Name: reconstitution of basic mitotic spindles in spherical emulsion droplets
Uploaded: 2016-08-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
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We like to thank the members of the Dogterom lab for valuable discussions. We acknowledge Stefan Diez and Marcel Janson for reagents, and Samara Reck-Peterson for help with the purification of dynein. This work was supported by funding from the European Research Council (ERC Synergy grant: MODEL-CELL).

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The authors declare that they have no competing financial interests.

방법은 유 중수 에멀젼 방울에 기본 유사 분열 스핀들을 재구성하기 위해 여기에 존재하는 최근의 노력을 설명했다. 기하학적 경계 내에서 스핀들 어셈블리를 공부하는 것은 많은 장점을 제공한다. 주요 피드백 메커니즘 방추사의 미세 소관 그들이 조립 된 기하학적 제한 사이에 존재한다. 미세 소관은 유사 분열 스핀들 변위가 발생할 수 있습니다 기하학적 경계로 성장할 때 힘을 밀어 생성 할 수 있습니다. 또한, 물리적 인 장벽으로 성장하면 미세 소관 재해를 유발할 수있다. 또한, 밀폐 된 형상 내의 스핀들 조립체는 차례로 직접 미세 소관 증가율 (36)에 영향을 미치는 등의 튜 불린 등의 개별 구성 요소의 점진적인 고갈을 초래할 수있다. 이들은 여기에 설명 된 분석법을 이용하여 연구 할 수 스핀들 조립체의 모든 중요한 결정 요인이다. 설명 된 분석은 작은 농도 differe에 매우 민감하다액적 성분 NCES. 이것은 작은 농도 차이가 너무 느리거나 너무 빠른 미세 소관의 성장을 초래할 수 tubulin에 대한 경우이다. 이 경우, 미세 소관 성장률들은 여전히​​ 실험의 첫 번째 ~ 30 분 동안 온도를 조정함으로써 보정 할 수있다. 방추사 조립체 및 위치도 (피질) 힘 발생기의 농도의 변화에​​ 매우 민감하다. 이렇게 정제 된 성분의 농도, 순도 및 활성에 의존 할 가능성이 모든 새로 정제 된 단백질을 적정 신중해야한다. 또한, 특정한 절충은 분석의 특성에 따라, 촬상 설정에서 수행 될 수있다. 먼저, 수용성 형광 튜 불린 이량 높은 수준의 화상 개별 미세 소관을 어렵게 만든다. 미세 소관은 이상 성장 수용성 튜 불린 천천히 고갈 된 바와 같이, 신호 대 잡음비가 점점 높아져 individu의 이미징을 허용알 미세 소관. 오픈 시스템 설정과는 달리 기하 구속 상당한 표백 결과, 벌크 저장소 내의 형광 분자 산소 제거제 시스템 부품의 교환을 방지한다. 특히, 시간이 지남에 따라 스핀들 어셈블리 및 위치 모니터링, 그것도 강력한 탈산 소제 시스템의 존재하에 낮은 광도를 가진 이미지에 요구된다. 이들 방법은 시험 관내 간략화 스핀들 형 구조의 상향식 재구성을 가능하게한다. 여기에 소개 된 구성 요소에 더하여, 다른 많은 요인 등 3 바이폴라 스핀들 형성, 위치, 방향, 정형을, 영향을 설명 하였다. 이 시스템은 추가의 힘 발생기의 개별 및 결합 효과를 연구하기 위해 확장 될 수있다. 이 시스템에서 현재 존재하지 않는다 스핀들 형성에 중요한 기여는 유사 분열 염색체 수 있습니다. 유사 분열 염색질은로 표시되었습니다&#39;극성 토출 힘&#39;(3), (2) 염색질 바인딩 RanGEF RCC1 (38)에 의해 RanGTP 구배의 형성, (3) kinetochores (해중합과 상호 작용할 수있는 소위 생성 할 수 있습니다 (1) chromokinesins에 의해 직접 스핀들 형성 ) 미세 소관 (39) 및 (4) 반대 미세 소관 (40) 사이에-기계 스프링 역할을 할 수있는 염색질 자체. 마지막으로, 기술 시스템은 현재 제한된 시간과 공간 활동을 제어 도입 힘 발전기의 국산화를 제공합니다. 세포, 많은 스핀들 어셈블리 요소는 특정 구획에 지역화 또는 제한된 시간 창에서 활성화됩니다. 현저한 예는 구체적으로는 (C)의 후방 측에 충실 네인의 활성 인 엘레 한 세포 단계의 배아는 비대칭 스핀들 포지셔닝 및 세포 분열을 촉진한다. 이 시스템에서, 우리는 현재와 같은 t을 흉내 낸의 가능성을 모색하고 있습니다광학 유전 기술에서 차용 emporal 및 비대칭 활동에 사용하는 방법. 또한, AS는 C.의 경우와 엘레 배아와 단단한 세포벽과 세포는 많은 세포 유사 분열에서 반올림하지 않습니다. 기하학적 구속 형상은 스핀들 (41)에 작용하는 힘에 기초 영향을 미칠 것이다. 따라서, 잠재적으로 정형 및 에멀젼이 기억 42,43 방울 허용 더 복잡한 마이크로 유체 시스템의 사용뿐만 아니라 비 구형 방울 스핀들 어셈블리 및 위치를 재구성하는 것이 중요 할 것이다. 마지막으로, 조직에서 세포 - 세포 및 세포 - 기질 시그널링 및 첨부들은 상피 세포에서 관찰 된 바와 같이, 스핀들 방향 지시로 번역 될 수있는 외부 신호를 제공하고, 줄기 세포. 이러한 전문적인 측면 모두이 현재 연구에서 고려되지 않은 및 유사 분열 스핀들 assemb의 생체 -like 더 reconstitutions으로 구축하는 미래의 도전을 제공 할 수 있습니다LY 및 위치.

