Al and Mary Agnes McQuinn, the Richard M. Schulze Foundation, and an NIH Relief Grant from the Mayo Clinic funded representative work described here.

The authors have nothing to disclose.

디자인, 조성 및 바이러스 게놈 내에서 마이크로 RNA 응답 요소의 현지화 효능과 특이성을 대상으로 지시합니다. 이러한 최적화 시행 착오가 필요합니다. 그러나, 합리적인 디자인 RNA 구조 분석 및 최적화 최소한 10, 11, 12, 13, 38과 함께이 기술의 구현에서 바이러스 복제 및 마이크로 RNA 서명 보조제의 이전 연구에 기초. RE가 디자인을 개시 할 때, 연구자들은 관심있는 표적 세포에서 발현되는 마이크로 RNA의 집합을 컴파일하여 시작해야 관심의 비 표적 세포에서 감소되며, 이는 실험적으로 검증되었다. 이러한 편집 후, 여러 가지의 예측 기반의 경쟁 분석은 마이크로 RNA-타지 가능성을 해결하기 위해 수행되어야t 상호 작용. 많은 마이크로 RNA 바이러스 또는 바이러스와 숙주 유전자 발현을 조작하기 위해 휴대폰을 격리시키는 마이크로 RNA 비 코딩의 RNA를 인코딩한다. 또한, 여러 RNA 바이러스는 복제 능력 (39), (40)을 강화하기 위해 셀룰러 마이크로 RNA와 상호 작용하는 것으로 나타났다. 개의 RE를 설계 할 때 따라서, 세포의 마이크로 RNA와 바이러스의 상호 작용이 알려져 여부가 잠재적으로 선택한 마이크로 RNA의 표적을 인식하거나 선택한 마이크로 RNA의 내생 적 표현을 변경할 수있는 바이러스 마이크로 RNA를 표현하는 경우 조사해야합니다. 문헌 검색 외에, 리더 온라인 생물 정보학 도구와 예측 된 RE의 합리적인 설계에 도움이 마이크로 RNA 바이러스 대상 정보를 포함 데이터베이스를 고려해야한다. 그러한 데이터베이스와 예측 도구는 미리 복수의 마이크로 RNA 또는 중첩 시드 서열에 의해 인식 될 수있는 표적 서열의 확인을 용이하게 할 수있다<html> 바이러스 게놈 내 보냈다. 마이크로 RNA의 표적을 식별하는 방법과 온라인 예측 도구 중 일부의 장단점 대한보다 심도있는 독자는 참고 문헌 41, 42라고합니다. 이러한 예측 도구는 가이드만큼 예측이 오탐 (false positive) 또는 네거티브를 얻을 수 역할을하는 것이 좋습니다. 이를 위해 상기 마이크로 RNA 그러나의 3 &#39;말단도 타겟팅 효율에 영향을 미칠 것이다 오버랩 시드 순서가있을 수있다. 규칙 집합이 너무 엄격한 사용은 때때로 불리 할 수있다. 잠재적 인 마이크로 RNA 표적의 세트가 식별되고 나면, 연구자는 마이크로 RNA 및 RNA 구조 예측을 10, 11, 12, 13의 생물학적 특성에 기초하여 대상을 순위가 계속해야EF &quot;&gt; 38. 성숙한 표적 세포에 마이크로 RNA 및 유전자 침묵의 과정을 지시 할 것이다 Argonaute 단백질과 연계 그 레벨의 절대 풍부. 몇몇 연구는 단지 다량 발현 마이크로 RNA 크게 유전자 발현 (16), (43)을 조절하는 것으로 입증 한 일부 마이크로 RNA 풍부 Argonaute 단백질 및 RISC 형성과의 상호 작용을 표현하는 동안 (44). 또한, 변환 (44)를 억제하기에 불충분하다. 또한 표적 세포 및 후속 오프에서 마이크로 RNA 포화의 가능성을 최소화 검증 기능이 매우 풍부 마이크로 RNA를 사용하여 대상은 독성. 다른 접근법은 여전히 오프 - 타겟 toxiciti 가능성을 최소화하면서 감소 카피 수에 대한 허용 할 수있는 복수의 miRNAs (45), (46)에 의해 타겟팅 된 RE를 사용할 수있다에스. 마이크로 RNA에 표적 mRNA의 비는이 접근법의 성공에 큰 영향을 미칠 것이다. 마이크로 RNA의 비율이 높은 타겟 억압 42, 43, 47, 48의 수준을 감소시킬 것이다. 이것은 잘못 내생 마이크로 RNA의 통제 할 수없는 수준으로 축적됩니다 감염시 초기 규제하는 경우 때 신속하게 복제하는 바이러스에 특히 중요하다. 대상에 대한 마이크로 RNA를 선택할 때 이러한 속성을 고려하는 것이 필수적이다; 이상적으로, 그 기능을 실험적으로 검증 된 마이크로 RNA를 사용. 표적 유전자 침묵의 효율도 성숙 마이크로 RNA에 표적의 퍼센트 상보성뿐만 아니라 삽입 마이크로 RNA 표적 서열의 매수에 의해 영향을 받는다. 마이크로 RNA (뉴클레오타이드 2-8)의 5 &#39;영역은 시드 서열을 구성한다. 그것은 일반적으로 인정되는이 지역은 성공적인 타겟팅 48, 49 완벽하게 보완해야한다는. 그것은 전 사체의 절단 및 endonucleolytic 마이크로 RNA의 신속한 재활용을 촉진함으로써 유전자 사일런 싱 활성을 증가시킬 수 있기 때문에, 대부분의 연구는 완벽한 상보성을 가진 응답 요소를 사용한다. 마이크로 RNA는 포유 동물 세포에서 Argonaute-2로 제한됩니다 endonucleolytic 활동이있는 Argonaute 단백질과 상호 작용 할 때 endonucleolytic 분열에만 발생합니다. 다른 Argonaute 단백질은 deadenylation 및 성적 증명서의 exonucleolytic 공격에 의해 mRNA의 분해를 촉진한다. 독자는 마이크로 RNA의 생합성 및 기능에 대해 자세히 설명 참조 4, 5, 13, 50, 51, 52로 지칭된다. 그것은 그 증분을 생각 일반적입니다카피 수를 완화하는 것은 더 타겟팅 효율성을 향상시킬 것입니다. 그러나, 이것은 또한 마이크로 RNA 포화를 강화할 수 있고, 항상 더 효능이 입증되지 않았습니다. 표적 세포 농축 상이한위한 마이크로 RNA 표적 서열을 포함하거나 복수의 마이크로 RNA에 의해 인식되는 표적 서열을 사용하는 것이 종종 더 좋다. 필요한 카피 수는 또한 침묵 필요 사체의 양 및 표적 세포에 마이크로 RNA의 상대적인 풍부함에 크게 의존한다. 빠르게 축적됩니다 성적 증명서는 마이크로 RNA 수준을 outcompeting 것을 방지하기 위해 더 많은 사본을 요구할 수있다. 실험적으로 충분한 타겟팅 결과 각각의 마이크로 RNA 대상에 대한 최적의 카피 수를 결정, 바이러스 체력을 유지하고, 그 탈출 돌연변이의 비율이 권장 최소화 할 수 있습니다. 바이러스 게놈 내의 마이크로 RNA 반응 요소의 지역화 매우 중요하다. 부정 결과 분석타겟팅 효율은 항상 바이러스 마이크로 RNA-대상이 될 수 없습니다 의미하지 않는다. 단순히 대상이 해당 위치에 액세스하지 않거나 표적 유전자의 억제가 병원성을 억제하기에 충분하지 않다 의미 할 수있다. 반응 요소의 대부분은 표적 사체의 3 &#39;비 번역 영역 (UTR)에 삽입된다. 그러나, 바이러스 성 게놈의 성공적인 타겟팅을 완성하기에 이르렀다 및 대응 요소는 5 &#39;UTR에 또는 필수 유전자 38 코딩 영역 내에 삽입 될 때 때때로 전시 유전 안정성을 향상. 