Name: use of immunolabeling to analyze stable, dynamic, and nascent microtubules in the zebrafish embryo
Uploaded: 2017-09-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 38 s
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Confocal 현미경에서는 미국 국립 과학 재단 (NSF), 부여 #DBI-0722569 자금으로 구입 했습니다. 연구로는 미국 국립 연구소의 건강/국립 연구소의 일반 의료 과학 (NIH/NIGMS) 그랜트 #GM085290 및 미국 부서 방어 (국방부) 부여 #W81XWH-16-1-0466 R.M. 브루 스 터에 게 수 여를 지원 했다. E. 생체 전 대학 및 학부 과학 교육 프로그램을 통해 하 워드 휴즈 의학 연구소에서 UMBC에 교부 금에 의해 지원 되었다, # 52008090를 부여. S.P. 브라운에 의해 미국 부의 교육 GAANN 장학금을 지원 했다, #GM055036, 그리고 자금으로 미국 국방부 부여 #W81XWH-16-1-0466 연구 조교 메이어 대학원 친교 NIH/NIGMS 보조금에 의해 자금.

<ol>
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저자는 공개 없다.

현재 많은 방법이 있다 초기 zebrafish 개발에서 산 역학 이미징을 위한 조직11,12,,1314고정 태그 분자의 라이브 영상에서의 immunolabeling에 이르기까지. 단일 셀에 MTs 동적 또는 안정 상태에 있을 수 있습니다, 있지만 epithelialization는 MTs는 시간이 지남에 따라 점차적으로 안정화 과정 이다. 안정적이 고 동적...

Microtubules (MTs)는 중합체의 α-및 β-tubulin 선형 protofilaments, 몇 가지는 속이 빈 튜브1,2형태로 결합으로 조립 이다. MTs는 끝 플러스 빠른 성장 하 고 느린-성장 하 고 끝은 centrosome 또는 다른 microtubule 조직 센터 (MTOC)3에서 앵커는 마이너스와 대립 된 구조. 드 노 보 MT 형성 nucleation 복잡 한 γ-tubulin 반지에서 (γ-TURC), 마운트 어셈블리4에 대 한 서식 파일을 제공 하 여 시작 됩니다. 어떤 주어진된 셀에 MTs의 두 인구 구분할 수 그 차례 이상의 서로 다른 속도로. 동적 MTs 성장의 단계 동적 불안정5라고 하는 과정에서 수축으로 전환 하 여 그들의 세포질 환경 탐구. 동적 MTs와 달리 안정적인 MTs 비 성장 고 동적 MTs6보다는 더 긴 반감기.

세포 생물학에 있는 연구의 십 년간은 정교한 배열의 마운트 구조와 기능을 공부 하는 도구를 제공 하 고 이러한 cytoskeletal 요소에 지식의 큰 몸이 귀착되. 예를 들어, MTs 설립 및 유지 보수 뿐만 아니라 안정적인 동적 MTs7, 대의 차동 subcellular 배포에 뿐만 아니라 그들의 본질적인 극성에 기인은 세포 극성의 중심 역할을 담당할 8. 반면, 훨씬 덜은 이해 MT 아키텍처 및 척 추가 있는 태아 같은 더 복잡 한 3 차원 (3 차원) 환경에서 기능에 대 한 부분에서 높은 해상도에서 산 골격을 이미징의 도전 때문. 이 제한에도 불구 하 고 최근 세대 GFP 표현 유전자 변형 라인 라벨 MTs 또는 붙일 태그가 MT 마커의 과도 식 MTs 받 다 동적 변화 및 그들의 휴대에 대 한 우리의 이해를 증가 했다 고 zebrafish 태아에 있는 발달 역할. 전체 MT 네트워크 수 수 몇 군데는 tubulin에 유전자 변형 라인에 직접 레이블된9 또는 tubulin 고분자는 직접 표시 하지 MT 관련 된 단백질을 사용 하는 Doublecortin 같은 키 (Dclk) 또는 Ensconsin (EMTB)10, 11. 다른 선 (및 구문) 생성 된 산 플러스 끝 으로써 특히 산 내장 극성의 평가 활성화 또는 끝11,12,13, 마이너스 centrosome 고정 14. 이러한 도구의 힘 유기 체를 개발, MT의 역학을 공부 하는 능력에 있다. 이러한 연구 결과 밝혀졌다, 예를 들어 특정 세포 인구에서 MTs의 공간 및 동적 배포, mitotic의 방향 스핀 들 겪고 morphogenesis (세포 분열의 비행기의 표시기), 조직에 산 폴리머의 극성 세포 신장 등 마이그레이션 프로세스와 관련 및 MT 성장률 혜성 속도9,,1315에 의해 결정. 이러한 도구의 한계는 그들이 쉽게 안정적이 고 동적 MT 인구 사이 차별 하지 않습니다 이다.