유사 분열 동안, 복제 된 게놈이 염색체 새로 형성된 딸세포 위에 자매 염색 분체의 동일한 분포가되도록하여 셀 적도 구성된다. 염색체 위치 및 분리는 두 개의 반대 중심체에서 발생하는 스핀들 미세 소관에 자신의 첨부 파일에 의해 매개된다. 충실 염색체 분배를 보장 외에도 방추사의 방향은 또한 세포 분열 평면 일을 지시. 세포 분열의 조정 방향은 개발의 여러 단계 동안 조직의 항상성이 필수적이다. 특히, 규제 유사 분열 스핀들의 위치는 휴대 내용의 비대칭 분포 될 수 있습니다 또는 다른 크기 2의 딸 세포를 생산하고 있습니다. 유사 분열 스핀들 조립 및 방향 의향에 시작 협력과 힘 발전소 3,4를 길항 사이의 복잡한 상호 작용에 의해 조율된다. 생성 된 힘은 B 구성OTH 당기고 미는 힘. 이러한 힘은 세포 외피와 스핀들 주소록에서뿐만 아니라 발 스핀들 내에 모두 기인 한 미소 관 역학뿐만 아니라 분자 모터 및 가교제 (도 1)에 의해 생성 될 수있다. 미세 소관은 세포 외피로서 단단한 구조에 대해 증가 할 때 가압력을 생성 할 수있다. 시스템 내에서 발생하는 총 저항력에 따라이는 유사 분열 스핀들 (낮은 힘)의 재배치가 발생하거나 미세 소관의 좌굴 또는 재앙 (높은 힘) 5-8를 트리거 할 수 있습니다. 길이가 9 미세 소관이 좌굴 강한 결정이므로 누름으로써 생성 될 수 힘의 크기는 미세 소관의 길이에 의존한다. 또한, 하나의 중심체에서 발생한 미세 소관, 다른 중심체 대해 초기 의향에 3,10- 중심체 분리 구동 제안 된 메커니즘을 밀 수있다. 광고에서성장 미세 소관에 의해 생성 된 힘을 추진, 미세 소관이 접촉 단부 셀 피질시 조건은 힘 (11)를 당겨 중재 할 수 있습니다. 여러 실험실에서 연구 피질 힘 발생기의 조절 활성을 생체 (1) 유사 분열 스핀들의 비대칭 위치 결정을 위해 필요한 것으로 나타났다. 이 당기는 힘에 필수는 (이하 &#39;네인&#39;이라 함) 피질 지역화 세포질 네인, 마이너스 엔드 감독 미세 소관 모터 단백질 8,12,13이다. 예를 들어, 효모, 피질 (14)을 따라 슬라이딩 모터에 의존하는 미세 소관의 미세 소관 격자 결과 대뇌 피질의 네인의 측면 상호 작용을 신진한다. 그러나, 피질 당기는 힘은 미세 소관 8 해중합에 말에 첨부 형성 네인의 ​​기능에 의해 생성 될 수있다. 미세 소관의 수축에 의해 생성 된 에너지는 일반적으로 높은 차수의 힘으로 이어질 수있다 (~ 50 PN (15 참조 </s최대&gt;)) 개별 모터 단백질에 의해 발생되는 힘보다 (~ 7-8 PN (참조. 16)). 해중합 미세 소관에 대뇌 피질의 네인의 최종에 첨부 신진 효모 (17)와 C에 스핀들 위치를 촉진 엘레 13. 모터에 의존하는 슬라이딩 및 미세 소관 해중합 구동 모두 대뇌 피질의 당기는 힘이 협력 또는 생체 내에서 상호 배타적 수 있는지 여부는 현재 알 수없는이다. 미세 소관 가압력과 네인 매개 피질 당기는 힘 이외에, 중심체의 위치는 다수의 다른 단백질에 의해 방추사 내에서 제어된다. 키네신 -5- 모터는, 예를 들면, 외측으로 슬라이딩 힘 18-20의 발생을 초래 평행 극간 소관 링크를 교차 할 수 사량 체로서 존재한다. 키네신-5 모터 가족의 일원은 C.를 제외하고, 연구 모든 진핵 생물의 중심체 분리 및 바이폴라 스핀들 조립에 필요한 엘레<html> (참고 21에서 검토). 또한, Ase1 / PRC1 가족의 확산 가교제는 생체 내에서 체외 22-27에서 극간 미세 소관의 미세 소관 영역을 중복으로 지역화하는 것으로 알려져있다. 중복 미세 소관 영역의 Ase1 중심의 확장에 의해 생성 된 힘은 시험관 (28, 29)에 키네신-14 매개 슬라이딩 힘을 상쇄 할만큼 크다. 세포에서 Ase1 / PRC1는 스핀들 midzone 25-27,30에 미세 소관 중복 영역 확산 가교제에 의해 발생하는 힘이 크게 스핀들 조직에 기여할 수 있다는 것을 암시 안정적인 형성을 위해 필요하다. 마지막으로, 유사 분열 염색질에서 힘과 kinetochores 다양한 경로 3을 통해 유사 분열 스핀들 어셈블리 및 위치에 영향을 미친다. 이들 구성 요소는 여기에 기재된 재구성 분석법의 일부가 아닌 때문에, 상세히 설명되지 않을 것이다. jove_content &quot;&gt; 다른 이론은 위에 설명 된 다른 분자 구성 요소와 세력이 주축 조립 및 위치에서 협력하는 방법에 존재하지만, 우리는 정량적 인 이해에서 멀리 아직도이다. 또한 실험에 살아있는 세포에, 정제 된 구성 요소와 생체 외 실험은 강력한를 제공 경로가이 목표를 달성 할 수 있도록. 여기에 우리가 기본 스핀들 유 중수 에멀젼 방울에서 재구성되는 최근 발표 된 방법의 적용 및 확장 버전 (로스 등. 31)에 대한 시각적 가이드를 제공하는로 시작 마이크로 유체 기술을 이용하여 부품의 최소 개수. 구면 방울이 분열 세포에 필적 크기로 생성된다. 이러한 액적 내에 정제 중심체와 튜 불린은 미세 소관 애 역학 연구 생성 및 애 - 애 상호 작용을 강제하기 위해 결합 될 수있다.하여 대뇌 피질 (예 : 네인 등) 간 극성 (예 : 키네신-5 / Ase1) 강제 발전기를 도입, 우리생체 내 상황을 닮은 시작 점점 복잡 스핀들 형 구조를 재구성한다.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;1. Preparation of microfluidic chips&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Photomask (Photomask on film substrate)</td><td>Selba S.A. Switzerland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU-8 3025</td><td>MicroChem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silicon wafer (4 inch silicon wafer p/Boron &amp;lt;1-0-0&gt;10-20 &amp;Omega;-cm, 500-550 &amp;mu;m, SSP, with 2 flats)</td><td>WRS Materials</td><td>4P0SSP-005</td><td></td></tr><tr><td>Spin coater&amp;nbsp;</td><td>Polos</td><td>SPIN150I</td><td></td></tr><tr><td>PDMS pre-polymer RVT615 A+B</td><td>Lubribond</td><td>9481</td><td></td></tr><tr><td>Corona treater</td><td>Electro-technic products</td><td>BD-20ACV</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;2. Microfluidic setup&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>DOPS (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840035</td><td></td></tr><tr><td>Biotinyl PE (1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl))</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>870285</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>650498</td><td></td></tr><tr><td>Glass pipets</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vacuum pump</td><td>Laboport</td><td>KNF</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum chamber</td><td>Kartell</td><td>Polypropylene Vacuum Desiccator</td><td></td></tr><tr><td>Mineral oil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5904</td><td></td></tr><tr><td>Surfactant (Span80)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85548</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Branson</td><td>M2800H</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips</td><td></td><td></td><td>24 mm x 60 mm, thickness 1.5</td></tr><tr><td>Glass-slides</td><td></td><td></td><td>26 mm x 76 mm</td></tr><tr><td>Puncher</td><td>Harris Uni-Core</td><td>135840/135841/135843</td><td></td></tr><tr><td>Laboratory sealing film</td><td>Parafilm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Valap (Vaseline, lanolin, paraffin wax melted at equal concentrations)</td><td></td><td></td><td>Home made</td></tr><tr><td>Brightfield Microscope</td><td>Leica</td><td>PMIRB&amp;nbsp;</td><td>Any inverted brightfield would suffice</td></tr><tr><td>Pressure controler</td><td>Fluigent</td><td>MFCS-FLEX-4C-1000</td><td></td></tr><tr><td>PEEK Tubing</td><td>Cluzeau Info. Labo, France</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microfluidics vials (Tubes Micrew 0.5 ml and 1 ml)</td><td>VWR, The Netherlands</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;3. Reconstituting spindle formation and positioning&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Dextran-647 nm (Dextran, Alexa Fluor 647, 10,000 MW, Anionic, Fixable)</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA - Bovine serum albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glucose (D-(+)-Glucose)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Glucose-oxidase (Glucose oxidase from Aspergillus niger)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6125</td><td></td></tr><tr><td>DTT (DL-dithioltheitol)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>646563</td><td></td></tr><tr><td>Catalase (Catalase form bovine liver)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9322</td><td></td></tr><tr><td>Tubulin (Tubulin from bovine brain)</td><td>Cytoskeleton Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubulin-488/561 (HiLyte-488/Rhodamine-labeled tubulin from porcine brain)</td><td>Cytoskeleton Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GTP (Guanosine-&#039;5-triphosphate, sodium salt hydrate)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>51120</td><td></td></tr><tr><td>&amp;kappa;-casein (&amp;kappa;-casein from bovine serum milk)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0406</td><td></td></tr><tr><td>Airfuge (Air-driven ultracentrifuge)</td><td>Beckman-Coulter</td><td>CLS</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;4. Introducing spindle-assembly factors&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Neutravidin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2666</td><td></td></tr><tr><td>ATP (Adenosine-&#039;5-triphosphate, disodium salt hydrate)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>PEP (Phospho(enol)pyruvic acid monosodium salt hydrate &amp;ge;97% (enzymatic))</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0564</td><td></td></tr><tr><td>PK/LDH -(Pyruvate kinase/lactic dehydrogenase enzymes from rabbit muscle)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0294</td><td></td></tr></tbody></table>

