Il microscopio confocale è stato acquistato con fondi dal US National Science Foundation (NSF), grant #DBI-0722569. La ricerca è stata sostenuta da l'US National istituti di salute/National Institute of General Medical Sciences (NIH/NIGMS) grant #GM085290 e U.S. dipartimento della difesa (DOD) grant n #W81XWH-16-1-0466 assegnato a R.M. Brewster. E. Vital è stato sostenuto da una sovvenzione per UMBC da Howard Hughes Medical Institute attraverso il pre-college e il programma di educazione scientifica dello studente non laureato, concedere #52008090. S.P. Brown è stato sostenuto da un US Dipartimento di educazione GAANN Fellowship, una borsa di studio Meyerhoff finanziato dalla sovvenzione di NIH/NIGMS #GM055036 e un assistentato di ricerca finanziato da l'US DOD grant n #W81XWH-16-1-0466.

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Attualmente ci sono molti metodi per imaging dinamiche MT nello sviluppo iniziale di zebrafish, che vanno da formazione immagine diretta di molecole con tag a immunolabeling di fisso tessuto11,12,13,14. Anche se MTs in una singola cella può esistere in stati stabili o dinamici, epithelialization è un processo in cui MTs sono progressivamente stabilizzate nel corso del tempo. Usando gli indica...

Microtubuli (MTs) sono polimeri di α - e β-tubulina che assemblare in protofilamenti lineari, molte delle quali si combinano per formare un tubo cavo1,2. Le MT sono strutture polarizzate, con rapida crescita plus estremità ed a crescita lenta meno le estremità che sono ancorate al centrosoma o altri di organizzazione dei microtubuli (MTOC) centro3. De novo Formazione di MT è iniziata da nucleazione presso l'anello di γ-tubulina complessa (γ-TURC), che fornisce un modello per MT montaggio4. In ogni cellula, due popolazioni di MTs possono essere distinte che girano sopra ai tassi differenti. MTs dinamico esplorare il loro ambiente cellulare passando tra le diverse fasi di crescita e di ritiro in un processo noto come instabilità dinamica5. A differenza di dinamica MTs, MTs stabile sono non-crescita e hanno un'emivita più lunga rispetto a dinamiche MTs6.

Decenni di ricerca in biologia cellulare ha fornito una sofisticata gamma di strumenti per studiare la funzione e la struttura MT e ha provocato un grande corpo di conoscenza su questi elementi del citoscheletro. Per esempio, MTs gioca un ruolo centrale nella creazione e mantenimento della polarità cellulare, che è attribuibile non solo alla loro polarità intrinseca, ma anche per la distribuzione subcellulare differenziale della scuderia contro dinamico MTs7, 8. al contrario, molto meno è capito circa MT architettura e funzione in ambienti (3D) tridimensionale più complessi, come l'embrione dei vertebrati, in parte dovuto la sfida di imaging del citoscheletro MT ad alta risoluzione. Nonostante questa limitazione, la più recente generazione di transgenici esprimenti GFP linee quell'etichetta MTs o transitoria espressione di marcatori di MT fluorescente-Tag ha aumentato la nostra comprensione dei cambiamenti dinamici che MTs subiscono e loro cellulare e ruolo dello sviluppo nell'embrione di zebrafish. L'intera rete MT può essere imaged in linee transgeniche in cui tubulina è sia direttamente con etichetta9 o tubulina polimeri sono etichettati indirettamente utilizzando proteine associate MT Doublecortin-like-chinasi (Dclk) o Ensconsin (EMTB)10, 11. Altre linee (e costrutti) sono stati generati che consentire la valutazione della polarità intrinseca MT identificando specificamente MT più finisce o ancorato centrosoma meno estremità11,12,13, 14. la potenza di questi strumenti si trova nella capacità di studiare la dinamica di MT in diretta, lo sviluppo di organismi. Tali studi hanno rivelato, ad esempio, la distribuzione spaziale e dinamica di MTs in popolazioni di cellule specifiche, l'orientamento di mitotic mandrini in tessuti in fase di morfogenesi (un indicatore del piano di divisione delle cellule), la polarità del polimero MT per quanto riguarda processi quali allungamento delle cellule e la migrazione e tasso di crescita di MT determinata dalla cometa velocità9,13,15. La limitazione di questi strumenti è che essi non prontamente discriminano tra popolazioni MT stabile e dinamici.