풍부한 세포 생물학 문학에서 그리기, zebrafish 태아에 있는 안정적이 고 동적 MTs 이미지를 immunolabeling 방법 설명, 여기는 유전자 변형 라인의 사용을 보완 합니다. 제 브라에서 같은 immunolabeling 방법의 광범위 한 사용은 고정 절차 동안 MT 무결성을 보존 하기에 있는 어려움에 의해 약간 방해 되었습니다. 프로토콜 1 immunolabeling 총, 동적, 최적화 된 방법을 설명 하 고 있는 안정적인 MTs 개발 zebrafish hindbrain의 횡단면. 또한, 상업적으로 사용 하 여 간단한 메서드 사용 가능한 소프트웨어 계량 이러한 산 인구를 설명 되어 있습니다. 안정적인 MTs는 α-tubulin acetylation, detyrosination, 시간16,17동안 안정적인 MTs에 축적 등의 여러 포스트 번역 상 수정에 따라 동적 MTs에서 구별 된다. Zebrafish 태아 acetylation 속눈썹 및 axonal MTs만 안정적인 interphase MTs18, 안정된 MTs의 하위 집합을이 마커의 유용성을 제한 하지에 발생 합니다. 대조적으로, detyrosination18zebrafish 태아 있는 모든 안정적인 MTs에 나타납니다. 이 포스트 번역 상 수정 α-tubulin (detyrosinated tubulin)18 의 카 터미널 글루탐산을 노출 하 고 안티-Glu-tubulin19를 사용 하 여 검출 될 수 있다. Detyrosination 안정 MTs에 우선적으로 발생 합니다, 하지만 실험적인 증거가 포스트 번역 상 수정 산 안정성16의 원인 보다는의 결과 임을 나타냅니다. 동적 MTs 구성 상호 MT 인구, 항 체, 안티-Tyr-tubulin, 그 구체적으로 인식 하는 α-tubulin19의 tyrosinated 형태를 사용 하 여 구별 된다. 이러한 마커 및 confocal 영상 immunolabeling, 다음 MTs (길이, 번호, 및 관계 되는 풍부)의 정량 분석 개발 신경 튜브의 정의 된 영역에서 수행할 수 있습니다. 효율적인된 방안은 여기 3 차원 이미지 처리 소프트웨어를 사용 하 여이 분석을 수행 하기 위해 제공 됩니다. 이 메서드는 주소 morphogenesis 설립 또는 세포 극성20의 성숙에 관한 질문에 적용할 수 있습니다. 실제로, 안정적인 MTs의 편광 배열의 정교 포토 리셉터 morphogenesis21, 개발 신경 튜브18 및 축 삭 형성8셀의 epithelialization를 포함 하 여 많은 개발 이벤트를 동반 한다.