reconstitution of basic mitotic spindles in spherical emulsion droplets

Mitotic spindle assembly, positioning and orientation depend on the combined forces generated by microtubule dynamics, microtubule motor proteins and cross-linkers. Growing microtubules can generate pushing forces, while depolymerizing microtubules can convert the energy from microtubule shrinkage into pulling forces, when attached, for example, to cortical dynein or chromosomes. In addition, motor proteins and diffusible cross-linkers within the spindle contribute to spindle architecture by connecting and sliding anti-parallel microtubules. In vivo, it has proven difficult to unravel the relative contribution of individual players to the overall balance of forces. Here we present the methods that we recently developed in our efforts to reconstitute basic mitotic spindles bottom-up in vitro. Using microfluidic techniques, centrosomes and tubulin are encapsulated in water-in-oil emulsion droplets, leading to the formation of geometrically confined (double) microtubule asters. By additionally introducing cortically anchored dynein, plus-end directed microtubule motors and diffusible cross-linkers, this system is used to reconstitute spindle-like structures. The methods presented here provide a starting point for reconstitution of more complete mitotic spindles, allowing for a detailed study of the contribution of each individual component, and for obtaining an integrated quantitative view of the force-balance within the mitotic spindle.

이전 섹션에 제시된 방법은 유 중수 에멀젼 액 적의 형상을 한정하여 복잡성이 증가함에 따라, 스핀들 형 구조의 재구성을 허용한다. 이 섹션에서는 성적이 분석의 능력을 보여 대표적인 결과를 설명합니다. 바이폴라 스핀들 조립 될 때 유사 분열 동안, 세포는 인간 세포에 대해 측정 된, 약 15 ㎛의 직경을 갖는 구체를 형성하는 라운드. 이 특성 유사 분열 세포 형태는 제한하고 모두 스핀들 크기와 방향 (35, 36)를 지시하는 기하학적 경계를 제공합니다. 미세 유체 기술은 정확하게 살아있는 세포에서 관찰 된 상황과 유사하기 때문에 체외에서 유사 분열 스핀들 상향식 재구성을 허용 기하 구속의 레벨을 제공한다. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-미세 소관의 성장이 기하학적 경계에 의해 제한되는 경우 페이지 = &quot;1&quot;&gt; 미세 소관의 과꽃은 이미 그 자체로 복잡한 행동을 할 수있다. 미세 소관이 증가함에 따라, 새로운 튜 불린 이량 체의 혼입에 의해 생성 된 가압력은 에멀젼 소적의 대향 측면에 두 중심체를 구동한다. 처음에는 중심체 자유롭게 제한 볼륨 (그림 4a, 왼쪽 패널) 내에서 확산. 약 20 ~ 30 분 후, 첫 번째 미세 소관은 미세 소관은 모든 방향으로 피질에 성장 표시 및 중심체 확산이 제한된다됩니다. 중간 길이 (액적 직경의 약 50 %)의 미세 소관과 과꽃은 (입체), 다른 중심체와 피질 서로 밀어 미세 소관으로, 각각 다른 물리 칠 수 있습니다. 이것은 서로 (그림 4a, 가운데 패널)을 반대하는 두 개의 중심체 전형적인 &#39;양극&#39;스핀들과 같은 배열을 초래한다. 미세 소관은 액적 직경의 ~ 50 % 이상 증가하는 경우미터는 중심체는 방울 피질 (그림 4a, 오른쪽 패널)을 따라 성장하는 미세 소관으로, 액체 방울의 반대 경계에 더 밀어 얻을. 이들 분석에서 미세 소관 성장률 온도-tubulin의 농도 모두에 매우 민감하다는 것이 중요하다. 핵이 처음 발견 될 때 정상 상태 애 위치에 도달하면이 매개 변수는 따라서 강력하게 시간에 영향을 미칠 것입니다. 세포에서 대뇌 피질의 당기는 힘은 미세 소관 플러스 엔드 및 피질 관련 네인 사이의 부하 베어링 첨부 파일의 형성을 통해 생성된다. 동물 세포에서이 협회는 Gαi 1의 N 말단 미리 스토 일화를 통해 세포막을 대상으로하는 Gαi / LGN / NUMA 단지에 따라 달라집니다. 이러한 재구성 분석법에서 Gαi / LGN / NUMA 착물의 요구를 직접 통해서 비오틴 네인 지질에 결합하여 우회비오틴 - 스트렙 트 아비딘 - 비오틴 복합체의 형성. 이 채권은 상대적으로 안정적 (K D ~ 10 -14 M) (37)이며, 빠르게 형성 (일반적으로 미세 소관의 핵 명백한되기 전에, 에멀젼 액적 형성 후 10 분 이내) (그림 4B). 네인의 부재에서, 중심체가 액적 피질 (도 4c)의 양측에 가압되는 반면 피질 네인의 존재 중심체는 일반적 이상의 중앙 위치를 유지한다. 우리는이 방지하고 미세 소관 추진 세력에 대항 두 가지 효과의 결과이다 추론. (1) 네인 직접 미세 소관의 재해하여 미세 소관의 길이를 제한하는 과도한 미세 소관의 좌굴을 방지하고, (2) 대뇌 피질의 당기는 힘이 애 - 애 스터의 반발 세력에 대항 개별 과꽃 8에 그물 중심 세력으로 이어질를 촉진한다. Ase1는 F를 유도 확산 성 가교제경향 orces는 반 평행 미세 소관 (29)의 중첩 영역을 증가시킵니다. 이과 일치는, (네인 및 부재)를 Ase1의 존재 중심체는 Ase1이 극간 미세 소관 (그림 4D)를 번들로 제공하는 현지화와 가깝게 찾을 수 있습니다. 