CG wird durch Zuschüsse der Agence Nationale de la Recherche (ANR-13-JSV1-0008), von der Europäischen Union Siebten Rahmenprogramm (Marie-Curie-Career Integration n˚8304162) und vom European Research Council (ERC) im Rahmen der Europäischen Union Horizon unterstützt 2020 Forschungs- und Innovationsprogramm (ERC Starting Grant n˚639300).

1. Ligand Konjugation an Magnetic Beads Hinweis: Ligand Konjugation durchgeführt unter Verwendung von superparamagnetischen Tosyl-aktivierte Kügelchen mit einem 2,8 &amp; mgr; m Durchmesser (Konzentration der Stammlösung 10 8 Perlen / ml, 30 mg Perlen / ml). Das folgende Protokoll basiert auf Proben von ca. 2 x 10 5 Zellen, die MRC-5 - Zellen entsprechen , zu 80% Konfluenz in einer 60 mm - Gewebekulturplatte gezüchtet. Stellen Sie die Lautstärke von Perlen und Reagenzien entsprechend, wenn die Platten in verschiedenen Größen oder Zellen bei verschiedenen confluences verwenden. Verwenden Sie eine Menge an superparamagnetische Perlen um 2 Perlen pro Zelle zu haben. Daher 4 x 10 5 Perlen sind für eine 60 - mm - Platte benötigt. <ol><li> Gründlich resuspendieren die Perlen in der Originalflasche durch Verwirbelung mindestens 30 s. Aliquot wurden 40 ul der resuspendierten superparamagnetische Perlen (entsprechend 4 x 10 6 Kügelchen) in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Das Röhrchen wird auf einem magnetischen separatiauf dem Stand, um die magnetischen Beads von der Lösung zu trennen. Überstand verwerfen, entfernen Sie Schlauch aus dem magnetischen Trennung Stand und resuspendieren die Perlen in 1 ml 0,1 M Na-Phosphat, pH 7,4. <ol><li> Wiederholen Waschschritt zweimal mit 1 ml 0,1 M Na-Phosphat pH 7.4. </li></ol></li><li> Nach dem letzten Waschen, Resuspendieren der Kügelchen in 1 ml 0,1 M Na-Phosphat pH 7.4. </li><li> Kombinieren von 100 &amp; mgr; g Rinder-Fibronectin (FN) oder jede andere Zelladhäsion Rezeptorliganden auf die 1 ml 0,1 M Na-Phosphat pH 7,4, der Perlen und mischen durch Pipettieren. </li><li> Wiederholen Sie vorherigen Schritte von FN oder jeder andere Ligand mit BSA, Poly-D-Lysin oder apo-Transferrin für negative Kontrollen zu ersetzen. </li><li> Optional für Gel-Analyse, nehmen Sie ein 10-ul-Aliquot der Ligandenlösung für die Analyse von Vernetzungseffizienz und mit einem geeigneten Volumen von konzentriertem Laemmli Probenpuffer mischen. </li><li> Inkubieren Kügelchen mit dem Ligand für 12-24 h bei 37 ° C an einem Rotor enthaltenden Lösung. </li><li> Wenn Wulst Aggregate erscheinen, nachdem die Reaktion stattgefunden hat, beschallen (Dauer 39 W Leistung) für nicht mehr als 10 bis 20 s. </li><li> Isolieren Sie die Perlen unter Verwendung von magnetischen Trennung Stand absaugen verbleibende Lösung und 1 mL PBS / 0,2% BSA, pH 7,6 Lösung. Inkubieren für 1 h auf den Rotor bei 37 ° C. </li><li> Waschen Perlen einen Magneten zweimal mit 1 ml PBS unter Verwendung von / 0,2% BSA, pH 7,6. Resuspendieren Kügelchen in 1 ml PBS / 0,2% BSA, pH 7,6. </li><li> Beschallen Perlen, wenn Aggregate erscheinen nicht mehr als 20 bis 30 s. </li><li> Kopplungseffizienz durch Western-Blot-Analyse (mischen mit einem geeigneten Volumen von konzentriertem Laemmli Probenpuffer) gegebenenfalls ein 10-ul-Aliquot entfernen. </li><li> Gehen Assays oder lagern Perlen für bis zu 1 Monat bei 4 ° C zu Zelle. </li><li> Optional eine SDS-PAGE-Gel und Flecken mit Coomassie-Blau laufen FN Vernetzungs an die magnetischen Kügelchen zu analysieren. </li></ol> 2. Anwendung von Zugkräften auf den Liganden-beschichteten Kügelchen gebunden zu Adhäsionsrezeptoren auf der dorsalenOberfläche von Zellen <ol><li> Kultur adhärenter Zellen auf 60 mm-Gewebekulturschale in geeigneten Wachstumsmedium (DMEM üblicherweise 4,5 g / L D-Glucose mit 10% FCS ergänzt), bis 80% Konfluenz zu erreichen. </li><li> Bereiten Sie nicht denaturierenden nichtionischen Lysepuffer (20 mM Tris - HCl pH 7,6, 150 mM NaCl, 2 mM MgCl 2, 0,1% NP-40) und Chill - Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Pellet die Liganden-beschichteten Kügelchen aus dem Abschnitt 1.10 und Resuspendieren in 1 mL PBS / 0,2% BSA, pH 7,6. Füge 100 &amp; mgr; l des Liganden-beschichteten Kügelchen Lösung auf 5 ml warmem Kulturmedium und vortexen. </li><li> Absaugen Medium in 60 mm Kulturschale und mit 5 ml warmem Wachstumsmedium mit Perlen ergänzt. </li><li> Inkubieren für 20 min unter Zellkulturbedingungen (37 ° C und 5% CO 2) die Kügelchen zu ermöglichen , an die Zellen zu sedimentieren und anhaften. Es ist von entscheidender Bedeutung, um nicht mehr als 20 min nicht überschreiten, da Kügelchen können durch Phagozytose internalisiert werden. </li><li> Optional beachten Sie die Perlen unter einem Lichtmikroskop eine 10X oder 20X obje mitctive und überprüfen Sie die Perle Haftung durch leichtes Schütteln der Schale zwischen befestigt und schwimmenden Perlen zu unterscheiden. </li><li> Während der Kulturschale in den Inkubator zu halten, tauschen die normale Schalendeckel für einen Deckel mit einem runden 38 mm Neodym-Magnet auf der Oberseite angebracht. Der Magnet wird an Ort und Stelle durch zwei kleinere 13 mm Neodym-Magneten auf der Unterseite des Deckels positioniert gehalten. Da die Magnete sehr mächtig sind, manipulieren sie sorgfältig. </li><li> Inkubieren , um Spannung für die gewünschten Zeitpunkten an Zellkulturbedingungen unterworfen Zellen (37 &amp; deg ; C und 5% CO 2). </li><li> Nach der Behandlung legen Schüssel auf Eis und sorgfältig das gesamte Medium aus der Schale absaugen. </li><li> Hinzufügen 300 ul Zelllyse-Puffer und Inkubation für 10 min auf Eis. Sammeln Sie das Lysat einem Zellschaber und in ein vorgekühltes 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit. </li><li> Pellet die magnetischen Kügelchen, die magnetische Trennung Stand und übertragen die gesamte Zelllysat auf eine neue Pre-Chill mited 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Bewahren Sie diese Fraktion, die bei -20 ° C für die weitere Analyse. </li><li> Waschen der Kügelchen 3-mal mit 1 ml eiskaltem Lysepuffer. In 50 ul Laemmli Probenpuffer zu dem Wulst Pellet, mischen durch Pipettieren und kochen bei 95 ° C für 5 Minuten mit einem trockenen Blockheizung verwendet wird. Diese Fraktion enthält die isolierten Haftkomplexe. Gehen Sie zur biochemischen Analyse oder bei -20 ° C. </li><li> Von den insgesamt nach Perlen Trennung erhaltene Zelllysat (etwa 300 &amp; mgr; l), entfernen Sie ein 50-ul-Aliquot für Western-Blot-Analyse. HINWEIS: Die 250 &amp; mgr; l für weitere biochemische Untersuchungen eingesetzt werden gelassen wie Protein-Protein-Interaktionsstudien (Immunpräzipitation, GST-Pull-down-Assays) oder GTPase-Aktivität Experimente (Lysepuffer kann eine Umschaltung in Abhängigkeit von der GTPase von Interesse erforderlich sein). </li></ol>

