Name: local field fluorescence microscopy: imaging cellular signals in intact hearts
Uploaded: 2017-03-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Local Field Fluorescence Microscopy: Imaging Cellular Signals in Intact Hearts at JoVE.com

우리는 제시된 작품의 중요한 논의 박사 알리샤 Mattiazzi 감사합니다. 이 작품은 NIH로부터 연구비 (R01 HL-084487) ALE에 지원되었다.

이 프로토콜은 모든 마우스 처리는 UC 머 시드 기관 동물 관리 및 사용위원회 (제 2008-201)에 의해 승인되었다. 앵무새와 실험 과학 연구에 대한 베네수엘라 연구소 (이 비치)의 과학위원회에 의해 설립 동물 사용의 일반적인 정책에 따라 1999 년에 실시 하였다. 1. 랑겐 돌프 세트까지 준비 <ol><li> 140의 NaCl, 5.4 KCl을,이 CaCl2를, 하나의 MgCl 2, 0.33 HPO 4, 10 글루코스, 10 HEPES 2 나트륨 : MM에서 다음과 용질 농도를 함유 타이로드 용액을 제조 하였다. NaOH로 7.4로 타이로드 용액의 pH를 조정 한 후 0.22 ㎛의 필터를 통해 용액을 필터. </li><li> 60 ML의 주사기에 타이로드 용액 (11), (12)는도 4에 도시 설정 수평 랑겐 돌프의 모든 튜브를 넣습니다. 모든 기포를 제거해야합니다. </li><li><stroNG&gt;도 4에 도시 된 바와 같이 침수 플라스틱 &quot;에어 스톤&quot;을 사용하여 100 % O 2 평형 타이로드 용액. <ol><li> 오 2 탱크에 플라스틱 튜브를 연결합니다. </li><li> 60 ML의 주사기에서 타이로드 용액에 5 &quot;튜브를 낮추기 위해 플라스틱 티 어댑터를 추가합니다. </li><li> 타이로드 솔루션으로이 뜻 거품 밖으로 O 있도록 5 &quot;튜브의 끝 부분에 플라스틱 공기 돌을 연결합니다. </li></ol></li><li> 캐 뉼러로 사용되는 바늘 주위에 비 흡수성 수술 용 봉합사를 놓습니다. 니들은 다른 솔루션 역 관류를 허용하는 매니 폴드 (도 4 참조)에 결합된다. 마지막으로, 심장의 대동맥은 바늘로 유관됩니다. </li></ol> 2. 동물 준비 및 심장 해부 <ol><li> 헤파린 마우스를 달아 주입 (예. 마우스 무게 20g의 20 단위 또는 200 μL로 주입) 자궁 전위에 의해 안락사 전에 15 분. 마취 잉꼬 따라 t오 동물을 사용하여 IACUC 프로토콜의 가이드 다음은 자궁 경부 전위를 진행합니다. 참고 : 8 주 오래 된 마우스 또는 20g의 앵무새를 사용합니다. </li><li> euthanization 후 흉강에서 마음을 제거합니다. 마우스에 대한 설명과 동일하게 잉꼬 마음의 압축을 풉니 다. <ol><li> 에탄올로 마우스의 가슴을 청소합니다. </li><li> 해부 가위를 사용하여 하복부에 절개를 한 후 목을 향해 측면을 잘라. </li><li> 절단 된 조직을 다시 당겨 아래로 핀. </li><li> 다이어프램을 잘라. 심장의 손상을 방지하기 위해 조리개를 절단 할 때주의해야합니다. </li><li> 폐와 주변 조직을 제거합니다. </li><li> 를 압박하지 않고 마음을 특종 핀셋을 사용합니다. 가능한 한 오랫동안 대동맥을 잘라. </li></ol></li><li> 약 1 mL의 타이로드 용액을 작은 무게 보트에 마음을 전송. </li><li> 비 흡수성 봉합사를 사용하여 수술하는 통해 수평 랑겐 돌프 장치 상 대동맥 넥타이바늘. 이 미세 핀셋의 도움으로 심장 대동맥을 묶어. 타이로드 용액을 함유하는 60 mL의 주사기에 직렬로 위치한 밸브를 개방하여 역 관류를 시작한다. </li><li> 심장이 10 분 동안 안정화 할 수 있습니다. 피와 염료를로드하기 전에 심장 주위의 지방 조직을 청소하는이 시간을 사용합니다. 핀셋으로 마음의베이스 근처의 지방 조직을 당겨 작은 해부 가위를 사용하여 잘라. 해부 현미경의 관점에서이 작업을 수행해야합니다. </li></ol> 3. 세포질 칼슘 측정 : 염료 루비로드 - 오전 2시 준비 <ol><li> 염료를 50㎍을 함유하는 염료 제조업체에서 제공하는 특수 패키징 플라스틱 바이알 DMSO의 20 % 플루 20 μL (비이 온성 계면 활성제)를 추가한다. </li><li> 거품을 피하고로 pipetting 아래로 섞는다. </li><li> 비이 온성 계면 활성제 및 투명한 유리 바이알에 특별한 포장 플라스틱 바이알에서 염료 혼합 DMSO 전송. 타이로드의 SOLU 1 mL를 넣고투명한 유리 병에 기. </li><li> 목욕 초음파기에서 15 ~ 20 분 동안 초음파 처리. </li><li> 실온에서 30 분 동안 연동 펌프를 사용하여 염료를 관류. <ol><li> 염료 실에 염료를 놓습니다. </li><li> 매니 폴드에 연결된 모든 다른 배관 라인을 압축하는 기계적 클램프를 사용한다. 클램프는 매니 폴드 위에 배치됩니다. 이를 60 mL의 주사기에 연결된 배관에 역류하는 것을 방지한다. </li><li> 염료를 순환 시작 관류 연동 펌프를 켭니다. 즉시 60 ml 주사기 아래의 3 방향 밸브를 닫는다. </li><li> 심장에 관류 된 염료를 재순환하는 마음 옆에 흡입 연동 펌프에 연결된 작은 튜브를 놓습니다. </li></ol></li></ol> 4. 내부-SR 칼슘 2 + 측정 : 염료 매기 - Fluo4AM 준비 <ol><li> 루비로드 - 오전 2시와 동일한 방식으로 매기 - Fluo4AM를 준비합니다. 단계별 지침은 3 장을 참조하십시오. </li><li> Afte염료 로딩 R, 역 관류를 시작 타이로드 용액을 함유하는 60 mL의 주사기에 직렬로있는 밸브를 연다. 매니 폴드 위의 클램프를 제거해야합니다. </li><li> 수평 챔버에 타이로드 솔루션을 추가하고 37 ° C로 예열. </li><li> 45 분 동안 타이로드 솔루션 레트로 관류는 세포질 염료를 제거합니다. </li></ol> 5. 멤브레인 잠재적 인 측정 : 염료 디 - 8 - ANEPPS 준비 <ol><li> 염료 5 ㎎을 포함하는 염료 바이알에 99 % 에탄올 5 mL를 추가한다. </li><li> 나누어지는 리피터 피펫을 사용하여 500 개인 1 ML의 플라스틱 튜브에 10 μL. </li><li> -20 ° C에서 고속 진공 건조하는 저장소. </li><li> 건조 된 염료의 10 μg의와 플라스틱 병에 20 20 %의 μL 플루 DMSO에 추가합니다. </li><li> 거품을 피하고로 pipetting 아래로 섞는다. </li><li> 플라스틱 병에서 눈금 실린더 (10 ㎖)에 플루와 염료로 DMSO를 포함 믹스를 전송합니다. 최종 VO에 타이로드 솔루션을 추가5 ㎖의 LUME. </li><li> 목욕 초음파기에서 20 ~ 25 분 동안 초음파 처리. </li><li> 연동 펌프를 사용하여 30 분 동안 심장 내로 관류. 3.5 절에서 단계별 지침을 참조하십시오. </li></ol> 6. 심 외막 신호를 기록 <ol><li> 염료를로드 한 후, 매니 폴드 위의 클램프를 제거하여 타이로드 용액과 마음을 복고 - 관류. 타이로드 용액을 함유하는 60 mL의 주사기에 직렬로있는 밸브를 연다. 10 분 동안 레트로 관류의 타이로드 솔루션은 마음을 안정. </li><li> 타이로드 솔루션 가로 실을 작성하고 37 ° C로 목욕 온도를 가지고 펠티에 장치의 전원을 켭니다. </li><li> 마음의 표면에 광섬유를 배치합니다. <ol><li> 2 mL를 피펫 내부의 광섬유를 배치 한 다음 미세 조작기에 피펫을 첨부합니다. </li><li> 약간 LV의 표면에 광섬유를 눌러 미세 조작기를 사용합니다. </li></ol></li><li> 외부 난방 조절이파형 발생기에 의해 제어되는 자극과 실온. <ol><li> 1 ms의 폭의 사각형 펄스를 제공하는 파형 생성기 프로그램. </li><li> 외부 적으로 동기화 될 수있는 자극을 설정하고 파동 발생기에 외부 입력을 연결한다. </li><li> 자극기의 각 출력에, 마지막에 납땜 침술 바늘로 와이어를 연결합니다. </li><li> 약 3mm 떨어져 서로 마음의 정점에 모두 침을 놓습니다. </li><li> 바늘이 조직에 배치됩니다 만 후 전기 충격을 방지하기 위해 자극기의 출력을 켭니다. </li></ol></li><li> 인수 소프트웨어에서, 10 kHz로 획득 주파수를 조정합니다. </li></ol> 7. 심 내막 신호를 기록 <ol><li> 염료를로드 한 후 마음을 안정시키기 위해 6.1 및 6.2 단계를 참조하십시오. </li><li> 광섬유의 크기를 급격히 23Ga 점을 이용하여, 격벽에 가까운 LV 심장의 표면에 작은 구멍을 만든다. </li> &lt;리&gt;은 미세 조작기를 이용하여 내막에 처음으로 광섬유의 위치에 도움이되도록 유리체 강내 수술 공막 어댑터를 놓습니다. </li><li> 외부 마음을 조절이. 6.4 단계를 참조하십시오. </li><li> 수집 소프트웨어에서, 10 kHz로 획득 주파수를 조정합니다. </li></ol>