프로토콜 2 그들의 어셈블리 단계 (nucleation/앵커리지와 성장)22,23동안 MTs를 분석 하는 세포 생물학 분석 실험의 비보에 적응을 설명 합니다. 초기 MTs는 centrosome에서 nucleated 되며 이후 어머니 중심소체23의 subdistal 부속에 고정. Depolymerization를 다음 초기 MT 자라나 분석 하는 방법을 설명 합니다. 이 프로토콜 MTs, 약 희미하게 절차와 치료 후 회복 기간 depolymerize nocodazole 치료에 세부 정보를 제공 합니다. MT 다시 성장에서 정기적 모니터링총 MTs에 대 한 마커 immunolabeling에 의해 s 게시물 유실 (β-tubulin) 안티는 centrosome에 대 한 표시와 함께 (안티 γ-tubulin)과 핵 (4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)), 프로토콜 1에서 설명 하는 일반 절차에 따라. 이 프로토콜의 MT depolymerization 단계 드 노 보 산 성장에 대 한 평가 보다는 기존 MTs의 확장 하면 필수적 이다. 이 기술은 다른 측정 하 산 성장 속도 (depolymerization의 부재) 끝 트 란 외.와 같이 녹색 형광 단백질 (GFP EB3), 융합 단백질 3을 묶는 등 플러스 팁 마커를 사용 하 여 다른 게시 된 절차 이므로 201211. 또한,이 분석 결과 배아 드 노 보 마운트 어셈블리에 결함 분석에 특히 유용 이전에 보고 된 NEDD1 돌연변이는 γ-tubulin는 centrosome에의 채용은 장애인 등에서 불완전 한 결과 신경 관 형성 및 신경 결함24.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td></td><td></td><td>Used to treat petridishes.&amp;nbsp;&amp;nbsp; Prepare 1% agarose&lt;br/&gt; by heating a solution of&amp;nbsp; 1 gram agarose per 100 ml 1X embryo medium in a microwave&lt;br/&gt; until polymerized.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Kpipes</td><td>Sigma</td><td>P7643</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma</td><td>T3253-500G</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333-500G</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&amp;middot;2H2O</td><td>Sigma</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>American Bioanalyticals</td><td>AB01424</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889-25G</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M2670-500G</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>Fisher</td><td>BP1605</td><td></td></tr><tr><td>Triton-x</td><td>American Bioanalyticals</td><td>AB02025</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Fade mounting medium</td><td>Invitrogen</td><td>P10144</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-&amp;beta;-tubulin</td><td>Developmental studies Hybridoma Bank</td><td>E7</td><td>1/200</td></tr><tr><td>Rabbit anti-&amp;gamma;-tubulin</td><td>Genetex</td><td>GTX113286</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Rabbit anti-&amp;alpha;-tubulin</td><td>Genetex</td><td>GTX108784</td><td>1/1000*</td></tr><tr><td>Rabbit anti-detyrosinated-tubulin</td><td>Millipore</td><td>AB3201</td><td>1/200-1/1000*&amp;nbsp; Titrate antibody with first use of new lot.</td></tr><tr><td>Rabbit anti-tyrosinated-tubulin</td><td>Millipore</td><td>ABT171</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Mouse anti-centrin</td><td>Millipore</td><td>04-1624</td><td>1/1000</td></tr><tr><td>Goat 488 anti-rabbit</td><td>Thermofisher</td><td>A11008</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Goat 594 anti-rabbit</td><td>Thermofisher</td><td>A11012</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Goat 594 anti-mouse</td><td>Thermofisher</td><td>A11005</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Goat 488 anti-mouse</td><td>Thermofisher</td><td>A11001</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Vibratome</td><td>1500</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>World Precision Instruments</td><td>555227F</td><td></td></tr><tr><td>100 mm petri dish</td><td>Cell treat</td><td>229693</td><td></td></tr><tr><td>35 mm petri dish</td><td>Cell treat</td><td>229638</td><td></td></tr><tr><td>50 ml falcon tube</td><td>Fisher</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Woven nylon mesh 70 um</td><td>Amazon.com</td><td>B0043D1SZG&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette</td><td>Gilson</td><td>F123602</td><td></td></tr><tr><td>Glass pipette</td><td>Fisher</td><td>NC-999363-9</td><td></td></tr><tr><td>Aquarium sealant</td><td>Amazon.com, by MarineLand</td><td>Silicone Sealer 1 oz (Tube)&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ring stand</td><td>Fisher</td><td>14-675BO</td><td></td></tr><tr><td>Microbore PTFE Tubing, 0.022&quot;ID</td><td>Cole-Parmer</td><td>WU-06417-21</td><td></td></tr><tr><td>Modeling clay</td><td>Amazon.com</td><td>Sargent Art 22-4000</td><td>Any wax or oil based non-toxic modeling clay will suffice</td></tr><tr><td>Clamp</td><td>Fisher</td><td>02-215-466</td><td></td></tr><tr><td>60ml syringe</td><td>Fisher</td><td>14-820-11</td><td></td></tr><tr><td>Embryo medium (E3)</td><td></td><td></td><td>34.8 g NaCl&lt;br/&gt; 1.6 g KCl&lt;br/&gt; 5.8 g CaCl2&amp;middot;2H2O&lt;br/&gt; 9.78 g MgCl2&amp;middot;6H2O&lt;br/&gt; &lt;br/&gt; To prepare a 60X stock, dissolve the ingredients in H2O, to a final volume of 2 L. Adjust the pH to 7.2 with NaOH. Autoclave. To prepare 1X medium, dilute 16.5 mL of the 60X stock to 1 L.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Blocking Solution</td><td></td><td></td><td>50 ml TBS-NP-40&lt;br/&gt; 2.5 ml normal goat serum&lt;br/&gt; 1 g BSA&lt;br/&gt; 625 &amp;micro;l Triton-X</td></tr><tr><td>TBS-NP-40 (pH 7.6)</td><td></td><td></td><td>155 mM NaCl&lt;br/&gt; 10 mM Tris HCl&lt;br/&gt; 0.1% NP-40</td></tr><tr><td>2x MAB (pH6.4)</td><td></td><td></td><td>160 mM KPIPES&lt;br/&gt; 10 mM EGTA&lt;br/&gt; 2 mM MgCl2</td></tr><tr><td>Commercial 3-D Image processing Software</td><td>PerkinElmer</td><td>Volocity (V 6.2)</td><td></td></tr><tr><td>Dry block heater&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>12621-108</td><td>Used as a hot plate to melt agarose in Protocol 1.</td></tr><tr><td>Dissecting Microscope</td><td>Leica</td><td>MZ12</td><td></td></tr><tr><td>Confocal Microscope</td><td>Leica</td><td>SP5</td><td></td></tr><tr><td>Flat embedding mold</td><td>emsdiasum.com</td><td>BEEM 70904-01</td><td></td></tr><tr><td>Public domain image processing software</td><td>NIH</td><td>ImageJ (V 1.5)</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">* Success varies by lot number</td></tr></tbody></table>