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Die Autoren erklären, keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Das hier beschriebene Verfahren stellt einen einfachen Ansatz Spannung an Zelloberflächen Adhäsionsrezeptoren aufzutragen und ihre nachfolgende Reinigung ermöglichen. Jedoch sind einige Schritte kritische effiziente Haftung Reinigung und mögliche Optimierung ausführen kann in Abhängigkeit von den angestrebten Adhäsionsrezeptoren erfolgen. Wir präsentieren potenzielle Probleme der Benutzer unten auftreten können. Wir verwendeten 2,8 um Durchmesser magnetische Kügelchen, aber größere Kügelchen können wie 4,5 &amp; mgr; m Durchmesser verwendet werden. Allerdings sollte Wulst Durchmesser auf 2-5 &amp; mgr; m beschränkt werden , da die Phagozytose könnte schneller während 30-60 min Inkubation auftreten und größere Perlen haben stärkere Haftung , so dass Wulst Verschiebung unter einem Magnetfeld eingeschränkt werden würde 34, 35. Daher ist es wichtig, Inkubationszeit auf kurze Zeiträume und verwenden, um die richtige Perlengrße zu begrenzen. Die Anzahl der Kügelchen pro Zelle inkubiert wird, die Menge des f auswirkenorce Erfahrung durch eine einzige Zelle. Während man will Zellen mit Spannung effizient zu stimulieren, können zu viele Perlen pro Zelle zu einer Aktivierung von irrelevanten Signalwege führen. Wir inkubieren Regel durchschnittlich zwei Perlen pro Zelle für FN-beschichteten Kügelchen, aber diese Menge eingestellt werden kann [1 bis 5 Perlen pro Zelle] abhängig von dem Zelltyp und den Zelloberflächenrezeptor. Dem Magneten in Bezug auf das beschriebene Verfahren verwendet hier einen Magneten , für die die resultierende Kraft auf eine 2,8 &amp; mgr; m (etwa 30-40 pN durch die Verschiebung der magnetischen Kügelchen in unverdünntem Glycerin Messung eine Newtonsche Flüssigkeit mit bekannter Viskosität 31, obwohl sie gemessen ist möglich, größere Magnete verwenden größere Menge an Kraft, wenn nötig anwenden. Es ist wichtig, dass diese Magnete extrem leistungsfähig zu beachten sind und sie sorgfältig zu manipulieren. Nach 12-24 h Inkubation mit ECM-Ligand (Schritt 1.7) sowie nach 1 h Inkubation (Schritt 1.9) mit PBS / 0,2% BSA, pH 7,6-Puffer, der magnetic Mikrokügelchen könnten Aggregate bilden. Es ist dann kritisch beads so weit wie möglich zu trennen, das Verhältnis von 2-Perlen pro Zelle zu respektieren. Jedoch ist es immer noch akzeptabel, eine 5 zu haben: 1-Verhältnis. Beads Trennung kann entweder durch Mischen und Pipettieren oder durch Verwendung von Ultraschall, obwohl für eine kurze Zeit (20-30 s) erreicht werden. Verschiedene Proteine ​​können an die Kügelchen konjugiert werden, einschließlich der Integrin-Liganden (FN, Kollagen), rekombinante Proteine ​​oder Antikörper-Targeting spezifische Zelloberflächenrezeptoren. Die Anbringung des Liganden-beschichteten magnetischen Kügelchen an der dorsalen Zelloberfläche kann durch die geringe Kopplungseffizienz des Liganden auf die Kügelchen geschwächt werden. Es wird empfohlen, an die Kügelchen-Bindung durch Sammeln eines Aliquots der verdünnten Ligandenlösung für den Liganden zu überprüfen, bevor am Ende des Kupplungsvorganges an die Perlen und einem Aliquot von Beads Zugabe. Diese Aliquoten können auf SDS-PAGE-Analyse und Coomassie-Blau-Färbung verarbeitet. Wenn keine Änderungen inSignalwege oder erwarteten mechanosensing Prozesse erkannt werden, ist es wichtig, verschiedene Möglichkeiten zu berücksichtigen. Eine Möglichkeit, das Problem zu identifizieren, ist die Dauer des Experiments mit dem Magneten zu modulieren. Es ist bekannt, daß die Geschwindigkeit zellulärer Prozesse variiert abhängig von der verwendeten Zelltyp. Eine weitere Option bekannte spannungsempfindliche Moleküle zu testen wäre und prüfen, ob ihre Post-translationale Modifikationen durch Western Blot (zum Beispiel paxillin Phosphorylierung oder FAK-Phosphorylierung analysiert werden). Die Kraft kann auch entscheidend sein, und ein dicker Magnet (gleiche Klasse N52) oder größeren Kügelchen verwendet, kann eine Option sein. Zusätzlich Ligand / Rezeptor-Bindungseffizienz kann durch die Analyse Adhäsionskomplexes sucht werden und für die Zelloberflächenrezeptoren (wie Cadherin oder Integrin) aussehen. Die Zellkonfluenz kann auch die zelluläre Antwort auf Spannung beeinflussen. Wie es diese Zelle / Zell-Adhäsion beobachtet wurde, kann das Zellverhalten und cystokeletal Vorspannung beeinflussen, ist es important zu beachten, dass die Konfluenz der Zellantwort auf Spannung beeinflussen kann. Obwohl wir 80% Konfluenz für die Anwendung von Spannung auf Integrin-basierte Adhäsionen empfehlen kann unterschiedlichen Bedingungen getestet werden, um das experimentelle System zu optimieren. Obwohl dieses Verfahren ein leistungsfähiges Werkzeug liefert die Spannung empfindlich adhesome sowie die zugehörigen Signalwege zu entschlüsseln, ist es auch einige Einschränkungen hatten. Erstens, da das Hauptanliegen solche kleine magnetische Kügelchen ist das Risiko der Internalisierung durch die Zellen verwendet wird, kann diese Methode nicht für die Untersuchung Langzeit mechanosensitive Signalisierungs zellulären Reaktionen verwendet werden, die Zellschicksal wie Differenzierung und Proliferation zu modifizieren. Eine weitere Einschränkung liegt in der Art und Weise, wie Kräfte auf die Schicht von Zellen in der Kulturplatte aufgebracht werden. In der Tat, da das Magnetfeld an der Peripherie des Magneten immer höher ist, können Kräfte an der Oberfläche der Kulturplatte variieren mit einem abnehmenden Gradienten von Zellerstreckt sich von der Peripherie zum Zentrum und könnte zu heterogenen Zellreaktionen führen. Das hier beschriebene Verfahren stellt eine einfache und kostengünstige Methode, die mechanosensitive zelluläre Wege sowie die Untersuchung der molekularen Zusammensetzung von Adhäsionskomplexe unterworfen Spannung erlaubt zu studieren. Andere Ansätze, wie beispielsweise Streckvorrichtung, die zyklische Belastung auf Zellen anwenden, führen zu der Anwendung von Spannung auf allen Zelloberflächenrezeptoren mit der extrazellulären Matrix zu interagieren. Das hier beschriebene Verfahren hat den Vorteil der Kraft Stimulation einer spezifischen Teilmenge von Zelloberflächenrezeptoren ermöglichen, und eine große Vielfalt von Liganden verwendet werden können, wie zum Beispiel Liganden oder Antikörper Integrin Zelloberflächenrezeptoren Targeting, so dass die Untersuchung vieler verschiedene mechanosensitive Systemen. Ein weiterer Vorteil dieses Verfahrens ist, dass es auf die Reinigung der Proteine ​​Komplexe führt, die Spannung erfahren und auf tragende eleme arbeitennts , die eine zentrale Rolle in Mechanotransduktion spielen 36 sind bekannt. Das gereinigte Adhäsionskomplexes kann auch für verschiedene biochemische Ansätze 14, beispielsweise Kinase - Assays verwendet werden Kinaseaktivität in Reaktion auf Spannung oder Aktin - Polymerisations - Assay zu untersuchen. Darüber hinaus kann dieses experimentelle System mit magnetischen Pinzette gekoppelt werden, um die zelluläre mechanische Reaktion zu untersuchen und diese Antwort mit den identifizierten Signalwege zu korrelieren. Interessanterweise wurden 37 kürzlich mechanisch Last Notch und E-Cadherin mit präziser Kontrolle in Zeit und Raum magnetoplasmonic Nanoteilchen verwendet. Diese jüngste Entwicklung helfen kann mechanosensitive Signalwege mit unterschiedlichen räumlichen, zeitlichen und mechanischen Eingänge zu erkunden.