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이 문서는 심장 근세포 생체의 기능을 평가하기 위해 국소 체 형광 기술을 설명하기에 중심. 결합 된 환경에서 이러한 세포의 연구뿐만 아니라 더 많은 생리적 인뿐만 아니라 장기 레벨 병리학을 평가하기위한 매우 적합하다. 여기 수축 커플 링 (ECC)를 기본 셀룰러 이벤트 세포 내 칼슘 역학을 모니터링 분자 프로브의 사용과 전체 기관 수준에서 (루비로드 2 세포질 칼슘을 매기-Fluo4 SR 칼슘) 평가 될 수 있으며, 전기 활동 (디 -8- ANEPPs). 여기, 우리는 모두 흥분과 광섬유를 이용하여 형광 지표에서 방출을 수집 세 LFFM의 표면 형광 기법을 제시 하였다. 이들은 사용 된 광원과 광 변조의 유형에 따라 다르다. LEDFM도 PLEDFM에 펄스 수의 LED를 사용하는 반면 PLFFM는, 빛, CLFFM 연속 레이저 빛을 사용하여 펄스 레이저를 사용합니다. 이 모든한 세트로서도 1에 제시되지만, 세 개의 표면 형광 배열의 하나로 구성 될 수있다. 또한, 상기 검출 된 광은 다양한 방법으로 처리 될 수있다. 예를 들어,도 2는 광전류가 통합 또는 직접 전류 전압 변환기에 의해 전압으로 변환 될 수있는 두 가지 경우를 예시한다. 도 3와 같이 일반적 LFFM 방식은 동시에 다수의 해부학 적 위치를 측정하는데 사용될 수있다. 본래 기관 수준에서 심근 특성을 평가하기 위해 여기에 제시된 방법은 셀들 사이의 커플 링은 상기 조직의 행동을 정의하는 중요한 문제를 연구하는 것이 더 적절하다. 다른 AP를 생산할 수있는 심장의 극한 이질성 특정 조직에 기초하여, 22 21, 13 파형하는 CE로부터LLS 유래. 따라서, 전체 장기 연구는 다른 해부학 적 구조의 셀의 로컬 생리 기능을 평가하는 기회를 제공한다. 또한, 우리는 불꽃과 파도 같은 세포 내 이벤트가 그대로 기관 (15)보다 해리 세포에서 다른 동력학을 가지고 보았다. 랑겐 돌프 세트 업 (그림 4)는 생체에 가까운 상황에서 마음을 유지하는 것이 중요합니다. 또한, 여러 가지 생리 학적 변수의 측정을 허용 다중 약물 및 다양한 형광 분자 프로브 retroperfusion 있습니다. 서로 다른 광원을 사용하는 외인성 형광 프로브 변경 광섬유의 크기를 증가 또는 선택 극적 기술의 응용을 변경할 수있다. 또한, 수평 챔버 아래 펠티에 유닛은 다양한 온도에서 칼슘 역학에 대한 연구를 촉진 할 수있다. 액세서리를 추가빔 스플리터가 그대로 마음에 다른 지역에서 기록하는 데 사용 광섬유의 수를 증가시킬 수 등 LFFM합니다. 이 지역의 차이는 병적 인 시나리오에서 발생할 경우 테스트하는 매우 유용한 적응이다. 그림 3은 내막을 보여주고 심장 외막 동시에 평가된다. 또한, 다른 효능과 마음을 관류하는 것은 우리가 심실 벽에서 서로 다른 영역을 조절하는 방법을 이해 할 수 있습니다. 전기 신호 (그림 5)과 칼슘 2 + 운동 (그림 6)은 이질성은 심장 외막과 내막에 비교 될 수있다. 또한, 상이한 여기 파장 및 방출 필터를 다수의 염료가 사용될 수있다. 예를 들어 크기 - FLUO-4를 사용함으로써, SR의 루멘의 칼슘 이온 농도는 (도 7)에 기록 될 수있다. 광섬유의 크기를 변경하는 것도 LAR에서 형광 촬영을 허용함으로써 이러한 방법의 용량을 확장 할 수있다게르 영역입니다. 이 논문은 또한 별도로 고가의 레이저에서, LED는 우리의 기술에서는 여기 광원으로서 사용할 수 있음을 보여준다. 도 8은 광원이 저렴 유형 ratiometrically AP를 측정 할 수 있음을 보여준다. 도 8에 도시 된 비율 적 측정은 이동에 의한 아티팩트를 포함한 실험없이 최종 기록 생산에 유리하다. 마지막으로, 심지어 칼슘 과도 AP 광학적 다중화 상이한 파장과 동일한 발광 스펙트럼과 염료를 사용하여, 동시에 기록 될 수있다. 도 9에 설명 된 신호 처리는 염료의 발광 스펙트럼의 중첩에 의해 생성 된 내부의 오염을 제거하는데 중요하다. 칼슘을 2 + 과도 및 AP를 동시에하지만, 두 개의 독립적 인 출력 신호를 기록하는 ECC 및 칼슘 유도 된 칼슘을 공부에 도움이됩니다 2+ </suP&gt;이 두 변수는 매우 서로 연결되어 프로세스가 릴리스 (CICR). LFFM 그대로 조직의 세포 생리학의 여러 응용 프로그램과의 기술이다. 그러나, 하나의 중요한 한계는 녹음 된 형광 광파이버가 조직과 접촉되는 로컬 영역 내의 기본 형광 표시기에서의 평균 발광 점이다. 두 개의 광섬유를 사용하는 경우에도, LFFM은 측정 된 신호의 세포 내 공간 분포를 제공하지 않는다. 광학 매핑 같은 AP, 칼슘 과도 전파로서 공간과 시간의 변화 생리 학적 변수를 모니터링하는 좋은 방법이며, alternans 23, 24, 25. LFFM는 공 초점 현미경 및 기타 광학 매핑 기술과 같은 구조의 영상을 제공 할 수 없습니다. 그럼에도 불구하고, 광섬유의 사용은 R에이 실용적심 내막 또는 공 초점 현미경으로 온전한 마음에 접근이 어렵거나 불가능한 다른 지역에서 지역 형광 신호를 ecording. 그대로 마음에서 얻은 생리 학적 변수들 사이에 고립 된 심근 세포 실험에서 비교는 어렵습니다. 절연 심장 근세포를 이용하는 가장 큰 이점은 패치 클램프 조건 하에서 세포의 생물 리 학적 특성을 평가할 수있는 유일한 기회이다. 반면, LFFM보다 네이티브 환경에서 생리와 병리 현상의 연구를 할 수 있습니다. 예를 들어, 그대로 마음에 우리는 분리 된 세포에서 달성 할 수없는 전층 생리의 차이 (15), AP와 칼슘의 심장 박동 의존성 2+ 범위 (13)을 평가할 수 있습니다. 또, 본래의 중심 구 (10)의 기능에 허혈의 효과를 연구 할 수있다. 항목의 심장 전위한 실험은 또한 우리가 다른 유형의 세포 및 근육 세포 (11) 사이의 상호 작용을 평가하기 위해 허용한다. LFFM는 세포 생리 학적 커플 링이있는 그대로 심장 수준에서 세포 신호 시각화 할 수 있습니다. 세포가 손상 기관에서 여전히 동안 LFFM은 세포 활동의 연구를 할 수 있습니다. 칼슘 역학과 전기 활동 : 형광 염료 및 epiluminescence와 함께, LFFM 두 가지 주요 심장 속성을 모니터링 할 수 있습니다. 마지막으로, 여기에 제시된 방법은 ECC의 연구에서 여러 응용 프로그램을 사용할 수 있습니다. 이 같은 부정맥 (16)과 허혈 9, 15으로 병적 인 상황에 영향을받는 방법 초분자 신호를 나타낼 수있는 도구입니다. 이 기술들이 단지 그대로 기관 수준에서 잘 이해 될 수 있기 때문에 이러한 병리를 연구하기 위해 필요한 것이다.