키네신-5 가족의 구성원은 (소개 참조) 스핀들 내에서 추진하는 힘을 제공하여 중심체 분리를 구동한다. Cut7합니다 (S. pombe 키네신 -5- ortholog)의 존재 하에서조차 Ase1 중심체 (도 4E)의 존재하에 에멀젼 소적의 양측에 가압된다. 피질 간 극성 동력 발전기를 결합함으로써, 복잡도의 레벨은 상기 바이폴라 결국 분열 스핀들 조립체의 포괄적 인 이해에 이르는 이들 실험에서 증가 될 수있다. 이러한 결과의 상세한 정량적 설명은 미래에 사용할 수 있습니다 (로스 외., 준비 원고). <p class="jove_content" fo:keeP-together.within 페이지는 = &quot;1&quot;&gt; 시간 고정 순간에 중심체의 위치를​​ 관찰하고, 미세 소관의 관측 길이 그들의 행동 관련 외에도 가치있는 정보를 통해 위치 결정 처리를 수행하여 얻을 수있다 시각. 노출 시간 및 레이저 강도를 감소시킴으로써, 단지 ~ 30 % 표백 적어도 1 시간 동안 2 분 간격으로 애 위치 결정을 수행하는 것이 가능하다. 이 중앙 집중화를 통해 자유롭게 확산 중심체에서 애 조립 및 위치 모니터링 (0 분). 수 (12 분.) 분산 과꽃 (36 분 추가) (도 5c)에. 이것은 정상 상태 동작과 스핀들 조립 속도론 모두의 연구를 용이하게한다. 동일한 샘플의 서로 다른 내용으로 방울을 조합함으로써, 예를 들면, 가능한 직접 (도 5b)와 피질 힘 발생기 않고 물방울 중심체 위치 스핀들 조립체 동력학과 비교된다. 그림 1 : 힘은 유사 분열 스핀들에 작용하는 여러 힘 생성 분자는 스핀들 형성 및 위치를 촉진하기 위해 유사 분열 스핀들의 미세 소관에 작용한다.. 셀 피질로 성장 미세 소관은 중심체의 미는 힘을 생성합니다. (보라색) 두피 네인은 해중합 미세 소관을 캡처하고 중심체에 당기는 힘을 생성합니다. PRC1 / Ase1 가족의 가교제가 힘을 슬라이딩 바깥쪽으로 반대 생성하는 반면, 스핀들 내에서 키네신-5 / Cut7 모터 단백질, 반 평행 미세 소관에서 바깥쪽으로 슬라이딩 힘을 제공합니다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54278/54278fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오 .</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54278/54278fig2.jpg" /> 그림 2 :. 4 마이크로 유체 칩을 포함하는 4 인치 포토 마스크의 미세 유체 칩 설계 (A) 디자인. (B)는 단일 칩의 상세한 표현. 칩은 하나의 출구 채널 및 먼지 필터 뒤에 세 개의 유입 채널을 포함한다. 입구 채널 (1)이 물 단계를 포함 지질 / 오일 상 및 제 3 채널이 채널은 추가적인 지방 / 오일 상으로 형성된 방울을 희석 할 수있다. (C) (상단과 하단에서 오는) 지질 / 오일 위상 (왼쪽에서 오는) 물 위상에 맞는 접합의 상세한 표현입니다. 교차로에서 물방울이 형성되고 오른쪽에있는 출구 통로쪽으로 흐른다. (D) 2 μm의 채널 먼지 필터의 상세한 표현입니다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54278/54278fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54278/54278fig3.jpg" /> 그림 3 :. 유 중수 에멀젼 액적 형성을위한 방법론 (A) 밝은 필드 현미경 미세 유체 칩과 마이크로 유체 관. 모두 물과 지방 / 오일 상 관이 각각 칩 입구 (1)과 (2)에 접속된다. 발수 지질 / 오일 위상이 충족 마이크로 유체 칩 (B) 제한. 압력을 변화시킴으로써, 소적 크기는 조절 될 수있다. PDMS 코팅 플로우 셀 (C) 설계. 플로우 셀에 방울을 넣은 후, 구단은 추가 Valap 폐쇄된다. (D)의 액적 형성의 회로도. 방울 중심체, 튜 불린 및 방추사 형성에 필요한 추가의 성분을 캡슐화하는데 사용된다. 대뇌 피질의-네인 타겟팅 (E) 도식. 바이오틴 (바이오) 네인은 스트렙 타비 딘 (STRP)를 통해 바이오틴 지질을 대상으로한다. <a= &quot;https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54278/54278fig3large.jpg&quot;대상 = &quot;_ 빈&quot;HREF&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/54278/54278fig4.jpg" /> 그림 4 :. 복잡성 증가와 스핀들 - Reconstitutions의 대표 결과 (A), 짧은 중간, 긴 미세 소관의 예를 보여주는 두 개의 중심체가 포함 된 물방울의 최대 강도 예측. 중심체와 미세 소관은 10 % HiLyte 488 튜 불린 표지의 첨가에 의해 가시화된다. 스케일 바는 10 μm의 =. (- 왼쪽)와 스트렙 타비 딘 (STRP)의 존재 (+, 오른쪽)이 없을 GFP - 비오틴 네인 - TMR의 (B) 버전. 대뇌 피질의 GFP - 비오틴 - 네인 - TMR의 (오른쪽 +,) - (왼쪽) 또는 존재 (C) 미세 소관의 애의 부재에 위치. (D) 미세 소관의 애 (왼쪽 패널, GREEN Ase1의 존재) 위치 (가운데 패널, 레드). Ase1 및 Cut7 (키네신-5) (중간 패널, 레드)의 존재 (E) 미세 소관의 애 (왼쪽 패널, 녹색) 위치. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54278/54278fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/54278/54278fig5.jpg" /> 그림 5 : 체외에서 이미징 애 위치 역학 (A) 몇 시간까지 액적 이미징을 할 수있는 PDMS 컵의 디자인.. (B) 생성, 저장 및 액적 이미징 형광 덱스 트란의 부재 (왼쪽) 포함 (우) (알렉사 647)에 의해 도시 된 다른 내용을 포함하는 (송신). (C) 60 분의 시간 경과의 단일 평면 이미지 (2 분 간격) 광고의 Z-스택 (2 μm의 거리)에서 촬영하나의 중심체를 포함 roplet. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54278/54278fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Reconstitution of Basic Mitotic Spindles in Spherical Emulsion Droplets