최적의 삽입 위치는 마이크로 RNA의 표적 서열의 높은 접근성을 허용 할 것이다. 내게는 RNA 이차 구조와 화학 양 론적 간섭에 의해 방해 할 수 있습니다. 따라서, 고도로 보존되는 구조적 영역에서 지역화 응답 요소 좋은 출발점이다. 서열도에 영향을 줄 수있는 주변 서열의 영향에 삽입된다. 티HUS 번 마이크로 RNA 표적 서열을위한 최적의 위치는 다른 반응 요소 반드시 최적이 아니다. RE 현지화의 실험적 검증 및 최적화가 필요하지만, 예측 소프트웨어를 사용하여 (예를 들어 http://unafold.rna.albany.edu/, http://rna.urmc.rochester.edu/software.html) 가능성이 삽입 사이트를 선별하기 주변 RNA 구조의 교란에 대한 매우, 54 (53)을 추천합니다. 높은 무결성 깨끗한 핵산 제제의 사용은 또한 최상의 결과를 얻기 위해 중요하다. 의 RNase없는 환경의 무균 기술 및 유지 보수 RNA 전 사체 또는 마이크로 RNA의 모방을 처리 필수적이다. 최상의 결과 RNA 전 사체를 들어, 마이크로 RNA의 모방, 최종 적정 바이러스 주식은 RNA 분해 및 바이러스 감염의 손실이 발생 반복 동결 융해를 방지하기 위해 작은 분량 씩 -80 ° C에서 보관해야합니다. 때 사용,이 시약의는 항상 얼음에 보관해야합니다. 많은 마이크로 RNA가 상보성을 공유하는 마이크로 RNA의 가족의 구성원이라는 것을 주목하는 것이 중요하다. 연구를 수행 할 때 그러므로 표적 특이성 평가를 향상시키기 위해 직접적인 마이크로 RNA 패밀리의 구성원을 포함하는 것이 유리할 수있다. 바이러스 복제가 요구되는 세포 내 가족 (예 미르 Let7 가족)의 구성원을 표현하는 경우에 중요해진다. 또한, 마이크로 RNA를 모방하여 특이성 분석 인공 시스템이며 과발현 일부 셀에서 마이크로 RNA의 오프 - 타겟 효과 (55)이 발생할 수 있음을 유의해야한다. 이 경우, 특이성은 마이크로 RNA 대신 억제제를 사용하여 해당 마이크로 RNA를 발현하는 세포에서 평가 될 수있다. 이 분석은 마이크로 RNA의 생리 학적으로 관련된 수준의 존재 하에서 바이러스 적정 및 세포 생존 판독 값에 기초하여 타겟팅 특이성의 분석을 허용한다. 10, 11, 12, 13 바이러스 - 매개 된 효과이다. 대부분의 바이러스는 높은 돌연변이 비율을 전시하고 신속하게 발생할 수있는 돌연변이를 탈출. 여러 다중 고도로 보존 된 영역 내에서 타겟 지역화 하나 이상의 마이크로 RNA의 타겟을 포함하는 표적 서열의 카피, 또는 이것을 완화 할 수있는 면역 반응을 비롯한 추가 바이러스 인자의 존재를 포함. 또한, 바이러스 게놈 내로 외래 유전자 물질의 삽입은 종종 바이러스의 복제가 감소 된 용량을 초래할 것이다. 이 경우 마이크로 RNA 표적 유전자 불안정하고 더 빨리 일어난다 돌연변이를 벗어날 가능성이있다. 여러 개의 마이크로 RNA 대상 복사 캘리포니아의 포함N은 마이크로 RNA 표적 재조합의 삭제 가능성을 증가시킨다. 따라서, 충분한 타겟팅을 위해 필요한 최소한의 카피 수의 실험적 결정이 필요하다. 탠덤 반복을 사용하여 대 게놈 전반에 걸쳐 다양한 위치에서 마이크로 RNA 대상 복사본을 지역화하는 것은이 제약을 우회에 도움이 될 수 있습니다. 그러나, 변형 된 바이러스의 복제 속도론에 포함되지 않는 필요한 대상 복사 및 삽입 부위의 최소 수와 RE 최적의 구성을 식별하는 재조합 표적 돌연변이 비율을 최소화하는 데 중요하다. 마이크로 RNA는 포화가 발생하면 표적 서열이 너무 많은 카피의 포함은 또한 오프 - 타겟 독성 잠재력을 증가시킬 수있다. 바람직하지 않은 효과가 발생할 수 55 정상 세포 단백질을 조절 가능한 마이크로 RNA의 양에서 큰 변화. 이를 위해, 다수의 바이러스는 셀 (56) 내에서,이 경우 마이크로 RNA 환경이 변경충분한 바이러스 복제가 유지되는 경우 대상 마이크로 RNA를 포함하는, 규정의 효율성이 저하 될 수있다. 이러한 문제의 모든 반응 성분 조성 및 / 또는 위치 파악을 최적화함으로써 철저한 타겟팅되는 시스템의 이해와 그 한계로 해결 될 수있다. 다른 타겟팅 방법과 관련된 일반적인 문제는 바이러스의 오프 대상 감쇠를 포함, 엔지니어링 바이러스와 관련된 제한 수행 능력 및 안전 문제와 바이러스의 유전 타겟팅 자료에 대한 크기 제한은 일반적으로 감염되지 않은 세포를 대상으로한다. 마이크로 RNA-타겟팅은 바이러스의 최소한의 변형 바이러스 친 화성의 조절이 가능합니다. 이는 바이러스 게놈 내에서 최소한의 공간을 필요로하고 휴대 마이크로 RNA 시그니처 광대 한 배열에 기초하여 맞추어 질 수있다. 이 기술은 새로운 안전 문제를 소개하지 않습니다 따라서 바이러스에 대한 새로운 tropisms을 소개하지 않습니다. 또한이방법은 동시에 다른 세포 형태 16, 17, 57, 58, 59, 60, 61 내에 농축 상이한 마이크로 RNA에 대한 표적 서열을 사용하여 여러 tropisms을 조절하는데 사용될 수있다. 이것은 모든 향상된 치료 효능과 바이러스의 안전성을 개선하는 메커니즘을 제공 할 수 있으므로 해당 마이크로 RNA를 발현하지 않는 세포에서 바이러스를 약독 화없이 달성 될 수있다. 셀룰러 마이크로 RNA 기계 악용 바이러스의 많은 다른 종류의 친 화성을 조절하기 위해 사용될 수있다. 여기에 설명 된 프로토콜은 바이러스 &#39;복제주기 및 특정 기자 것이란에 따라하지만 그들이 적용 할 수 있습니다, 마이크로 RNA 타겟 피 코르 나 바이러스과의 바이러스의 구조 및 특성을 위해 설계douts. 다른 바이러스는 특정 구조 전략되었지만, 마이크로 RNA 표적 서열에 관계없이 전체 게놈은 단일 플라스미드 또는 바이러스는 DNA 또는 RNA 게놈을 가지고 있는지 여부를 부호화하는지 여부 바이러스 게놈에 삽입 할 수있다. 한 생산자 세포가 동족 마이크로 RNA를 발현하지 않는 한, 최적화 된 마이크로 RNA의 표적은 바이러스의 구조를 방해해서는 안된다. 실험은 바이러스의 성장 동역학을 분석하여 마이크로 RNA는 타겟팅 특이성 것은 바이러스 복제의 단일 라운드의 길이를 특정 바이러스 복제 / 독성에 대한 판독 (예를 들어, 리포터 단백질, 세포 독성, 게놈 정량화에 기초하여 수집 된 시점을 변화시킴으로써 수정 될 수있다 등). 또한이 기술은 이론적으로 모든 종류의 바이러스에 적용 할 수 있지만, 여러 가지 요인이 방법의 효율성에 영향을 미칠 수 있음을 주목하는 것이 중요하다. 예를 들어, 네거티브 센스 RNA 바이러스에 의한 제한 AC 때문일 포지티브 센스 RNA 바이러스로 검증 응답하지miRNA의 기계 (13)의 게놈 RNA의은 접근하기. 따라서, 바이러스의 각 클래스의 생물학적 특성은 RE 최적화에 대한 자세한 제약을 부여합니다. 이러한 제약에도 불구하고,이 기술은 안전, 유틸리티를 포함하는 바이러스 친 화성 촉진 연구, 바이러스의 모든 클래스에 대한 생물학적 과정의 기본적인 이해를 목표로하는 다른 방법을 제공합니다.