핵심은 심장 혈관 시스템의 중심 기관이다. 심장의 수축은 세포 내에서 증가 [칼슘 2 +]에 의해 시작된다. 세포 내 칼슘 방출의 전기적 흥분성 변화 사이의 관계는 역사적으로 효소 적 세포 해리 (1, 2)에서 연구되고있다. 그러나, 심근 세포 대사되어 전기적 및 기계적 4 3 결합된다. 격리되면, 근육 세포가 물리적으로 결합되지 없지만, 상이한 계층에서 심근 세포를 해리 5 동안 혼합한다. 또한, 전압 클램프 조건 하에서 분리 된 세포 연구로부터 나왔다 막대한 장점, 6, 7, 8의 전기 syncytium ALWA 같은 심장의 본질 불구YS는 조직 3에 존재하는 것과 세포를 분해하는 방법을 기능적으로 다른 질문을 제기. 이 논문에서는 본래 심장 로컬 필드 형광 현미경 (LFFM) 기술을 사용하여 심장 생리학의 기술에서 얻어진 발전을 설명한다. LFFM는 세포질 칼슘, 내 근질 세망 (SR) 칼슘과 막 잠재력 등 여러 생리적 변수를 측정하는 형광 표시를 사용합니다. 이러한 측정은 심실 압력 9, 10, 9 심전도, 전기 활동 전위 (APS), 이온 전류 및 기록 갇힌 화합물 (4)의 플래시 광분해, (11)과 함께 동시에 얻을 수있다. 또한, 이들 측정은 가까운 높은 주파수에서 그대로 심장 페이싱에 의해 얻을 수있다생리 요금에 연구. 여러 문서 있지만 9, 11, 12, 13, 14 LFFM 기술을 이용하여 우리 그룹에 의해 출판 된, 이러한 기술과 관련된 기술적 인 복잡성의 추정은 심장 및 다른 기관에 생체 생리 현상 공부의 다량 사용을 방지하고있다. LFFM 기술 (도 1)이 조직과 접촉하는 멀티 모드 광파이버를 사용하여 얻어진 표면 형광 측정에 기초한다. 접촉 형광 영상 법처럼, 광학 해상도는 직경, 섬유의 개구 수 (NA)에 따라 달라진다. 광섬유의 NA보다 작은 직경 측정의 공간 해상도를 증가시킬 것이다. NAS 및 섬유 직경은 각각 0.22에서 mm 0.66과 μm의 1 (50)에 이르기까지 다양 할 수 있습니다. 에서개구를 주름은 큰 입체각에서 도착 광자를 받아들임으로써 잡음비 (S / N)에 신호를 개선한다. 표면 형광 장치로서 작용하기 위해서는, 광 빔은 비구면 렌즈 표면 형광 또는 목적을 가진 광섬유에 집중되는 경우, 렌즈의 NA와 광 매치. 이 검색은 여기 및 형광 물질에 의해 방출되는 광자를 다시 수집하는 에너지 전달을 최대화한다. 조직에 들어 외인성 형광 표시기를 자극하기 위해, 다른 광원, 조명 모드가 이용 될 수있다. 펄스 지역 필드 형광 현미경 (3), 12 (PLFFM)를 사용하여 우리의 선구적인 연구는 저가의 피코 초 레이저 (그림 1a, PLFFM)를 사용. 광원이 유형의 실질적으로 인한 색소 표백 않고 조명 영역 하에서 형광 분자의 흥미로운 큰 분획의 큰 장점을 갖는다짧은 펄스 (12) 기간. 게다가 초단 펄스의 사용은 염료 (12)의 형광 수명의 평가를 허용했다. 형광 수명은 칼슘 결합 염료 분자의 비율을 정량하는 데 사용될 수있는 특성이다. 불행히도, 펄스 간에서 진폭 펄스 및 변화의 시간적 터링 색소에 결합하는 리간드에 의해 생성 된 형광의 변화가 큰 경우에,이 실험 전략의 적용을 제한한다. 연속파 (CW) 레이저는 일반적 LFFM (도 1b, CLFFM)의 메인 조명 원으로 사용된다. 레이저 빔은 연속 조직을 조명하거나 ferroelectrically 변조 될 수있다. 빔의 강유전체 변조 마이크로 광 펄스를 생성 할 수있다. 이 변조는 외부의 하드웨어에 의해 제어 될 수있다. 이 절차는뿐만 아니라 극적으로 t을 감소그는 광 펄스의 시간적 지터하지만, 또한 서로 다른 파장의 광선을 혼합 할 수 있습니다. 보의 혼합은 다른 레이저에서 다중 광선에 의해 수행된다. 결과적으로, 상이한 스펙트럼 특성을 가지는 다수의 염료는, 예를 들면, 생리 학적 변수의 다양한 측정을 수행하도록 기대 될 수 루비로드 -2- 세포질 칼슘 들면 MagFluo4 인트라 SR 칼슘 및 디 -8- ANEPPS 대한 대 막 잠재력. LFFM의 광원으로서 레이저가 본 다양한 장점 있지만, 광원의 다른 유형의 발광 다이오드 (LED)를 포함하여 사용할 수있다. 이 경우, 상기 여기 광원은 InGaN으로 LED (도 1C, PLEDFM)로 구성되었다. 전도대의 전자가 가전 자대의 정공과 재결합 할 때의 LED에서 광자 자발적 방출된다. 고체 레이저와의 차이는 발광 다른 광자에 의해 자극되지 않는다는 것이다. 이것은 비 - 간섭 성 빔의 결과LED의 넓은 스펙트럼 방사. 하이 파워 LED의 종류가 사용될 수있다. 