하면 부식성이있다. 흄 후드에서 작업하고 적절한 개인 보호 장비를 착용하십시오. 또한 페놀, 클로로포름 및 이소 아밀 알코올 폐기물 처리주관 기관의 규칙에 따라 <ol><li> 한 번 반복하십시오. </li></ol></li><li> 다음의 수정 사항과 함께 제조사의 지시에 따라 정제 컬럼을 사용하여 DNA를 정제하십시오 : <ol><li> 멤브레인을 두 번 씻으십시오. 마지막 세척 후 튜브를 실온에서 2 분 동안 열어두고 잔여 에탄올을 증발시킵니다. </li><li> 용출을 위해, 50 μL의 H 2 O를 첨가하고, 실온에서 1 분 동안 인큐베이션하고, 막을 적절하게 적시는데 1 초 동안 스핀시키고, 실온에서 1 분 동안 인큐베이션하여, 1 분 동안 원심 분리하여 DNA를 용출시킨다 24 ° C ~ 17,900 X g. </li></ol></li><li> 제조 업체의 지침에 따라 고감도 키트를 사용하여 형광 분석기에서 정제 DNA를 정량하십시오. </li><li> 1.8 % 아가 로스 겔에서 약 500 ng의 정제 된 DNA를 분석하고 고감도 키트를 사용하는 전기 영동 시스템에서 약 1 ng을 분석합니다. 참고 : 예상 크기e는 200 내지 500 bp이다. </li></ol> 3, 4 일째 4. 면역 침전 <ol><li> 5 부피의 희석 완충액으로 전단 된 용 해물 1 부피를 희석한다. </li><li> 30μL / ML 단백질 A 아가로 오스 비즈 ( 부록 A에 따라 준비)와 미리 차가운 방에서 회전하면서 30 분. </li><li> ~ 750 x g에서 5 분간 4 ℃에서 원심 분리하십시오. </li><li> 투입물의 10 %를 모으고 4 ° C에 보관하십시오. </li><li> 원하는 분량의 용 해물을 새로운 튜브에 분주하십시오 (자세한 내용은 표 3 참조). 각 튜브에 원하는 항체를 추가하고 (자세한 내용은 표 3 참조) 4 ° C에서 밤새 회전하십시오. </li><li> 회전하는 동안 단백질 A 비즈 40 μL를 추가하고 4 ° C에서 1 시간 동안 품어 둡니다. </li><li> 낮은 소금 버퍼, 높은 소금 버퍼, LiCl 버퍼 및 TE 버퍼 (각 씻어에 대한 4 분 ° C.에 5 분 품어 회전 및 원심 분리기 1 ML의 구슬을 씻으십시오4 ℃에서 3 분, ~ 950 xg). 자세한 내용은 표 3 을 참조하십시오. </li><li> 용리 버퍼 110 μL를 추가하고 매 2 분 vortexing 실온에서 15 분 품어. </li><li> 4 ° C에서 3 분 동안 원심 분리기와 ~ 950 XG 및 새로운 1.5 ML 튜브에 뜨는의 100 μL를 전송합니다. </li><li> 용리 완충액 100 μL로 4.7-4.8 단계를 반복하고 용리액을 합치십시오. 샘플을 입력하기 위해 최대 200 μL의 용리 완충액을 첨가하십시오. </li><li> 모든 샘플을 65 ° C에서 밤새 인큐팅하여 흔들어 섞으십시오. </li></ol> 5 일째 5. DNA 정제 <ol><li> 각 용리액에 TE 완충액 200 μL와 10 mg / mL RNase A (0.2 μg / μL 최종 농도) 8 μL를 넣는다. 37 ° C에서 2 시간 동안 혼합하고 품어, 흔들어 섞으십시오. </li><li> 20 μg / mL proteinase K 4 μL (0.2 μg / μL 최종 농도)를 각 용리액에 첨가하고 55 ° C에서 2 시간 동안 항온 배양하십시오. </li><li> 각 샘플을 젤로 옮기십시오.페놀 / 클로로포름 / 이소 아밀 알코올 추출에 적합한 튜브; 제조업체의 지침에 따라 취급하십시오. </li><li> 페놀 / 클로로포름 / 이소 아밀 알코올 (25 : 24 : 1) 400 μL를 넣고 튜브를 흔든다. 24 ° C 및 ~ 16,000 X g에서 5 분간 원심 분리하십시오. 상층을 새로운 튜브로 옮긴다. 주의 : 페놀, 클로로포름, 이소 아밀 알코올은 흡입하면 부식성이있다. 흄 후드에서 작업하고 적절한 개인 보호 장비를 착용하십시오. 또한 호스트 기관의 규정에 따라 페놀, 클로로포름 및 이소 아밀 알코올 폐기물을 처리하십시오. <ol><li> 한 번 반복하십시오. </li></ol></li><li> 다음의 수정 사항과 함께 제조 업체의 지침에 따라 정제 컬럼을 사용하여 DNA를 정제하십시오 : </li><li> 멤브레인을 두 번 씻으십시오. 마지막 씻은 후 잔여 에탄올을 증발 실온에서 2 분 동안 튜브를 열어 둡니다. </li><li> 용출을 위해, 50 μL의 H 2 O를 첨가하고, 실온에서 배양한다다시 1 분 동안 24 ° C에서 1 분간 원심 분리하여 DNA를 용리시키기 전에 실온에서 1 분 동안 배양하고 ~ 17,900 x g. </li></ol>

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저자는 경쟁적인 금전적 이해 관계가 없습니다.