use of immunolabeling to analyze stable, dynamic, and nascent microtubules in the zebrafish embryo

Microtubules (MTs)는 역동적이 고 연약한 구조는 이미지에 vivo에서, 특히 척 추가 있는 태아에에서 게 도전 하는. Immunolabeling 메서드는 zebrafish 태아의 개발 신경 관에서 MTs의 명백한 인구 분석 여기 설명 되어 있습니다. 신경 조직에 포커스를 실행 하는 동안이 방법론은 다른 조직에 광범위 하 게 적용 됩니다. 그러나 절차는 일찍 중반 somitogenesis 단계 배아 (1 somite 12 somites에), 그들은 수 다른 단계 비교적 사소한 조정의 범위에 적응을 위해 최적화 됩니다. 첫 번째 프로토콜에는 안정적이 고 동적 MTs의 공간적 분포를 평가 하 고 이미지 처리 소프트웨어와 함께 이러한 인구의 정량 분석을 수행 하는 방법을 제공 합니다. 이 방법은 기존 도구 이미지 microtubule 역학 및 실시간, 사용 유전자 변형 라인 또는 태그 구문 과도 식에서 배포를 보완합니다. 그러나 사실, 이러한 도구는 매우 유용 합니다, 쉽게 역동적이 고 안정적인 MTs 사이 구분 하지 않습니다. 이미지 분석이 고유한 microtubule 인구를 셀 분극 및 morphogenesis 기본 이해 메커니즘에 대 한 중요 한 의미를 갖는다. 두 번째 프로토콜 초기 MTs를 구체적으로 분석 하는 기법을 설명 합니다. 이것은 약 nocodazole와 마약 유실 후 복구 기간 microtubule depolymerization 다음 시간이 지남에, MTs의 드 노 보 성장 특성을 포착 하 여 수행 됩니다. 이 기술은 zebrafish 태아에 있는 MTs의 연구에 적용 하지 않은 하지만 microtubule 어셈블리에 연루는 단백질의 기능 vivo에서 조사에 대 한 가치 있는 분석 결과 이다.