디 -8- ANEPPS 및 CA에 대해를 사용하여 AP의 레코딩을위한 2+ 과도 FLUO-4 또는 크기 - FLUO-4, 우리는 485 나노 미터 (블루), 20 nm의 절반 폭의 전형적인 피크 방출을 갖는 LED를 사용하여 기록 (그림 1D). 루비로드-2로 기록 칼슘 과도를 들어, LED는 540 nm의 (녹색), 35 nm의 (도 1D)의 절반 폭 일반적인 발광 피크를 가지고 있었다. LED는 밴드 파장에서 방출하기 때문에 자신의 스펙트럼 방사를 좁힐 필터를 필요로한다. 또, 펄스 광은 20 μs의 지속 시간 1.6 kHz의 속도로 생성 될 수있다. LED는 빠르고 전력 MOSFET 전계 효과 트랜지스터로 펄스 하였다. 다른 지표 동시 녹화 시간 다중화 LED에 의해 수행 될 수있다. 불행히도, LED에 의해 방출 된 광은 레이저 광과 비교하여 광섬유에 초점을 더 어렵다. 따라서, 우리의 주요 단점LED를 보내고 그들의 방출 프로파일 메인 축으로부터의 각도 변위 (± 15 °)를 가지며, 보조 광학 그것을 보정하기 위해 사용되어야한다는 것이다. 전술 한 광학 모든 구성에서, 여기 광은 다이크로 익 미러의 ​​도움으로 반사된다. 빔이어서 조직에 위치하는 다중 모드 광섬유 상에 비구면 렌즈는 현미경 대물 렌즈에 의해 집광된다. 모든 표면 형광 장치에서와 같이, 다이크로 익 미러는 출사 된 광으로부터 음원을 분리하는 역할을한다. 방출 된 빛의 스펙트럼은 반영 여기를 제거하기 위해 다시 차단 필터를 통해 이동한다. 마지막으로, 출사 광은 광 검출기 (도 1) 상에 목적으로 집중된다. 전류 빛의 전달은 실리콘 애벌 런치 포토 다이오드에 의해 수행된다. 이 다이오드는 빠른 응답 및 낮은 광 검출을 허용하는 높은 감도를 가지고있다. 그만큼애벌랜치 포토 다이오드에 의해 생성 된 광전류는 두 가지 방식으로 증폭 될 수있다 : 트랜스 임피던스 증폭기의 전압 (도 1F)로 전류 변환하는 저항성 피드백 요소 (도 1E)을 갖는 또는 적분기로. 첫 번째 방법을 사용하여, 출력 전압과 광전류 피드백 저항에 비례한다. 피코 초 레이저 펄스의 저항 검출의 전형적인 예는도 2a, 2b 및 2c에 도시되어있다. 패널 2a는 트랜스 임피던스 증폭기의 출력을 도시하고 패널 (2B)은 별표 (*)로 표시된 구간의 시간 전개를 보여준다. 피크 추적 알고리즘은 형광 응답 (12)의 피크 (적색)과베이스 (녹색)을 검출하도록 실시 하였다. 기본 형광 측정은 주변 조명기구에 의해 도입 된 애벌랜치 포토 다이오드의 암전류와 간섭 양자의 정보를 제공한다HT 및 전자기 커플 링. 피크 염기의 표현은도 2c에 도시된다. 이 그림은 박동 잉꼬 심장의 심장주기 동안 2 + 칼슘 결합 염료 (루비로드-2)에 의해 방출되는 형광을 보여줍니다. 두 번째 방법에있어서, 상기 적분기의 출력 전압 및 전류 피드백 용량의 함수이다 (도 2D, 2E 및 2F). 어떤 외부 조명과 제 1 및 펄스 LED로부터인가 된 광 펄스와 두 번째 그림 2 층은 두 개의 연속적인 통합주기를 보여줍니다. 자세한 설명은도 2g과 2 시간에 제시되어있다. 이 접근법은 더 힘든 있지만 의한 피드백 커패시터의 열 잡음의 부재로 큰 S / N을 제공한다. 기기는 여기 광을 모두 제어 다중화를 생성하고 headstage 통합 및 입술 명령하는 타이밍 단을 포함등 기간. 이것은 일반적으로도 데이터의 온라인 회귀 계산으로 통합 된 출력 신호의 디지털 미분을 행하는 디지털 신호 처리 회로가 수행된다. 저항 피드백을 사용하는 경우에는, 어느 A / D 수집 보드를 사용할 수있다. 마지막으로, 우리 LFFM 기법 다용도이며 하나 이상의 영역으로부터 기록하도록 구성 될 수있다. 빛의 경로에 빔 스플리터를 추가하면 우리는 두 개의 광섬유로 빛을 분할 할 수 있습니다. 각 광섬유는 그 외인성 형광 프로브로부터 독립적으로 여기시키기 조직 기록 방출 서로 다른 영역에 배치 될 수있다. 이 수정은 생리 학적 변수에 영향을 미치는 방법을 해부학 적 지역적 차이 평가하기 위해 우리를 허용합니다. 도 3은 두 개의 광 화이버는 전층 전기 또는 세포를 측정하기 위해 사용되는 CW 여기 광을 분할하기 위해 사용되는 빔 스플리터를 도시한다 [칼슘] 레벨 재치시간 마이너 침입. 전층 신호는 하나의 내막의 섬유 심실 벽의 외막 층의 다른 배치하여 기록 할 수있다. 따라서, LFFM 기술은 상이한 영역에서 셀룰러 신호의 시간 경과를 측정하는 기능이 지역 변경 병리학 적 상황에서 발생하는지 테스트하는데 사용될 수있다.

