Name: intracellular staining and flow cytometry to identify lymphocyte subsets within murine aorta, kidney and lymph nodes in a model of hypertension
Uploaded: 2017-01-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Intracellular Staining and Flow Cytometry to Identify Lymphocyte Subsets within Murine Aorta, Kidney and Lymph Nodes in a Model of Hypertension at JoVE.com

이 작품은 FL에 미국 심장 협회 (American Heart Association) 원정대 상 (16POST29950007), 건강 (NIH T32 HL069765) BLD, MA 살레에 미국 심장 협회 (American Heart Association) 원정대 상 (14POST20420025) 중 국립 연구소에서 훈련 보조금 및 NIH에 의해 지원되었다 K08 상 MSM에 (HL121671). MSM은 길르앗 과학, Inc.의 연구 보조금에 의해 지원됩니다

밴더빌트 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회는 여기에 설명 된 절차를 승인했다. 마우스는 보관 및 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드에 따라 마음에 든다고된다 (국립 아카데미를 누릅니다. 개정 2010). 쥐의 대동맥 배수 림프절, 신장 및 대동맥 1. 분리 <ol><li> CO 2 흡입하여 쥐를 안락사. 70 % 에탄올로 가슴 스프레이 조심스럽게 피부와 마음을 노출 가위로 가슴 벽을 엽니 다. </li><li> 혈관을 관류하기 우심방에 작은 절개를 수행하고 꾸준히 21 23 G 바늘을 사용하여 좌심실의 정점에 차가운 PBS (약 1 ㎖ / 초)의 적어도 10 ㎖를 주입. 모든 기관이 희게 될 때까지 관류. 핵심은 첫째 blanches. 간의 창백하면 관류 잘 수행되었음을 나타냅니다. </li><li> 작은 집게와 미세 가위를 사용하여, 부드럽게, 절단 및 창자를 꺼내위장, 비장, 췌장과 간 더 나은 대동맥을 시각화합니다. 참고 :이 단계는 오염을 유도 할 수 위장관 손상으로 매우 정확하게 수행해야합니다. </li><li> 잘라 가위 각각의 폐를 제거합니다. 무 바늘 주사기를 사용하여 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)와 흉강을 씻어. 멸균 거즈를 사용하여 여분의 혈액과 액체를 제거합니다. </li><li> 미세 해부 집게를 사용하여 복부 대동맥 림프절을 제거합니다. 캡슐을 파열하지 않도록합니다. 해부 포셉 각 림프절의 표면에 남아있는 지방을 제거합니다. 미세 가위로 두 개의 신장을 잘라. </li><li> 잘, 곡선 가위로 전체 대동맥 (흉부 및 복부 대동맥)을 해부하다. 마음의 수준에서 시작하고 조심스럽게 식도 및 대동맥에 부착 된 주변 혈관 주위 지방을 유지해야하고 장골 분기의 수준에 이르기까지 척추의 해부. 참고 : 대동맥의 추가 절개는 레모하기주변 구조 현미경 하에서 수행 될 수했습니다. 특히, 동맥 분기 (경동맥, 쇄골 하 동맥, 복강, 장간막, 신장 동맥)과 림프절을 제거합니다. 이 많은 염증 세포가 고혈압의 설정에있는 사이트이기 때문에 각 대동맥 주위 혈관 주위 지방의 일관된 층을 유지 마십시오. 차가운 PBS를 포함하는 별도의 튜브에서 각 조직을 놓습니다. </li></ol> 각 조직에서 단일 세포 현탁액의 2 세대 <ol><li> 신장 주 : 신장 기계적 해리 플러스 소화 효소를 결합하여 단일 세포 현탁액 내로 해리 될 수있다. <ol><li> (5 % 소 태아 혈청 (FBS) 보충) 1640 배지 (2 ㎎ / ㎖) 콜라게나 D를 첨가의 DNase I (100 μg의 / ㎖) RPMI에 의해 신장 분해 용액을 제조 하였다. 신장 샘플 당 10 ml의를 준비합니다. </li><li> 신장 다이제스트 10㎖를 함유하는 분리 튜브에 두 신장 전송 집게를 사용하여이온 용액. </li><li> 제조자의 지시에 따른 반자동 dissociator 장치를 이용하여 기계적 분리를 수행한다. </li><li> 기계적 해리 후에 장치로부터 튜브를 분리하여 효소 소화를 수행한다. 연속 회전에서 37 ºC에서 20 분 동안 샘플을 품어. 즉시 5 % FBS로 보충 차가운 RPMI 1640 배지를 첨가하여 효소 소화를 멈춘다. </li><li> 40 μm의 여과기를 통해 여과 한 후 50 ML 원뿔 튜브에 피펫으로 솔루션을 전송합니다. 1 ML의 주사기의 플런저로 눌러 떨어져 나머지 조직을 애타게. 세포 (500 XG, 8 분, 4 ºC)를 펠렛. </li><li> 36 %의 밀도 구배 원심 분리 배지 3 ㎖에 펠렛을 재현 탁. 15 ML 원뿔 관에 정지를 전송합니다. 조심스럽게 중단없이 3 ml의 36 % 세포 현탁액을 72 % 아래 밀도 구배 원심 분리 배지 3 ㎖을 추가한다. 원심 분리기 (브레이크없이 1,000 XG, 20 분, 4 ° C). &lt;/ 리&gt; <li> 면역 세포는 인터페이스에 위치한다. 세포 파편을 포함하는 최상위 황색 층을 제거하고 차가운 PBS를 사용하여 15 ml의 볼륨을 불러옵니다. 고장 잘 구배를 흔들어. 셀 (300 XG, 8 분, 39 ° C)를 스핀 5 % FBS와 RPMI 3 ㎖에 펠렛을 재현 탁. 트립 판 블루 배타를 이용하여 혈구의 생균 수를 계산. </li></ol></li><li> 대동맥 <ol><li> 콜라게나 제 A (1 ㎎ / ㎖), 콜라게나 제 B (1 mg / ㎖)을 첨가하여 대동맥 소화 용액을 조제하고,의 DNase I (100 μg의 / ㎖) RPMI로 (5 % FBS로 보충) 1640. </li><li> 미세 핀셋을 이용하여 대동맥 소화 용액 1 ㎖를 함유하는 2 ml의 튜브로 대동맥을 전송. 1 ml의 소화 용액 미세 가위로 아주 작은 조각으로 전체 대동맥을 말하다. 얼음에 보관하십시오. 연속 회전에서 37 ° C에서 30 분 동안 샘플을 품어. </li><li> 조직 배양 접시에 용액을 옮기고 enzyma 정지5 % FBS와 차가운 RPMI의 5 배 부피를 첨가하여 TIC 소화. </li><li> 40 μm의 여과기를 통해 여과 한 후 50 ML 원뿔 튜브에 피펫으로 솔루션을 전송합니다. 1 mL의 주사기 플런저로 눌러 단일 세포 현탁액으로 이격 나머지 조직 애타게. 여과기를 세척하고 세포 (300 XG, 8 분, 4 ºC)를 펠렛. </li><li> 5 % FBS RPMI에 10 ㎖를 첨가하여 침전물을 세척 하였다. 셀 (300 XG, 8 분, 39 ° C)를 스핀 5 % FBS와 RPMI 3 ㎖에 펠렛을 재현 탁. 트립 판 블루 배타를 이용하여 혈구의 생균 수를 계산. </li></ol></li><li> 대동맥 림프절 <ol><li> 조직 배양 접시 (60mm X 15mm)에 40 μm의 여과기를 놓습니다. 스트레이너의 림프절을 놓고 1 ML의 주사기의 플런저로 눌러 단일 세포 현탁액에 떨어져 그들을 애타게. 5 % FBS와 RPMI 2 ㎖와 스트레이너를 플래시합니다. 접시에 세포를 수집합니다. </li><li> 이전15 ㎖의 팔콘 튜브에 세포 펠렛 세포 (300 XG, 8 분, 4 ° C). 5 % FBS와 RPMI 500 μL에 펠렛을 재현 탁. 트립 판 블루 배타를 이용하여 혈구의 생균 수를 계산. </li></ol></li></ol> 유동 세포 계측법에 의한 사이토 카인 탐지 3. 예 생체 자극 <ol><li> 5 % FBS, 비 필수 아미노산는 0.1mm, 50 μM의 β 머 캅토 에탄올 및 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 RPMI : 세포 배양액을 준비한다. </li><li> 원심 분리기 신장, 대동맥 림프절에서 얻은 각각의 세포 현탁액 (300 XG, 8 분, 4 ° C). 용액에 1 × 106 세포의 농도로 세포 배양 배지와 각 펠렛을 재현 탁. </li><li> 세포 배양의 각 1 ml를 위해 (포르 볼 12- 미리 스테이트 13- 아세테이트 (PMA), 칼슘 이온 운반체에 이오 노마 이신을 함유하고, 골지체 억제제 Brefeldin A) 세포 활성화 칵테일 2 μl를 첨가하여 세포를 자극한다. 참고 : 최종 농도PMA의 81 nm의, PMA와 Brefeldin A. 