In Metazoen leitet mechanische Spannung Gewebeentwicklung und Homöostase durch die Regulierung einer Vielzahl von zellulären Prozessen, wie Proliferation, Differenzierung und das Überleben 1, 2. Mechanische Spannung kann von der extrazellulären Matrix entstehen oder durch anhaftenden Zellen erzeugt werden, die Probe ihre extrazelluläre Umgebung durch die Aktomyosin Kontraktions Maschinen, die auf extrazelluläre Matrix zieht und Sonden ihre Steifigkeit durch spannungsempfindliche Moleküle. Als Reaktion auf die Spannung, durchlaufen mechanosensitive Adhäsionsproteine ​​Konformationsänderungen, die komplexe Signalkaskaden auslösen. Wiederum orchestriert diese Signalwege eine mechanoresponse umfasst Proliferation, Differenzierung und das Überleben, die das Zellverhalten in die extrazelluläre Umgebung anpasst. Solche Verfahren können in einem kurzfristigen Zeitraum (Sekunden bis Minuten), um schnell füttern zurück auf die Schleife von Mecha abgerechnet<html> notransduction durch die mechanosensitive Strukturen zu verändern. Zum Beispiel verstärken Integrin-basierte Adhäsionen in Reaktion auf Spannung durch Rho - GTPase-vermittelten Zytoskelett - Remodeling 3, 4, 5. Parallel dazu werden andere Signalwege über Stunden und Tage aktiviert , um genetische Programme steuern , die schließlich Zellschicksal 6 auswirken. Während haben viele Studien die Wirkung der Matrix Steifigkeit auf Zelle Determinismus und die Entwicklung der Krankheit 1 hervorgehoben, 2, die genauen molekularen Mechanismen der Adhäsion vermittelten Mechanotransduktion bleiben immer noch schwer zu fassen. Verschiedene Ansätze wurden die Wirkungen von zell erzeugten Kräfte oder externe Kräfte , die auf das Zellverhalten, einschließlich Strömungssysteme zu untersuchen entwickelt, Fluoreszenzresonanzenergietransfer (FRET) -tension Sensoren 7,lass = &quot;xref&quot;&gt; 8 kompatible Substrate 9, magnetische Pinzette, optische Pinzette 10 und Rasterkraftmikroskopie (AFM) 11. Hier präsentieren wir ein Protokoll superparamagnetische Perlen mit auf Mechanotransduktion Wege in Reaktion auf Zugkräften Rezeptoren angewendet spezifische Adhäsion zu charakterisieren. Superparamagnetische Perlen sind Teilchen, die reversibel, wenn sie in ein Magnetfeld gebracht magnetisieren. Einmal beschichtet mit einem Liganden für einen spezifischen Rezeptor liefern diese Kügelchen ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Effekte von extrazellulärem Kraftbeaufschlagung zu studieren. Diese Methode wurde von mehreren Studien validiert 3, 5, 12 - 17 und den Vorteil präsentieren weitgehend biochemische Analyse auf adhärente Zellen erleichtern. Unter Verwendung ähnlicher Kollagen-beschichteten magnetischen Kügelchen gefolgt von biochemischen Analyse, berichtet frühen Arbeiten eine Erhöhung derProtein - Tyrosin - Phosphorylierung und Aktivierung RhoA in Antwort auf Zug 5, 18, 19. Das nachfolgend beschriebene Verfahren wurde auch mit Fibronectin (FN) -beschichteten Kügelchen verwendet worden , um die Signalwege zu charakterisieren nachgeordnet Spannung angelegt an Integrine 3. In dieser Studie Guilluy et al. RhoA durch die Einstellung der beiden Guaninnucleotid- Austauschfaktoren (GEF), LARG und GEF-H1, an Integrin Adhäsionskomplexe zeigten, dass Spannung aktiviert. Da dass, haben andere Studien gezeigt , dass GEF-H1 zu Adhäsionskomplexe in Reaktion auf zell erzeugte Spannung eingestellt wird unter Verwendung von verschiedenen Verfahren 20, 21, demonstriert die Robustheit der Methodik beschrieben. Als Ergebnis wurde aktiviert RhoA gezeigt Haftverstärkung, durch Zytoskelett Remodellierung zu fördern. Dieses System wurde auch Spannung angelegt t verwendet, um zu erkundeno Zell / Zell-Adhäsion Rezeptoren. Anwendung von Kräften auf die magnetischen Kügelchen , beschichtet mit der extrazellulären