<table><tbody><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-glucose</td><td>Sigma</td><td>50-99-7</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Sigma</td><td>7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>7365-45-9</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate</td><td>Sigma</td><td>10049-21-5</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride solution</td><td>Sigma</td><td>10043-52-4</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride solution</td><td>Sigma</td><td>7786-30-3</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hyrdoxide</td><td>Sigma</td><td>S-8045</td><td></td></tr><tr><td>0.2 &amp;mu;m nylon membrane filter</td><td>Whatman</td><td>7402-004</td><td></td></tr><tr><td>Manifold MPP</td><td>Warner</td><td>64-0216&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>21G1.5 Precision glide needle</td><td>B-D</td><td>305167</td><td></td></tr><tr><td>Black Braided silk string (non-absorbable surgical suture)</td><td>AllMech Tech</td><td>LOOK-SP105</td><td></td></tr><tr><td>Heparin sodium injection 1000USP/mL</td><td>AllMech Tech</td><td>NDC63323-540-11</td><td></td></tr><tr><td>DMSO D8779</td><td>Sigma</td><td>67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>Blebbistatin</td><td>Sigma</td><td>856925-71-8</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127 20% solution</td><td>Biotium</td><td>59004</td><td></td></tr><tr><td>Materflex C/L peristaltic pump</td><td>Cole-Parmer</td><td>77122-26</td><td></td></tr><tr><td>Isostim stimulator</td><td>World Precision Instruments</td><td>A320RC</td><td></td></tr><tr><td>Waveform generator</td><td>Teledyne Lecroy</td><td>WaveStation 2012</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasonic cleaner FS20</td><td>Fisher Scientific</td><td>1533530</td><td></td></tr><tr><td>Tygon tubing ID:1/32&quot; OD:3/32&quot; Wall 1/32&quot;</td><td>Component Supply</td><td>TET-031A</td><td></td></tr><tr><td>Tygon tubing ID:3/32&quot; OD:5/32&quot; Wall 1/32&quot;</td><td>Component Supply</td><td>TET-094A</td><td></td></tr><tr><td>Adapter luer lock to 3-way valve</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-31200-80</td><td></td></tr><tr><td>Tee adapters and plastic fittings</td><td>Cole-Parmer</td><td>6365-90</td><td></td></tr><tr><td>Plastic clamp</td><td>WaterZoo</td><td>2465</td><td></td></tr><tr><td>Peltier</td><td>TE Technology</td><td>TE-127-2.0-2.5</td><td></td></tr><tr><td>Rhod-2AM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R1245MP</td><td></td></tr><tr><td>Di-8-ANEPPS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D3167</td><td></td></tr><tr><td>Mag-Fluo-4AM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>M14206</td><td></td></tr><tr><td>Acupunture needles</td><td>LHASA</td><td>TC1.20x13</td><td></td></tr><tr><td>60 mL BD syringe with luer-lok</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-820-11</td><td></td></tr><tr><td>LabView</td><td>National Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Speed vacuum Eppendorf Vagufuge</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-748-13</td><td></td></tr><tr><td>Digital signal processing circuit DSP TMS 320</td><td>Texas Instrument</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Longpass Dichroic mirror 567 nm</td><td>ThorLabs</td><td>DMLP567L</td><td></td></tr><tr><td>Objective 10X NA 0.25 DIN AchromaticFinite Intl Standard Objective</td><td>Edmund Optics</td><td>Stock# 33-437</td><td></td></tr><tr><td>Objective 20X NA 0.40 DIN Achromatic Finite Intl Standard Objective</td><td>Edmund Optics</td><td>Stock# 33-438</td><td></td></tr><tr><td>Longpass colored glass filter 590 nm&amp;nbsp;</td><td>ThorLabs</td><td>FGL590</td><td></td></tr><tr><td>Green Nd-YAG laser 532 nm, 500 mW</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator for laser</td><td>Siskiyou</td><td>MX130R</td><td></td></tr><tr><td>Multimode fiber optic 200 &amp;micro;m NA 0.39</td><td>ThorLabs</td><td>FT200UMT</td><td></td></tr><tr><td>LEDs blue</td><td>Lumileds</td><td>L135-B475003500000</td><td></td></tr><tr><td>LEDs green</td><td>Lumileds</td><td>L135-G525003500000</td><td></td></tr><tr><td>Cube beam splitter, non-polarizing</td><td>ThorLabs</td><td>BS007</td><td></td></tr><tr><td>36&quot; Length, Dovetail Optical Rail</td><td>Edmund Optics</td><td>54-402</td><td></td></tr><tr><td>2.5&quot; Width, Dovetail Carrier</td><td>Edmund Optics</td><td>54-404</td><td></td></tr><tr><td>0.75&quot; Travel, micrometer stage</td><td>Edmund Optics</td><td>37-983</td><td></td></tr><tr><td>Dovetail optical rail 3&quot;</td><td>ThorLabs</td><td>RLA075/M</td><td></td></tr><tr><td>Dovetail rail carrier 1&quot;</td><td>ThorLabs</td><td>RC1</td><td></td></tr><tr><td>Avalanche photodiode Helix 902</td><td>Digi-Key</td><td>HELIX-902-200</td><td></td></tr><tr><td>Objective holder XY Translator&amp;nbsp;</td><td>ThorLabs</td><td>ST1XY-S</td><td></td></tr><tr><td>Aluminum breadboard 6&quot; x 6&quot;</td><td>ThorLabs</td><td>MB6</td><td></td></tr><tr><td>Nexus otpical table 4&#039; x 6&#039;</td><td>ThorLabs</td><td>T46HK</td><td></td></tr><tr><td>Stainless steel cap screws</td><td>ThorLabs</td><td>HW-KIT5/M</td><td></td></tr><tr><td>Acrylic&amp;nbsp; sheet</td><td>Home Depot/Lowes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sylgard Silicone elastomer kit</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Epoxy gel&amp;nbsp;</td><td>Walmart/Home Depot</td><td>2-part 5 min clr 1oz</td><td></td></tr><tr><td>21G1.5 Precision glide needle</td><td>B-D</td><td>305167</td><td></td></tr><tr><td>23G Precision glide needle</td><td>B-D</td><td>305145</td><td></td></tr><tr><td>Mounting base, 25 mm x 75 mm x 10 mm</td><td>ThorLabs</td><td>BA1/M</td><td></td></tr><tr><td>Wire shelve posts 36&quot;</td><td>Alera</td><td>AALESW59PO36SR</td><td></td></tr><tr><td>Wire shelves</td><td>Alera</td><td>ALESW582424SR</td><td></td></tr><tr><td>Post and angle clamp</td><td>ThorLabs</td><td>SWC/M-P5</td><td></td></tr><tr><td>Glass syringe for dye chamber</td><td>Wheaton</td><td>W851020</td><td></td></tr><tr><td>Rubber stopper</td><td>Home Science Tools</td><td>CE-STOP01C</td><td></td></tr></tbody></table>