Attingendo alla letteratura biologia cellulare ricca, immunolabeling metodi di immagine stabile e dinamico MTs nell'embrione di zebrafish sono descritti qui, che sono complementari all'uso di linee transgeniche. L'uso molto diffuso di tali metodi immunolabeling in zebrafish è stata un po' ostacolata dalla difficoltà nel preservare l'integrità MT durante la procedura di fissazione. 1 protocollo delinea un metodo ottimizzato per immunolabeling totale, dinamico, e stabile MTs in sezioni trasversali del hindbrain zebrafish in via di sviluppo. Inoltre, un metodo diretto utilizzando commercialmente disponibile software è descritto per quantificare queste popolazioni di MT. MTs stabile si distinguono da MTs dinamico basato su diverse modificazioni post-traduzionali di α-tubulina, quali acetilazione e detyrosination, che si accumulano su MTs stabile nel tempo16,17. Nell'embrione di zebrafish, acetilazione si verifica su MTs ciliare e axonal ma non su stabile interfase MTs18, limitando l'utilità di questo indicatore a un sottoinsieme di MTs stabilizzato. Al contrario, detyrosination sembra verificarsi su tutte le MTs stabile nel quartiere di embrione di zebrafish18. Questa modificazione post-traduzionale espone l'acido glutammico carbossi-terminale di α-tubulina (detyrosinated tubulina)18 e può essere rilevata utilizzando anti-Glu-tubulina19. Anche se detyrosination si verifica preferenzialmente su MTs stabile, la prova sperimentale indica che questa modificazione post-traduzionale è un risultato di, piuttosto che una causa di, MT stabilità16. La popolazione di reciproco MT, composta da MTs dinamico, si distingue usando un anticorpo, anti-Tyr-tubulina, che riconosce specificamente la forma di termine di α-tubulina19. A seguito di immunolabeling con questi marcatori e imaging confocale, l'analisi quantitativa di MTs (lunghezza, numero e abbondanza relativa) può essere eseguita in regioni definite del tubo neurale in via di sviluppo. Qui vi attende un metodo semplificato per l'esecuzione di questa analisi utilizzando software di elaborazione delle immagini 3D. Questo metodo può essere applicato per rispondere alle domande per quanto riguarda la morfogenesi e l'istituzione o la maturazione delle cellule polarità20. Infatti, l'elaborazione di matrici polarizzate di MTs stabile accompagna molti eventi inerenti allo sviluppo, tra cui fotorecettore morfogenesi21, epithelialization delle cellule nello sviluppo del tubo neurale18 e assone formazione8.