ChIP는 단백질 또는 그 PTM이 특정 게놈 영역에서 풍부하게되는지 여부를 조사하는 유효한 기술입니다. ChIP 분석 결과는 종종 생물학적 또는 기술적 인 이유로 해석하기가 어렵습니다. 생물학적 인 이유는 여러 가지이며 DNA에 약하거나 간접적으로 결합하는 단백질을 포함합니다. 제한된 항체 특이성 및 비효율적 인 세포 용해 또는 염색질 전단과 같은 기술적 한계도 있습니다. 문제 해결 가이드 ( 표 5 )는 독자가 ChIP 분석에서 발생할 수있는 문제를 해결하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 프로토콜은 냉각 집중 초음파 장치를 사용하여 성숙한 마우스 T 세포주의 염색질을 효율적으로 전단 할 수 있습니다. 프로토콜의 주요 중요 단계는 각 세포 유형에 대해 항상 최적화되어야하는 염색질의 전단으로 표현됩니다. 세포 수와 sonication주기의 수를 변화시키는 것이 좋습니다. 게다가, 그녀는<html> 활성 효율성은 샘플에서 SDS 침전물의 존재에 의해 부정적으로 영향을받으며, 이는 SDS 용해 완충액으로 얼음 위에서 세포를 분해하는 동안 형성 될 수있다. 이 경우 SDS 침전물의 존재를 줄이기 위해 실온에서 몇 분 동안 용해한 후 시료를 배양하는 것이 가장 좋습니다. 200 ~ 500 bp 사이에서 절단 된 단편을 얻고 면역 침전을 진행하기 전에 시료의 전단 품질을 항상 평가하기 위해 프로토콜을 최적화하는 것이 좋습니다. 또한, 고정 시간, 항체 및 / 또는 세포의 양 및 세척 조건은 각각의 항체에 대해 최적화되어야한다. 저 특이성 항체가 면역 침강의 효율을 현저히 감소 시킴에 따라 ChIP 절차를 성공적으로 수행하는 데있어 한 가지 더 중요한 단계는 항체의 선택입니다. 이전에는 통일 된 품질 검사 절차를 통해 시장에서 판매되는 여러 항체의 특이성을 평가할 수있었습니다<html> ss = &quot;xref&quot;&gt; 19. 선별 파이프 라인은 도트 블랏, 웨스턴 블랏 및 ChIP을 기반으로 ChIP 19에 적합한 고품질 시약 목록을 제공합니다. 보다 최근에는 여러 상업적으로 이용 가능한 항체의 특이성을 고밀도 히스톤 펩타이드 마이크로 어레이 플랫폼을 사용하여 평가하여 항체 특이성에 대한 데이터베이스를 확립했다. 독자는이 유용한 도구를 사용하여 ChIP 실험에 사용할 수있는 가장 구체적인 항체를 확인할 수 있습니다. 이 프로토콜은 기본 T 세포에 대해 테스트되지 않았으며,이 경우 판독기는 기본 T 세포 3 , 4 , 21 에서 ChIP를 성공적으로 수행하는 다른 게시 된 프로토콜을 참조해야합니다. 주목할 만하게,이 프로토콜은 성공적으로 마우스 progenitor T - 세포 라인뿐만 아니라 마우스 내피 세포 라인에 대한 칩을 수행하는 데 사용되었습니다. ove_content &quot;&gt; 히스톤 자국 분석을 위해 각 면역 침전에 5 x 10 6 개 세포를 사용해야한다.이 프로토콜은 일부 최적화와 함께 TF 또는 보조 인자에 ChIP를 수행하기에 적합하기 때문에 세포 수를 늘리는 것이 가장 좋다 이 경우 면역 침전에 사용됩니다. 각 실험에 필요한 수의 세포에 도달하기 위해 전단 분해물의 더 많은 분량을 희석 완충액에서 염색질을 희석하기 전에 함께 모을 수 있습니다. 이 프로토콜은 또한 DNA에 직접적으로 결합하지 않는 내인성 단백질에서 ChIP을 수행하도록 변형 될 수 있습니다. 이 경우 단백질 - 단백 가교제 ( 예 : 디메틸 아디 피 미딘, DMA)를 사전 고정해야 할 수 있습니다 (자세한 내용은 부록 B 참조). 보조 인자에 대한 ChIP의 성공적인 수행은 이전에 biotin-tag에 융합 된 단백질을 과발현함으로써 이루어졌습니다. 이 경우 단백질을 streptavidin-conjuga자성 비드를 넣고 DMA로 사전 고정시켰다.

발달, 분화 및 항상성은 염색질 구조를 조절하는 시그널링 사건에 의해 확립 된 특정 유전자 발현 프로그램에 의존하기 때문에 특정 유전자가 세포 및 시간 특이 적 방식으로 활성화되거나 억제되는지를 결정한다. T 세포 발달 과정에서 여러 개의 중간 단계 1 을 거쳐 이중 네거티브 (DN)에서 단일 포지티브 (SP) 상태로 T 세포 전구체의 성숙을 올바르게 결정하기위한 특정 유전자 발현 프로그램을 수립해야합니다 1 . T 세포 발달 과정에서 유전자 발현 프로그램이 어떻게 동적으로 조절되는지는 지난 몇 년 동안 여러 실험실에서 2 , 3 , 4 , 5 , 6 번 조사 되었다. 히스톤의 번역 후 변형 (PTM)에 의해,히스톤 변이가있는 표준 히스톤, 뉴 클레오 솜 퇴거 및 DNA 메틸화는 유전자의 ON / OFF 스위치를 조절합니다. 여러 그룹이 PTM과 히스톤 변이체의 게놈 전체 분포를 조사하여 근위 및 원위의 조절 영역 7 , 8 , 9 , 10 에서 다른 염색질 상태와 관련된 표지를 결정했습니다. 시그널링 캐스케이드는 특정 인핸서 요소에서 양성 및 음성 염색질 변형 효소 (염색질 변형 제로도 알려짐)의 교환을 통해 동적 인 염색질 조절을 조율합니다. 이러한 염색질 변형 제는 염색질 구조를 조절하여 예를 들어 동적 히스톤 메틸화 및 아세틸 화에 의한 전사 결과를 조절합니다. 이것은 Notch 신호 전달 경로 11 , 12 , 13 ,14. 동적 히스톤 PTM; 히스톤 변이체와 교환; 히스톤, 전사 인자 및 보조 인자의 동적 인 점유는 염색질 면역 침전 (ChIP) 분석에 의해 조사 될 수있다. 고도로 특이적인 항체를 사용하여 특정 DNA- 단백질 복합체를 정제하고 정제 된 DNA를 정량적 PCR (qPCR)로 분석합니다. 심층 시퀀싱 (ChIP-Seq); 또는 요즘에는 마이크로 어레이 (ChIP-ChIP)와의 하이브리드 화가 적습니다. 칩 분석은 세포의 용해, 염색질의 전단 및 / 또는 항체의 낮은 특이성으로 인해 때로는 어려움을 겪습니다. NEXSON 15 와 마찬가지로 프로토콜을 개선하기위한 몇 가지 전략이 채택되었습니다. 냉각 수 욕조 소니 케이 터의 사용은 조사중인 단백질에 존재하는 에피토프를 손상시킬 수있는 시료 가열을 피할 수 있지만 시료의 전단에 필요한 에너지는 물에 분산됩니다.에너지의 분산을 방지하는 집속 된 초음파 장치의 개발로 또 다른 개선이 이루어졌습니다. 따라서 초점을 맞춘 초음파 장치는 세포 용해 및 염색질 전단에서의 개선을 허용하여 조작자 - 유도 된 변이를 제거하고 재현성을 현저히 증가시킵니다. 이 작업은 E2-10HA 16 , 17 이라고 불리는 성숙한 마우스 T 세포주에서 히스톤 단백질의 ChIP을 효율적으로 수행하기위한 프로토콜 ( 그림 1의 개략도)을 설명합니다. T 세포는 보통 용해하기가 어렵고, 염색질의 전단은 비효율적 인 것으로 밝혀졌습니다. 냉각 집중 초음파 장치를 사용하는이 프로토콜에서는 E2-10HA 마우스 T 세포주에 대해 세포 수, 용해 완충액 및 전단 설정이 최적화되었습니다. 이 프로토콜은 높은 재현성과 합리적인 시간에 ChIP을 수행 할 수있게합니다. 사실, 그것은 requir염색질을 전단하고 전단력의 품질을 평가하고 약 3 일 동안 면역 침전을 수행하고 교차 결합을 역전 시키며 DNA를 정제하는 데 약 2 일이 소요됩니다.