local field fluorescence microscopy: imaging cellular signals in intact hearts

심장에서 분자 신호 전달 연구는 일반적으로 고립 된 근육 세포에서 수행된다. 그러나, 허혈 및 부정맥과 같은 많은 병리학 적 상황은 완전히 전체 기관 수준에서 잘 이해 될 수있다. 여기서는 본래 심장 세포 신호를 측정 할 수 있도록 로컬 필드 형광 현미경 (LFFM) 분광 기법을 제시한다. 이 기술은 랑겐 돌프 관류 심장 및 형광 신호를 기록하는 광 화이버의 결합에 기초한다. LFFM 정상 및 병적 상태에서 마음을 연구하는 심장 혈관 생리학의 분야에서 다양한 응용 프로그램이 있습니다. 다중 심장 변수는 상이한 형광 표시기를 사용하여 모니터링 할 수있다. 다음은 세포질 [칼슘 2 +] 내 근질 세망 [칼슘 2 +]와 막 전위를 포함한다. 외인성 형광 프로브 흥분 방출 된 형광 LFFM의 표면 형광 기법의 세 가지 다른 배열 검출이 논문에서 제시 s의. 이러한 기술들 중 중앙의 차이는 여기하고 상기 여기 광을 변조 방식에 사용되는 광원의 종류이다. 연속파 LFFM (CLFFM)는 연속 여기 레이저 광을 사용하는 반면 펄스 LFFM (PLFFM)의 레이저 광 펄스를 사용한다. 마지막으로, 발광 다이오드 (LED)는 제 3 광원으로 사용했다. 이 비 간섭 장치는 펄스 형 LED 형광 현미경 (PLEDFM)라고한다.

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Local Field Fluorescence Microscopy: Imaging Cellular Signals in Intact Hearts

중심부에 위치한 분자 이벤트는 기관의 전기 및 수축 기능을 조정. 여기에 제시된 지역 필드 형광 현미경 기술의 집합은 그대로 마음에 휴대 변수의 기록을 할 수 있습니다. 심장 기능을 정의하는 메커니즘을 확인하면 마음이 병적 인 상황에서 어떻게 작동하는지 이해에 중요하다.

지역 필드 형광 현미경 : 본래 마음의 세포 신호 이미징

In the heart, molecular signaling studies are usually performed in isolated myocytes. However, many pathological situations such as ischemia and ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

8.2K 조회수.  University of California, Merced.  중심부에 위치한 분자 이벤트는 기관의 전기 및 수축 기능을 조정. 여기에 제시된 지역 필드 형광 현미경 기술의 집합은 그대로 마음에 휴대 변수의 기록을 할 수 있습니다. 심장 기능을 정의하는 메커니즘을 확인하면 마음이 병적 인 상황에서 어떻게 작동하는지 이해에 중요하다. 

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Imaging Cleared Embryonic and Postnatal Hearts at Single-cell Resolution

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, and allow for the study of the cellular and molecular basis of normal and abnormal cardiac morphogenesis. Recent emerging technologies of retrospective single clonal analyses make the study of cardiac morphogenesis at single cell resolution feasible. However, tissue opacity and light scattering of the heart as imaging depth is increased hinder whole-heart imaging at single cell resolution. To overcome these obstacles, a whole-embryo clearing system that can render the heart highly transparent for both illumination and detection must be developed. Fortunately, in the last several years, many methodologies for whole-organism clearing systems such as CLARITY, Scale, SeeDB, ClearT, 3DISCO, CUBIC, DBE, BABB and PACT have been reported. This lab is interested in the cellular and molecular mechanisms of cardiac morphogenesis. Recently, we established single cell lineage tracing via the ROSA26-CreERT2; ROSA26-Confetti system to sparsely label cells during cardiac development. We adapted several whole embryo-clearing methodologies including Scale and CUBIC (clear, unobstructed brain imaging cocktails and computational analysis) to clear the embryo in combination with whole mount staining to image single clones inside the heart. The heart was successfully imaged at single cell resolution. We found that Scale can clear the embryonic heart, but cannot effectively clear the postnatal heart, while CUBIC can clear the postnatal heart, but damages the embryonic heart by dissolving the tissue. The methods described here will permit the study of gene function at a single clone resolution during cardiac morphogenesis, which, in turn, can reveal the cellular and molecular basis of congenital heart defects.

We describe a protocol to volumetrically image fluorescent protein labeled cells deep inside intact embryonic and postnatal hearts. Utilizing tissue-clearing methods in combination with whole mount staining, single fluorescent protein-labeled cells inside an embryonic or postnatal heart can be imaged clearly and accurately.