Protocollo n. 2 descrive un adattamento in vivo di un'analisi di biologia delle cellule per analizzare MTs durante il loro montaggio fase (nucleazione/anchorage e crescita)22,23. Nascente MTs sono nucleate presso il centrosoma e successivamente ancorati alla subdistal appendici della madre Centriolo23. È descritto un metodo per analizzare la nascente ricrescita MT seguendo la depolimerizzazione. Questo protocollo fornisce dettagli sul trattamento nocodazole a depolymerize MTs, la procedura di washout di droga e il periodo di recupero post-trattamento. MT. re-crescita viene monitorata ad intervalli regolariwashout post s da immunolabeling con marcatori per MTs totale (anti β-tubulina) al fianco di marcatori per il centrosoma (anti γ-tubulina) e nucleo (4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)), secondo le procedure generali descritte nel protocollo n. 1. Il passo di depolimerizzazione MT del presente protocollo è essenziale in quanto permette la valutazione della crescita MT de novo piuttosto che estensione di preesistenza MTs. Questa tecnica è quindi distinta da altre procedure pubblicate per misurare i tassi di crescita di MT (in assenza di depolimerizzazione) utilizzando un marcatore con punta plus come fine proteina 3 fusa alla proteina fluorescente verde (EB3-GFP), come mostrato in Tran et al., 201211. Inoltre, questo test è particolarmente utile per l'analisi di embrioni difettosi in de novo MT assieme, come ad esempio i mutanti NEDD1 precedentemente segnalati in cui il reclutamento di γ-tubulina per il centrosoma è alterato, conseguente incompleta formazione del tubo neurale e difetti di un neurone24.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td></td><td></td><td>Used to treat petridishes.&amp;nbsp;&amp;nbsp; Prepare 1% agarose&lt;br/&gt; by heating a solution of&amp;nbsp; 1 gram agarose per 100 ml 1X embryo medium in a microwave&lt;br/&gt; until polymerized.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Kpipes</td><td>Sigma</td><td>P7643</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma</td><td>T3253-500G</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333-500G</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&amp;middot;2H2O</td><td>Sigma</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>American Bioanalyticals</td><td>AB01424</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889-25G</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M2670-500G</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>Fisher</td><td>BP1605</td><td></td></tr><tr><td>Triton-x</td><td>American Bioanalyticals</td><td>AB02025</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Fade mounting medium</td><td>Invitrogen</td><td>P10144</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-&amp;beta;-tubulin</td><td>Developmental studies Hybridoma Bank</td><td>E7</td><td>1/200</td></tr><tr><td>Rabbit anti-&amp;gamma;-tubulin</td><td>Genetex</td><td>GTX113286</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Rabbit anti-&amp;alpha;-tubulin</td><td>Genetex</td><td>GTX108784</td><td>1/1000*</td></tr><tr><td>Rabbit anti-detyrosinated-tubulin</td><td>Millipore</td><td>AB3201</td><td>1/200-1/1000*&amp;nbsp; Titrate antibody with first use of new lot.</td></tr><tr><td>Rabbit anti-tyrosinated-tubulin</td><td>Millipore</td><td>ABT171</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Mouse anti-centrin</td><td>Millipore</td><td>04-1624</td><td>1/1000</td></tr><tr><td>Goat 488 anti-rabbit</td><td>Thermofisher</td><td>A11008</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Goat 594 anti-rabbit</td><td>Thermofisher</td><td>A11012</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Goat 594 anti-mouse</td><td>Thermofisher</td><td>A11005</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Goat 488 anti-mouse</td><td>Thermofisher</td><td>A11001</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Vibratome</td><td>1500</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>World Precision Instruments</td><td>555227F</td><td></td></tr><tr><td>100 mm petri dish</td><td>Cell treat</td><td>229693</td><td></td></tr><tr><td>35 mm petri dish</td><td>Cell treat</td><td>229638</td><td></td></tr><tr><td>50 ml falcon tube</td><td>Fisher</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Woven nylon mesh 70 um</td><td>Amazon.com</td><td>B0043D1SZG&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette</td><td>Gilson</td><td>F123602</td><td></td></tr><tr><td>Glass pipette</td><td>Fisher</td><td>NC-999363-9</td><td></td></tr><tr><td>Aquarium sealant</td><td>Amazon.com, by MarineLand</td><td>Silicone Sealer 1 oz (Tube)&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ring stand</td><td>Fisher</td><td>14-675BO</td><td></td></tr><tr><td>Microbore PTFE Tubing, 0.022&quot;ID</td><td>Cole-Parmer</td><td>WU-06417-21</td><td></td></tr><tr><td>Modeling clay</td><td>Amazon.com</td><td>Sargent Art 22-4000</td><td>Any wax or oil based non-toxic modeling clay will suffice</td></tr><tr><td>Clamp</td><td>Fisher</td><td>02-215-466</td><td></td></tr><tr><td>60ml syringe</td><td>Fisher</td><td>14-820-11</td><td></td></tr><tr><td>Embryo medium (E3)</td><td></td><td></td><td>34.8 g NaCl&lt;br/&gt; 1.6 g KCl&lt;br/&gt; 5.8 g CaCl2&amp;middot;2H2O&lt;br/&gt; 9.78 g MgCl2&amp;middot;6H2O&lt;br/&gt; &lt;br/&gt; To prepare a 60X stock, dissolve the ingredients in H2O, to a final volume of 2 L. Adjust the pH to 7.2 with NaOH. Autoclave. To prepare 1X medium, dilute 16.5 mL of the 60X stock to 1 L.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Blocking Solution</td><td></td><td></td><td>50 ml TBS-NP-40&lt;br/&gt; 2.5 ml normal goat serum&lt;br/&gt; 1 g BSA&lt;br/&gt; 625 &amp;micro;l Triton-X</td></tr><tr><td>TBS-NP-40 (pH 7.6)</td><td></td><td></td><td>155 mM NaCl&lt;br/&gt; 10 mM Tris HCl&lt;br/&gt; 0.1% NP-40</td></tr><tr><td>2x MAB (pH6.4)</td><td></td><td></td><td>160 mM KPIPES&lt;br/&gt; 10 mM EGTA&lt;br/&gt; 2 mM MgCl2</td></tr><tr><td>Commercial 3-D Image processing Software</td><td>PerkinElmer</td><td>Volocity (V 6.2)</td><td></td></tr><tr><td>Dry block heater&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>12621-108</td><td>Used as a hot plate to melt agarose in Protocol 1.</td></tr><tr><td>Dissecting Microscope</td><td>Leica</td><td>MZ12</td><td></td></tr><tr><td>Confocal Microscope</td><td>Leica</td><td>SP5</td><td></td></tr><tr><td>Flat embedding mold</td><td>emsdiasum.com</td><td>BEEM 70904-01</td><td></td></tr><tr><td>Public domain image processing software</td><td>NIH</td><td>ImageJ (V 1.5)</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">* Success varies by lot number</td></tr></tbody></table>