치료 이오 노마 이신의 1.33 μM, 5 ㎍ / ㎖의 이오 노마 이신은 사이토 카인을 생산하는 세포를 활성화 : 각 구성 요소들입니다. 사이토킨 검출 할 수있는 세포에 포획해야 단백질이 분비된다. Brefeldin A는 소포체와 골지체 장치에서 정상적으로 분비되는 단백질의 축적을 야기한다. 따라서, 여기에 설명 된 기술은 유동 세포 계측법에 의한 사이토 카인의 생산 림프구의 검출 가능성을 향상시킨다. </li><li> 12 잘 2 백만 세포 (대동맥 또는 신장) 또는 24 웰 (림프절) 낮은 부착 판에 판 1. 3 시간 동안 37 ° C 가습 CO 2 배양기에서 접시를 놓습니다. 주 : 도금 된 세포의 수는 대조군 마우스로부터의 림프절에서 낮아질 수있다. 또한, 자극 시간은 경험적 연구 각 세포 집단 및 사이토킨에 대해 결정되어야한다. 대동맥, 신장, 림프절로부터 분리 된 T 세포의 경우는 3 내지 4 시간 동안 자극하는 것을 권장합니다. 더 긴 자극 w병 사이토 카인 분비를 증가시키고, CD3, CD4 및 CD8과 같은 여러 가지 T 세포 표면 마커의 추가의 하향 조절을 유도하지 않습니다. (심지어 3 ~ 4 시간 자극이 마커의 일부 하향 조절을 유도 않습니다.) </li></ol> 4. 표면 얼룩 <ol><li> 폴리스티렌 FACS 튜브와 원심 분리기 (300 XG에, 8 분, 4 ° C)에 세포를 전송합니다. (FACS 완충액으로 두번 (칼슘 및 마그네슘 +없는 PBS 4 % FBS 및 2mM의 EDTA를 함유) 세포를 세척하고, 원하는 항체 패널의 개수 및 필요한 제어 튜브의 수에 따라 서로 다른 FACS 튜브에 동등 세포 현탁액을 나누어 아래 참조). </li><li> 각 패널에 대한 보상을 수행하려면 각 조직 유형 및 항체 패널 흠 제어 튜브와 하나의 스테인드 튜브를 준비합니다. 또한, 모든 그러나 하나의 항체를 첨가하여 각각의 항체 패널 용 형광 마이너스 온 (FMO) 제어 튜브를 준비한다. </li><li> FACS 2 ml의 각 튜브의 볼륨을 조절완충기. 원심 분리기는 세포 현탁액 (300 XG, 8 분, 4 ° C), 얼음에 10 분 동안 만 셀 당 항 CD16 / CD32 항체 0.5 μg의와 세포를 배양하여 상층 액과 블록 된 Fc 수용체를 제거합니다. 참고 : CD16는 선호도가 낮은 IgG의 Fc 수용체 III FCR (III)이며, CD32는 FcRγ 쇄 II입니다. CD16 / CD32는 과립구, 비만 세포, 단핵구 / 대 식세포, 자연 살해 세포, B 세포, 수지상 세포 및 일부 활성화 성숙한 T 세포 상에 발현된다. </li><li> 생존 염색을 수행 1X PBS의 1,000 μL에 1X PBS, 원심 분리기 (300 XG에, 8 분, 4 ° C) 및에 resuspend로 세포를 씻으십시오. 셀 - impermeant 아민 반응성 염료 (생존 얼룩) 1 μl를 추가합니다. 빛으로부터 보호 4 ° C에서 15 분 동안 품어. </li><li> 배양하는 동안, FACS 버퍼의 적절한 볼륨 (표면 염색) 항체의 칵테일을 준비합니다. FACS 버퍼의 1-2 ㎖로 두 번 세포를 씻으, 원심 분리기 (300 XG에, 8 분, 4 ° C) 100 ㎕를 각 펠렛을 재현 탁항체 혼합물. 빛으로부터 보호 4 ° C에서 30 분 동안 품어. 주 : 각 항체 유동 세포 계측법,이 도즈 적정 곡선을 수행함으로써 필요한 항체의 최적 량을 결정하는데 유용하다. </li><li> 세포 (300 XG, 8 분, 4 ° C)를 FACS 버퍼 2 ㎖로 두 번 세포를 씻어 펠렛. </li></ol> 5. 고정, Permeabilization 및 세포 내 염색 <ol><li> 제조업체의 지침에 따라 적절한 버퍼를 포함하는 고정 및 permeabilization 키트와 함께 세포 염색을 수행합니다. 수정 및 적절한 버퍼에이를 재현 탁하여 세포 Permeabilize 하시려면. 빛으로부터 보호 4 ° C에서 40 분 동안 샘플을 품어. </li><li> 1 배의 permeabilization 1 ㎖를 추가하고 고정 투과성이 세포에 직접 버퍼 씻는다. 원심 분리기 (500 XG, 8 분, 4 ° C)과 뜨는을 제거합니다. 1X 세척 버퍼의 2 ㎖로 펠렛을 재현 탁. </li><li> antib의 혼합물을 준비1X 세척 버퍼 (튜브 당 보통 100 μL)의 적절한 볼륨 (세포 내 염색만을위한) odies. 주의 : 전술 한 바와 같이, 최적의 항체 농도는 패널의 각 항체에 대해 결정해야한다. 예를 들어, IL-17A 또는 IL-17F에 대한 항체, 우리 1:30의 희석 배수를 사용하지만, IFNγ와 T-내기에 대한 항체, 우리는 하나의 희석 배수 사용 : 100. </li><li> 원심 분리기 세포 (500 XG, 8 분, 4 ° C) 및 항체 혼합물 100 ㎕ 각 펠렛을 재현 탁. 빛으로부터 보호 4 ° C에서 40 분 동안 품어. </li><li> 세포 (500 XG, 8 분, 4 ° C)를 1 배 세척 버퍼 2 ㎖로 두 번 세포를 씻어 펠렛. 1X 세척 완충액 300 μL에 펠렛을 재현 탁하고 적절한 필터를 유세포 분석. </li><li> 조직 샘플 당 세포의 총 수 정량을 위해 카운트 비드를 사용한다. 인수 이전에, 각각의 튜브에 구슬을 계산의 권장 볼륨 / 번호를 추가 할 수 있습니다. </li></ol> 6. 보상, 게이팅, 정규화, 및 팁 <ol><li> 보상 및 게이팅 <ol><li> 보상을위한 실행 흠 단일 스테인드 제어 튜브 스펙트럼 중복에 대한 조정합니다. 주 : 보상 비드보다는 세포 보상 제어의 사용은 샘플에 대한 관심 또는 세포 집단의 항원 그 보상 어렵다 세포를 사용하여 낮은 수준으로 존재하는 경우에 필요하다. 탠덤 염료를 사용하는 경우 또한 노트의, 탠덤 염료가 많이-많은-과 매일 함께 다양하기 때문에 각 실험에 대한 보상을 준비하는 것이 좋습니다. </li><li> 새로운 여러 가지 빛깔의 실험을 시작할 때 형광을 뺀 패널의 모든 형광 하나의 컨트롤 (FMOs)를 실행합니다. 참고 : FMO 컨트롤 하나를 제외한 패널의 모든 항체를 포함하는 샘플입니다. 이러한 컨트롤에 제대로 adjus 생략 된 항체에 대한 부정적인 신호 대 양의 정확한 차별을 허용게이트에서 t. 이러한 제어는 발현이 표적 집단의 분리가 불량 할 때 또는 (예를 들면, 대상이 사이토 카인 또는 전사 인자이다) 낮을 때 특히 중요하다. 그들은 항원 특이성이없는 항체 이소 타입 및 형광 복합체에 대한 적절한 보상을 제공하기 때문에 FMO 컨트롤 항상 필요하지 않지만, 어떤 경우에는, 아이소 타입 컨트롤 곳에서 바람직 할 수있다. </li><li> 기본 게이트를 설정 : 백혈구 인구를 검출하기 위해 앞으로 분산 형 지역 (FSC-A) 및 사이드 분산 형 지역 (SSC-A) 전압을 조정합니다. </li><li> 죽은 세포를 제외합니다. 참고 : 생존의 얼룩은 표면과 세포의 내부 모두에 존재하는 무료 아민과 반응. 세포를 살아 달리 (손상된 멤브레인) 사균 단백질 표지의 양을 증가 염료 세포질에 입력 할 수있다. 따라서, 죽은 세포는 쉽게 차별을 허용하는 살아있는 세포보다 밝은 것입니다. 라이브에 게이트세포. 주 : 대동맥 및 신장에서 세포 현탁액의 생존 인해 추가 소화 단계 림프절로부터 세포 현탁액의 생존율보다 낮을 수있다. </li><li> 플롯 앞으로 분산 형 지역 (FSC-A) [y 축] 및 전달 살포 높이 (FSC-H) x 축]. 단봉이 점 플롯에 대각선으로 나타납니다. 이 대각선에 게이트 이중선을 제외합니다. 이어서 SSC-A [Y 축] 및 CD45 [X 축] 플롯. </li><li> 백혈구 CD45 + 집단은 쉽게 식별 될 수있다. 이 인구에 문입니다. 후속 집단은이 집단으로부터 식별 될 수있다. </li></ol></li><li> 세포 수의 정규화 <ol><li> 계산 구슬 낮은 FSC 높은 SSC 발생 특성을 가지고있다. 50,000 비드 단일 세포 현탁액 300 ㎕를 첨가하는 경우에 다음과 같이 튜브는 당, 예를 들어, 어느 하나의 절대 수의 계산을위한 방정식은 세포 유형을 제공 : 세포의 수 페이지어 관 = (흐름 cytometer에 의해 계산 구슬 50,000 / 수) 계산 세포의 X 번호. 이 계산을 이용하여, 튜브 당 특정 세포 유형의 절대 값이 결정될 수있다. 각 장기로부터 발생 얼마나 많은 튜브 기준 장기 당 세포의 수를 산출 할 수있다. 참고 : 프로토콜 동안 4 ° C에서 모든 세포 및 시약 보관하십시오. 이 세포를 손상시킬 수 있기 때문에 활발한 텍싱을 피하십시오. 세포 펠렛 최소한의 힘을 사용합니다. 이 세포 사멸을 침전 수 있으므로 FACS 튜브에 거품을 피한다. 펠릿 언제든지 건조하게하지 마십시오. </li></ol></li></ol>

