Name: high-fat feeding paradigm for larval zebrafish: feeding, live imaging, and quantification of food intake
Uploaded: 2016-10-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 30 s
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The authors thank Meng-Chieh Shen for images, Jennifer Anderson for providing helpful comments on the manuscript, and members of the Farber laboratory for their contributions in developing these techniques. This study was funded by NIDDK-NIH award RO1DK093399 (S.A.F.), RO1GM63904 (The Zebrafish Functional Genomics Consortium: PI Stephen Ekker and Co-PI S.A.F), and F32DK096786 (J.P.O.). This content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of NIH. Additional support was provided by the G. Harold and Leila Y. Mathers Charitable Foundation to the laboratory of S.A.F and the Carnegie Institution for Science endowment.

이 프로토콜은 과학 기관 동물 관리 및 사용위원회 카네기 연구소 (프로토콜 없음. 139)에 의해 승인되었습니다. 1. 동물 준비 <ol><li> 14 시간에 28 ° C에서 성인과 애벌레 유지 : 10 시간 빛 : 어두운주기를. 쉘 무료 아테 미아 (디 캡슐 레이트, 비 부화, 14 DPF에서 시작) 및 상업 micropellets으로 하루에 두 번 성인 피드. </li><li> 이 프로토콜은 AB 배경의 자연 산란에 의해 수집 6-7 DPF 유충의 사용에 최적화되어 있습니다. 프로토콜은 다른 연령대와 배경의 유충에 대한 수정 될 수 있습니다. 외래 음식을 이전 6 DPF를 제공하지 않습니다. </li><li> 배아 매체 Tricaine (EM)와 유충 실온 (RT) (4 mg을 100 ㎖의 EM 당 / ㎖ Tricaine 4.2 ㎖) 마취. </li></ol> 지질이 풍부한 달걀 노른자 피드 2. 준비 <ol><li> 준비하고 닭고기 달걀 노른자를 저장합니다. 12 닭고기 달걀의 노른자와 흰색을 구분합니다. , 나누어지는 1 ml의 1.5에 노른자를 풀1 년에 -80 ° C 최대의 ML의 튜브, 저장 (12 노른자는 ~ 80 분취를 만들 것입니다). 백인, 저장 수영장, 지질 가난한, 단백질이 풍부한 사료로 사용합니다. </li><li> 원한다면 준비 형광 리피드 유사체 (들) 난황 사료에 첨가한다. <ol><li> 제조업체의 지침에 따라, 불투명 유리 튜브에 나누어지는 (다음 참고 용매를 논의 참조) / μL 0.1 μg의 100 % 에탄올 또는 100 % 클로로포름 구입, 분말 형광 지질 아날로그를 일시 중단 파라 필름으로 밀봉, 저장. 때문에 유기 용매의 빠른 증발에 장기 저장을 위해 ~ 400 μL 이하 분취 볼륨을 사용하지 않는다. 주 : 지질 아날로그 에탄올에 현탁하는 경우는, 클로로포름보다 N 2하에 빠르게 건조되므로 지질 아날로그 다량 사용한다. 지질 아날로그 에탄올에 현탁 경우 단계 2.2.4에서 리포솜 피드에 추가하기 전에 건조시키고, 재현 탁 될 수 없지만, 전체 에탄올 농도는 0을 초과하지 않아야한다.리포좀 피드의 1 % 에탄올 잠재적으로 혼란 생리 학적 효과를 방지 할 수 있습니다. </li><li> 형광 지방산 유사체의 경우 : EM 20 mL의 5 % 난황 에멀젼의 총 부피를 준비한다. 그 라이브 공 초점 이미지 및 음식 섭취 분석 또는 1 μg의 / ㎖ 6.4 μM 4,4- 디 플루오로 -4- 보라 -3a, 4a- 디아 자 - S - 인다 센의 최종 농도 (BODIPY C 16)와 5 ml의 분취 량을 준비 입체 영상에 대한 BODIPY C (12). 1.5 ml의 플라스틱 튜브로 형광 지질 아날로그 원하는 금액을 전송. 튜브에서 지질을 날려 않도록주의하면서, N 2의 스트림에서 지질을 건조. </li><li> 즉시, 상기 튜브의 양쪽 다운 스트림을 피펫 5 μL의 100 % 에탄올에 재현 탁을 95 μL의 EM을 추가하고, 잘 혼합한다. 참고 : 혼합물이 균질 나타납니다; 컬러 지질 튜브의 측면에 유지되거나 액체가 덩어리 진 나타나면 지질 완전히 용해 에탄올 등을 필요로하지 않았다. 