Immunolabeling를 사용 하 여 안정적이 고 동적 MTs의 분석 프로토콜 1, 산 초 (신경 용골) 동안 부분 모집단의 분포와 신경 관 발달의 늦은 (신경 대) 단계 드러났습니다, 각각 사용 하 여 Glu tubulin 및 Tyr tubulin 표식으로 안정적이 고 동적 MTs에 대 한. 동적 MTs는 hindbrain에 신경 용골 단계 (4-5 somites)에서 지배 (그림 2A-D). ...

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Use of Immunolabeling to Analyze Stable, Dynamic, and Nascent Microtubules in the Zebrafish Embryo

Immunolabeling 방법 개발 zebrafish 두뇌에 microtubules의 명료한 인구를 분석 하는 다른 조직에 광범위 하 게 적용 되는 여기에, 설명 됩니다. 첫 번째 프로토콜 immunolabeling 안정적이 고 동적 microtubules에 대 한 최적화 된 방법을 설명합니다. 두 번째 프로토콜 이미지와 초기 microtubules 구체적으로 정량화 하는 방법을 제공 합니다.

분석, 동적, 안정과 초기 Microtubules Zebrafish 태아에 있는 Immunolabeling의 사용

Microtubules (MTs) are dynamic and fragile structures that are challenging to image in vivo, particularly in vertebrate embryos. Immunolabeling methods ...

use-immunolabeling-to-analyze-stable-dynamic-nascent-microtubules

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.2K 조회수.  University of Maryland, Baltimore County. Immunolabeling 방법 개발 zebrafish 두뇌에 microtubules의 명료한 인구를 분석 하는 다른 조직에 광범위 하 게 적용 되는 여기에, 설명 됩니다. 첫 번째 프로토콜 immunolabeling 안정적이 고 동적 microtubules에 대 한 최적화 된 방법을 설명합니다. 두 번째 프로토콜 이미지와 초기 microtubules 구체적으로 정량화 하는 방법을 제공 합니다.

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Labeling and Imaging Cells in the Zebrafish Hindbrain

Key to understanding the morphogenetic processes that shape the early vertebrate embryo is the ability to image cells at high resolution. In zebrafish embryos, injection of plasmid DNA results in mosaic expression, allowing for the visualization of single cells or small clusters of cells 1 . We describe how injection of plasmid DNA encoding membrane-targeted Green Fluorescent Protein (mGFP) under the control of a ubiquitous promoter can be used for imaging cells undergoing neurulation. Central to this protocol is the methodology for imaging labeled cells at high resolution in sections and also in real time. This protocol entails the injection of mGFP DNA into young zebrafish embryos. Embryos are then processed for vibratome sectioning, antibody labeling and imaging with a confocal microscope. Alternatively, live embryos expressing mGFP can be imaged using time-lapse confocal microscopy. We have previously used this straightforward approach to analyze the cellular behaviors that drive neural tube formation in the hindbrain region of zebrafish embryos 2. The fixed preparations allowed for unprecedented visualization of cell shapes and organization in the neural tube while live imaging complemented this approach enabling a better understanding of the cellular dynamics that take place during neurulation.

Key to understanding the morphogenetic processes that shape the early embryo is the ability to image cells at high resolution. We describe here a technique for labeling single cells or small clusters of cells in whole zebrafish embryos with membrane-targeted Green Fluorescent Protein.

Zebrafish의 Hindbrain에 라벨 부착 및 이미징 셀

Key to understanding the morphogenetic processes that shape the early vertebrate embryo is the ability to image cells at high resolution. In zebrafish ...

연구

신경과학

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.