Domäne von E-Cadherin einen Anstieg in Vinculin Einstellungs ähnlich Integrin assoziiert Adhäsionskomplexe induzierten 12. Collins und Kollegen beobachteten , dass die Anwendung von Spannung auf PECAM-1 fördert Integrin und RhoA Aktivierung 13. Ein weiterer experimenteller Ansatz unter Verwendung von magnetischen Kügelchen ist die Untersuchung der Spannung an isolierten Kernen angewendet. Mit Perlen , beschichtet mit Antikörpern gegen das Atom-Hüllprotein Nesprin-1 wurden Kernhülle Komplexe gereinigt zu zeigen , dass sie in Reaktion auf die mechanische Spannung 22 dynamisch geregelt werden. Diese Ergebnisse unterstützen die Mächtigkeit dieser Methode in der Studie von Mechanotransduktion Wege. Darüber hinaus, während eine Strömung oder Zugkraftsysteme allgemeine zelluläre Prozesse zu stimulieren, magnetische Kügelchen spezifisch eine Zelladhäsion Rezeptor gezielt entweder durch Rezeptor-Liganden 13, 15. Ein weiterer Vorteil dieses Verfahrens ist die Isolierung von Haftkomplexen durch eine einfache Ligandenaffinitätsreinigungsverfahren. Es ist bekannt , dass die Zugabe von Liganden-beschichteten Kügelchen an Zellen Adhäsionsrezeptoren und induziert die Rekrutierung von verschiedenen Adhäsionsproteinen 23 bindet. Weitere Anwendung von Kräften auf Ligand-beschichteten magnetischen Kügelchen verwandelt sich diese Adhäsionskomplexe in molekularen Plattformen , die verschiedene Spannungs abhängige Signalwege 4, 24 vermittelt. Zellyse durch bead Konzentration gefolgt unter Verwendung eines Magneten erlaubt die Isolierung der Adhäsion Plattformen. Andere Verfahren verwendet Adhäsionskomplexe zu reinigen sind bereits in adhärenten Zellen verwendet. Sie kombinieren die chemische Vernetzung von Protein-Protein-Wechselwirkungen zu konservierenund eine Zelllyse Schritt Waschmittel- und Scherströmung oder Beschallung 20, 21, 25, 26, 27, 28. Der letzte Schritt ist das Sammeln der resultierenden ventral Plasmamembranen, die Haftkomplexe enthält. Im Gegensatz zu diesen Verfahren lassen magnetische Kügelchen eine größere Reinigungsgrad der Zelladhäsion Komplexe durch gezielt eine bestimmte Familie von Adhäsion Rezeptoren abzielen. Die Magnetkügelchen wurden bereits verwendet worden Adhäsionskomplexe in nicht anhaftenden Zellen zu Ligand-beschichteten Mikrokügelchen 29, 30 angebracht zu reinigen. Das Verfahren unter ahmt biologische Situationen beschrieben, in denen Kraft für einen kurzen längeren Zeitraum (Sekunden bis Minuten) angewendet wird. Daher stellt sie ein leistungsfähiges Werkzeug für die molekulare Zusammensetzung von gereinigtem Adhäsionskomplexe Untersuchung unddie nachgeschalteten mechanosensitive-Signalwege. Hier präsentieren wir eine detaillierte experimentelle Protokoll für magnetische Kügelchen unter Verwendung von Zugkräften auf die Haftung Oberflächenproteine ​​anzuwenden. Ein Permanent Neodym-Magnet ist auf der Oberseite der Kulturschale Oberfläche gelegt. Die Polfläche des Magneten in einer Höhe von 6 mm angeordnet , so dass die Kraft , die auf einem einzelnen 2,8 um magnetische Perle konstant ist (etwa 30-40 pN) 31. Die Dauer der Stimulationsspannung wird durch den Bediener in Abhängigkeit von dem Molekül von Interesse und ihre Zeitskala der Aktivierung bestimmt. Die Zellen werden schließlich lysiert, Adhäsion Komplexe werden durch Sicken Trennung gereinigt unter Verwendung eines Magneten und biochemische Analysen verarbeitet. Dieses Protokoll umfasst die Herstellung von Ligand-beschichtete superparamagnetische Perlen, und die Anwendung von Spannung durch Magnet durch biochemische Analysen gefolgt. Darüber hinaus bieten wir eine repräsentative Stichprobe von Daten, dass die Spannung an Integrin-basierte adh angewendet demonstrierenesions induziert Adhäsion Umbau und verändert Proteintyrosinphosphorylierung.