<table><tbody><tr><td>Agilent High Sensitivity D5000 Reagents</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5593</td><td></td></tr><tr><td>Agilent High Sensitivity D5000 ScreenTape</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5592</td><td></td></tr><tr><td>Agilent Tapestation 4200</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2991AA</td><td></td></tr><tr><td>Covaris S220 AFA System</td><td>Covaris</td><td>500217</td><td></td></tr><tr><td>dimethyl adipimidate (DMA)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20660</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Pan-Biotech</td><td>1502-P121301</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde (FMA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>Insulin solution human&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9278-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Iscove&#039;s modified Dulbecco&#039;s medium (IMDM)</td><td>Gibco</td><td>21980-032</td><td></td></tr><tr><td>Minimum essential medium non-essential amino acids (MEM NEAA)</td><td>Gibco</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>nProtein A Sepharose 4 Fast Flow</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5280-02</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin&lt;br /&gt;(10,000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Peptone primatone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4963-100G</td><td></td></tr><tr><td>Phase Lock Gel Heavy 2&amp;nbsp;mL</td><td>5 Prime</td><td>2302830</td><td></td></tr><tr><td>Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1)</td><td>Roth</td><td>A156.2</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td><td>GIBCO</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K Solution (20 mg/mL), RNA grade</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25530049</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit (250)</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 3.0 Fluorometer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>Qubit assay tubes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>RNase A, DNase and protease-free (10&amp;nbsp;mg/mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>Tube AFA Fiber &amp;amp; Cap</td><td>Covaris</td><td>520081</td><td></td></tr></tbody></table>

chromatin immunoprecipitation (chip) in mouse t-cell lines

시그널링 경로는 히스톤 테일의 번역 후 변형 (PTM), 히스톤 변이체와의 표준 히스톤 교환 및 뉴 클레오 솜 퇴거와 같은 상이한 수준에서 염색질 구조의 조절을 통해 유전자 발현 프로그램을 조절한다. 이러한 조절은 인핸서 (enhancers)로 정의 된 조절 요소에서 염색질 변형 효소를 모집하는 신호 감수성 전사 인자 (signal-sensitive transcription factors, TF)의 결합을 필요로한다. 신호 전달 계통이 enhancer 활동을 조절하는 방법을 이해하려면 TF, 염색질 변형 효소의 결합, 특정 히스톤 마크로 및 히스톤 변이체의 점유에 대한 포괄적 인 분석이 필요합니다. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) 분석은 특이 적 항체를 이용하여 특정 단백질 / DNA 복합체를 면역 침전시킨다. 정제 된 DNA의 후속 분석은 항체에 의해 인식되는 단백질에 의해 점유 된 영역을 확인하게한다. 이 작업은 효율적으로 pe성숙 마우스 T 세포주에서 histone 단백질의 rform 칩. 제시된 프로토콜은 합리적인 시간 프레임 및 높은 재현성으로 ChIP 분석의 수행을 가능하게한다.