제한된 친 화성을 가진 벡터 엔지니어링에 대해 광범위하게 적용 할 수있는 간단하고 효과적인 방법의 개발은 안전성, 생물학적 이해와 바이러스의 치료 유틸리티를 향상시키는 중요한 기회를 제공한다. 여러 가지 메커니즘은 transductional, 전사 및 번역 기반 기술을 포함하여 바이러스 친 화성을 대상으로 존재한다. 그러나 이러한 방법은 표적 세포에 결함 신호 전달 경로가 필요하거나 바이러스 게놈에 큰 코딩 서열의 삽입을 요구할 수있다, 모든 벡터 시스템에 일반적으로 적용되지 않습니다. 또한 이러한 방법은 크게 자신의 치료 활동을 방해하고 수정되지 않은 시스템에 대한 통찰력을 제한, 바이러스의 감쇠가 발생할 수 있습니다. 마이크로 RNA는 진핵 세포의 유전자 침묵을 매개 비 코딩 RNA를 작은 (22 ~ 25 뉴클레오티드)이다. (mRNA의) resulti 메신저 RNA를 보완 대상 시퀀스 (응답 요소)를 결합하여 마이크로 RNA 기능<html> 성적 증명서의 불안정, 저하 또는 번역 억압에서 NG. 마이크로 RNA는 일반적으로 부분적으로 상보성 응답 요소를 결합하여 유전자 발현을 1, 2, 3, 4, 5의 작은 변형을 얻었다. 유전자 발현의 더 중요한 변화는 반응 요소 (6)의 보완을 증가시킴으로써 달성 될 수있다. 성숙 마이크로 RNA 수천 세포 및 조직 유형 7, 8, 9의 다양한 종 많은 전시 차등 발현 양상의 다양한 확인되었다. 이러한 마이크로 RNA 서명은 바이러스 게놈 (10)에 완벽하게 상보 응답 요소를 도입하여 바이러스 증폭 셀 고유의 제한을 위해 이용 될 수있다= &quot;외부 참조&quot;&gt; 11, 12, 13. 이 마이크로 RNA-타겟팅 기술의 전체 목표는 추가적인 감쇠없이 벡터 게놈의 친 화성을 제어 할 수있다. 바이러스의 친 화성을 조정하기위한이 방법의 유용성은 원래 특정 조직 14, 15, 16에서 유전자 발현을 제한하는 렌티 바이러스 벡터의 입증되었다. 이 기술은 계속해서,도 17를 복제 정상 조직 10, 11, 12, 13, 원하지 않는 부작용을 제거하여 다수의 온 콜리 틱 바이러스의 안전성 프로파일을 개선 할뿐만 아니라 개선 된 유전자 치료를위한 바이러스 벡터 비 복제의 광대 한 배열에 적용된 . 또한, 안전하고 전자를 생성하기 위해 이용 된ffective 생균 백신과 바이러스 백신 제조는 18, 19, 20, 21를 처리 향상시킬 수있다. 제조자 시스템에서 야생형 성장 수준을 유지하면서, 마이크로 RNA-타겟팅 벡터 접종 호스트 또는 타겟 시스템의 감쇠를 허용 할 수있다. 마이크로 RNA-타겟팅도 다른 호스트 (22) 내의 전송을 유지하면서, 하나의 종 (예 : 인간)에 송신을 제한함으로써 연구 목적을위한 바이러스의 생물 안전성을 향상 시키는데 사용될 수있다. 최종적으로 심층 바이러스 성장 23, 24, 25, 26을 분리하는함으로써 바이러스 생활주기와 병원성 및 면역 세포 유형의 특정 역할을 분석 할 수 있도록 마이크로 RNA는 타겟팅. 이 기술은 고도을 제공합니다모든 바이러스 시스템에서 쉽게 구현 방법 및 적용 타겟팅 ernative. 또한, 특정 세포 유형에 차등 발현 패턴을 가진 성숙한 마이크로 RNA의 끊임없이 확장 컬렉션이 기술은 매우 다양한 있습니다. 마이크로 RNA-기반 타겟팅 시스템의 기능을 손상시키지 않으면 서 바이러스 시스템의 다양한 효능이 입증되었다. 이 기술의 주요 제한은 시행 착오 최적화, 탈출 돌연변이의 가능성, 그리고 내생 성적 증명서에 잠재적 인 오프 대상 효과를 포함한다. 그러나, 이러한 제한은 일반적으로 최적화 합리적인 반응 요소 디자인 극복 될 수있다. 포지티브 - 센스 RNA 바이러스는 그들의 게놈의 포지티브 - 센스 방향과 완전히 세포질 복제 사이클 동안 마이크로 RNA 기계에 사체의 가용성에 마이크로 RNA-타겟팅 특히 반응 경향이있다. 여기서 우리는 마이크로 RNA-대상으로 피 코르 나 바이러스과의 바이러스와 experim를 생성하기위한 프로토콜을 설명ental 방법은 시험관 타겟팅의 효율성과 특이성을 확인합니다.