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MSM은 길르앗 심장 혈관 과학에서 보조금에 의해 지원됩니다.

The protocol described herein has been optimized to properly identify T cell subsets present within murine kidneys, aorta and lymph nodes. This protocol can be easily adapted to examine other immune cell subsets such as B lymphocytes and innate immune cells and can be modified to include other tissue types. The digestion step is critical and has to be modified and optimized for each tissue9. A prolonged digestion step or the use of an inappropriate enzyme can affect the stability of antigen expression. Similarly, an incomplete digestion can affect the results leading to a lower number of positive cells. Furthermore, the time of ex vivo stimulation needs to be carefully adjusted for each cell type/cytokine to allow for optimal stimulation with minimal cell toxicity. 
Although intracellular staining coupled with flow cytometry analysis is one of the most powerful methods to analyze immune processes at a cellular level in blood and tissues, this technique has its limitations. These limitations include the relatively low number of immune cells in cardiovascular and renal tissues. Thus, depending on the cell type examined, it may be necessary to pool organs from several mice to obtain one sample. Furthermore, the instability of markers is another limitation as the expression of markers can be affected by several steps during the process. For this reason, it is advisable to perform histology in parallel to confirm the results obtained by flow cytometry. There are also special considerations regarding the use of the flow cytometer and the interpretation of the results. The flow cytometer is a sophisticated instrument and requires highly trained operators. Importantly, despite the use of compensation controls, there is still an issue of spectral overlap that limits experiments to 8-12 markers (usually 8) per sample. 
Moreover, this technique is very sensitive and subject to several experimental manipulations which can lead to slight day-to-day variation in the quantification of results. Thus, if performing this technique across multiple days for a given study, it is important to include control and experimental groups each day to determine relative changes. Finally, another limitation/source of variation is the choice of the markers used to identify a population10. Each study tends to use different combinations of markers and fluorochromes to define a population, which can lead to slight differences in quantification.
Despite these limitations, this is a powerful experimental technique that allows the identification and quantification of T cell subsets in solid organs. In fact, while other techniques measure either the expression of surface markers, cytokines or transcription factors separately, this method permits the measurement of several markers simultaneously at the single cell level. Furthermore, once the cells are identified, several other parameters can then be determined11,12,13,14. For example, one can evaluate for markers of apoptosis, protein phosphorylation or the proliferation of a specific T cell subset15. In addition, there are newer proprietary methods to detect mRNAs in cells using flow cytometry16,17.
In conclusion, we have outlined a detailed and reproducible protocol to identify T cell subsets using surface and intracellular markers (cytokines and transcription factors) in murine kidney, aorta and aortic draining lymph nodes in a model of angiotensin II induced hypertension. This protocol can be applied to other tissues (with slight modification) and to other models of disease.