성숙한 쥐의 T 세포를 ChIP 분석하여 히스톤 3 (H3K4me1)에 대한 리신 4의 모노 메틸화, 히스톤 3 (H3K4me3)에 대한 리신 4의 트리 메틸렌 화, 및 리신 27의 아세틸 화 히스톤 3 (H3K27ac)뿐만 아니라 panH3 칩에 의해 밝혀 뉴 소 솜 점유. 전단 품질은 1.8 % 아가 로즈 겔 ( 그림 2A ) 및 전기 영동 시스템 ( 그림 2B )에 대한 분석에 의해 평가되었습니다. H3K4me1과 H3K4me3은 일반적으로 각각 인핸서 사이트와 프로모터를 식별하는 데 사용됩니다 ( 그림 3A ). 사실, H3K4me3는 발기인 5 , 8 , 14 에서 두드러지게 나타나지만 배타적이지는 않습니다. 활성 증강 인자의 특성은 H3K4me1 및 H3K27ac에 대해 고도로 강화되고 H3K4me3에 대해서는 풍부하게 농후하게된다 (&lt;비활성 패널은 H3K4me3과 H3K27ac의 낮은 수준을 나타내지 만 높은 수준의 H3K4me1을 보였다 ( 그림 3A , 하부 패널). 도 3B 에 나타낸 바와 같이 , 글리세롤 알데히드 3- 인산 탈수소 효소 ( Gapdh ) 유전자는 활성 유전자 프로모터 ( Gapdh 프로모터 )의 분석을 대표한다. 사실, H3K4me3과 H3K27ac의 높은 수준과 H3K4me1의 낮은 수준을 보여줍니다. 도 3b 에서, Deltex1 ( Dtx1 )은 H3K4me1에 대해 고도로 농축되고 H3K4me3 및 H3K27ac에 대해서는 불충분하게 풍부하므로, 비활성 인핸서 ( Dtx1 인핸서 )를 대표한다. 유전자 사막 은 코딩 유전자가없는 지역의 대표이며, 일반적으로 활성 염색질 표지에 대한 음성 대조군으로 고소됩니다. H3K4me1이 잘 받아 들여지는 인핸서 마크 4 , 5 , </sup&gt; 7 , 14 , 18 번은 진 사막 에서 풍성하지 않다.이 지역에는 인핸서가 없다. <img alt="그림 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55907/55907fig1.jpg" /> 그림 1 : 제시된 ChIP 프로토콜의 개략 개요. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55907/55907fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55907/55907fig2.jpg" /> 그림 2 : 성숙한 마우스 T - 세포 라인의 전단 품질 관리. ( A ) 성숙한 마우스 T 세포주 E2-10HA의 2 개의 상이한 분취 량을 전단하고 약 500 ng의 정제 된 DNA를 1.8 % 아가 로스 겔에서 분석하여 이들의 전단을 평가 하였다ing 품질. ( B ) 샘플 2의 정제 DNA 1ng을 전기 영동으로 분석하여 전단 품질을 평가 하였다. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55907/55907fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55907/55907fig3.jpg" /> 그림 3 : 인핸서와 프로모터를 특징 짓는 크로마 틱 마크. ( A ) 액티브 인핸서 (상부 패널)는 높은 H3K4me1, 낮은 H3K4me3 및 높은 H3K27ac을 특징으로하는 반면, 비활성 인핸서 (낮은 패널)는 높은 H3K4me1, 낮은 H3K4me3 및 낮은 H3K27ac을 나타낸다. ( B ) 그림 2A 에 제시된 샘플을 함께 모아 ChIP 분석 대 H3K4me1, H3K4me3 및 H3K27ac 히스톤 마크와 히스톤 점유, panH3 칩에 의해 밝혀졌다. 이 분석은 the 프로모터 Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase ( Gapdh promoter )는 H3K4me3과 H3K27ac에 대해 매우 농축되어 있으며 H3K4me1에 대해서는 풍부하게 농축되어있다. 한편, 비활성 유전자 Deltex1 ( Dtx1 인핸서 )의 인핸서 는 H3K4me1에 대해 고도로 농축되지만 H3K4me3 및 H3K27ac에 대해서는 풍부하게 농축되지 않는다. panH3 항체를 사용하는 칩을 사용하여 뉴 소솜 점유를 조사 하였다. 유전자 사막 은 음성 대조군으로 사용되었다. 하나의 대표적인 실험이 표시됩니다. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55907/55907fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 버퍼의 이름 </td><td> 시약 </td><td> 최종 농도 </td></tr><tr><td rowspan="5"> 희석액 완충액 </td><td> 나트륨 도덱(SDS) </td><td> 0.01 % (w / v) </td></tr><tr><td> 트리톤 X-100 </td><td> 1.1 % (v / v) </td></tr><tr><td> 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) pH 8.0 </td><td> 1.2 mM </td></tr><tr><td> 트리스 -HCl pH 8.1 </td><td> 16.7 mM </td></tr><tr><td> 염화나트륨 (NaCl) </td><td> 167 mM </td></tr><tr><td rowspan="2"> DMA 용액 </td><td> 디메틸 아디 피 이미 데이트 (DMA) </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> 인산염 완충 식염수 (PBS) </td><td> 1 배 </td></tr><tr><td rowspan="3"> 용출 완충액 </td><td> 나트륨 도데 실 설페이트 (SDS) </td><td> 1 % (w / v) </td></tr><tr><td> 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) pH 8.0 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> 트리스 -HCl pH 8.0 </td><td> 50 mM </td></tr><tr><td rowspan="5"> 고염 버퍼 </td><td> 나트륨 도데 실 설페이트 (SDS) </td><td> 0.1 % (w / v) </td></tr><tr><td> 트리톤 X-100 </td><td> 1 % (v / v) </td></tr><tr><td> 에틸렌 디아 미넷 테트라 아세트산 (EDTA) pH 8.0 </td><td> 2 mM </td></tr><tr><td> 트리스 -HCl pH 8.1 </td><td> 20 mM </td></tr><tr><td> 염화나트륨 (NaCl) </td><td> 500 mM </td></tr><tr><td rowspan="6"> IMDM 매체 </td><td> Iscove의 변형 된 Dulbecco &#39;s medium (IMDM) </td><td> 1 배 </td></tr><tr><td> 태아 소 혈청 (FBS) </td><td> 2 % (v / v) </td></tr><tr><td> 페니실린 / 스트렙토 마이신 </td><td> 1 배 </td></tr><tr><td> 펩톤 프리마 존 </td><td> 0.3 mg / mL </td></tr><tr><td> 인간 인슐린 용액 </td><td> 4.8 mg / mL </td></tr><tr><td> 최소 필수 필수 비 필수 아미노산 (MEM NEAA) </td><td> 1 배 </td></tr><tr><td rowspan="4"> LiCl 염 완충액 </td><td> 리튬 클로라이드 (LiCl) </td><td> 0.25M </td></tr><tr><td> 이 페칼 - CA630 </td><td> 1 % (v / v) </td></tr><tr><td> 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) pH 8.0 </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> 트리스 -HCl pH 8.1 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td rowspan="5"> 저염 버퍼 </td><td> 나트륨 도데 실 설페이트 (SDS) </td><td> 0.1 % (w / v) </td></tr><tr><td> 트리톤 X-100 </td><td> 1 % (v / v) </td></tr><tr><td> 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) pH 8.0 </td><td> 2 mM </td></tr><tr><td> 트리스 -HCl pH 8.1 </td><td> 20 mM </td></tr><tr><td> 염화나트륨 (NaCl) </td><td> 150 mM </td></tr><tr><td rowspan="5"> 단백질 A 세파 로즈 비드 세척 완충액 </td><td> 트리스 -HCl pH 8.0 </td><td> 20 mM </td></tr><tr><td> 염화나트륨 (NaCl) </td><td> 500 mM </td></tr><tr><td> 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) pH 8.0 </td><td> 2 mM </td></tr><tr><td> 나트륨 도데 실 설페이트 (SDS) </td><td> 0.1 % (w / v) </td></tr><tr><td> 이 페칼 - CA630 </td><td> 1 % (v / v) </td></tr><tr><td rowspan="3"> SDS 용해 완충액 </td><td> 나트륨 도데 실 설페이트 (SDS) </td><td> 1 % (w / v) </td></tr><tr><td> 에틸렌 디아민aminetetraacetic acid (EDTA) pH 8.0 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> 트리스 -HCl pH 8.1 </td><td> 50 mM </td></tr><tr><td rowspan="2"> TE 완충액 </td><td> 트리스 -HCl pH 8.0 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) pH 8.0 </td><td> 1 mM </td></tr></tbody></table> 표 1 :이 프로토콜에 사용 된 버퍼 및 매체 목록. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> 에 </td><td> 떨어져서 </td></tr><tr><td> 최고 출력 </td><td> 150.0 </td><td> 2.5 </td></tr><tr><td> 듀티 팩터 </td><td> 15.0 </td><td> 15.0 </td></tr><tr><td> 사이클 / 버스트 </td><td> 500 </td><td> 500 </td></tr><tr><td> 사이클 수 </td><td colspan="2"> 28 </td></tr></tbody></table>표 2 :이 프로토콜에서 사용 된 전단 설정. 이러한 조건은 성숙한 마우스 T 세포주에 최적화되었습니다. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 항독소 </td><td> 공급자 </td><td> 항체 양 / 면역 침전 량 </td><td> 세포의 양 / 면역 침전 </td><td> 세탁 조건 </td></tr><tr><td> H3 </td><td> 아캄 (ab1791) </td><td> 2.5 mg </td><td> 5 x 10 6 </td><td> 일단 저염 완충액에서, 고염 완충액에서 2 번, LiCl 염 완충액에서 2 번 및 TE 완충액에서 3 번 </td></tr><tr><td> H3K4me1 </td><td> Abcam (ab8895) </td><td> 2.5 mg </td><td> 5 x 10 6 </td><td> 일단 저염 완충액에서, 고염 완충액에서 2 번, LiCl 염 완충액에서 2 번 및 TE 완충액에서 3 번 </td></tr><tr><td> H3K4me3 </td><td> Diagenode (pAb-003-050) </td><td> 2.5 mg </td><td> 5 x 10 6 </td><td> 일단 저염 완충액에서, 고염 완충액에서 2 번, LiCl 염 완충액에서 2 번 및 TE 완충액에서 3 번 </td></tr><tr><td> H3K27ac </td><td> 디아 노 코드 (pAb-174-050) </td><td> 2.5 mg </td><td> 5 x 10 6 </td><td> 저염 완충액 중 Oce, 고염 완충액 중 두 번, LiCl 염 완충액 중 두 번 및 TE 완충액 중 세 번 </td></tr><tr><td> IgG </td><td> Diagenode (C15410206) </td><td> 변하기 쉬운* </td><td> 변하기 쉬운* </td><td> 변하기 쉬운* </td></tr><tr><td colspan="5"> IgG 컨트롤의 경우, 항체와 세포의 양과 세척 단계는 다른 면역 침전의 조건을 반영해야합니다. </td></tr></tbody></table> 표 3 :이 연구에서 사용 된 항체 및 세척 조건. <table border="1" fo:keep-together.within-page = &quot;1&quot;fo : keep-with-next.within-page = &quot;always&quot;&gt; <tbody><tr><td> 유전자 </td><td> 정방향 프라이머 </td><td> 리버스 프라이머 </td><td> 조사 </td></tr><tr><td> Gapdh 프로모터 (0 kb) </td><td> 5&#39;-GGG TTC CTA TAA ATA CGG ACT GC-3 &#39; </td><td> 5&#39;-CTG GCA CTGCAC AAG AAG A-3 &#39; </td><td> 68 </td></tr><tr><td> Dtx1 인핸서 ( +26kb ) </td><td> 5&#39;-CTC TGG GTT GTA GGG GAC AG-3 &#39; </td><td> 5&#39;-GCA TGG GAA CTG TGT TAC AGA A-3 &#39; </td><td> 27 </td></tr><tr><td> 진 사막 </td><td> 5&#39;-CAA TGC ATG GGT CCA GAT TT-3 &#39; </td><td> 5&#39;-ATT GGC ACG GAA GTA GTG CT-3 &#39; </td><td> 94 </td></tr></tbody></table> 표 4 :이 연구에서 qPCR에 사용 된 프라이머 및 프로브. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page = &quot;always&quot;&gt; <tbody><tr><td> 문제 </td><td> 원인 </td><td> 해결책 </td></tr><tr><td rowspan="3"> 크로마 틴이 전단되고 파편이 너무 큽니다. </td><td> 너무 많은 셀이 사용되었습니다. </td><td> 세포 수를 줄이십시오. </td></tr><tr><td rowspan="2"> 전단이 너무 낮습니다. </td><td> 전단 사이클 수를 늘리십시오. </td></tr><tr><td> 전단 피크 파워, 듀티 팩터 및 / 또는 사이클 / 버스트를 증가시킵니다. </td></tr><tr><td rowspan="3"> 크로마 틴이 절단되어 파편이 너무 작습니다. </td><td> 너무 적은 셀이 사용되었습니다. </td><td> 세포의 수를 늘리십시오. </td></tr><tr><td rowspan="2"> 전단력이 너무 높습니다. </td><td> 전단 사이클 수를 줄입니다. </td></tr><tr><td> 전단 피크 파워, 듀티 팩터 및 / 또는 사이클 / 버스트를 줄입니다. </td></tr><tr><td rowspan="11"> 너무 낮은 복구gG 조절 및 / 또는 음성 대조 (높은 배경). </td><td> 실험에 사용 된 염색질이 충분하지 않습니다. </td><td> 염색질 양을 늘리십시오. </td></tr><tr><td> 항체의 양이 너무 적습니다. </td><td> 항체 양을 늘리십시오. </td></tr><tr><td> 항체의 양이 너무 많습니다. </td><td> 항체 양을 줄이십시오. </td></tr><tr><td> 항체는 특이도가 낮습니다. </td><td> 항체를 변경하십시오. </td></tr><tr><td rowspan="2"> 세탁 조건이 너무 엄격합니다. </td><td> 세탁 횟수를 줄이십시오. </td></tr><tr><td> 세척 버퍼의 엄격 성을 줄입니다. </td></tr><tr><td rowspan="2"> 세탁 조건은 충분히 엄격하지 않습니다. </td><td> 세탁 횟수를 늘리십시오. </td></tr><tr><td> 세척 버퍼의 엄격 성을 증가시킵니다. </td></tr><tr><td> 너무 많은 DNA가 qPCR에 pipetted되었다. </td><td> qPCR에서 pipetted DNA의 양을 줄이십시오. </td></tr><tr><td rowspan="2"> qPCR 조건이 최적이 아닙니다. </td><td> qPCR 조건을 최적화하십시오. </td></tr><tr><td> 주기 수를 줄이십시오. </td></tr><tr><td rowspan="4"> 입력 샘플의 qPCR 반응에서 제품이나 제품이 너무 낮습니다. </td><td> qPCR에는 충분한 DNA가 피펫 팅되어 있지 않습니다. </td><td> qPCR에서 pipetted DNA의 양을 늘리십시오. </td></tr><tr><td rowspan="2"> qPCR 조건이 최적이 아닙니다. </td><td> qPCR 조건을 최적화하십시오. </td></tr><tr><td> 주기 수를 늘리십시오. </td></tr><tr><td> 실험에 사용 된 염색질이 충분하지 않습니다. </td><td> 염색질 양을 늘리십시오. </td></tr><tr><td rowspan="4"> 양성 대조군 및 / 또는 panH3 칩에는 신호가 없음. </td><td> 실험에 사용 된 염색질이 충분하지 않습니다. </td><td> 염색질 양을 늘리십시오. </td></tr><tr><td> 항체의 양이 너무 적습니다. </td><td> 항체 양을 늘리십시오. </td></tr><tr><td> 안티몸은 특이성이 낮습니다. </td><td> 항체를 변경하십시오. </td></tr><tr><td> 용출은 차선책입니다. </td><td> 용액에 비드를 유지하기 위해 샘플을 자주 와동시킨다. </td></tr></tbody></table> 표 5 : 문제 해결.