The assembly and positioning of the mitotic spindle depend on the combined forces generated by microtubule dynamics, motor proteins and cross-linkers. Here we present our recently developed methods in which the geometrical confinement of spherical emulsion droplets is used for the bottom-up reconstitution of basic mitotic spindles.

구형 에멀젼 방울의 기본 유사 분열 스핀들의 재구성

Mitotic spindle assembly, positioning and orientation depend on the combined forces generated by microtubule dynamics, microtubule motor proteins and ...

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Nanyang Technological University

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9.7K 조회수.  Delft University of Technology. The assembly and positioning of the mitotic spindle depend on the combined forces generated by microtubule dynamics, motor proteins and cross-linkers. Here we present our recently developed methods in which the geometrical confinement of spherical emulsion droplets is used for the bottom-up reconstitution of basic mitotic spindles.

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Preparation of Giant Vesicles Encapsulating Microspheres by Centrifugation of a Water-in-oil Emulsion

The constructive biology and the synthetic biology approach to creating artificial life involve the bottom-up assembly of biological or nonbiological materials. Such approaches have received considerable attention in research on the boundary between living and nonliving matter and have been used to construct artificial cells over the past two decades. In particular, Giant Vesicles (GVs) have often been used as artificial cell membranes. In this paper, we describe the preparation of GVs encapsulating highly packed microspheres as a model of cells containing highly condensed biomolecules. The GVs were prepared by means of a simple water-in-oil emulsion centrifugation method. Specifically, a homogenizer was used to emulsify an aqueous solution containing the materials to be encapsulated and an oil containing dissolved phospholipids, and the resulting emulsion was layered carefully on the surface of another aqueous solution. The layered system was then centrifuged to generate the GVs. This powerful method was used to encapsulate materials ranging from small molecules to microspheres.

Giant vesicles containing highly packed micrometer-sized components are useful cell models. The water-in-oil emulsion centrifugation method is a simple, powerful tool for the preparation of giant vesicles with encapsulated materials.

유 중수 에멀젼의 원심 분리에 의해 거 소포 캡슐화 미소 구의 제조

The constructive biology and the synthetic biology approach to creating artificial life involve the bottom-up assembly of biological or nonbiological ...

연구

생화학

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Real-time measurement of oscillations at the single-cell level is important to uncover the mechanisms of biological clocks. Although bulk extracts prepared from Xenopus laevis eggs have been powerful in dissecting biochemical networks underlying the cell-cycle progression, their ensemble average measurement typically leads to a damped oscillation, despite each individual oscillator being sustained. This is due to the difficulty of perfect synchronization among individual oscillators in noisy biological systems. To retrieve the single-cell dynamics of the oscillator, we developed a droplet-based artificial cell system that can reconstitute mitotic cycles in cell-like compartments encapsulating cycling cytoplasmic extracts of Xenopus laevis eggs. These simple cytoplasmic-only cells exhibit sustained oscillations for over 30 cycles. To build more complicated cells with nuclei, we added demembranated sperm chromatin to trigger nuclei self-assembly in the system. We observed a periodic progression of chromosome condensation/decondensation and nuclei envelop breakdown/reformation, like in real cells. This indicates that the mitotic oscillator functions faithfully to drive multiple downstream mitotic events. We simultaneously tracked the dynamics of the mitotic oscillator and downstream processes in individual droplets using multi-channel time-lapse fluorescence microscopy. The artificial cell-cycle system provides a high-throughput framework for quantitative manipulation and analysis of mitotic oscillations with single-cell resolution, which likely provides important insights into the regulatory machinery and functions of the clock.

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

We present a method for the generation of in vitro self-sustained mitotic oscillations at the single-cell level by encapsulating egg extracts of Xenopus laevis in water-in-oil microemulsions.

Microemulsions 셀 무료 Xenopus 달걀 추출 물에서 세포 주기 진동의 재구성

Real-time measurement of oscillations at the single-cell level is important to uncover the mechanisms of biological clocks. Although bulk extracts ...

Fabrication of Spherical and Worm-shaped Micellar Nanocrystals by Combining Electrospray, Self-assembly, and Solvent-based Structure Control

Micellar nanocrystals (micelles with encapsulated nanocrystals) have become an emerging major class of nanobiomaterials. We describe a method of fabricating micellar nanocrystals based on combining top-down electrospray, bottom-up self-assembly, and solvent-based structure control. This method involves first using electrospray to generate uniform ultrafine liquid droplets, each of which functions as a micro-reactor in which self-assembly reaction occurs forming micellar nanocrystals, with the structures (micelle shape and nanocrystal encapsulation) controlled by the organic solvent used. This method is largely continuous and produces high quality micellar nanocrystal products with an inexpensive structure control approach. By using a water-miscible organic solvent tetrahydrofuran (THF), worm-shaped micellar nanocrystals can be produced due to solvent-induced/facilitated micelle fusion. Compared with the common spherical micellar nanocrystals, worm-shaped micellar nanocrystals can offer minimized non-specific cellular uptake, thus enhancing biological targeting. By co-encapsulating multiple nanocrystals into each micelle, multifunctional or synergistic effects can be achieved. Current limitations of this fabrication method, which will be part of the future work, primarily include imperfect encapsulation in the micellar nanocrystal product and the incompletely continuous nature of the process.

The present work describes a method to fabricate micellar nanocrystals, an emerging major class of nanobiomaterials. This method combines top-down electrospray, bottom-up self-assembly, and solvent-based structure control. The fabrication method is largely continuous, can produce high quality products, and possesses an inexpensive means of structure control.