최근의 증거는 적응성 면역계, 특히 T 림프구가 여러 1,2,3,4,5 심혈관 질환의 발달에서 중요한 역할을한다는 것을 보여준다. 예를 들어, 안지오텐신 II 고혈압의 모델에서는, 용기 및 마우스의 신장에서 T 세포의 축적이 6을 설명 하였다. 혈관 축적은 외막과 혈관 주위 지방에 주로있다. 신장에서, T 세포는 골수 및 신장 피질 모두에서 축적된다. 관련되는 서브 세트에 따라 이러한 T 세포는 혈관 및 신장 기능에 영향을 병리 현상을 초래할 수있는 다른 사이토킨을 야기 (맥 매스터 등. (6)에 의해 검토). CD4 + T 헬퍼 림프구 여러 서브 세트들로 분할 될 수있다 : 그 기능 및 서명 사이토에 기초하여 T 헬퍼 1 (받은 Th1), TH2, TH9, Th17, Th22, T 조절 (TREG) 세포 및 T 모낭 헬퍼 (TFH) 세포kines 7. 마찬가지로, CD8 + 세포 독성 T 세포는 T에서, TC2, TC9 Tc17 또는 8로 분류 될 수있다. 합니다 (CD4 또는 CD8 T 세포 마커를 발현하지 않는, 즉 세포) 더블 부정적인 T 세포도 있습니다. 이들 세포의 서브 세트는 다른 감마 델타 T 세포 수용체 (대신 고전 알파 및 베타 수용체)를 갖고, 따라서 감마 델타 T 세포라고 칭한다. 표면 마커, 사이토 카인 및 전사 인자의 유동 세포 계측법에 의한 다 변수 분석은 이들 세포를 식별하기 위해 가장 좋은 방법을 구성한다. 이 방법은 광범위 면역학 분야에서 사용되지만, 그것은 덜 단단한 장기 및 심혈 관계 질환의 설정에 대하여 설명한다. 역사적으로, 조직에 임파구의 식별은 면역 또는 RT-PCR에 방법에 한정되었다. 면역 조직 화학 및 면역 형광은 INT의 항원의 조직 분포를 결정하는 강력한 방법이 있지만erest, 그들은 표현형과 관련된 부분 집합을 식별하는 데 불충분하다. RT-PCR 분석은 항원, 사이토 카인 또는 전사 인자의 mRNA의 발현을 검출하는 데 유용하면서 또한, 그것은 동시에 각각의 세포의 레벨에 여러 단백질의 검출을 허용하지 않는다. 사이토 카인 및 전사 인자를 검출하는 세포 염색 결합 특히 유동 세포의 출현은, 고형 장기 면역 세포 서브 세트의 단일 세포 수준에서의 식별 및 정량화 할 수있는 강력한 방법으로 연구자를 제공한다. 우리는 안지오텐신 II 유발 고혈압 모델 쥐의 신장, 대동맥 및 대동맥 림프절 내에 존재하는 주요 T 세포 하위 집합 유동 세포 계측법에 의해 식별하는 세포 내 염색 분석을 최적화했다. 높은 다시 A의 조직 소화, 생체 활성화, permeabilization, 표면 및 세포 내 염색 결과 : 각 단계의 최적화심혈관 및 신장 질환 모델에 적용 할 수있는 제조 가능한 분석.

<table><tbody><tr><td>Collagenase D</td><td>ROCHE</td><td>11088882001</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase A</td><td>ROCHE</td><td>10103586001</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase B</td><td>ROCHE</td><td>11088815001</td><td></td></tr><tr><td>Dnase</td><td>ROCHE</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>1x Red blood cell lysis buffer</td><td>eBioscience</td><td>00-4333-57</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Medium 1614 1x</td><td>Gibco</td><td>11835-030</td><td></td></tr><tr><td>DPBS without calcium and magnesium</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5445-02</td><td>For density gradient centrifugation</td></tr><tr><td>GentleMACS&amp;trade; C tube</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-334</td><td></td></tr><tr><td>GentleMACS dissociator device</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td>Use the program SPLEEN_04</td></tr><tr><td>Cell activation cocktail (with Brefeldin A)</td><td>Biolegend</td><td>423303</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD16/32</td><td>eBioscience</td><td>14-0161-81</td><td>dilute 1:100</td></tr><tr><td>LIVE/DEAD fixable violet dead cell stain kit</td><td>Life Technologies</td><td>L34955</td><td></td></tr><tr><td>Transcription factor buffer set</td><td>BD Pharmingen</td><td>562725</td><td></td></tr><tr><td>OneComp eBeads&amp;nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>01-1111-42</td><td></td></tr><tr><td>123 count eBeads</td><td>eBioscience</td><td>01-1234-42</td><td></td></tr><tr><td>CD45 AmCyan (clone 30-F11)</td><td>BioLegend</td><td>103138</td><td></td></tr><tr><td>CD3 PerCP-Cy5.5 (clone 17A2)</td><td>BioLegend</td><td>100218</td><td></td></tr><tr><td>IL-17A FITC (clone TC11-18H10.1)</td><td>BioLegend</td><td>506910</td><td></td></tr><tr><td>IL-17F APC (clone 9D3.1C8)</td><td>BioLegend</td><td>517004</td><td></td></tr><tr><td>CD4 APC-Cy7 (clone GK1.5)</td><td>BD Biosciences</td><td>560181</td><td></td></tr><tr><td>CD8 APC (clone 53-67)</td><td>eBioscience</td><td>17-0081-82</td><td></td></tr><tr><td>T-bet PE-Cy7 (clone 4B10)</td><td>BioLegend</td><td>644823</td><td></td></tr><tr><td>IFN&amp;gamma; FITC (clone XMG1.2)</td><td>BD Biosciences</td><td>557724</td><td></td></tr></tbody></table>

intracellular staining and flow cytometry to identify lymphocyte subsets within murine aorta, kidney and lymph nodes in a model of hypertension