<table><tbody><tr><td>RE encoding Oligonucleotides</td><td>IDT</td><td>PAGE-Purified Ultramer</td><td>Sequence Designed by Investigator</td></tr><tr><td>Oligonucleotides encoding unique restriction site</td><td>IDT</td><td>25nM</td><td>Sequence Designed by Investigator</td></tr><tr><td>Expand High Fidelity PCR Kit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11732641001</td><td>Many other High Fidelity Polymerase PCR kits available</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase System</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>MEGAscript Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM1333</td><td></td></tr><tr><td>MEGAclear Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM1908</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EDTA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM9260G</td><td>RNase-free</td></tr><tr><td>5 M NH&lt;sub&gt;4&lt;sub&gt; Acetate</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>N/A</td><td>Comes in MEGAclear Kit</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP2818100</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-free Water</td><td>Fisher Scientific</td><td>AM9938</td><td></td></tr><tr><td>TransIT-2020 Transfection Reagent</td><td>Mirus</td><td>MIR 5404</td><td></td></tr><tr><td>TransIT-mRNA Transfection Reagent</td><td>Mirus</td><td>MIR 2225</td><td></td></tr><tr><td>0.2 &amp;mu;m syringe filter</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>2 ml Screw-Cap Tubes</td><td>Sarstedt</td><td>72.694.005</td><td></td></tr><tr><td>Cell Scrapers</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-100-241</td><td></td></tr><tr><td>MicroRNA Mimics</td><td>Dharmacon</td><td>Varied</td><td></td></tr><tr><td>MTT Cell Proliferation Assay</td><td>ATCC</td><td>30-1010K</td><td></td></tr><tr><td>Subcloning Efficiency DH5&amp;alpha; Competent Cells</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18265017</td><td></td></tr><tr><td>pBlueScript II Vectors</td><td>Agilent Technologies</td><td>Variable (e.g. 212205)</td><td>There are different plasmids with T7 or T3 promoters and variable cloning sites to enable cloning and RNA transcription.</td></tr></tbody></table>

microrna-based regulation of picornavirus tropism

Cell-specific restriction of viral replication without concomitant attenuation can benefit vaccine development, gene therapy, oncolytic virotherapy, and understanding the biological properties of viruses. There are several mechanisms for regulating viral tropism, however they tend to be virus class specific and many result in virus attenuation. Additionally, many viruses, including picornaviruses, exhibit size constraints that do not allow for incorporation of large amounts of foreign genetic material required for some targeting methods. MicroRNAs are short, non-coding RNAs that regulate gene expression in eukaryotic cells by binding complementary target sequences in messenger RNAs, preventing their translation or accelerating their degradation. Different cells exhibit distinct microRNA signatures and many microRNAs serve as biomarkers. These differential expression patterns can be exploited for restricting gene expression in cells that express specific microRNAs while maintaining expression in cells that do not. In regards to regulating viral tropism, sequences complementary to specific microRNAs are incorporated into the viral genome, generally in the 3' non-coding regions, targeting them for destruction in the presence of the cognate microRNAs thus preventing viral gene expression and/or replication. MicroRNA-targeting is a technique that theoretically can be applied to all viral vectors without altering the potency of the virus in the absence of the corresponding microRNAs. Here we describe experimental methods associated with generating a microRNA-targeted picornavirus and evaluating the efficacy and specificity of that targeting in vitro. This protocol is designed for a rapidly replicating virus with a lytic replication cycle, however, modification of the time points analyzed and the specific virus titration readouts used will aid in the adaptation of this protocol to many different viruses.