<table><tbody><tr><td>Neodymium magnets (on the upper face of 60 mm dish)</td><td>K&amp;amp;J Magnetics, Inc</td><td>DX88-N52</td><td>grade N52 dimension: 1 1/2&quot; dia. x 1/2&quot; thick</td></tr><tr><td>Neodymium magnets (on the lower face of 60 mm dish)</td><td>K&amp;amp;J Magnetics, Inc</td><td>D84PC-BLK</td><td>grade N42 dimension: 1/2&quot; dia. x 1/4&quot; thick Black Plastic Coated&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Dynabeads M280 Tosylactivated</td><td>Thermofisher</td><td>14203</td><td>superparamagnetic beads&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>DynaMag-2 Magnet</td><td>Thermofisher</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141-5MG</td><td>Fibronectin from bovine plasma</td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7280-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Apo-Transferrin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1428-50MG</td><td>Bovine Apo-Transferrin</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906-500G</td><td></td></tr><tr><td>DMEM high glucose, GlutaMAX supplement, pyruvate&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>31966-021</td><td>DMEM+GlutaMAX-I 500 ml&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>60*15 mm culture dish</td><td>Falcon</td><td>353004</td><td></td></tr></tbody></table>

analyzing cell surface adhesion remodeling in response to mechanical tension using magnetic beads

Mechanosensitiven Zelloberfläche Adhäsionskomplexe erlauben Zellen die mechanischen Eigenschaften ihrer Umgebung zu erfassen. Jüngste Studien haben beide Kraftmess Moleküle an Haftstellen und kraftabhängige Transkriptionsfaktoren identifiziert, die linienspezifische Genexpression regulieren und phänotypische Ausgänge gilt. Allerdings haben die Signalisierungsnetze Umwandlung mechanischer Spannung in biochemischen Wege blieb schwer zu fassen. Um die Signalwege erkunden bei einer mechanischen Spannung in Eingriff angewendet Zelloberflächenrezeptor, können superparamagnetische Mikrokügelchen verwendet werden. Hier präsentieren wir ein Protokoll für magnetische Kügelchen mit Kräften an Zelloberflächen Adhäsionsproteine ​​anzuwenden. Mit diesem Ansatz ist es möglich, nicht nur kraftabhängige Wege cytoplasmatischen Signal zu untersuchen, indem verschiedene biochemische Ansätze, sondern auch Remodeling Adhäsion durch magnetische Trennung von Haftkomplexen gebunden an den Liganden-beschichteten Kügelchen. Dieses Protokoll umfasst die Herstellung von Ligand-coATED superparamagnetische Perlen, und die Anwendung von Zugkräften durch biochemische Analysen gefolgt definieren. Darüber hinaus bieten wir eine repräsentative Stichprobe von Daten, dass die Spannung an Integrin-basierte Haftung Haftung Umbau angewendet demonstriert löst und verändert Proteintyrosinphosphorylierung.