use of immunolabeling to analyze stable, dynamic, and nascent microtubules in the zebrafish embryo

Microtubuli (MTs) sono strutture dinamiche e fragile che stanno sfida a immagine in vivo, in particolare in embrioni vertebrati. Immunolabeling metodi sono descritte qui per analizzare popolazioni distinte di MTs nel tubo neurale in via di sviluppo dell'embrione di zebrafish. Mentre l'attenzione è il tessuto neurale, questa metodologia è ampiamente applicabile ad altri tessuti. Le procedure sono ottimizzate per presto ad metà-somitogenesis-stage embrioni (1 somite a 12 somiti), tuttavia possono essere adattati ad una gamma di altre fasi con relativamente piccoli aggiustamenti. Il primo protocollo fornisce un metodo per valutare la distribuzione spaziale delle MTs stabile e dinamico ed eseguire un'analisi quantitativa di queste popolazioni con il software di elaborazione delle immagini. Questo approccio si integra con gli strumenti esistenti per immagine microtubule dynamics e distribuzione in tempo reale, utilizza linee transgeniche o espressione transitoria di costrutti con tag. Infatti, tali strumenti sono molto utili, tuttavia non facilmente distinguere MTs dinamica e stabile. La capacità di immagine e analizzare queste popolazioni distinte microtubule ha implicazioni importanti per la comprensione dei meccanismi alla base di polarizzazione cellulare e morfogenesi. Il secondo protocollo delinea una tecnica per analizzare in particolare il nascente MTs. Questa operazione viene eseguita mediante l'acquisizione le proprietà di crescita de novo di MTs nel tempo, seguendo la depolimerizzazione dei microtubuli con il nocodazole di droga e un periodo di recupero dopo interruzione del farmaco. Questa tecnica non è ancora stata applicata allo studio di MTs in embrioni di zebrafish, ma è un saggio prezioso per indagare la funzione in vivo delle proteine implicate in microtubuli.

Analisi di MTs stabile e dinamico utilizzando immunolabeling Nel protocollo n. 1, la distribuzione delle sub-popolazioni MT durante prima (chiglia neurale) e fine (neurali asta) fasi di sviluppo del tubo neurale sono rivelate, utilizzando Glu-tubulina e Tyr-tubulina come marcatori per MTs stabile e dinamico, rispettivamente. MTs dinamico predominano in del hindbrain nella fase di chiglia neurale (4-5 somiti) (Figura 2<stro...