표 1은 피 코르 나 바이러스과의 바이러스에 대한 적정 분석의 전형적인 결과를 나타내고, 50 % 조직 배양 감염 용량을 계산하는 방법을 설명한다. 이 논문에 기재된 바이러스 향성의 마이크로 RNA 기반 규제의 전반적인 개념의 개략도는 세포 내 작용 어닐링 플라스미드 삽입 반응 요소 올리고 뉴클레오티드의 적절한 설계 동안 반응 요소에도 1의 마이크로 RNA의 방향에 도시 한되고 시험 관내 전사를위한 마이크로 RNA 표적 바이러스 게놈을 코딩하는 플라스미드 DNA의지도 2.도 3은 아가로 오스 겔 전기 영동에 의해 가시화 무결성을 다양한 각도에서 RNA 전 사체를 도시도에 도시된다. 원격 교육 내에서 3A 레인 2에 잔류 불순물과 같이 적절한 처리 및 DNA의 사용은 적절하게 전사 RNA 전 사체 발생합니다 불순물이없는 템플릿음 공인 DNA 템플릿 또는 클레아 미량는 3A 레인에서 관찰 된 것과 유사한 부적절 전사 RNA 및 / 또는 분해물의 낮은 레벨을 초래할 수있다 (3) 등을 초래할 것이다 잔류 에탄올 등의 불순물의 많은 양을 함유하는 플라스미드 DNA 또는 DNA의 불완전한 선형화 3A 레인 4, 5도 3에 나타낸 부적절한 전사 및 저하 제품은 깨끗한 RNA 전 사체의 형질 다음 Mengovirus 매개 세포 변성 효과 (CPE)의 이미지를 보여줍니다. 변성 및 마이크로 RNA 타겟 Mengovirus의 성장 동역학을 평가 시간 코스 실험도 4 표시 나타내는 데이터. 결과는 Mengovirus 게놈으로 설계된 마이크로 RNA 반응 요소 동족 마이크로 RNA 중 하나를 발현하지 않는 H1-HeLa 세포에서 바이러스 복제의 동역학을 변화시키지 않는다는 것을 나타낸다. 그러나, 마이크로 RNA-125의 중간 수준 및 마이크로 RNA-14의 높은 수준을 표현 RAW 264.7 대 식세포에서해당 반응 요소를 코딩이 바이러스는 마이크로 RNA 발현의 수준과 상관 복제 억제 동력학을 표시. 그림 5의 데이터는 Mengovirus의 친 화성의 마이크로 RNA 기반 규제의 특이성을 보여줍니다. H1-HeLa 세포에 각 마이크로 RNA의 과발현은 특히 전파 (낮은 바이러스 역가) 및 동족 마이크로 RNA 반응 요소를 코딩 Mengovirus의 독성 (세포 생존 증가)을 억제한다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/55033/55033fig1.jpg" /> 그림 1 : 바이러스 친 화성의 마이크로 RNA 기반 규제의 도식 표현. 바이러스 게놈에 통합 마이크로 RNA 응답 요소 (RE)는 특정 세포 유형 내에서 농축 동족 마이크로 RNA에 의해 인식과 바이러스 성 성적 증명서 / 게놈의 대상이 저하 될 것입니다. 이 막을 바이러스 복제, 확산 및 독성 토륨하기E는 셀 주변. 그러나, 바이러스 복제 바이러스 전파, 확산 및 세포 사멸에 대한 허용 동족 마이크로 RNA를 발현하지 않는 세포에서 유지됩니다. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55033/55033fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/55033/55033fig2.jpg" /> 그림 2 : 마이크로 RNA 반응 요소 디자인. 성공적으로 완벽하게 보완되어야 RE의 씨앗 시퀀스 지역을 타겟팅 (A). 리는 그것이의 mRNA 전 사체 및 / 또는 바이러스 게놈의 동족 성숙 마이크로 RNA에 의해 인식 될 수있는 바이러스 성 게놈 내에 배향한다. RE들의 대부분은 성적 증명서의 3 &#39;UTR 내에 배치된다. (B)을 포함하는 탠덤 개의 RE를 코딩 적절하게 설계 및 어닐링 된 올리고 뉴클레오티드 묘사를 XhoI 제한 효소 부위의 돌출 뉴클레오타이드 어귀 마이크로 RNA 표적 서열 (miRT)를 반복한다. 탠덤 반복 입술을 설계 할 때, 각각의 마이크로 RNA-대상 복사본 사이에 스페이서 뉴클레오티드를 (일반적으로 4-6)를 포함해야합니다. (C) 플라스미드 DNA의 3 &#39;UTR하는 T7 프로모터에 통합 RE 및 시험 관내 전사를위한 선형화 독특한 제한 부위 전체 길이의 바이러스 게놈을 인코딩하는 단계를 포함한다. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55033/55033fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/55033/55033fig3.jpg" /> 그림 3 : 게놈 인코딩 RNA 전 사체에서 바이러스의 구조. 증명서의 무결성을 평가하는 피 코르 나 바이러스과의 바이러스 게놈을 코딩하는 시험 관내 전사 된 RNA는의 (A) RNA 겔 전기 영동. 레인<html> 1 : RNA 사다리. 레인 2 : 제대로 높은 무결성 RNA를 전사. 레인 3 : 중간 무결성 RNA 전 사체. 높은 밴드는 정확한 크기와 낮은 밴드 잠재적으로 분해 제품 또는 원하지 않는 RNA 전 사체입니다. 레인 4 : 잘못 RNA를 전사. 레인 5 : 낮은 무결성 RNA. 시험 관내 전사 RNA의 500 NG 잘 당로드했습니다. 부적절한 전사 또는 분해 제품으로 인해 낮은 순도 또는 불완전하게 선형화 된 DNA의 사용 가능성이있다. Mengovirus을 코딩하는 RNA 전 사체 형질 모의 형질 H1-HeLa 세포 및 셀 (B) 이미지. 형질 전환 시약 만 (모의)의 관리는 신선한 세포에 형질 전환뿐만 아니라 통로를 따라 세포 생존을 유지합니다. 신선한 H1-HeLa 세포에 뜨는 및 통로의 여과를 다음 유지하기 위해 관리되는 Mengovirus 게놈을 암호화 RNA 전 사체 (VMC 24) 세포 변성 효과 결과의 형질. 스케일 바 = 100 μm의.ce.jove.com/files/ftp_upload/55033/55033fig3large.jpg &quot;대상 =&quot;_ 빈 &quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/55033/55033fig4.jpg" /> 도 4 : 동족 마이크로 RNA의 존재 또는 부재하에 비 변형 및 마이크로 RNA 타겟 Mengoviruses 성장 동력학. 참조 (17)에서 수정. (A) H1-HeLa 세포는은 miR-124, -125, 또는 -142을 표현하지 않습니다. 세 Mengovirus 인코딩 마이크로 RNA 입술은 바이러스 복제를 변경하지 않는이 위치 (5 &#39;UTR)에서 마이크로 RNA의 삽입을 나타내는 수정되지 않은 바이러스와 유사한 반응 속도 (VMC 24)를 복제합니다. (B) RAW 264.7 대 식세포는은 miR-125B 미르-142-3p 높은 수준의 중간 수준을 표현하지만은 miR-124을 표현하지 않습니다. 바이러스 게놈 ATT의 결과에 대응하는 마이크로 RNA 표적 서열의 혼입마이크로 RNA 발현 수준과 일치 enuation. 데이터는 평균 바이러스 역가로 표시됩니다 +/- SD합니다. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55033/55033fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/55033/55033fig5.jpg" /> 그림 5 : 합성 마이크로 RNA의 모방을 사용하여 마이크로 RNA-대상 특이성의 분석. 참조 (17)에서 수정. 각각의 마이크로 RNA를 모방로 형질 H1-HeLa 세포 0.2의 MOI에서 수정되지 않은 바이러스 (VMC 24) 또는 마이크로 RNA-대상 바이러스 (miRT-VMC 24)에 감염되었다. (A)는 모의 - 처리 된 세포로 정규화 세포 생존율은 MTT 세포 증식 분석을 통해 24 시간 후 감염에서 측정 하였다. 모든 시료의 상층 액 (B)는 바이러스 역가가 24 시간의 감염 후에서 측정 하였다. 그만큼데이터는 평균 생존 또는 바이러스 역가 +/- SD로 표시됩니다. (동일하지 않은 분산을위한) 웰치의 보정 짝이 학생 t 테스트를 두 꼬리 통계 분석에 사용 하였다. 는 P 값 &lt;0.01는 상당한 여겨졌다. (** p &lt;0.01, *** p &lt;0.001). <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55033/55033fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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MicroRNA-based Regulation of Picornavirus Tropism

We describe here a method for regulating picornavirus tropism by incorporating sequences complementary to specific microRNAs into the viral genome. This protocol can be adapted to all different classes of viruses with modifications based upon the length and nature of their life cycle.