Die schematische Darstellung der Technik ist in 1a veranschaulicht. Folgende Liganden Konjugation werden magnetische Perlen für 20 min mit Zellen inkubiert, und dann wird ein Permanentmagnet verwendet, um Zugkräfte von etwa 30-40 pN für verschiedene Zeitdauer anzuwenden. Abbildung 1b zeigt 2,8 um FN-beschichteten magnetischen Kügelchen gebunden zu MRC5- Zelladhäsionsrezeptoren. Die Waschschritte der superparamagnetischen Perlen nach der Zelllyse sind entscheidend und der Grad der Reinigung zu bestimmen. Ein Minimum von drei Wäschen wird empfohlen. GADPH Immunoblots mit Langzeitbelichtungen kann nützlich sein , um die Reinheit von Adhäsionskomplexe zu testen (Abbildung 2a). FN-beschichteten Kügelchen wurden verwendet, um die Mechanotransduktion Prozesse zu untersuchen, die an den Adhäsionskomplexe als Reaktion auf Spannung im Laufe der Zeit auftreten. Nach magnetischer Trennung der Adhäsionskomplexes Fraktion, das Lysat und das Adhäsionskomplexes Fraktion wurden analysiert durchwestlicher Fleck. Wie erwartet, haben wir beobachtet , Talin, Vinculin und paxillin, aber nicht GAPDH in der Fraktion Adhäsionskomplexe sogar in Abwesenheit von mechanischer Stimulation (Abbildung 2b). In Übereinstimmung mit früheren Berichten , 32, 33, ausgelöst Spannung Vinculin Rekrutierung Adhäsionskomplexe. Während Spannung nicht paxillin Rekrutierung Adhäsionskomplexe beeinflußte, dessen Phosphorylierung an Tyrosin-31 wurde in Reaktion auf die mechanische Spannung verbessert sowohl im gesamten Zell-Lysat und in der Adhäsionskomplexes Fraktion. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/55330/55330fig1.jpg" /> Abbildung 1. Beschreibung des Verfahrens. (A) Schematische Darstellung der Technik. Die Zellen werden zuerst in Medium Kultur kultiviert, bis die gewünschte Konfluenz erreicht ist. Dann werden superparamagnetische Perlen für 15-20 min zugegeben. Zugkräften etwa 30-40 pN sinddann angewendet, um den kalibrierten Magnet für unterschiedliche Menge an Zeit verwenden. (B) Fibronektin-beschichtete binden superparamagnetische Perlen an Zelladhäsionsrezeptoren. Die Zellen werden durch Phasenkontrast im Durchlichtmikroskopie 15 min nach Zugabe der superparamagnetische Perlen (weißer Pfeil) in Medium abgebildet wird. (Bild oben: Maßstabsbalken = 25 &amp; mgr; m, unteres Bild: Maßstabsbalken = 100 &amp; mgr; m) <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55330/55330fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55330/55330fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/55330/55330fig2.jpg" /> Abbildung 2. Mechanische Spannung induziert Adhäsion Reifung. (A) Reinigung von Haftkomplexen. GAPDH Immunoblotting wird als Ladekontrolle für die gesamte Zelllysat verwendet und die Reinheit der Adhäsionskomplexe zu überprüfen. Die Nitrocellulosemembran wurde mit einer Langzeitbelichtung bebildert th zu demonstrierene Abwesenheit eines Signals in Adhäsionskomplexes Fraktion. (B) Die Spannung induziert Adhäsion Reifung. Ladekontrolle (GAPDH) und Kandidaten (Vinculin, Talin und paxillin) bekannt zu mechanischen Spannungen an Adhäsionskomplexe in Reaktion rekrutiert oder phosphoryliert werden immunoblottiert. Dieses Experiment wurde auf MRC5-Zellen durchgeführt. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55330/55330fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55330/55330fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Analyzing Cell Surface Adhesion Remodeling in Response to Mechanical Tension Using Magnetic Beads

Die Zelloberflächen Adhäsionen sind von zentraler Bedeutung in Mechanotransduktion, da sie mechanische Spannung und initiieren die Signalwege beteiligt in Gewebshomöostase und Entwicklung übertragen. Hier stellen wir ein Protokoll für die biochemischen Wege Sezieren, die als Antwort auf Zug aktiviert werden, unter Verwendung von Liganden-beschichteten magnetischen Mikrokügelchen und Kraftbeaufschlagung Adhäsionsrezeptoren.

Analyse Zelloberflächenhaftung Remodeling in Reaktion auf mechanische Spannung Mit Magnetic Beads

Mechanosensitive cell surface adhesion complexes allow cells to sense the mechanical properties of their surroundings. Recent studies have identified both ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

8.4K Aufrufe.  Centre de recherche UGA - INSERM U1209 - CNRS UMR.  Die Zelloberflächen Adhäsionen sind von zentraler Bedeutung in Mechanotransduktion, da sie mechanische Spannung und initiieren die Signalwege beteiligt in Gewebshomöostase und Entwicklung übertragen. Hier stellen wir ein Protokoll für die biochemischen Wege Sezieren, die als Antwort auf Zug aktiviert werden, unter Verwendung von Liganden-beschichteten magnetischen Mikrokügelchen und Kraftbeaufschlagung Adhäsionsrezeptoren. 

Serie: Analyzing Cell Surface Adhesion Remodeling in Response to Mechanical Tension Using Magnetic Beads

Preparation of Complaint Matrices for Quantifying Cellular Contraction

The regulation of cellular adhesion to the extracellular matrix (ECM) is essential for cell migration and ECM remodeling. Focal adhesions are macromolecular assemblies that couple the contractile F-actin cytoskeleton to the ECM. This connection allows for the transmission of intracellular mechanical forces across the cell membrane to the underlying substrate. Recent work has shown the mechanical properties of the ECM regulate focal adhesion and F-actin morphology as well as numerous physiological processes, including cell differentiation, division, proliferation and migration. Thus, the use of cell culture substrates has become an increasingly prevalent method to precisely control and modulate ECM mechanical properties.
To quantify traction forces at focal adhesions in an adherent cell, compliant substrates are used in conjunction with high-resolution imaging and computational techniques in a method termed traction force microscopy (TFM). This technique relies on measurements of the local magnitude and direction of substrate deformations induced by cellular contraction. In combination with high-resolution fluorescence microscopy of fluorescently tagged proteins, it is possible to correlate cytoskeletal organization and remodeling with traction forces.
Here we present a detailed experimental protocol for the preparation of two-dimensional, compliant matrices for the purpose of creating a cell culture substrate with a well-characterized, tunable mechanical stiffness, which is suitable for measuring cellular contraction. These protocols include the fabrication of polyacrylamide hydrogels, coating of ECM proteins on such gels, plating cells on gels, and high-resolution confocal microscopy using a perfusion chamber. Additionally, we provide a representative sample of data demonstrating location and magnitude of cellular forces using cited TFM protocols.