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Chromatin Immunoprecipitation ChIP in Mouse T-cell Lines

이 작품은 성숙 마우스 T 세포 라인을 사용하여 염색질 immunoprecipitation (ChIP)에 대한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 특정 프로모터 사이트 또는 게놈 전체에서 특정 히스톤 마크의 분포를 조사하는 데 적합합니다.

마우스 T- 세포주에서 Chromatin Immunoprecipitation (ChIP)

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Genetics

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) in Mouse T-cell Lines

18.3K 조회수.  University of Giessen.  이 작품은 성숙 마우스 T 세포 라인을 사용하여 염색질 immunoprecipitation (ChIP)에 대한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 특정 프로모터 사이트 또는 게놈 전체에서 특정 히스톤 마크의 분포를 조사하는 데 적합합니다. 

비디오: Chromatin Immunoprecipitation ChIP in Mouse T-cell Lines

Improved Protocol for Chromatin Immunoprecipitation from Mouse Skeletal Muscle

We describe an efficient and reproducible protocol for the preparation of chromatin from adult mouse skeletal muscle, a physically resistant tissue with a high content of structural proteins. Dissected limb muscles from adult mice are physically disrupted by mechanical homogenisation, or a combination of mincing and douncing, in a hypotonic buffer before formaldehyde fixation of the cell lysate. The fixed nuclei are purified by further cycles of mechanical homogenisation or douncing and sequential filtrations to remove cell debris. The purified nuclei can be sonicated immediately or at a later stage after freezing. The chromatin can be efficiently sonicated and is suitable for chromatin immunoprecipitation experiments, as illustrated by the profiles obtained for transcription factors, RNA polymerase II, and covalent histone modifications. The binding events detected using chromatin prepared by this protocol are predominantly those taking place in the muscle fiber nuclei despite the presence of chromatin from other fiber-associated satellite and endothelial cells. This protocol is therefore adapted to study gene regulation in the adult mouse skeletal muscle.

A novel protocol for the preparation of chromatin from adult mouse skeletal muscle adapted to the study of gene regulation in muscle fibers by chromatin immunoprecipitation is presented.

마우스 골격 근육에서 Chromatin Immunoprecipitation에 대 한 향상 된 프로토콜

We describe an efficient and reproducible protocol for the preparation of chromatin from adult mouse skeletal muscle, a physically resistant tissue with a ...

연구

생화학

Chromatin Immunoprecipitation of Murine Brown Adipose Tissue

Most cellular processes are regulated by transcriptional modulation of specific gene programs. Such modulation is achieved through the combined actions of a wide range of transcription factors (TFs) and cofactors mediating transcriptional activation or repression via changes in chromatin structure. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a useful molecular biology approach for mapping histone modifications and profiling transcription factors/cofactors binding to DNA, thus providing a snapshot of the dynamic nuclear changes occurring during different biological processes.
To study transcriptional regulation in adipose tissue, samples derived from in vitro cell cultures of immortalized or primary cell lines are often favored in ChIP assays because of the abundance of starting material and reduced biological variability. However, these models represent a limited snapshot of the actual chromatin state in living organisms. Thus, there is a critical need for optimized protocols to perform ChIP on adipose tissue samples derived from animal models.
Here we describe a protocol for efficient ChIP-seq of both histone modifications and non-histone proteins in brown adipose tissue (BAT) isolated from a mouse. The protocol is optimized for investigating genome-wide localization of proteins of interest and epigenetic markers in the BAT, which is a morphologically and physiologically distinct tissue amongst fat depots.

Here we describe a protocol for efficient chromatin immunoprecipitation (ChIP) followed by high-throughput DNA sequencing (ChIP-seq) of brown adipose tissue (BAT) isolated from a mouse. This protocol is suitable for both mapping histone modifications and investigating genome-wide localization of non-histone proteins of interest in vivo.

Murine 갈색 지방이 많은 직물의 염색 질 Immunoprecipitation

Most cellular processes are regulated by transcriptional modulation of specific gene programs. Such modulation is achieved through the combined actions of ...