피 코르 나 바이러스과의 바이러스 친 화성의 마이크로 RNA-기반 규제

Cell-specific restriction of viral replication without concomitant attenuation can benefit vaccine development, gene therapy, oncolytic virotherapy, and ...

microrna-based-regulation-of-picornavirus-tropism

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

7.5K 조회수.  Mayo Clinic College of Medicine. We describe here a method for regulating picornavirus tropism by incorporating sequences complementary to specific microRNAs into the viral genome. This protocol can be adapted to all different classes of viruses with modifications based upon the length and nature of their life cycle. 

비디오: MicroRNA-based Regulation of Picornavirus Tropism

Reverse Genetics Mediated Recovery of Infectious Murine Norovirus

Human noroviruses are responsible for most cases of human gastroenteritis (GE) worldwide and are recurrent problem in environments where close person-to-person contact cannot be avoided 1, 2. During the last few years an increase in the incidence of outbreaks in hospitals has been reported, causing significant disruptions to their operational capacity as well as large economic losses. The identification of new antiviral approaches has been limited due to the inability of human noroviruses to complete a productive infection in cell culture 3. The recent isolation of a murine norovirus (MNV), closely related to human norovirus 4 but which can be propagated in cells 5 has opened new avenues for the investigation of these pathogens 6, 7. 
MNV replication results in the synthesis of new positive sense genomic and subgenomic RNA molecules, the latter of which corresponds to the last third of the viral genome (Figure 1). MNV contains four different open reading frames (ORFs), of which ORF1 occupies most of the genome and encodes seven non-structural proteins (NS1-7) released from a polyprotein precursor. ORF2 and ORF3 are contained within the subgenomic RNA region and encode the capsid proteins (VP1 and VP2, respectively) (Figure 1). Recently, we have identified that additional ORF4 overlapping ORF2 but in a different reading frame is functional and encodes for a mitochondrial localised virulence factor (VF1) 8.
Replication for positive sense RNA viruses, including noroviruses, takes place in the cytoplasm resulting in the synthesis of new uncapped RNA genomes. To promote viral translation, viruses exploit different strategies aimed at recruiting the cellular protein synthesis machinery 9-11. Interestingly, norovirus translation is driven by the multifunctional viral protein-primer VPg covalently linked to the 5' end of both genomic and subgenomic RNAs 12-14. This sophisticated mechanism of translation is likely to be a major factor in the limited efficiency of viral recovery by conventional reverse genetics approaches. 
Here we report two different strategies based on the generation of murine norovirus-1 (referred to as MNV herewith) transcripts capped at the 5' end. One of the methods involves both in vitro synthesis and capping of viral RNA, whereas the second approach entails the transcription of MNV cDNA in cells expressing T7 RNA polymerase. The availability of these reverse genetics systems for the study of MNV and a small animal model has provided an unprecedented ability to dissect the role of viral sequences in replication and pathogenesis 15-17.

Noroviruses are a major cause of gastroenteritis yet molecular techniques for their characterisation are still relatively new. Here we report two different reverse genetics approaches for the efficient recovery of murine norovirus (MNV), the only member of this genus which can be propagated in cell culture.

감염성 Murine 노로 바이러스의 역방향 유전학 중재 복구

Human noroviruses are responsible for most cases of human gastroenteritis (GE) worldwide and are recurrent problem in environments where close ...

연구

면역학 및 감염병학

Use of a Recombinant Mosquito Densovirus As a Gene Delivery Vector for the Functional Analysis of Genes in Mosquito Larvae

In vivo microinjection is the most commonly used gene transfer technique for analyzing the gene functions in individual mosquitoes. However, this method requires a more technically demanding operation and involves complicated procedures, especially when used in larvae due to their small size, relatively thin and fragile cuticle, and high mortality, which limit its application. In contrast, viral vectors for gene delivery have been developed to surmount extracellular and intracellular barriers. These systems have the advantages of easy manipulation, high gene transduction efficiency, long-term maintenance of gene expression, and the ability to produce persistent effects in vivo. Mosquito densoviruses (MDVs) are mosquito-specific, small single-stranded DNA viruses that can effectively deliver foreign nucleic acids into mosquito cells; however, the replacement or insertion of foreign genes to create recombinant viruses typically causes a loss of packaging and/or replication abilities, which is a barrier to the development of these viruses as delivery vectors.
Herein, we report using an artificial intronic small-RNA expression strategy to develop a non-defective recombinant Aedes aegypti densovirus (AaeDV) in vivo delivery system. Detailed procedures for the construction, packaging and quantitative analysis of the rAaeDV vectors, and for larval infection are described.
This study demonstrates, for the first time, the feasibility of developing a non-defective recombinant MDV micro RNA (miRNA) expression system, and thus providing a powerful tool for the functional analysis of genes in mosquito and establishing a basis for the application of viral paratransgenesis for controlling mosquito-borne diseases. We demonstrated that Aedes albopictus 1st instar larvae could be easily and effectively infected by introducing the virus into the water body of the larvae breeding site and that the developed rAaeDVs could be used to overexpress or knock down the expression of a specific target gene in larvae, providing a tool for the functional analysis of mosquito genes.

We report using an artificial intronic small RNA expression strategy to develop a non-defective recombinant Aedes aegypti densovirus (AaeDV) in vivo delivery system. A detailed procedure for the construction, packaging, and quantitative analysis of the rAaeDV vectors as well as for larval infection is described.

모기 유 충에서 유전자의 기능 분석에 대 한 유전자 납품 벡터로 재조합 모기 Densovirus의 사용

In vivo microinjection is the most commonly used gene transfer technique for analyzing the gene functions in individual mosquitoes. However, this method ...

발생학

Potato Virus X-Based microRNA Silencing (VbMS) In Potato.