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Use of Immunolabeling to Analyze Stable, Dynamic, and Nascent Microtubules in the Zebrafish Embryo

Immunolabeling metodi per analizzare popolazioni distinte dei microtubuli in zebrafish sviluppo del cervello sono descritti qui, che sono ampiamente applicabili ad altri tessuti. Il primo protocollo delinea un metodo ottimizzato per immunolabeling stabile e dinamica dei microtubuli. Il secondo protocollo fornisce un metodo per immagine e quantificare i microtubuli nascenti in particolare.

Uso di Immunolabeling per analizzare i microtubuli stabili, dinamici e nascenti nell'embrione di pesce zebra

Microtubules (MTs) are dynamic and fragile structures that are challenging to image in vivo, particularly in vertebrate embryos. Immunolabeling methods ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.2K Views.  University of Maryland, Baltimore County. Immunolabeling metodi per analizzare popolazioni distinte dei microtubuli in zebrafish sviluppo del cervello sono descritti qui, che sono ampiamente applicabili ad altri tessuti. Il primo protocollo delinea un metodo ottimizzato per immunolabeling stabile e dinamica dei microtubuli. Il secondo protocollo fornisce un metodo per immagine e quantificare i microtubuli nascenti in particolare.

Video: Use of Immunolabeling to Analyze Stable, Dynamic, and Nascent Microtubules in the Zebrafish Embryo

Labeling and Imaging Cells in the Zebrafish Hindbrain

Key to understanding the morphogenetic processes that shape the early vertebrate embryo is the ability to image cells at high resolution. In zebrafish embryos, injection of plasmid DNA results in mosaic expression, allowing for the visualization of single cells or small clusters of cells 1 . We describe how injection of plasmid DNA encoding membrane-targeted Green Fluorescent Protein (mGFP) under the control of a ubiquitous promoter can be used for imaging cells undergoing neurulation. Central to this protocol is the methodology for imaging labeled cells at high resolution in sections and also in real time. This protocol entails the injection of mGFP DNA into young zebrafish embryos. Embryos are then processed for vibratome sectioning, antibody labeling and imaging with a confocal microscope. Alternatively, live embryos expressing mGFP can be imaged using time-lapse confocal microscopy. We have previously used this straightforward approach to analyze the cellular behaviors that drive neural tube formation in the hindbrain region of zebrafish embryos 2. The fixed preparations allowed for unprecedented visualization of cell shapes and organization in the neural tube while live imaging complemented this approach enabling a better understanding of the cellular dynamics that take place during neurulation.

Key to understanding the morphogenetic processes that shape the early embryo is the ability to image cells at high resolution. We describe here a technique for labeling single cells or small clusters of cells in whole zebrafish embryos with membrane-targeted Green Fluorescent Protein.

Etichettatura e cellule Imaging nel romboencefalo Zebrafish

Key to understanding the morphogenetic processes that shape the early vertebrate embryo is the ability to image cells at high resolution. In zebrafish ...

Ricerca

Neuroscienze

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.

analizzare<em&gt; In Vivo</em&gt; Migrazione cellulare utilizzando Trapianti cellulari e Time-lapse imaging in embrioni di zebrafish

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Biologia dello sviluppo

Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin condensation, microtubule-kinetochore attachment, chromosome segregation, and cytokinesis in a small time frame. Errors in the delicate process can result in human disease, including birth defects and cancer. Traditional approaches investigating human mitotic disease states often rely on cell culture systems, which lack the natural physiology and developmental/tissue-specific context advantageous when studying human disease. This protocol overcomes many obstacles by providing a way to visualize, with high resolution, chromosome dynamics in a vertebrate system, the zebrafish. This protocol will detail an approach that can be used to obtain dynamic images of dividing cells, which include: in vitro transcription, zebrafish breeding/collecting, embryo embedding, and time-lapse imaging. Optimization and modifications of this protocol are also explored. Using H2A.F/Z-EGFP (labels chromatin) and mCherry-CAAX (labels cell membrane) mRNA-injected embryos, mitosis in AB wild-type, auroraBhi1045, and esco2hi2865 mutant zebrafish is visualized. High resolution live imaging in zebrafish allows one to observe multiple mitoses to statistically quantify mitotic defects and timing of mitotic progression. In addition, observation of qualitative aspects that define improper mitotic processes (i.e., congression defects, missegregation of chromosomes, etc.) and improper chromosomal outcomes (i.e., aneuploidy, polyploidy, micronuclei, etc.) are observed. This assay can be applied to the observation of tissue differentiation/development and is amenable to the use of mutant zebrafish and pharmacological agents. Visualization of how defects in mitosis lead to cancer and developmental disorders will greatly enhance understanding of the pathogenesis of disease.