유전학

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are characterized by two fundamental properties: self-renewal and multipotency that allows a stem cell to differentiate into virtually any cell type 1. The progression stem cell to differentiated cell is characterized by loss of multipotency, structural and morphological changes and the hierarchic activity of transcription factors and signaling molecules, whose activities establish and maintain cell-type specific gene expression patterns. At the molecular level, cell differentiation involves dynamic changes of the structure and composition of chromatin and the detection of those dynamic changes can provide valuable insights into the functional features of stem cells and the cell differentiation process 2,3. Chromatin is a highly compacted DNA-protein complex that forms when cells package chromosomal DNA with proteins, mainly histones 4. Stemcellness and cell differentiation has been correlated with the presence of specific arrays of regulatory proteins such as epigenetic factors, histone variants, and transcription factors 2,3,5.
 Chromatin immunoprecipitation (ChIP) provides a valuable method to monitor the presence of RNA, proteins, and protein modifications in chromatin 6,7. The comparison of chromatin from different cell types can elucidate dynamic changes in protein-chromatin associations that occur during cell differentiation.
Chromatin immunoprecipitation involves the purification of in vivo cross-linked chromatin. The isolated chromatin is reduced to smaller fragments by enzymatic digestion or mechanical force. Chromatin fragments are precipitated using specific antibodies to target proteins or protein and DNA modifications. The precipitated DNA or RNA is purified and used as a template for PCR or DNA microarray based assays. Prerequisites for a successful ChIP are high quality antibodies to the desired antigen and the availability of chromatin from control cells that do not express the target molecule. ChIP can correlate the presence of proteins, protein and RNA modifications, and RNA with specific target DNA, and depending on the choice of outread tool, detects the association of target molecules at specific target genes or in the context of an entire genome. The comparison of the distribution of proteins in the chromatin of differentiating cells can elucidate the dynamic changes of chromatin composition that coincide with the progression of cells along a cell lineage.

The differentiation of ESC coincides with cell-type specific changes in the structure and composition of chromatin. The detection of those changes provides valuable insights into the mechanisms that define stemcellness and cell differentiation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) represents a valuable method to dissect the molecular mechanisms underlying stem cell differentiation.

인간 배아 줄기 세포에서 염색질의 Immunoprecipitation

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

생물학

Chromatin Immunoprecipitation Assay Using Micrococcal Nucleases in Mammalian Cells

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene expression. The cellular transcriptional machinery and its chromatin modification proteins coordinate to regulate transcription. To analyze transcriptional regulation at the molecular level, several experimental methods such as electrophoretic mobility shift, transient reporter and chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays are available. We describe a modified ChIP assay in detail in this article because of its advantages in directly showing histone modifications and the interactions between proteins and DNA in cells. One of the key steps in a successful ChIP assay is chromatin shearing. Although sonication is commonly used for shearing chromatin, it is difficult to identify reproducible conditions. Instead of shearing chromatin by sonication, we utilized enzymatic digestion with micrococcal nuclease (MNase) to obtain more reproducible results. In this article, we provide a straightforward ChIP assay protocol using MNase.

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool for understanding the molecular mechanisms of gene regulation. However, the method involves difficulties in obtaining reproducible chromatin fragmentation by mechanical shearing. Here, we provide an improved protocol for a ChIP assay using enzymatic digestion.

포유류 세포에서 미세 Coccal 뉴클레아제사용 염색질 면역침전 분석

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene ...

High-Resolution Mapping of Protein-DNA Interactions in Mouse Stem Cell-Derived Neurons using Chromatin Immunoprecipitation-Exonuclease (ChIP-Exo)

Identification of specific protein-DNA interactions on the genome is important for understanding gene regulation. Chromatin immunoprecipitation coupled with high-throughput sequencing (ChIP-seq) is widely used to identify genome-wide binding locations of DNA-binding proteins. However, the ChIP-seq method is limited by its heterogeneity in length of sonicated DNA fragments and non-specific background DNA, resulting in low mapping resolution and uncertainty in DNA-binding sites. To overcome these limitations, the combination of ChIP with exonuclease digestion (ChIP-exo) utilizes 5&#8217; to 3&#8217; exonuclease digestion to trim the heterogeneously sized immunoprecipitated DNA to the protein-DNA crosslinking site. Exonuclease treatment also eliminates non-specific background DNA. The library-prepared and exonuclease-digested DNA can be sent for high-throughput sequencing. The ChIP-exo method allows for near base-pair mapping resolution with greater detection sensitivity and reduced background signal. An optimized ChIP-exo protocol for mammalian cells and next-generation sequencing is described below.

High-Resolution Mapping of Protein-DNA Interactions in Mouse Stem Cell-Derived Neurons using Chromatin Immunoprecipitation-Exonuclease ChIP-Exo

Precise determination of protein-binding locations across the genome is important for understanding gene regulation. Here we describe a&#160;genomic mapping method that treats chromatin-immunoprecipitated DNA with exonuclease digestion (ChIP-exo) followed by high-throughput sequencing. This method detects protein-DNA interactions with near base-pair mapping resolution and high signal-to-noise ratio in mammalian neurons.

크롬 마틴 면역 침전 -엑소뉴클레아제 (ChIP-Exo)를 사용하여 마우스 줄기 세포 유래 뉴런에서 단백질 DNA 상호 작용의 고해상도 매핑

Identification of specific protein-DNA interactions on the genome is important for understanding gene regulation. Chromatin immunoprecipitation coupled ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This technique has been widely exploited in tissue culture cells, and to a lesser extent, in primary tissue. The application of ChIP to rodent embryonic tissue, especially at early times of development, is complicated by the limited amount of tissue and the heterogeneity of cell and tissue types in the embryo. Here we present a method to perform ChIP using a dissociated embryonic day 8.5 (E8.5) embryo. Sheared chromatin from a single E8.5 embryo can be divided into up to five aliquots, which allows the investigator sufficient material for controls and for investigation of specific protein:chromatin interactions.
We have utilized this technique to begin to document protein:chromatin interactions during the specification of tissue-specific gene expression programs. The heterogeneity of cell types in an embryo necessarily restricts the application of this technique because the result is the detection of protein:chromatin interactions without distinguishing whether the interactions occur in all, a subset of, or a single cell type(s). However, examination of tissue-specific genes during or following the onset of tissue-specific gene expression is feasible for two reasons. First, immunoprecipitation of tissue specific factors necessarily isolates chromatin from the cell type where the factor is expressed. Second, immunoprecipitation of coactivators and histones containing post-translational modifications that are associated with gene activation should only be found at genes and gene regulatory sequences in the cell type where the gene is being or has been activated. The technique should be applicable to the study of most tissue-specific gene activation events.
In the example described below, we utilized E8.5 and E9.5 mouse embryos to examine factor binding at a skeletal muscle specific gene promoter. Somites, which are the precursor tissues from which the skeletal muscles of the trunk and limbs will form, are present at E8.5-9.54,5. Myogenin is a regulatory factor required for skeletal muscle differentiation 6-9. The data demonstrate that myogenin is associated with its own promoter in E8.5 and E9.5 embryos. Because myogenin is only expressed in somites at this stage of development 6,10, the data indicate that myogenin interactions with its own promoter have already occurred in skeletal muscle precursor cells in E8.5 embryos.