분석<em&gt; 생체</em&gt; 셀 마이그레이션 Zebrafish의 배아에서 세포 이식 및 시간 경과 이미징을 사용하여

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

발생학

Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin condensation, microtubule-kinetochore attachment, chromosome segregation, and cytokinesis in a small time frame. Errors in the delicate process can result in human disease, including birth defects and cancer. Traditional approaches investigating human mitotic disease states often rely on cell culture systems, which lack the natural physiology and developmental/tissue-specific context advantageous when studying human disease. This protocol overcomes many obstacles by providing a way to visualize, with high resolution, chromosome dynamics in a vertebrate system, the zebrafish. This protocol will detail an approach that can be used to obtain dynamic images of dividing cells, which include: in vitro transcription, zebrafish breeding/collecting, embryo embedding, and time-lapse imaging. Optimization and modifications of this protocol are also explored. Using H2A.F/Z-EGFP (labels chromatin) and mCherry-CAAX (labels cell membrane) mRNA-injected embryos, mitosis in AB wild-type, auroraBhi1045, and esco2hi2865 mutant zebrafish is visualized. High resolution live imaging in zebrafish allows one to observe multiple mitoses to statistically quantify mitotic defects and timing of mitotic progression. In addition, observation of qualitative aspects that define improper mitotic processes (i.e., congression defects, missegregation of chromosomes, etc.) and improper chromosomal outcomes (i.e., aneuploidy, polyploidy, micronuclei, etc.) are observed. This assay can be applied to the observation of tissue differentiation/development and is amenable to the use of mutant zebrafish and pharmacological agents. Visualization of how defects in mitosis lead to cancer and developmental disorders will greatly enhance understanding of the pathogenesis of disease.

Mitosis is critical to every living organism and defects often lead to cancer and developmental disorders. Using this imaging protocol and zebrafish as a model system, researchers can visualize mitosis in a live vertebrate organism and the multitude of defects that arise when mitotic processes are defective.

라이브 Zebrafish의 배아에서 유사 분열 부문 및 역학을 관찰

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin ...

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and optical transparency. In particular, the zebrafish embryo has become an important organism to study vertebrate kidney organogenesis as well as multiciliated cell (MCC) development. To visualize MCCs in the embryonic zebrafish kidney, we have developed a combined protocol of whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) and whole mount immunofluorescence (IF) that enables high resolution imaging. This manuscript describes our technique for co-localizing RNA transcripts and protein as a tool to better understand the regulation of developmental programs through the expression of various lineage factors.

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Cilia development is vital to proper organogenesis. This protocol describes an optimized method to label and visualize ciliated cells of the zebrafish.

Multiciliated 셀 전체 마운트 형광 제자리에서 교 잡 및 면역 형광의 결합 된 프로토콜을 통해 Zebrafish에 시각화

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

<meta charset="utf8"></head><body>CRISPR/Cas9 Knock-In을 사용한 제브라피시 유충의 형광 단백질 태깅

Fluorescence Labeling to Visualize Low-Expressed Proteins in Zebrafish

CRISPR/Cas9-mediated knock-in (KI) technology allows for easier fluorescent-protein tagging in zebrafish (Danio rerio), a preferred model organism for in vivo imaging due to its transparency during the early developmental stage. Here, we provide a detailed protocol for performing high-efficiency fluorescence gene KI, rapid screening for KI founders, and low-abundance protein tracing in zebrafish larvae, which will lay a critical foundation for subsequent physio-pathological studies in zebrafish. The current protocol includes complete steps for the sgRNA design for the gene of interest, sgRNA in vitro transcription, Cas9 mRNA in vitro transcription, in vivo sgRNA screen for the one with the highest efficiency, donor plasmid design and construction, microinjection in zebrafish larvae, KI founder screen and zebrafish live imaging. Critical steps, troubleshooting tips, quality control methods, and advantages and applications of this protocol are included and discussed. This protocol assures quick and accurate results at a low cost and has been validated by multiple trials.

<meta charset="utf8"></head><body>제브라피시에서 저발현 단백질을 시각화하기 위한 형광 라벨링

Here, we present a protocol to label proteins with a fluorescence protein tag in zebrafish larvae, a newly developed and modified in vivo system especially useful for visualizing low-abundance proteins in zebrafish.

제브라피시에서 저발현 단백질을 시각화하기 위한 형광 라벨링

CRISPR/Cas9-mediated knock-in (KI) technology allows for easier fluorescent-protein tagging in zebrafish (Danio rerio), a preferred model organism for in ...