Mitosis is critical to every living organism and defects often lead to cancer and developmental disorders. Using this imaging protocol and zebrafish as a model system, researchers can visualize mitosis in a live vertebrate organism and the multitude of defects that arise when mitotic processes are defective.

Osservando divisione mitotica e Dynamics in un embrione vivo Zebrafish

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin ...

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and optical transparency. In particular, the zebrafish embryo has become an important organism to study vertebrate kidney organogenesis as well as multiciliated cell (MCC) development. To visualize MCCs in the embryonic zebrafish kidney, we have developed a combined protocol of whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) and whole mount immunofluorescence (IF) that enables high resolution imaging. This manuscript describes our technique for co-localizing RNA transcripts and protein as a tool to better understand the regulation of developmental programs through the expression of various lineage factors.

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Cilia development is vital to proper organogenesis. This protocol describes an optimized method to label and visualize ciliated cells of the zebrafish.

Visualizzazione di cellule Multiciliated in Zebrafish attraverso un protocollo combinato di tutta Monte fluorescente ibridazione In Situ e immunofluorescenza

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

<meta charset="utf8"></head><body>Marcatura fluorescente delle proteine nelle larve di zebrafish utilizzando CRISPR/Cas9 Knock-In

Fluorescence Labeling to Visualize Low-Expressed Proteins in Zebrafish

CRISPR/Cas9-mediated knock-in (KI) technology allows for easier fluorescent-protein tagging in zebrafish (Danio rerio), a preferred model organism for in vivo imaging due to its transparency during the early developmental stage. Here, we provide a detailed protocol for performing high-efficiency fluorescence gene KI, rapid screening for KI founders, and low-abundance protein tracing in zebrafish larvae, which will lay a critical foundation for subsequent physio-pathological studies in zebrafish. The current protocol includes complete steps for the sgRNA design for the gene of interest, sgRNA in vitro transcription, Cas9 mRNA in vitro transcription, in vivo sgRNA screen for the one with the highest efficiency, donor plasmid design and construction, microinjection in zebrafish larvae, KI founder screen and zebrafish live imaging. Critical steps, troubleshooting tips, quality control methods, and advantages and applications of this protocol are included and discussed. This protocol assures quick and accurate results at a low cost and has been validated by multiple trials.

<meta charset="utf8"></head><body>Marcatura a fluorescenza per visualizzare le proteine a bassa espressione nel pesce zebra

Here, we present a protocol to label proteins with a fluorescence protein tag in zebrafish larvae, a newly developed and modified in vivo system especially useful for visualizing low-abundance proteins in zebrafish.

Marcatura a fluorescenza per visualizzare le proteine a bassa espressione nel pesce zebra

CRISPR/Cas9-mediated knock-in (KI) technology allows for easier fluorescent-protein tagging in zebrafish (Danio rerio), a preferred model organism for in ...

Genetica

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. Although many immunohistochemistry protocols have been optimized for mammalian tissue and tissue sections, these protocols often require modification and optimization for non-mammalian model organisms. Zebrafish are increasingly used as a model system in basic, biomedical, and translational research to investigate the molecular, genetic, and cell biological mechanisms of developmental processes. Zebrafish offer many advantages as a model system but also require modified techniques for optimal protein detection. Here, we provide our protocol for whole-mount fluorescence immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae. This protocol additionally describes several different mounting strategies that can be employed and an overview of the advantages and disadvantages each strategy provides. We also describe modifications to this protocol to allow detection of chromogenic substrates in whole mount tissue and fluorescence detection in sectioned larval tissue. This protocol is broadly applicable to the study of many developmental stages and embryonic structures.

Here, we present a protocol for fluorescent antibody-mediated detection of proteins in whole preparations of zebrafish embryos and larvae.