구형 및 벌레 모양의 Micellar 나노 자기 조립, 분무, 결합 하 여 용 매 기반 구조 제어의 제조

Micellar nanocrystals (micelles with encapsulated nanocrystals) have become an emerging major class of nanobiomaterials. We describe a method of ...

화학

Reconstitution of Msp1 Extraction Activity with Fully Purified Components

As the center for oxidative phosphorylation and apoptotic regulation, mitochondria play a vital role in human health. Proper mitochondrial function depends on a robust quality control system to maintain protein homeostasis (proteostasis). Declines in mitochondrial proteostasis have been linked to cancer, aging, neurodegeneration, and many other diseases. Msp1 is a AAA+ ATPase anchored in the outer mitochondrial membrane that maintains proteostasis by removing mislocalized tail-anchored proteins. Using purified components reconstituted into proteoliposomes, we have shown that Msp1 is necessary and sufficient to extract a model tail-anchored protein from a lipid bilayer. Our simplified reconstituted system overcomes several of the technical barriers that have hindered detailed study of membrane protein extraction. Here, we provide detailed methods for the generation of liposomes, membrane protein reconstitution, and the Msp1 extraction assay.

Here, we present a detailed protocol for reconstitution of Msp1 extraction activity with fully purified components in defined proteoliposomes.

완전히 정제된 구성 요소로 Msp1 추출 활동의 재구성

As the center for oxidative phosphorylation and apoptotic regulation, mitochondria play a vital role in human health. Proper mitochondrial function ...

Self-Assembly of Microtubule Tactoids

The cytoskeleton is responsible for major internal organization and re-organization within the cell, all without a manager to direct the changes. This is especially the case during mitosis or meiosis, where the microtubules form the spindle during cell division. The spindle is the machinery used to segregate genetic material during cell division. Toward creating self-organized spindles in vitro, we recently developed a technique to reconstitute microtubules into spindle-like assemblies with a minimal set of microtubule-associated proteins and crowding agents. Specifically, MAP65 was used, which is an antiparallel microtubule crosslinker from plants, a homolog of Ase1 from yeast and PRC1 from mammalian organisms. This crosslinker self-organizes microtubules into long, thin, spindle-like microtubule self-organized assemblies. These assemblies are also similar to liquid crystal tactoids, and microtubules could be used as mesoscale mesogens. Here, protocols are presented for creating these microtubule tactoids, as well as for characterizing the shape of the assemblies using fluorescence microscopy and the mobility of the constituents using fluorescence recovery after photobleaching.

This article presents a protocol for the formation of microtubule assemblies in the shape of tactoids using MAP65, a plant-based microtubule crosslinker, and PEG as a crowding agent.

미세 소관 선인장체의 자체 조립

The cytoskeleton is responsible for major internal organization and re-organization within the cell, all without a manager to direct the changes. This is ...

Reconstitution of Septin Assembly at Membranes to Study Biophysical Properties and Functions

Most cells can sense and change their shape to carry out fundamental cell processes. In many eukaryotes, the septin cytoskeleton is an integral component in coordinating shape changes like cytokinesis, polarized growth, and migration. Septins are filament-forming proteins that assemble to form diverse higher-order structures and, in many cases, are found in different areas of the plasma membrane, most notably in regions of micron-scale positive curvature. Monitoring the process of septin assembly in vivo is hindered by the limitations of light microscopy in cells, as well as the complexity of interactions with both membranes and cytoskeletal elements, making it difficult to quantify septin dynamics in living systems. Fortunately, there has been substantial progress in the past decade in reconstituting the septin cytoskeleton in a cell-free system to dissect the mechanisms controlling septin assembly at high spatial and temporal resolutions. The core steps of septin assembly include septin heterooligomer association and dissociation with the membrane, polymerization into filaments, and the formation of higher-order structures through interactions between filaments. Here, we present three methods to observe septin assembly in different contexts: planar bilayers, spherical supports, and rod supports. These methods can be used to determine the biophysical parameters of septins at different stages of assembly: as single octamers binding the membrane, as filaments, and as assemblies of filaments. We use these parameters paired with measurements of curvature sampling and preferential adsorption to understand how curvature sensing operates at a variety of length and time scales.

Cell-free reconstitution has been a key tool to understand the cytoskeleton assembly, and work in the last decade has established approaches to study septin dynamics in minimal systems. Presented here are three complementary methods to observe septin assembly in different membrane contexts: planar bilayers, spherical supports, and rod supports.

생체 물리학 적 특성과 기능을 연구하기 위해 멤브레인에서 Septin 어셈블리의 재구성

Most cells can sense and change their shape to carry out fundamental cell processes. In many eukaryotes, the septin cytoskeleton is an integral component ...

In Vitro Reconstitution of the Actin Cytoskeleton Inside Giant Unilamellar Vesicles

The actin cytoskeleton, the principal mechanical machinery in the cell, mediates numerous essential physical cellular activities, including cell deformation, division, migration, and adhesion. However, studying the dynamics and structure of the actin network in vivo is complicated by the biochemical and genetic regulation within live cells. To build a minimal model devoid of intracellular biochemical regulation, actin is encapsulated inside giant unilamellar vesicles (GUVs, also called liposomes). The biomimetic liposomes are cell-sized and facilitate a quantitative insight into the mechanical and dynamical properties of the cytoskeleton network, opening a viable route for bottom-up synthetic biology. To generate liposomes for encapsulation, the inverted emulsion method (also referred to as the emulsion transfer method) is utilized, which is one of the most successful techniques for encapsulating complex solutions into liposomes to prepare various cell-mimicking systems. With this method, a mixture of proteins of interest is added to the inner buffer, which is later emulsified in a phospholipid-containing mineral oil solution to form monolayer lipid droplets. The desired liposomes are generated from monolayer lipid droplets crossing a lipid/oil-water interface. This method enables the encapsulation of concentrated actin polymers into the liposomes with desired lipid components, paving the way for in vitro reconstitution of a biomimicking cytoskeleton network.