영상은 단일 셀 해상도에서 배아 및 출생 후의 마음을 해제

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, ...

연구

발생학

Optical Mapping of Langendorff-perfused Rat Hearts

Optical mapping of the cardiac surface with voltage-sensitive fluorescent dyes has become an important tool to investigate electrical excitation in experimental models that range in scale from cell cultures to whole-organs[1, 2]. Using state-of-the-art optical imaging systems, generation and propagation of action potentials during normal cardiac rhythm or throughout initiation and maintenance of arrhythmias can be visualized almost instantly[1]. The latest commercially-available systems can provide information at exceedingly high spatiotemporal resolutions and were based on custom-built equipment initially developed to overcome the obstacles imposed by more conventional electrophysiological methods[1]. Advancements in high-resolution and high-speed complementary metal-oxide-semiconductor (CMOS) cameras and intensely-bright, light-emitting diodes (LEDs) as well as voltage-sensitive dyes, optics, and filters have begun to make electrical signal acquisition practical for cardiovascular cell biologists who are more accustomed to working with microscopes. Although the newest generation of CMOS cameras can acquire 10,000 frames per second on a 16,384 pixel array, depending on the type of sample preparation, long-established fluorescence acquisition technologies such as photodiode arrays, laser scanning systems, and cooled charged-coupled device (CCD) cameras still have some distinct advantages with respect to dynamic range, signal-to-noise ratio, and quantum efficiency[1, 3]. In the present study, Lewis rat hearts were perfused ex vivo with a crystalloid perfusate (Krebs-Henseleit solution) at 37&deg;C on a modified Langendorff apparatus. After a 20 minute stabilization period, the hearts were intermittently perfused with 11 mMol/L 2,3-butanedione monoxime to eliminate contraction-associated motion during image acquisition. For optical mapping, we loaded hearts with the fast-response potentiometric probe di-8-ANEPPS[4] (5 &mu;Mol/L) and briefly illuminated the preparation with 475&plusmn;15 nm excitation light. During a typical 2 second period of illumination, &gt;605 nm light emitted from the cardiac preparation was imaged with a high-speed CMOS camera connected to a horizontal macroscope. For this demonstration, hearts were paced at 300 beats per minute with a coaxial electrode connected to an isolated electrical stimulation unit. Simultaneous bipolar electrographic recordings were acquired and analyzed along with the voltage signals using readily-available software. In this manner, action potentials on the surface of Langendorff-perfused rat hearts can be visualized and registered with electrographic signals.

This article describes a high temporal and spatial resolution technique to optically image action potential movement on the surface of Langendorff-perfused rat hearts using a potentiometric dye (di-8-ANEPPS).

Langendorff - perfused 랫 하트의 광학 매핑

Optical mapping of the cardiac surface with voltage-sensitive fluorescent dyes has become an important tool to investigate electrical excitation in ...

생물학

Light-sheet Fluorescence Microscopy for the Study of the Murine Heart

Light-sheet fluorescence microscopy has been widely used for rapid image acquisition with a high axial resolution from micrometer to millimeter scale. Traditional light-sheet techniques involve the use of a single illumination beam directed orthogonally at sample tissue. Images of large samples that are produced using a single illumination beam contain stripes or artifacts and suffer from a reduced resolution due to the scattering and absorption of light by the tissue. This study uses a dual-sided illumination beam and a simplified CLARITY optical clearing technique for the murine heart. These techniques allow for deeper imaging by removing lipids from the heart and produce a large field of imaging, greater than 10 x 10 x 10 mm3. As a result, this strategy enables us to quantify the ventricular dimensions, track the cardiac lineage, and localize the spatial distribution of cardiac-specific proteins and ion-channels from the post-natal to adult mouse hearts with sufficient contrast and resolution.

This study uses a dual-sided illumination light-sheet fluorescence microscopy (LSFM) technique combined with optical clearing to study the murine heart.

Murine 심장 연구에 대 한 빛-시트 형광 현미경 검사 법

Light-sheet fluorescence microscopy has been widely used for rapid image acquisition with a high axial resolution from micrometer to millimeter scale. ...

생체공학

Intra-cardiac Side-Firing Light Catheter for Monitoring Cellular Metabolism using Transmural Absorbance Spectroscopy of Perfused Mammalian Hearts

Absorbance spectroscopy of cardiac muscle provides non-destructive assessment of cytosolic and mitochondrial oxygenation via myoglobin and cytochrome absorbance respectively. In addition, numerous aspects of the mitochondrial metabolic status such as membrane potential and substrate entry can also be estimated. To perform cardiac wall transmission optical spectroscopy, a commercially available side-firing optical fiber catheter is placed in the left ventricle of the isolated perfused heart as a light source. Light passing through the heart wall is collected with an external optical fiber to perform optical spectroscopy of the heart in near real- time. The transmission approach avoids numerous surface scattering interference occurring in widely used reflection approaches. Changes in transmural absorbance spectra were deconvolved using a library of chromophore reference spectra, providing quantitative measures of all the known cardiac chromophores simultaneously. This spectral deconvolution approach eliminated intrinsic errors that may result from using common dual wavelength methods applied to overlapping absorbance spectra, as well as provided a quantitative evaluation of the goodness of fit. A custom program was designed for data acquisition and analysis, which permitted the investigator to monitor the metabolic state of the preparation during the experiment. These relatively simple additions to the standard heart perfusion system provide a unique insight into the metabolic state of the heart wall in addition to conventional measures of contraction, perfusion, and substrate/oxygen extraction.

Here we introduce a method for using an intra-ventricle optical catheter in perfused hearts to perform absorbance spectroscopy across the heart wall. The data obtained provides robust information on tissue oxygen tension as well as substrate utilization and membrane potential simultaneously with cardiac performance measures in this ubiquitous preparation.

교란 성 포유류 심장의 경부 흡광도 분광학을 사용하여 세포 대사를 모니터링하기위한 심장 내 측 발사 라이트 카테터

Absorbance spectroscopy of cardiac muscle provides non-destructive assessment of cytosolic and mitochondrial oxygenation via myoglobin and cytochrome ...

Optical Imaging of Isolated Murine Ventricular Myocytes

The ability to isolate adult cardiac myocytes has permitted researchers to study a variety of cardiac pathologies at the single cell level. While advances in calcium sensitive dyes have permitted the robust optical recording of single cell calcium dynamics, recording of robust transmembrane optical voltage signals has remained difficult. Arguably, this is because of the low single to noise ratio, phototoxicity, and photobleaching of traditional potentiometric dyes. Therefore, single cell voltage measurements have long been confined to the patch clamp technique which while the gold standard, is technically demanding and low throughput. However, with the development of novel potentiometric dyes, large, fast optical responses to changes in voltage can be obtained with little to no phototoxicity and photobleaching. This protocol describes in detail how to isolate adult murine myocytes which can be used for cellular shortening, calcium, and optical voltage measurements. Specifically, the protocol describes how to use a ratiometric calcium dye, a single-excitation calcium dye, and a single excitation voltage dye. This approach can be used to assess the cardiotoxicity and arrhythmogenicity of various chemical agents. While phototoxicity is still an issue at the single cell level, methodology is discussed on how to reduce it.