It is now well known that T lymphocytes play a critical role in the development of several cardiovascular diseases1,2,3,4,5. For example, studies from our group have shown that hypertension is associated with an excessive accumulation of T cells in the vessels and kidney during the development of experimental hypertension6. Once in these tissues, T cells produce several cytokines that affect both vascular and renal function leading to vasoconstriction and sodium and water retention1,2. To fully understand how T cells cause cardiovascular and renal diseases, it is important to be able to identify and quantify the specific T cell subsets present in these tissues. T cell subsets are defined by a combination of surface markers, the cytokines they secrete, and the transcription factors they express. The complexity of the T cell population makes flow cytometry and intracellular staining an invaluable technique to dissect the phenotypes of the lymphocytes present in tissues. Here, we provide a detailed protocol to identify the surface and intracellular markers (cytokines and transcription factors) in T cells isolated from murine kidney, aorta and aortic draining lymph nodes in a model of angiotensin II induced hypertension. The following steps are described in detail: isolation of the tissues, generation of the single cell suspensions, ex vivo stimulation, fixation, permeabilization and staining. In addition, several fundamental principles of flow cytometric analyses including choosing the proper controls and appropriate gating strategies are discussed.

이 프로토콜은 허용에게 안지오텐신 II 유발 고혈압 모델 쥐의 신장, 대동맥 및 대동맥 림프절에서 분리 된 T 세포 표면과 세포 마커의 식별을 설명했다. 대표 결과는 다음과 같다. 도 1은 고혈압을 유도하는 안지오텐신 II로 넘치는 WT 마우스의 대동맥으로부터 제조 한 세포 현탁액 중의 T 세포 집단을 식별하는 데 사용되는 게이팅 전략을 보여준다. 유사한 전략은 신장, 림프절에 사용됩니다. 순방향 분산 영역 (FSC-A) 및 측면 스 캐터 지역 (SSC-A)의 전압은 백혈구 집단 (G1)를 검출하고, 이물질을 제외하도록 조정 하였다. 라이브 세포 (G2)는 태평양 파란색과 결합 된 생존 마커 음. 라이브 세포를 만에 게이트에 전달 살포 높이 (FSC-H) 및 전달 살포 지역 (FSC-A)에 문이 있었다단일 인구 (G3). 백혈구는 다음 SSC-A 및 CD45 (G4)에 게이팅에 의해 선정되었다. CD45는이 예에서 AmCyan와 결합된다. 마지막으로, T 세포는 CD45 + CD3 + 인구 (G5)으로 문이 있습니다. CD3이 예에서는를 PerCP-Cy5.5와 결합된다. IL-17A 및이 모델 쥐 신장 동맥 내 T 세포를 생산하는 IL-17F의 존재를 결정하기 위해, 단일 세포 현탁액은 IL-17A 및 IL-17F에 대해 염색 하였다. 그림 2는 형광 마이너스 IL-17A와 신장 샘플에서 IL-17F 염색에 대해 하나의 컨트롤 (FMOs) (각각 FITC와 APC와 결합)을 보여줍니다. FMO 컨트롤은 하나를 제외하고 패널의 모든 항체를 포함하는 샘플입니다. 예상대로, 거의 세포는 FMO 컨트롤에서 IL-17A (그림 2A) 또는 IL-17F (그림 2B)에 긍정적이다. 제대로 ADJ에 이러한 컨트롤은 긍정적 대 부정적인 신호의 정확한 차별을 허용UST는 게이트 실험 시료에서 IL-17A 또는 IL-17F 양성 세포를 식별. 그림 3은 T 신장 (그림 3A)에서 분리 된 세포와 차량 (가짜) 또는 안지오텐신 II (중앙 II) 주입 WT 쥐의 대동맥 (그림 3B)의 세포 내 염색의 예를 제공합니다. 사실, IL-17A 또는 IL-17F를 발현 T 세포의 서브 세트는이 모델에서 두 조직에서 검출 될 수있다. 도 4는이 모델 (도 4a)에서 대동맥 림프절 내 T 세포의 세포 염색을 나타낸다. CD8 + T 세포는 제 (도 4B) 게이팅 하였다. 그런 다음, 두에 T 마커의 발현, 사이토 카인 IFNγ 또는 전사 인자 T 베팅은 CD8 + T 세포 하위 집합에서 정량화 하였다. 도 4c는 IFN 대한 FMOs를 도시47; 및 림프절 샘플에서 T-내기 염색 (각각 FITC와 PE-Cy7와 결합). 도 4d는 WT 마우스의 대동맥 림프절은 안지오텐신 II 주입에서 CD8 + IFNγ + 및 CD8 + T 베팅 + 세포 집단이 식별 될 수 있음을 보여준다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/55266/55266fig1.jpg" /> 도 1 : T 세포를 식별하기 위해 게이팅 전략 유동 세포 계측법. 백혈구는 먼저 앞으로 분산 / 측면 산란 (FSC-A / SSC-A) 도트 플롯 (G1), 라이브 셀 선택 (G2)에 문이있다. 세포 후 단봉 (FSC-A / FSC-H) (G3)에 게이트된다. G3의 세포는 또한 CD45 (G4)의 발현을 특징으로한다. 마지막으로, T 세포는 CD45 + CD3 + 더블 양성 세포 (G5)에 문이있다. 이 단일 세포 현탁액을 야생형 분리 전체 대동맥으로부터 제조 하였다 (WT) 마우스 angiot 주입<html> ensin II는 고혈압을 유발합니다. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55266/55266fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/55266/55266fig2.jpg" /> 그림 2 : 형광을 뺀 컨트롤 IL-17A와 IL-17F 용 (FMO). (A) 안지오텐신 II 처리 한 쥐 신장 샘플에서 분리 된 단일 세포 현탁액 정착 생존 마커 (태평양 블루), CD45 (AmCyan), CD3 (를 PerCP-Cy5.5) 및 IL-17F (APC)를 사용하여 염색 하였다. IL-17A에 대한 항체가 IL-17A의 적절한 게이팅을 결정 생략 하였다. (B) 안지오텐신 II 처리 한 쥐 신장 샘플에서 분리 된 단일 세포 현탁액을 고칠 생존 마커 (태평양 블루), CD45 (AmCyan), CD3 (를 PerCP-Cy5.5) 및 IL-17A (FITC)을 사용하여 염색 하였다. 이때, IL-17F에 대한 항체는 생략 하였다.urce.jove.com/files/ftp_upload/55266/55266fig2large.jpg &quot;대상 =&quot;_ 빈 &quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/55266/55266fig3.jpg" /> 도 3 : IL-17A 및 IL-17F에 대한 쥐 신장 및 대동맥으로부터 분리 T 세포의 세포 내 염색. 유동 세포 계측법 + II (중앙 II) 이전은 CD45 + CD3에 문 WT 차량 (위장) 주입 마우스 또는 안지오텐신에서 신장 (A) 및 대동맥 (B)에서 T 세포에서 IL-17A와 IL-17F 식을 보여주는 플롯을 점 세포. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55266/55266fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/55266/55266fig4.jpg" /> 그림 4 : T 세포의 세포 내 염색<html> 쥐의 대동맥 림프절에서 격리 s의. WT에 마우스를 두 척추 대동맥 림프절의 (A) 외관 육안. (B)는 WT 마우스로부터 단리 네 대동맥 림프절로부터 분리 된 CD4 + 및 CD8 + T 세포의 도트 플롯 안지오텐신 II 주입 이전 및 CD45 + CD3 + 세포 상에 게이팅 주제 유동 세포 계측법. (C)는 림프절로부터 분리 된 단일 세포 현탁액은 생존 마커 (퍼시픽 블루)을 사용하여 염색하고, CD3 (를 PerCP-Cy5.5), CD4 (APC-Cy7) 및 CD8 (APC). FMO 컨트롤하는 IFNγ (FITC) 또는 T-내기 (PE-Cy7)에 대한 항체가 적절한 게이팅을 결정하기 위해 생략 표시됩니다. (D)는 세포 계측법 FMO 컨트롤에 의해 결정되는 게이트를 사용하여 CD8 + 림프절의 T 세포 내에서 긍정적 인 IFNγ와 T-내기 식을 보여주는 플롯을 점 흐른다.g &quot;대상 =&quot;_ 빈 &quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Intracellular Staining and Flow Cytometry to Identify Lymphocyte Subsets within Murine Aorta, Kidney and Lymph Nodes in a Model of Hypertension