유전학

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. Although many immunohistochemistry protocols have been optimized for mammalian tissue and tissue sections, these protocols often require modification and optimization for non-mammalian model organisms. Zebrafish are increasingly used as a model system in basic, biomedical, and translational research to investigate the molecular, genetic, and cell biological mechanisms of developmental processes. Zebrafish offer many advantages as a model system but also require modified techniques for optimal protein detection. Here, we provide our protocol for whole-mount fluorescence immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae. This protocol additionally describes several different mounting strategies that can be employed and an overview of the advantages and disadvantages each strategy provides. We also describe modifications to this protocol to allow detection of chromogenic substrates in whole mount tissue and fluorescence detection in sectioned larval tissue. This protocol is broadly applicable to the study of many developmental stages and embryonic structures.

Here, we present a protocol for fluorescent antibody-mediated detection of proteins in whole preparations of zebrafish embryos and larvae.

제브라피시 배아와 애벌레의 전체 마운트 면역항암화학

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...

Antibody Uptake Assay for Tracking Notch/Delta Endocytosis During the Asymmetric Division of Zebrafish Radial Glia Progenitors

Asymmetric cell division (ACD), which produces two daughter cells of different fates, is fundamental for generating cellular diversity. In the developing organs of both invertebrates and vertebrates, asymmetrically dividing progenitors generates a Notchhi self-renewing and a Notchlo differentiating daughter. In the embryonic zebrafish brain, radial glia progenitors (RGPs)-the principal vertebrate neural stem cells-mostly undergo ACD to give birth to one RGP and one differentiating neuron. The optical clarity and easy accessibility of zebrafish embryos make them ideal for in vivo time-lapse imaging to directly visualize how and when the asymmetry of Notch signaling is established during ACD. Recent studies have shown that dynamic endocytosis of the Notch ligand DeltaD plays a crucial role in cell fate determination during ACD, and the process is regulated by the evolutionarily conserved polarity regulator Par-3 (also known as Pard3) and the dynein motor complex. To visualize the in vivo trafficking patterns of Notch signaling endosomes in mitotic RGPs, we have developed this antibody uptake assay. Using the assay, we have uncovered the dynamicity of DeltaD-containing endosomes during RGP division.

This work develops an antibody uptake assay for imaging intra-lineage Notch/DeltaD signaling in dividing radial glia progenitors of the embryonic zebrafish brain.

Zebrafish Radial Glia Progenitors의 비대칭 분열 동안 Notch/Delta Endocytosis 추적을 위한 항체 흡수 분석

Asymmetric cell division (ACD), which produces two daughter cells of different fates, is fundamental for generating cellular diversity. In the developing ...

Imaging Glycans in Zebrafish Embryos by Metabolic Labeling and Bioorthogonal Click Chemistry

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or alkyne-tagged monosaccharides1, 2. The modified monosaccharides, processed by the glycan biosynthetic machinery, are incorporated into cell surface glycoconjugates. The bioorthogonal azide or alkyne tags then allow covalent conjugation with fluorescent probes for visualization, or with affinity probes for enrichment and glycoproteomic analysis. This protocol describes the procedures typically used for noninvasive imaging of fucosylated glycans in zebrafish embryos, including: 1) microinjection of one-cell stage embryos with GDP-5-alkynylfucose (GDP-FucAl), 2) labeling fucosylated glycans in the enveloping layer of zebrafish embryos with azide-conjugated fluorophores via biocompatible Cu(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC), and 3) imaging by confocal microscopy3. The method described here can be readily extended to visualize other classes of glycans, e.g. glycans containing sialic acid4 and N-acetylgalactosamine5, 6, in developing zebrafish and in other living organisms.

A click-chemistry based method that allows for the rapid, noninvasive, and robust labeling of alkyne-tagged glycans in zebrafish embryos is described. Fucosylated glycans in the enveloping layer of zebrafish embryos in the late gastrulation stage were imaged in this study.

분석, 동적, 안정과 초기 Microtubules Zebrafish 태아에 있는 Immunolabeling의 사용

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제브라피시에서 저발현 단백질을 시각화하기 위한 형광 라벨링

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Zebrafish Radial Glia Progenitors의 비대칭 분열 동안 Notch/Delta Endocytosis 추적을 위한 항체 흡수 분석

신진 대사 라벨링 및 Bioorthogonal 클릭 화학에 의해 Zebrafish 태아의 영상 Glycans