Intero Monte Immunohistochimica in Embrioni e Larve di pesce zebra

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...

Antibody Uptake Assay for Tracking Notch/Delta Endocytosis During the Asymmetric Division of Zebrafish Radial Glia Progenitors

Asymmetric cell division (ACD), which produces two daughter cells of different fates, is fundamental for generating cellular diversity. In the developing organs of both invertebrates and vertebrates, asymmetrically dividing progenitors generates a Notchhi self-renewing and a Notchlo differentiating daughter. In the embryonic zebrafish brain, radial glia progenitors (RGPs)-the principal vertebrate neural stem cells-mostly undergo ACD to give birth to one RGP and one differentiating neuron. The optical clarity and easy accessibility of zebrafish embryos make them ideal for in vivo time-lapse imaging to directly visualize how and when the asymmetry of Notch signaling is established during ACD. Recent studies have shown that dynamic endocytosis of the Notch ligand DeltaD plays a crucial role in cell fate determination during ACD, and the process is regulated by the evolutionarily conserved polarity regulator Par-3 (also known as Pard3) and the dynein motor complex. To visualize the in vivo trafficking patterns of Notch signaling endosomes in mitotic RGPs, we have developed this antibody uptake assay. Using the assay, we have uncovered the dynamicity of DeltaD-containing endosomes during RGP division.

This work develops an antibody uptake assay for imaging intra-lineage Notch/DeltaD signaling in dividing radial glia progenitors of the embryonic zebrafish brain.

Saggio di assorbimento degli anticorpi per il monitoraggio dell'endocitosi notch/delta durante la divisione asimmetrica dei progenitori della glia radiale del pesce zebra

Asymmetric cell division (ACD), which produces two daughter cells of different fates, is fundamental for generating cellular diversity. In the developing ...

Imaging Glycans in Zebrafish Embryos by Metabolic Labeling and Bioorthogonal Click Chemistry

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or alkyne-tagged monosaccharides1, 2. The modified monosaccharides, processed by the glycan biosynthetic machinery, are incorporated into cell surface glycoconjugates. The bioorthogonal azide or alkyne tags then allow covalent conjugation with fluorescent probes for visualization, or with affinity probes for enrichment and glycoproteomic analysis. This protocol describes the procedures typically used for noninvasive imaging of fucosylated glycans in zebrafish embryos, including: 1) microinjection of one-cell stage embryos with GDP-5-alkynylfucose (GDP-FucAl), 2) labeling fucosylated glycans in the enveloping layer of zebrafish embryos with azide-conjugated fluorophores via biocompatible Cu(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC), and 3) imaging by confocal microscopy3. The method described here can be readily extended to visualize other classes of glycans, e.g. glycans containing sialic acid4 and N-acetylgalactosamine5, 6, in developing zebrafish and in other living organisms.

A click-chemistry based method that allows for the rapid, noninvasive, and robust labeling of alkyne-tagged glycans in zebrafish embryos is described. Fucosylated glycans in the enveloping layer of zebrafish embryos in the late gastrulation stage were imaged in this study.

Uso di Immunolabeling per analizzare i microtubuli stabili, dinamici e nascenti nell'embrione di pesce zebra

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Etichettatura e cellule Imaging nel romboencefalo Zebrafish

analizzare

Osservando divisione mitotica e Dynamics in un embrione vivo Zebrafish

Visualizzazione di cellule Multiciliated in Zebrafish attraverso un protocollo combinato di tutta Monte fluorescente ibridazione In Situ e immunofluorescenza

Marcatura a fluorescenza per visualizzare le proteine a bassa espressione nel pesce zebra

Marcatura a fluorescenza per visualizzare le proteine a bassa espressione nel pesce zebra

Marcatura a fluorescenza per visualizzare le proteine a bassa espressione nel pesce zebra

Intero Monte Immunohistochimica in Embrioni e Larve di pesce zebra

Saggio di assorbimento degli anticorpi per il monitoraggio dell'endocitosi notch/delta durante la divisione asimmetrica dei progenitori della glia radiale del pesce zebra

Glicani Imaging in embrioni di zebrafish con marcatura metabolica e Chimica Clicca Bioorthogonal