Virus-based microRNA silencing (VbMS) is a rapid and efficient tool for functional characterization of microRNAs (miRNAs) in plants. The VbMS system has been developed and applied for various plant species including Nicotiana benthamiana, tomato, Arabidopsis, cotton, and monocot plants such as wheat and maize. Here, we describe a detailed protocol using PVX-based VbMS vectors to silence endogenous miRNAs in potato. To knock down the expression of a specific miRNA, target mimic (TM) molecules of miRNA of interest are designed, integrated into plant virus vectors, and expressed in potato by Agrobacterium infiltration to bind directly to the endogenous miRNA of interest and block its function.

Potato Virus X-Based microRNA Silencing VbMS In Potato.

We present a detailed protocol for potato virus X (PVX)-based microRNA silencing (VbMS) system to functionally characterize endogenous microRNAs (miRNAs) in potato. Target mimic (TM) molecules of miRNA of interest are integrated into the PVX vector and transiently expressed in potato to silence the target miRNA or miRNA family.

감자에서 감자 바이러스 X 기반 마이크로RNA 침묵 (VbMS)

Virus-based microRNA silencing (VbMS) is a rapid and efficient tool for functional characterization of microRNAs (miRNAs) in plants. The VbMS system has ...

환경과학

Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented, negative-sense, single-stranded, enveloped RNA virus (Figure 1) with potential applications as a vector for vaccination and treatment of human diseases. In-depth exploration of these applications has only become possible after the establishment of reverse genetics techniques to rescue recombinant viruses from plasmids encoding their complete genomes as cDNA2-5. Viral cDNA can be conveniently modified in vitro by using standard cloning procedures to alter the genotype of the virus and/or to include new transcriptional units. Rescue of such genetically modified viruses provides a valuable tool to understand factors affecting multiple stages of infection, as well as allows for the development and improvement of vectors for the expression and delivery of antigens for vaccination and therapy. Here we describe a protocol for the rescue of recombinant NDVs.

Newcastle disease virus (NDV) has been extensively studied in the last few years in order to develop new vectors for vaccination and therapy, among others. These studies have been possible due to techniques to rescue recombinant virus from cDNA, such as those we describe here.

의 cDNA에서 재조합 뉴캐슬 질병 바이러스의 구조

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of  the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented,  negative-sense, ...

Monitoring Activation of the Antiviral Pattern Recognition Receptors RIG-I And PKR By Limited Protease Digestion and Native PAGE

Host defenses to virus infection are dependent on a rapid detection by pattern recognition receptors (PRRs) of the innate immune system. In the cytoplasm, the PRRs RIG-I and PKR bind to specific viral RNA ligands. This first mediates conformational switching and oligomerization, and then enables activation of an antiviral interferon response. While methods to measure antiviral host gene expression are well established, methods to directly monitor the activation states of RIG-I and PKR are only partially and less well established.
Here, we describe two methods to monitor RIG-I and PKR stimulation upon infection with an established interferon inducer, the Rift Valley fever virus mutant clone 13 (Cl 13). Limited trypsin digestion allows to analyze alterations in protease sensitivity, indicating conformational changes of the PRRs. Trypsin digestion of lysates from mock infected cells results in a rapid degradation of RIG-I and PKR, whereas Cl 13 infection leads to the emergence of a protease-resistant RIG-I fragment. Also PKR shows a virus-induced partial resistance to trypsin digestion, which coincides with its hallmark phosphorylation at Thr 446. The formation of RIG-I and PKR oligomers was validated by native polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). Upon infection, there is a strong accumulation of RIG-I and PKR oligomeric complexes, whereas these proteins remained as monomers in mock infected samples.
Limited protease digestion and native PAGE, both coupled to western blot analysis, allow a sensitive and direct measurement of two diverse steps of RIG-I and PKR activation. These techniques are relatively easy and quick to perform and do not require expensive equipment.

Innate defenses to virus infections are triggered by pattern recognition receptors (PRRs). The two cytoplasmic PRRs RIG-I and PKR bind to viral signature RNAs, change conformation, oligomerize, and activate antiviral signaling. Methods are described which allow to conveniently monitor the conformational switching and the oligomerization of these cytoplasmic PRRs.

항 바이러스 패턴 인식 수용체 RIG-I와 PKR에 의해 제한 프로테아제 소화 및 기본 페이지의 모니터링 활성화

Host defenses to virus infection are dependent on a rapid detection by pattern recognition receptors (PRRs) of the innate immune system. In the cytoplasm, ...

A Reporter Assay to Analyze Intronic microRNA Maturation in Mammalian Cells

MicroRNAs (miRNAs) are short RNA molecules that are widespread in eukaryotes. Most miRNAs are transcribed from introns, and their maturation involves different RNA-binding proteins in the nucleus. Mature miRNAs frequently mediate gene silencing, and this has become an important tool for comprehending post-transcriptional events. Besides that, it can be explored as a promising methodology for gene therapies. However, there is currently a lack of direct methods for assessing miRNA expression in mammalian cell cultures. Here, we describe an efficient and simple method that aids in determining miRNA biogenesis and maturation through confirmation of its interaction with target sequences. Also, this system allows the separation of exogenous miRNA maturation from its endogenous activity using a doxycycline-inducible promoter capable of controlling primary miRNA (pri-miRNA) transcription with high efficiency and low cost. This tool also allows modulation with RNA-binding proteins in a separate plasmid. In addition to its use with a variety of different miRNAs and their respective targets, it can be adapted to different cell lines, provided these are amenable to transfection.

We developed an intronic microRNA biogenesis reporter assay to be used in cells in vitro with four plasmids: one with intronic miRNA, one with the target, one to overexpress a regulatory protein, and one for Renilla luciferase. The miRNA was processed and could control luciferase expression by binding to the target sequence.

포유류 세포에서 인트로닉 마이크로RNA 성숙을 분석하기 위한 리포터 분석

MicroRNAs (miRNAs) are short RNA molecules that are widespread in eukaryotes. Most miRNAs are transcribed from introns, and their maturation involves ...