In this video, we demonstrate the experimental techniques used to fabricate compliant, extracellular matrix (ECM) coated substrates suitable for cell culture, and which are amenable to traction force microscopy and observing effects of ECM stiffness on cell behavior.

Vorbereitung der Beschwerde Matrizen zur Quantifizierung von Cellular Kontraktion

The regulation of cellular adhesion to the extracellular matrix (ECM) is essential for cell migration and ECM remodeling.  Focal adhesions are ...

Forschung

Biotechnik

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

The generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology, with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 and wound healing3. In each of these examples, cells both exert force on their surroundings and simultaneously enzymatically remodel the extracellular matrix (ECM). The effect of forces on ECM has thus become an area of considerable interest due to its likely biological and medical importance4-7.
	Single molecule techniques such as optical trapping8, atomic force microscopy9, and magnetic tweezers10,11 allow researchers to probe the function of enzymes at a molecular level by exerting forces on individual proteins. Of these techniques, magnetic tweezers (MT) are notable for their low cost and high throughput. MT exert forces in the range of ~1-100 pN and can provide millisecond temporal resolution, qualities that are well matched to the study of enzyme mechanism at the single-molecule level12. Here we report a highly parallelizable MT assay to study the effect of force on the proteolysis of single protein molecules. We present the specific example of the proteolysis of a trimeric collagen peptide by matrix metalloproteinase 1 (MMP-1); however, this assay can be easily adapted to study other substrates and proteases.

In this article we describe the use of magnetic tweezers to study the effect of force on enzymatic proteolysis at the single molecule level in a highly parallelizable manner.

Multiplexed Einzelmolekül-Kraftspektroskopie Proteolyse Messungen mit magnetischen Pinzette

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

Magnetic Tweezers for the Measurement of Twist and Torque

Single-molecule techniques make it possible to investigate the behavior of individual biological molecules in solution in real time. These techniques include so-called force spectroscopy approaches such as atomic force microscopy, optical tweezers, flow stretching, and magnetic tweezers. Amongst these approaches, magnetic tweezers have distinguished themselves by their ability to apply torque while maintaining a constant stretching force. Here, it is illustrated how such a &#8220;conventional&#8221; magnetic tweezers experimental configuration can, through a straightforward modification of its field configuration to minimize the magnitude of the transverse field, be adapted to measure the degree of twist in a biological molecule. The resulting configuration is termed the freely-orbiting magnetic tweezers. Additionally, it is shown how further modification of the field configuration can yield a transverse field with a magnitude intermediate between that of the &#8220;conventional&#8221; magnetic tweezers and the freely-orbiting magnetic tweezers, which makes it possible to directly measure the torque stored in a biological molecule. This configuration is termed the magnetic torque tweezers. The accompanying video explains in detail how the conversion of conventional magnetic tweezers into freely-orbiting magnetic tweezers and magnetic torque tweezers can be accomplished, and demonstrates the use of these techniques. These adaptations maintain all the strengths of conventional magnetic tweezers while greatly expanding the versatility of this powerful instrument.

Magnetic tweezers, a powerful single-molecule manipulation technique, can be adapted for the direct measurements of the twist (using a configuration called freely-orbiting magnetic tweezers) and torque (using a configuration termed magnetic torque tweezers) in biological macromolecules. Guidelines for performing such measurements are given, including applications to the study of DNA and associated nucleo-protein filaments.

Magnetische Pinzette zur Messung von Dreh-und Drehmoment

Single-molecule techniques make it possible to investigate the behavior of individual biological molecules in solution in real time. These techniques ...

Bead Aggregation Assays for the Characterization of Putative Cell Adhesion Molecules

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions for many of these proteins are poorly understood. Here we present a simple, rapid method for characterizing the adhesive properties of putative homophilic cell adhesion molecules. Cultured HEK293 cells are transfected with DNA plasmid encoding a secreted, epitope-tagged ectodomain of a cell surface protein. Using functionalized beads specific for the epitope tag, the soluble, secreted fusion protein is captured from the culture medium. The coated beads can then be used directly in bead aggregation assays or in fluorescent bead sorting assays to test for homophilic adhesion. If desired, mutagenesis can then be used to elucidate the specific amino acids or domains required for adhesion. This assay requires only small amounts of expressed protein, does not require the production of stable cell lines, and can be accomplished in 4 days.

Here we present a simple, rapid method for characterizing the intrinsic adhesive properties of putative cell adhesion molecules. The secreted, epitope-tagged ectodomain of a cell adhesion molecule is captured from the culture medium on small, uniform functionalized beads. These beads can then be used immediately in simple bead aggregation assays.

Wulst Aggregationsassays zur Charakterisierung von putativen Zelladhäsionsmoleküle

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions ...