We demonstrate a chromatin immunoprecipitation (ChIP) method to identify factor interactions at tissue-specific genes during or after the onset of tissue-specific gene expression in mouse embryonic tissue. This protocol should be widely applicable for the study of tissue-specific gene activation as it occurs during normal embryonic development.

초기 마우스 배아를 사용하는 조직 특정 유전자에 대한 염색질의 Immunoprecipitation 분석

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This ...

Efficient Chromatin Immunoprecipitation using Limiting Amounts of Biomass

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used method for determining the interactions of different proteins with DNA in chromatin of living cells. Examples include sequence-specific DNA binding transcription factors, histones and their different modification states, enzymes such as RNA polymerases and ancillary factors, and DNA repair components. Despite its ubiquity, there is a lack of up-to-date, detailed methodologies for both bench preparation of material and for accurate analysis allowing quantitative metrics of interaction. Due to this lack of information, and also because, like any immunoprecipitation, conditions must be re-optimized for new sets of experimental conditions, the ChIP assay is susceptible to inaccurate or poorly quantitative results.
Our protocol is ultimately derived from seminal work on transcription factor:DNA interactions1,2 , but incorporates a number of improvements to sensitivity and reproducibility for difficult-to-obtain cell types. The protocol has been used successfully3,4 , both using qPCR to quantify DNA enrichment, or using a semi-quantitative variant of the below protocol.
This quantitative analysis of PCR-amplified material is performed computationally, and represents a limiting factor in the assay. Important controls and other considerations include the use of an isotype-matched antibody, as well as evaluation of a control region of genomic DNA, such as an intergenic region predicted not to be bound by the protein under study (or anticipated not to show changes under the experimental conditions). In addition, a standard curve of input material for every ChIP sample is used to derive absolute levels of enrichment in the experimental material. Use of standard curves helps to take into account differences between primer sets, regardless of how carefully they are designed, and also efficiency differences throughout the range of template concentrations for a single primer set. Our protocol is different from others that are available5-8 in that we extensively cover the later, analysis phase.

We describe a robust method for chromatin immunoprecipitation using primary T cells. The method is founded on standard approaches, but uses a specific set of conditions and reagents that improve efficiency for limited a quantities of cells. Importantly, a detailed description of the data analysis phase is presented.

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Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a  widely-used method for determining the interactions of different proteins with  DNA in chromatin of living ...

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological functions have been extensively studied. Indeed, the advent of next-generation deep sequencing and chromatin immunoprecipitation (ChIP) via specific histone modification antibodies has revolutionized our view of epigenetic regulation across the genome. Conversely, tissues typically consist of diverse cell types, and their complex mixture poses analytic challenges to investigating the epigenome in a particular cell type. To address the cell type-specific chromatin state in a genome-wide manner, we recently developed tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq), which is based on the selective purification of chromatin by tagged core histone proteins from cell types of interest, followed by ChIP-Seq. The goal of this protocol is the introduction of best practices of tChIP-Seq. This technique provides a versatile tool for tissue-specific epigenome investigation in diverse histone modifications and model organisms.

We describe a step-by-step protocol for tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq) that enables the analysis of cell-type-specific genome-wide histone modification.

TChIP-Seq: 셀 형식 관련 Epigenome 프로 파일링

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological ...

Chromatin Extraction from Frozen Chimeric Liver Tissue for Chromatin Immunoprecipitation Analysis

Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) is a widely used technique to assess levels of histone marks and occupancy of transcription factors on host and/or pathogen chromatin. Chromatin preparation from tissues creates additional challenges that need to be overcome to obtain reproducible and reliable protocols comparable to those used for cell culture. Tissue disruption and fixation are critical steps to achieve efficient shearing of chromatin. Coexistence of different cell types and clusters may also require different shearing times to reach optimal fragment size and hinders shearing reproducibility. The purpose of this method is to achieve reliable and reproducible host chromatin preparations from frozen tissue (liver) suitable for both ChIP-qPCR and next generation sequencing (NGS) applications. We observed that the combination of liquid nitrogen tissue pulverization followed by homogenization leads to increased reproducibility compared to homogenization only, since it provides a suspension consisting mostly of dissociated single cells that can be efficiently sheared. Moreover, the fixation step should be performed under mild rotation to provide homogeneous crosslinking. The fixed material is then suitable for buffer-based nuclei isolation, to reduce contamination of cytoplasmic protein and pathogen DNAs and RNAs (when applicable), avoiding time-consuming centrifugation gradients. Subsequent sonication will complete nuclear lysis and shear the chromatin, producing a specific size range according to the chosen shearing conditions. The size range should fall between 100 and 300 nt for NGS applications, while it could be higher (300-700 nt) for ChIP-qPCR analysis. Such protocol adaptations can greatly improve chromatin analyses from frozen tissue specimens.

This protocol focuses on chromatin preparation from snap frozen tissues and it is suitable for Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) followed by either quantitative PCR analysis (X-ChIP-qPCR) or next generation sequencing approaches (X-ChIP-seq).

염색질 면역침전 분석을 위한 냉동 키메라 간 조직에서 염색질 추출

Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) is a widely used technique to assess levels of histone marks and occupancy of transcription factors on ...

Chromatin Immunoprecipitation

Histones are proteins that help organize DNA in eukaryotic nuclei by serving as &#8220;scaffolds&#8221; around which DNA can be wrapped, forming a complex called &#8220;chromatin&#8221;. These proteins can be modified through the addition of chemical groups, and these changes affect gene expression. Researchers use a technique called chromatin immunoprecipitation (ChIP) to better understand which DNA regions associate with specific histone modifications or other gene regulatory proteins. Antibodies are used to isolate the protein of interest, and the bound DNA is extracted for analysis. Here, JoVE presents the principles behind ChIP, discussing specific histone modifications and their relationship to gene expression and DNA organization. We then review how to perform a ChIP protocol, and explore the ways scientists are currently using this technique.

크로마틴 면역침전반응

Histones are proteins that help organize DNA in eukaryotic nuclei by serving as &#8220;scaffolds&#8221; around which DNA can be wrapped, forming a complex ...