In Vitro Reconstitution of the Actin Cytoskeleton Inside Giant Unilamellar Vesicles

In this manuscript, we demonstrate the experimental techniques to encapsulate the F-actin cytoskeleton into giant unilamellar lipid vesicles (also called liposomes), and the method to form a cortex-biomimicking F-actin layer at the inner leaflet of the liposome membrane.

체외 거대한 Unilamellar 소포 내부의 Actin Cytoskeleton 재구성

The actin cytoskeleton, the principal mechanical machinery in the cell, mediates numerous essential physical cellular activities, including cell ...

생체공학

Particle Templated Emulsification enables Microfluidic-Free Droplet Assays

Reactions performed in monodispersed droplets afford enhanced accuracy and sensitivity compared to equivalent ones performed in bulk. However, the requirement of microfluidics to form controlled droplets imposes a barrier to non-experts, limiting their use. Here, we describe particle templated emulsification, an approach to generate monodisperse droplets without microfluidics. Using templating hydrogel spheres, we encapsulate samples in monodispersed droplets by simple vortexing. We demonstrate the approach by using it to perform microfluidic-free digital PCR.

Water-in-oil droplet assays are useful for analytical chemistry, enzyme evolution, and single cell analysis, but typically require microfluidics to form the droplets. Here, we describe particle templated emulsification, a microfluidic-free approach to perform droplet assays.

입자 템플릿 유화제를 통해 미세 유체가 없는 물방울 분석을 가능하게 합니다.

Reactions performed in monodispersed droplets afford enhanced accuracy and sensitivity compared to equivalent ones performed in bulk. However, the ...

생물학

Reconstitution of Membrane-Tethered Minimal Actin Cortices on Supported Lipid Bilayers

The surface of a living cell provides a versatile active platform for numerous cellular processes, which arise from the interplay of the plasma membrane with the underlying actin cortex. In the past decades, reconstituted, minimal systems based on supported lipid bilayers in combination with actin filament networks have proven to be very instrumental in unraveling basic mechanisms and consequences of membrane-tethered actin networks, as well as in studying the functions of individual membrane-associated proteins. Here, we describe how to reconstitute such active composite systems in vitro that consist of fluid supported lipid bilayers coupled via membrane-associated actin-binding proteins to dynamic actin filaments and myosin motors that can be readily observed via total internal reflection fluorescence microscopy. An open-chamber design allows one to assemble the system in a step-by-step manner and to systematically control many parameters such as linker protein concentration, actin concentration, actin filament length, actin/myosin ratio, as well as ATP levels. Finally, we discuss how to control the quality of the system, how to detect and troubleshoot commonly occurring problems, and some limitations of this system in comparison with the living cell surface.

This protocol describes the formation of supported lipid bilayers and the addition of cytoskeletal filaments and motor proteins to study the dynamics of reconstituted, membrane-tethered cytoskeletal networks using fluorescence microscopy.

지지된 지질 이중층에 대한 막으로 묶인 최소 액틴 피질의 재구성

The surface of a living cell provides a versatile active platform for numerous cellular processes, which arise from the interplay of the plasma membrane ...

Impact of cytoskeleton on nuclear shape and condensate dynamics in mouse oocytes(생쥐 난모세포의 핵 형태 및 응축물 역학에 대한 세포골격의 영향)

Capturing Cytoskeleton-Based Agitation of the Mouse Oocyte Nucleus Across Spatial Scales

A major challenge in understanding the causes of female infertility is to elucidate mechanisms governing the development of female germ cells, named oocytes. Their development is marked by cell growth and subsequent divisions, two critical phases that prepare the oocyte for fusion with sperm to initiate embryogenesis. During growth, oocytes reorganize their cytoplasm to position the nucleus at the cell center, an event predictive of successful oocyte development in mice and humans and, thus, their embryogenic potential. In mouse oocytes, this cytoplasmic reorganization was shown to be driven by the cytoskeleton, the activity of which generates mechanical forces that agitate, reposition, and penetrate the nucleus. Consequently, this cytoplasmic-to-nucleoplasmic force transmission tunes the dynamics of nuclear RNA-processing organelles known as biomolecular condensates. This protocol provides an experimental framework to document, with high temporal resolution, the impact of the cytoskeleton on the nucleus across spatial scales in mouse oocytes. It details the imaging and image analysis steps and tools necessary to evaluate i) cytoskeletal activity in the oocyte cytoplasm, ii) cytoskeleton-based agitation of the oocyte nucleus, and iii) its effects on biomolecular condensate dynamics in the oocyte nucleoplasm. Beyond oocyte biology, the methods elaborated here can be adapted for use in somatic cells to similarly address cytoskeleton-based tuning of nuclear dynamics across scales.

저자 스포트라이트: Elucidating the Dynamics of Mechano-Transduction and Nuclear Agitation in Mouse Oocytes

This protocol provides an experimental framework to document the physical impact of the cytoskeleton on nuclear shape and the internal membrane-less organelles in the mouse oocyte system. The framework can be adapted for use in other cell types and contexts.

공간 규모에 걸쳐 마우스 난모세포핵의 세포골격 기반 교반 캡처

A major challenge in understanding the causes of female infertility is to elucidate mechanisms governing the development of female germ cells, named ...