A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When the substrate is coated with an extracellular matrix protein, cells adhere to the gel and apply forces, causing the gel to deform. The deformation depends on the cell traction and the elastic properties of the gel. If the deformation field of the surface is known, surface traction can be calculated using elasticity theory. Gel deformation is commonly measured by embedding fluorescent marker beads uniformly into the gel. The probes displace as the gel deforms. The probes near the surface of the gel are tracked. The displacements reported by these probes are considered as surface displacements. Their depths from the surface are ignored. This assumption introduces error in traction force evaluations. For precise measurement of cell forces, it is critical for the location of the beads to be known. We have developed a technique that utilizes simple chemistry to confine fluorescent marker beads, 0.1 and 1 &#181;m in diameter, in PA gels, within 1.6 &#956;m of the surface. We coat a coverslip with poly-D-lysine (PDL) and fluorescent beads. PA gel solution is then sandwiched between the coverslip and an adherent surface. The fluorescent beads transfer to the gel solution during curing. After polymerization, the PA gel contains fluorescent beads on a plane close to the gel surface.

Traditional techniques for fabricating polyacrylamide (PA) gels containing fluorescent probes involve sandwiching a gel between an adherent surface and a glass slide. Here, we show that coating this slide with poly-D-lysine (PDL) and fluorescent probes localizes the probes to within 1.6 &#181;m from the gel surface.

Eine neue Methode zur Lokalisierung Reporter fluoreszierende Kügelchen In der Nähe der Zellkulturoberfläche für Traction Force Microscopy

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

Magnetic Tweezers in a Microplate Format

Mechanobiology describes how the physical forces and mechanical properties of biological material contribute to physiology and disease. Typically, these approaches are limited single-molecule methods, which restricts their availability. To address this need, a microplate assay was developed that enables mechanical manipulation while performing standard biochemical assays. This is achieved using magnets incorporated into a microplate lid to create multiple magnetic tweezers. In this format, force is exerted across biomolecules connected to paramagnetic beads, equivalent to a typical magnetic tweezer. The study demonstrates the application of this tool with FRET-based assays to monitor protein conformations. However, this approach is widely applicable to different biological systems ranging from measuring enzymatic activity through to the activation of signaling pathways in live cells.

Here, we describe the use of a novel microplate assay to enable mechanical manipulation of biomolecules while performing ensemble biochemical assays. This is achieved using a microplate lid modified with magnets to create multiple static magnetic tweezers across the microplate.

Mechanobiology describes how the physical forces and mechanical properties of biological material contribute to physiology and disease. Typically, these ...

Biochemie

High-Speed Magnetic Tweezers for Nanomechanical Measurements on Force-Sensitive Elements

Single-molecule magnetic tweezers (MTs) have served as powerful tools to forcefully interrogate biomolecules, such as nucleic acids and proteins, and are therefore poised to be useful in the field of mechanobiology. Since the method commonly relies on image-based tracking of magnetic beads, the speed limit in recording and analyzing images, as well as the thermal fluctuations of the beads, has long hampered its application in observing small and fast structural changes in target molecules. This article describes detailed methods for the construction and operation of a high-resolution MT setup that can resolve nanoscale, millisecond dynamics of biomolecules and their complexes. As application examples, experiments with DNA hairpins and SNARE complexes (membrane-fusion machinery) are demonstrated, focusing on how their transient states and transitions can be detected in the presence of piconewton-scale forces. We expect that high-speed MTs will continue to enable high-precision nanomechanical measurements on molecules that sense, transmit, and generate forces in cells, and thereby deepen our molecular-level understanding of mechanobiology.

Here, we describe a high-speed magnetic tweezer setup that performs nanomechanical measurements on force-sensitive biomolecules at the maximum rate of 1.2 kHz. We introduce its application to DNA hairpins and SNARE complexes as model systems, but it will be also applicable to other molecules involved in mechanobiological events.

Hochgeschwindigkeits-Magnetpinzette für nanomechanische Messungen an kraftempfindlichen Elementen

Single-molecule magnetic tweezers (MTs) have served as powerful tools to forcefully interrogate biomolecules, such as nucleic acids and proteins, and are ...

<meta charset="utf8"></head><body>In-vivo-Mechanotransduktionsstudie mit magnetischen Kügelchen im Herzen des Zebrafisches

Manipulating Mechanical Forces in the Developing Zebrafish Heart Using Magnetic Beads

Mechanical forces continuously provide feedback to heart valve morphogenetic programs. In zebrafish, cardiac valve development relies on heart contraction and physical stimuli generated by the beating heart. Intracardiac hemodynamics, driven by blood flow, emerge as fundamental information shaping the development of the embryonic heart. Here, we describe an effective method to manipulate mechanical forces in vivo by grafting a 30 &#181;m to 60 &#181;m diameter magnetic bead in the cardiac lumen. The insertion of the bead is conducted through microsurgery in anesthetized larvae without perturbing heart function and enables artificial alteration of the boundary conditions, thereby modifying flow forces in the system. As a result, the presence of the bead amplifies the mechanical forces experienced by endocardial cells and can directly trigger mechanical stimulus-dependent calcium influx. This approach facilitates the investigation of mechanotransduction pathways that govern heart development and can provide insights into the role of mechanical forces in cardiac valve morphogenesis.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor im Rampenlicht: Verständnis der mechanischen Kräfte, die an der Formung des Zebrafischherzens beteiligt sind

This protocol outlines a method for grafting a magnetic bead into the developing zebrafish heart through microsurgery, enabling the manipulation of mechanical forces in vivo and triggering mechanical stimulus-dependent calcium influx in endocardial cells.

Mechanische Kräfte im sich entwickelnden Zebrafischherz mit Hilfe von Magnetkügelchen manipulieren

Mechanical forces continuously provide feedback to heart valve morphogenetic programs. In zebrafish, cardiac valve development relies on heart contraction ...

Analyse Zelloberflächenhaftung Remodeling in Reaktion auf mechanische Spannung Mit Magnetic Beads

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Mechanische Kräfte im sich entwickelnden Zebrafischherz mit Hilfe von Magnetkügelchen manipulieren

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