이 문서에서는 식별하고 세포 내 염색에 의해 쥐의 신장, 대동맥 림프절 내에 존재하는 기능 T 림프구의 하위 집합을 정량화 및 유동 세포 계측법하는 자세한 방법을 제공합니다. 안지오텐신 II 유발 된 고혈압의 모델은 설명 단계별, 절차 및 유동 세포 계측법의 기본 원리 및 세포 내 염색하기 위해 선택되었다.

세포 내 염색 및 유동 세포 계측법은 고혈압의 모델에 쥐 대동맥, 신장 및 림프절에서 림프구 하위 집합을 식별하는

It is now well known that T lymphocytes play a critical role in the development of several cardiovascular diseases1,2,3,4,5. For example, studies from our ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam cells, immune cells, vascular endothelial and smooth muscle cells, platelets, extracellular matrix, and a lipid-rich core with extensive necrosis and fibrosis of surrounding tissues.1 The innate and adaptive arms of the immune response are involved in the initiation, development and persistence of atherosclerosis.2, 3 There is a significant body of evidence that different subsets of the immune cells, such as macrophages, dendritic cells, T and B lymphocytes, are present within the aortas of healthy and atherosclerosis-prone mice4. Additionally, immune cells are found in the surrounding aortic adventitia which suggests an important role of this tissue in atherogenesis.2
For some time, the quantitative detection of different types of immune cells, their activation status, and the cellular composition within the aortic wall was limited by RT-PCR and immunohistochemical methods for the study of atherosclerosis. Few attempts were made to perform flow cytometry using human aortas, and a number of problems, such as a high autofluorescence, have been reported5,6. Human atherosclerotic plaques were digested with collagenase 1, and free cells were collected and stained for CD14+/CD11c+ to highlight macrophage-derived foam cells. In this study, a "mock" channel was used to avoid false-positive staining.6 Necrotic materials accumulating during the digestion process give rise in a large amount of debris that generates a high autofluorescence in aortic samples. To resolve this problem, a panel of negative and positive controls has been proposed, but only double staining could be applied in these samples. We have developed a new flow cytometry-based method7 to analyze the immune cell composition and characterize the activation, proliferation, differentiation of immune cells in healthy and atherosclerosis-prone aorta. This method allows the investigation of the immune cell composition of the aortic wall and opens possibilities to use a broad spectrum of immunological methods for investigations of immune aspects of this disease.

This paper presents a flow cytometry-based method to investigate the immune composition of aortas. The paper also illustrates an additional technique that allows examining surrounding adventitia and vessel wall separately. This method opens possibilities to perform phenotypical analyses of aortic leukocytes and apply several immunological assays for atherosclerosis studies.

Murine Aortas 이내에 면역 세포의 흐름 Cytometry 분석

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

연구

면역학 및 감염병학

Quantitative Analysis and Characterization of Atherosclerotic Lesions in the Murine Aortic Sinus

Atherosclerosis is a disease of the large arteries and a major underlying cause of myocardial infarction and stroke. Several different mouse models have been developed to facilitate the study of the molecular and cellular pathophysiology of this disease. In this manuscript we describe specific techniques for the quantification and characterization of atherosclerotic lesions in the murine aortic sinus and ascending aorta. The advantage of this procedure is that it provides an accurate measurement of the cross-sectional area and total volume of the lesion, which can be used to compare atherosclerotic progression across different treatment groups. This is possible through the use of the valve leaflets as an anatomical landmark, together with careful adjustment of the sectioning angle. We also describe basic staining methods that can be used to begin to characterize atherosclerotic progression. These can be further modified to investigate antigens of specific interest to the researcher. The described techniques are generally applicable to a wide variety of existing and newly created dietary and genetically-induced models of atherogenesis.

We describe procedures to quantify and characterize atherosclerotic lesions in mouse models using precision sectioning of the aortic sinus and ascending aorta combined with histochemical and immunohistochemical analysis.

쥐의 대동맥 부비동의 동맥 경화 병변의 정량 분석​​ 및 특성

Atherosclerosis is a disease of the large arteries and a major underlying cause of myocardial infarction and stroke. Several different mouse models have ...

의학

Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal disease. Macrophages are heterogeneous cells that have been implicated in kidney injury. Macrophages may be classified into two different phenotypes: classically activated macrophages (M1 macrophages), that release pro-inflammatory cytokines and promote fibrosis; and alternatively activated macrophages (M2 macrophages) that are associated with immunoregulatory and tissue-remodeling functions. These macrophage phenotypes need to be discriminated and analyzed to determine their contribution to renal injury. However, there are scarce studies reporting consistent phenotypic and functional information about macrophage subtypes in inflammatory renal disease models, especially in rats. This fact may be related to the limited macrophage markers used in rats, contrary to mice. Therefore, novel strategies are necessary to quantify and characterize the renal content of these infiltrating cells in a reliable way. This manuscript details a protocol for kidney digestion and further phenotypic and quantitative analysis of macrophages from rat kidneys by flow cytometry. Briefly, kidneys were incubated with collagenase and total macrophages were identified according to the dual presence of CD45 (leukocytes common antigen) and CD68 (PAN macrophage marker) in live cells.This was followed by surface staining of CD86 (M1 marker) and CD163 (M2 marker). Rat peritoneal macrophages were used as positive control for macrophage marker detection by flow cytometry. Our protocol resulted in low cellular mortality and allowed characterization of different intracellular and surface protein markers, thus limiting the loss of cellular integrity observed in other protocols. Moreover, this procedure allows the use of macrophages for further techniques, including cell sorting and mRNA or protein expression studies, among others.