암 연구학

Genome-wide Screen for miRNA Targets Using the MISSION Target ID Library

The Target ID Library is designed to assist in discovery and identification of microRNA (miRNA) targets. The Target ID Library is a plasmid-based, genome-wide cDNA library cloned into the 3'UTR downstream from the dual-selection fusion protein, thymidine kinase-zeocin (TKzeo). The first round of selection is for stable transformants, followed with introduction of a miRNA of interest, and finally, selecting for cDNAs containing the miRNA's target. Selected cDNAs are identified by sequencing (see Figure 1-3 for Target ID Library Workflow and details).
To ensure broad coverage of the human transcriptome, Target ID Library cDNAs were generated via oligo-dT priming using a pool of total RNA prepared from multiple human tissues and cell lines. Resulting cDNA range from 0.5 to 4 kb, with an average size of 1.2 kb, and were cloned into the p3&#900;TKzeo dual-selection plasmid (see Figure 4 for plasmid map). The gene targets represented in the library can be found on the Sigma-Aldrich webpage. Results from Illumina sequencing (Table 3), show that the library includes 16,922 of the 21,518 unique genes in UCSC RefGene (79%), or 14,000 genes with 10 or more reads (66%).

The Target ID Library is a plasmid-based, genome-wide collection of cloned cDNA used to identify miRNA targets. Here we demonstrate its use and application.

선교 대상 아이디 라이브러리를 사용하여 miRNA 목표를위한 게놈 - 와이드 스크린

The Target ID Library is designed to assist in discovery and identification of microRNA (miRNA) targets. The Target ID Library is a plasmid-based, ...

생물학

Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3'UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and play a role in many biological processes. More than 700 human miRNAs have been identified so far with each having up to hundreds of unique target mRNAs. Computational tools, expression and proteomics assays, and chromatin-immunoprecipitation-based techniques provide important clues for identifying mRNAs that are direct targets of a particular miRNA. In addition, 3'UTR-reporter assays have become an important component of thorough miRNA target studies because they provide functional evidence for and quantitate the effects of specific miRNA-3'UTR interactions in a cell-based system. To enable more researchers to leverage 3'UTR-reporter assays and to support the scale-up of such assays to high-throughput levels, we have created a genome-wide collection of human 3'UTR luciferase reporters in the highly-optimized LightSwitch Luciferase Assay System. The system also includes synthetic miRNA target reporter constructs for use as positive controls, various endogenous 3'UTR reporter constructs, and a series of standardized experimental protocols.
Here we describe a method for co-transfection of individual 3'UTR-reporter constructs along with a miRNA mimic that is efficient, reproducible, and amenable to high-throughput analysis.

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and have been shown to play a role in numerous biological processes. To better understand miRNA-UTR interactions, we have created a genome-wide collection of 3 UTR luciferase reporters paired with a novel luciferase gene and assay reagent, the LightSwitch system.

3&#39;UTR - 기자의 구성과 microRNA를 사용하여 LightSwitch의 루시페라제 분석 시스템과 인간 microRNAs의 확인 대상이 자기편 세포의 모방

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and play a role in many biological processes.  More than 700 human miRNAs have been ...

Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. However, these screens are typically conducted in cells that are naturally permissive to the viral pathogen under study. Therefore, the robust replication of viruses in control conditions may limit the dynamic range of these screens. Furthermore, these screens may be unable to easily identify cellular defense pathways that restrict virus replication if the virus is well-adapted to the host and capable of countering antiviral defenses. In this article, we describe a new paradigm for exploring virus-host interactions through the use of screens that center on naturally abortive infections by arboviruses such as vesicular stomatitis virus (VSV). Despite the ability of VSV to replicate in a wide range of dipteran insect and mammalian hosts, VSV undergoes a post-entry, abortive infection in a variety of cell lines derived from lepidopteran insects, such as the gypsy moth (Lymantria dispar). However, these abortive VSV infections can be &#34;rescued&#34; when host cell antiviral defenses are compromised. We describe how VSV strains encoding convenient reporter genes and restrictive L. dispar cell lines can be paired to set-up screens to identify host factors involved in arbovirus restriction. Furthermore, we also show the utility of these screening tools in the identification of virally encoded factors that rescue VSV replication during coinfection or through ectopic expression, including those encoded by mammalian viruses. The natural restriction of VSV replication in L. dispar cells provides a high signal-to-noise ratio when screening for the conditions that promote VSV rescue, thus enabling the use of simplistic luminescence- and fluorescence-based assays to monitor the changes in VSV replication. These methodologies are valuable for understanding the interplay between host antiviral responses and viral immune evasion factors.

Here, we present the protocols to identify 1) virus-encoded immunomodulators that promote arbovirus replication and 2) eukaryotic host factors that restrict arbovirus replication. These fluorescence- and luminescence-based methods allow researchers to rapidly obtain quantitative readouts of arbovirus replication in simplistic assays with low signal-to-noise ratios.

Arbovirus 감염 바이러스 Immunomodulators 및 호스트 항 바이러스 요인의 식별을 위한 도구를 심사로

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. ...

Confocal Imaging of Double-Stranded RNA and Pattern Recognition Receptors in Negative-Sense RNA Virus Infection

Double-stranded (ds) RNA is produced as a replicative intermediate during RNA virus infection. Recognition of dsRNA by host pattern recognition receptors (PRRs) such as the retinoic acid (RIG-I) like receptors (RLRs) RIG-I and melanoma differentiation-associated protein 5 (MDA-5) leads to the induction of the innate immune response. The formation and intracellular distribution of dsRNA in positive-sense RNA virus infection has been well characterized by microscopy. Many negative-sense RNA viruses, including some arenaviruses, trigger the innate immune response during infection. However, negative-sense RNA viruses were thought to produce low levels of dsRNA, which hinders the imaging study of PRR recognition of viral dsRNA. Additionally, infection experiments with highly pathogenic arenaviruses must be performed in high containment biosafety level facilities (BSL-4). The interaction between viral RNA and PRRs for highly pathogenic RNA virus is largely unknown due to the additional technical challenges that researchers need to face in the BSL-4 facilities. Recently, a monoclonal antibody (Mab) (clone 9D5) originally used for pan-enterovirus detection has been found to specifically detect dsRNA with a higher sensitivity than the traditional J2 or K1 anti-dsRNA antibodies. Herein, by utilizing the 9D5 antibody, we describe a confocal microscopy protocol that has been used successfully to visualize dsRNA, viral protein and PRR simultaneously in individual cells infected by arenavirus. The protocol is also suitable for imaging studies of dsRNA and PRR distribution in pathogenic arenavirus infected cells in BSL4 facilities.

Double-stranded RNA produced during RNA virus replication can be recognized by pattern recognition receptors to induce an innate immune response. For negative-sense RNA viruses, the interaction between the low-level dsRNA and PRRs remains unclear. We have developed a confocal microscopy method to visualize arenavirus dsRNA and PRR in individual cells.

이중 가닥 RNA와 패턴 인식 수용 체 부정적인 감 RNA 바이러스 감염에의 confocal 영상

Double-stranded (ds) RNA is produced as a replicative intermediate during RNA virus infection. Recognition of dsRNA by host pattern recognition receptors ...