We present the methodology for the isolation of murine myocytes and how to obtain voltage or calcium traces simultaneously with sarcomere shortening traces using fluorescence photometry with simultaneous digital cell geometry measurements.

고립 된 뮤린 심실 근세포의 광학 이미징

The ability to isolate adult cardiac myocytes has permitted researchers to study a variety of cardiac pathologies at the single cell level. While advances ...

Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently labelled structures in large biological specimens, and is down to cellular resolution. Meanwhile, the constant refinement of underlying protocols and the enhanced availability of specialized commercial systems enable us to investigate the microstructure of whole mouse organs and even allow for the characterization of cellular behavior in various live-cell imaging approaches. Here, we describe a protocol for the spatial whole-mount visualization and quantification of the CD45+ leukocyte population in inflamed mouse hearts. The method employs a transgenic mouse strain (CD11c.DTR)that has recently been shown to serve as a robust, inducible model for the study of the development of fulminant fatal myocarditis, characterized by lethal cardiac arrhythmias. This protocol includes myocarditis induction, intravital antibody-mediated cell staining, organ preparation, and LSFM with subsequent computer-assisted image post-processing. Although presented as a highly-adapted method for our particular scientific question, the protocol represents the blueprint of an easily adjustable system that can also target completely different fluorescent structures in other organs and even in other species.

Here, we describe a light-sheet microscopy approach to visualize the cardiac CD45+ leukocyte infiltrate in a murine model of aseptic fulminant myocarditis, which is induced by the intratracheal diphtheria toxin treatment of CD11c.DTR mice.

Light Sheet Microscopy에 의한 심근 성 심근염의 Murine 모델에서의 백혈구 침윤의 정량적 시각화

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently ...

의학

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포에서 단세포 광학 작용 잠재적 측정

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial dysfunction often accompanies and contributes to human disease. Majority of the approaches that have been developed to evaluate mitochondrial function and dysfunction are based on in vitro or ex vivo measurements. Results from these experiments have limited ability in determining mitochondrial function in vivo. Here, we describe a novel approach that utilizes confocal scanning microscopy for the imaging of intact tissues in live aminals, which allows the evaluation of single mitochondrial function in a real-time manner in vivo. First, we generate transgenic mice expressing the mitochondrial targeted superoxide indicator, circularly permuted yellow fluorescent protein (mt-cpYFP). Anesthetized mt-cpYFP mouse is fixed on a custom-made stage adaptor and time-lapse images are taken from the exposed skeletal muscles of the hindlimb. The mouse is subsequently sacrificed and the heart is set up for Langendorff perfusion with physiological solutions at 37 &deg;C. The perfused heart is positioned in a special chamber on the confocal microscope stage and gentle pressure is applied to immobilize the heart and suppress heart beat induced motion artifact. Superoxide flashes are detected by real-time 2D confocal imaging at a frequency of one frame per second. The perfusion solution can be modified to contain different respiration substrates or other fluorescent indicators. The perfusion can also be adjusted to produce disease models such as ischemia and reperfusion. This technique is a unique approach for determining the function of single mitochondrion in intact tissues and in vivo.

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Confocal scanning microscopy is applied for imaging single mitochondrial events in perfused heart or skeletal muscles in live animal. Real-time monitoring of single mitochondrial processes such as superoxide flashes and membrane potential fluctuations enables the evaluation of mitochondrial function in a physiologically relevant context and during pathological perturbations.

단일 미토콘드리아 과산화물 온전한 마음에 점멸 또는 공 촛점 이미징<em&gt; 생체</em

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial ...

포괄적인 심장 이미징을 위한 Light-Sheet Microscopy and Tissue Clearing (광시트 현미경 검사) 및 Tissue Clearing(조직 투명화)

Light-Sheet Imaging to Reveal Cardiac Structure in Rodent Hearts

Light-sheet microscopy (LSM) plays a pivotal role in comprehending the intricate three-dimensional (3D) structure of the heart, providing crucial insights into fundamental cardiac physiology and pathologic responses. We hereby delve into the development and implementation of the LSM technique to elucidate the micro-architecture of the heart in mouse models. The methodology integrates a customized LSM system with tissue clearing techniques, mitigating light scattering within cardiac tissues for volumetric imaging. The combination of conventional LSM with image stitching and multiview deconvolution approaches allows for the capture of the entire heart. To address the inherent trade-off between axial resolution and field of view (FOV), we further introduce an axially swept light-sheet microscopy (ASLM) method to minimize out-of-focus light and uniformly illuminate the heart across the propagation direction. In the meanwhile, tissue clearing methods such as iDISCO enhance light penetration, facilitating the visualization of deep structures and ensuring a comprehensive examination of the myocardium throughout the entire heart. The combination of the proposed LSM and tissue clearing methods presents a promising platform for researchers in resolving cardiac structures in rodent hearts, holding great potential for the understanding of cardiac morphogenesis and remodeling.

저자 스포트라이트: 설치류 심장의 심근 구조를 조사하기 위한 맞춤형 광시트 이미징

The protocol utilizes advanced light-sheet microscopy along with adapted tissue clearing methods to investigate intricate cardiac structures in rodent hearts, holding great potential for the understanding of cardiac morphogenesis and remodeling.

설치류 심장의 심장 구조를 밝히기 위한 Light-Sheet Imaging

Light-sheet microscopy (LSM) plays a pivotal role in comprehending the intricate three-dimensional (3D) structure of the heart, providing crucial insights ...

지역 필드 형광 현미경 : 본래 마음의 세포 신호 이미징

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영상은 단일 셀 해상도에서 배아 및 출생 후의 마음을 해제

Langendorff - perfused 랫 하트의 광학 매핑

Murine 심장 연구에 대 한 빛-시트 형광 현미경 검사 법

교란 성 포유류 심장의 경부 흡광도 분광학을 사용하여 세포 대사를 모니터링하기위한 심장 내 측 발사 라이트 카테터

고립 된 뮤린 심실 근세포의 광학 이미징

Light Sheet Microscopy에 의한 심근 성 심근염의 Murine 모델에서의 백혈구 침윤의 정량적 시각화

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포에서 단세포 광학 작용 잠재적 측정

단일 미토콘드리아 과산화물 온전한 마음에 점멸 또는 공 촛점 이미징

설치류 심장의 심장 구조를 밝히기 위한 Light-Sheet Imaging

설치류 심장의 심장 구조를 밝히기 위한 Light-Sheet Imaging