This manuscript describes a detailed protocol for phenotypic and quantitative analysis of resident macrophages from rat kidneys by flow cytometry. The resulting stained cells can be also used for other applications, including cell sorting, gene expression analysis or functional studies, thus increasing the information obtained in the experimental model.

유동 세포 계측법에 의해 쥐의 신장에서 대 식세포의 표현형 특성

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal ...

Visualizing Leukocyte Rolling and Adhesion in Angiotensin II-Infused Mice: Techniques and Pitfalls

Epifluorescence intravital video microscopy (IVM) of blood vessels is an established method to evaluate the activation of immune cells and their ability to role and adhere to the endothelial layer. Visualization of circulating cells by injection of fluorescent dyes or fluorophore-coupled antibodies is commonly used. Alternatively, fluorescent reporter mice can be used. Interactions of leukocytes, in particular lysozyme M+ (LysM+) monocytes, with the vessel wall play pivotal roles in promoting vascular dysfunction and arterial hypertension. We here present the technique to visualize and quantify leukocyte rolling and adhesion in carotid arteries in angiotensin II (AngII)-induced hypertension in mice by IVM.
The implantation of a catheter damages the vascular wall and leads to altered blood cell responses. We compared different injection techniques and administration routes to visualize leukocytes in a LysMCre+IRG+ mouse with widespread expression of red fluorescent protein and conditional expression of green fluorescent protein in LysM+ cells. To study LysM+ cell activation, we used AngII infused mice in which rolling and adhesion of leukocytes to the endothelium is increased. We either injected acridine orange using a jugular catheter or directly though the tail vein and compared the amount of rolling and adhering cells. We found that jugular catheter implantation per se increased the number of rolling and adhering LysM+ cells in sham-infused LysMCre+IRG+ mice compared to controls. This activation was augmented in AngII-infused mice. Interestingly, injecting acridine orange directly through the tail vein did not increase LysM+ cell adhesion or rolling in sham-infused mice. We thereby demonstrated the importance of transgenic reporter mice expressing fluorescent proteins to not interfere with in vivo processes during experimentation. Furthermore, tail vein injection of fluorescent tracers might be a possible alternative to jugular catheter injections.

This manuscript describes the use of transgenic reporter mice and different administration routes of fluorescent dyes in angiotensin II-induced hypertension using intravital video microscopy of blood vessels to evaluate the activation of immune cells and their ability to roll and adhere to the endothelium.

백혈구 롤링 Angiotensin II-주입 마우스에서 접착 시각화: 기술 및 함정

Epifluorescence intravital video microscopy (IVM) of blood vessels is an established method to evaluate the activation of immune cells and their ability ...

Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the lymph nodes where cellular debris and antigens can be surveyed. We are very interested in understanding how the lymphatic vasculature might be involved in inflammation and immune cell function within the liver. However, very little has been published establishing digestion protocols for the isolation of lymphatic endothelial cells (LECs) from the liver or specific markers that can be used to evaluate liver LECs on a per cell basis. Therefore, we optimized a method for the digestion and staining of the liver in order to evaluate the LEC population in the liver. We are confident that the method outlined here will be useful for the identification and isolation of LECs from the liver and will strengthen our understanding of how LECs respond to the liver microenvironment.

The goal of this protocol is to identify lymphatic endothelial cell populations within the liver using described markers. We utilize collagenase IV and DNase and a gentle mincing of tissue, combined with flow cytometry, to identify a distinct population of lymphatic endothelial cells.

림프 내 피 세포의 흐름 Cytometric 분석 Murine 간 소화

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the ...

Quantification of Atherosclerosis in Mice

Cardiovascular disease is the main cause of death in the world. The underlying cause in most cases is atherosclerosis, which is in part a chronic inflammatory disease. Experimental atherosclerosis studies have elucidated the role of cholesterol and inflammation in the disease process. This has led to successful clinical trials with pharmaceutical agents that reduce clinical manifestations of atherosclerosis. Careful and well-controlled experiments in mouse models of the disease could further elucidate the pathogenesis of the disease, which is not fully understood. Standardized lesion analysis is important to reduce experimental variability and increase reproducibility. Determining lesion size in aortic root, aortic arch, and brachiocephalic artery are common endpoints in experimental atherosclerosis. This protocol provides a technical description for evaluation of atherosclerosis at all these sites in a single mouse. The protocol is particularly useful when material is limited, as is frequently the case when genetically modified animals are being characterized.

Murine models of atherosclerosis are useful tools to investigate pathogenic pathways on a molecular level, but require standardized quantification of lesion development. This protocol describes an optimized method to determine lesion size in the major arterial vessels including the aortic root, aortic arch, and brachiocephalic artery.

마우스에서 동맥 경화증의 정량화

Cardiovascular disease is the main cause of death in the world. The underlying cause in most cases is atherosclerosis, which is in part a chronic ...

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Tissue-resident memory T cell (TRM) is a rapidly expanding field of immunology research. Isolating T cells from various non-lymphoid tissues is one of the key steps to investigate TRMs. There are slight variations in lymphocyte isolation protocols for different organs. Kidney is an essential non-lymphoid organ with numerous immune cell infiltration especially after pathogen exposure or autoimmune activation. In recent years, multiple labs including our own have started characterizing kidney resident CD8+ T cells in various physiological and pathological settings in both mouse and human. Due to the abundance of T lymphocytes, kidney represents an attractive model organ to study TRMs in non-mucosal or non-barrier tissues. Here, we will describe a protocol commonly used in TRM-focused labs to isolate CD8+ T cells from mouse kidneys following systemic viral infection. Briefly, using an acute lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) infection model in C57BL/6 mice, we demonstrate intravascular CD8+ T cell labeling, enzymatic digestion, and density gradient centrifugation to isolate and enrich lymphocytes from mouse kidneys to make samples ready for the subsequent flow cytometry analysis.

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Following viral infection, kidney harbors a relatively large number of CD8+ T cells and offers an opportunity to study non-mucosal TRM cells. Here, we describe a protocol to isolate mouse kidney lymphocytes for flow cytometry analysis.

유동 세포 분석용 마우스 신장 거주자 CD8+ T 세포의 격리

Tissue-resident memory T cell (TRM) is a rapidly expanding field of immunology research. Isolating T cells from various non-lymphoid tissues is one of the ...

Quantitative Analysis of Cellular Composition in Advanced Atherosclerotic Lesions of Smooth Muscle Cell Lineage-Tracing Mice

Atherosclerosis remains the leading cause of death worldwide and, despite countless preclinical studies describing promising therapeutic targets, novel interventions have remained elusive. This is likely due, in part, to a reliance on preclinical prevention models investigating the effects of genetic manipulations or pharmacological treatments on atherosclerosis development rather than the established disease. Also, results of these studies are often confounding because of the use of superficial lesion analyses and a lack of characterization of lesion cell populations. To help overcome these translational hurdles, we propose an increased reliance on intervention models that employ investigation of changes in cellular composition at a single cell level by immunofluorescent staining and confocal microscopy. To this end, we describe a protocol for testing a putative therapeutic agent in a murine intervention model including a systematic approach for animal dissection, embedding, sectioning, staining, and quantification of brachiocephalic artery lesions. In addition, due to the phenotypic diversity of cells within late-stage atherosclerotic lesions, we describe the importance of using cell-specific, inducible lineage tracing mouse systems and how this can be leveraged for unbiased characterization of atherosclerotic lesion cell populations. Together, these strategies may assist vascular biologists to more accurately model therapeutic interventions and analyze atherosclerotic disease and will hopefully translate into a higher rate of success in clinical trials.

We propose a standardized protocol to characterize the cellular composition of late-stage murine atherosclerotic lesions including systematic methods of animal dissection, tissue embedding, sectioning, staining, and analysis of brachiocephalic arteries from atheroprone smooth muscle cell lineage tracing mice.

부드러운 근육 세포 계보 추적 마우스의 고급 동맥 경 화성 병 변에서 세포 성분의 정량 분석

Atherosclerosis remains the leading cause of death worldwide and, despite countless preclinical studies describing promising therapeutic targets, novel ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cell Subsets within the Murine Spleen, Bone Marrow, Lymph Nodes and Synovial Tissue in an Osteoarthritis Model

Osteoarthritis (OA) is one of the most prevalent musculoskeletal diseases, affecting patients suffering from pain and physical limitations. Recent evidence indicates a potential inflammatory component of the disease, with both T-cells and monocytes/macrophages potentially associated with the pathogenesis of OA. Further studies postulated an important role for subsets of both inflammatory cell lineages, such as Th1, Th2, Th17, and T-regulatory lymphocytes, and M1, M2, and synovium-tissue-resident macrophages. However, the interaction between the local synovial and systemic inflammatory cellular response and the structural changes in the joint is unknown. To fully understand how T-cells and monocytes/macrophages contribute towards OA, it is important to be able to quantitively identify these cells and their subsets simultaneously in synovial tissue, secondary lymphatic organs and systemically (the spleen and bone marrow). Nowadays, the different inflammatory cell subsets can be identified by a combination of cell-surface markers making multi-color flow cytometry a powerful technique in investigating these cellular processes. In this protocol, we describe detailed steps regarding the harvest of synovial tissue and secondary lymphatic organs as well as generation of single cell suspensions. Furthermore, we present both an extracellular staining assay to identify monocytes/macrophages and their subsets as well as an extra- and intra-cellular staining assay to identify T-cells and their subsets within the murine spleen, bone marrow, lymph nodes and synovial tissue. Each step of this protocol was optimized and tested, resulting in a highly reproducible assay that can be utilized for other surgical and non-surgical OA mouse models.

Here, we describe a detailed and reproducible flow cytometry protocol to identify monocyte/macrophage and T-cell subsets using both extra- and intracellular staining assays within the murine spleen, bone marrow, lymph nodes and synovial tissue, utilizing an established surgical model of murine osteoarthritis.

Osteoarthritis (OA) is one of the most prevalent musculoskeletal diseases, affecting patients suffering from pain and physical limitations. Recent ...

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on changes in intracellular calcium ([Ca2+]i) and nitric oxide (NO). In order to understand how [Ca2+]i, NO and downstream molecules are handled by a blood vessel in response to vasoconstrictors and vasodilators, we developed a novel technique that applies calcium-labeling (or NO-labeling) dyes with two photon microscopy to measure calcium handling (or NO production) in isolated blood vessels. Described here is a detailed step-by-step procedure that demonstrates how to isolate an aorta from a rat, label calcium or NO within the endothelial or smooth muscle cells, and image calcium transients (or NO production) using a two photon microscope following physiological or pharmacological stimuli. The benefits of using the method are multi-fold: 1) it is possible to simultaneously measure calcium transients in both endothelial cells and smooth muscle cells in response to different stimuli; 2) it allows one to image endothelial cells and smooth muscle cells in their native setting; 3) this method is very sensitive to intracellular calcium or NO changes and generates high resolution images for precise measurements; and 4) described approach can be applied to the measurement of other molecules, such as reactive oxygen species. In summary, application of two photon laser emission microscopy to monitor calcium transients and NO production in the endothelial and smooth muscle cells of an isolated blood vessel has provided high quality quantitative data and promoted our understanding of the mechanisms regulating vascular function.

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Vascular cell functiondepends on activity of intracellular messengers. Described here is an ex vivo two photon imaging method that allows the measurement of intracellular calcium and nitric oxide levels in response to physiological and pharmacological stimuli in individual endothelial and smooth muscle cells of an isolated aorta.

세포 내 칼슘의 두 광자 이미징<sup&gt; 2 +</sup&gt; 고립 된 쥐 대동맥의 취급 및 내피 세포에서 산화 질소 생산과 부드러운 근육 세포

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on ...

세포 내 염색 및 유동 세포 계측법은 고혈압의 모델에 쥐 대동맥, 신장 및 림프절에서 림프구 하위 집합을 식별하는

요약

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이 비디오의 챕터

Murine Aortas 이내에 면역 세포의 흐름 Cytometry 분석

쥐의 대동맥 부비동의 동맥 경화 병변의 정량 분석 및 특성

유동 세포 계측법에 의해 쥐의 신장에서 대 식세포의 표현형 특성

백혈구 롤링 Angiotensin II-주입 마우스에서 접착 시각화: 기술 및 함정

림프 내 피 세포의 흐름 Cytometric 분석 Murine 간 소화

마우스에서 동맥 경화증의 정량화

유동 세포 분석용 마우스 신장 거주자 CD8⁺ T 세포의 격리

부드러운 근육 세포 계보 추적 마우스의 고급 동맥 경 화성 병 변에서 세포 성분의 정량 분석

Flow Cytometry Analysis of Immune Cell Subsets within the Murine Spleen, Bone Marrow, Lymph Nodes and Synovial Tissue in an Osteoarthritis Model

세포 내 칼슘의 두 광자 이미징

세포 내 염색 및 유동 세포 계측법은 고혈압의 모델에 쥐 대동맥, 신장 및 림프절에서 림프구 하위 집합을 식별하는

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Murine Aortas 이내에 면역 세포의 흐름 Cytometry 분석

쥐의 대동맥 부비동의 동맥 경화 병변의 정량 분석​​ 및 특성

유동 세포 계측법에 의해 쥐의 신장에서 대 식세포의 표현형 특성

백혈구 롤링 Angiotensin II-주입 마우스에서 접착 시각화: 기술 및 함정

림프 내 피 세포의 흐름 Cytometric 분석 Murine 간 소화

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유동 세포 분석용 마우스 신장 거주자 CD8+ T 세포의 격리

부드러운 근육 세포 계보 추적 마우스의 고급 동맥 경 화성 병 변에서 세포 성분의 정량 분석

Flow Cytometry Analysis of Immune Cell Subsets within the Murine Spleen, Bone Marrow, Lymph Nodes and Synovial Tissue in an Osteoarthritis Model

세포 내 칼슘의 두 광자 이미징

쥐의 대동맥 부비동의 동맥 경화 병변의 정량 분석 및 특성

유동 세포 분석용 마우스 신장 거주자 CD8⁺ T 세포의 격리