이리저리 튜브를 보호얼음 m 빛과 상점. </li><li> 형광 콜레스테롤 아날로그의 경우 : 라이브 영상 연구를위한 5 ml의 0.5 % 달걀 노른자 에멀젼 2.4 μg의 / ㎖ 콜레스테롤의 최종 농도를 준비합니다. 1.5 ml의 플라스틱 튜브로 콜레스테롤의 정량을 전송. 튜브에서 지질을 날려 않도록주의하면서, N 2의 스트림에서 지질을 건조. </li><li> 즉시, 상기 튜브의 양쪽 다운 스트림을 피펫 정제 H 2 O. RT에서 1 %의 지방산이없는 BSA 85 μL와 혼합하여 RT 100 % 에탄올 15 μL에 재현 탁 빛으로부터 튜브를 보호하고 얼음에 저장합니다. </li></ol></li><li> 계란 노른자 리포좀 피드를 준비합니다. <ol><li> 50 ML 원뿔 튜브에 EM에 달걀 노른자의 해동 나누어지는을 추가합니다. 1-2 분 동안 희석 된 난황 혼합물을 와동; 혼합물이 균질 한 에멀젼으로 나타납니다. </li><li> 새로운, 신선한 50 ML 원뿔 튜브에 단백질 대기업을 제거하고 수집하는 좋은 메쉬 스트레이너를 통해 혼합물을 붓고. </li><li> 펄스 SONICA리포좀을 만들 RT에서 :; 한 네 번째 인치 테이퍼 마이크로 팁과 (6 W 출력 강도 각 세트 사이에 5 ~ 10 초 일시 중지 5 회 (5 × 1 초, 1 초 오프)) 계란 혼합물을 테. 초음파기 전원 설정 종속 기기이며, 따라서 각각의 악기와 마이크로 팁에 대한 최적화를 필요로한다. 주 : 계속 사용할 때까지 동질성을 유지하기 위해 RT에서 리포좀 혼합물을 흔들어. </li></ol></li><li> 원하는 경우, 달걀 노른자 리포좀에 형광 지질 아날로그를 추가합니다. 즉시 초음파 처리 한 후, 리포솜에 통합 30 초 동안 고속으로 리포솜 혼합물 소용돌이로 제조 된 지질 피펫. 호일에 튜브를 배치하여 빛의 혼합물을 보호하고 실온에서 락을 계속합니다. </li></ol> 3. 수유 패러다임 <ol><li> 먹이의 애벌레를 준비합니다. <ol><li> 공급을 방해 할 수 명백한 형태 학적 결함에 대한 공급, 화면 애벌레를 시작하기 전에. 60mm X 15mm 페트리 접시 또는 6 또는 12도 괞 찮아로 전송 애벌레TES, EM 최소로 감소시키고, 제조 된 리포좀 용액 5 ㎖로 교체한다. </li><li> 필요한 경우, EM 5 ML의 EM 및 / 또는 5 ml의 5 % 달걀 흰색에 unfed 제어 유충을 전송하고 병렬로 처리합니다. </li></ol></li><li> 부드럽게 형광 지질 유사체가있는 경우 빛으로부터 보호하기 위해 계속하는 동안 음식 섭취를 장려하기 위해 공급 전반에 걸쳐 배양 로커의 유충 (30 rpm에서 29 ~ 31 °의 C를) 바위. 애벌레 필요가 빛에 노출 될 경우, 착색 유리 인큐베이터 덮개 노출을 최소화 할 수 있습니다. </li><li> 공급 기간의 끝에서, EM 3 회 자유롭게 수영 유충을 헹군다. 참고 : 애벌레 피드 동안 어느 시점에서 리포좀을 소비 시작할 수 있습니다. 이 유충이 동시에 공급하기 시작하는 것이 중요한 경우, 음식 섭취에 대한 화면 급전 1 시간 후 (3.4 참조) 공급을 완료 난황 에멀젼 공급을 개시 한 경우에만 애벌레를 반환한다. </li><li> 소수로 음식 섭취량이 시점에서 유충 화면 EA 않을 수도t (일반적 ~ 0~5%). 그들이 공급 한 경우 결정하기 위해 얼음에 금속 블록에 마취 또는 약간 냉각 된 유충의 장을 검사 : 리포좀을 섭취 한 유충은 어두운 소장 (그림 1)을해야합니다. </li><li> 바로 음식 섭취에 대한 이미지 또는 공정 애벌레. 또는, 장소 신선한 EM의 유충 및 28 ° C에서 부화 대사 처리가 발생 할 수 있습니다. </li></ol> 라이브 영상에 대한 유충을 설치 (4) <ol><li> 장착 미디어를 준비합니다. <ol><li> 3 % 메틸 셀룰로오스의 경우 : -20 ° C에서 년 동안 근처 끓는 EM, 소용돌이, 4 ° C에서 2~3일 완전히 용해 될 때까지 실온에서 바위, 저장 25 ml의 0.75 g의 메틸 셀룰로오스를 추가합니다. 4 ° C에서 동결 융해의 반복주기는 공기 방울을 제거합니다. 애벌레를 설치하는 동안 얼음에 3 % 메틸 셀룰로오스를 저장합니다. </li><li> 1.2 % 낮은 마운트 아가로 오스의 경우 : 0.3 g 추가 25 ㎖ EM에 아가로 오스 낮은 용융 및 2 ML의 t에 종기, 나누어지는로 가져 와서 용해ubes, 그리고 열 블록에 26 ~ 28 ℃로 유지한다. 미사용 분취 량을 RT에서 저장 또는 -20 ° C 및 사용시에 다시 비등 될 수있다. 아가로 오스는 유충에 노출하거나 가열을 통해-수 있습니다 전에 처리 할 수있을만큼 멋진 있는지 확인합니다. </li></ol></li><li> 낮은 배율, 중간 처리량 라이브 영상의 경우, 얼음에 금속 블록에 조직에 유리 슬라이드를 배치하고 슬라이드가 식을 때까지 기다립니다. 에 붙어 낚시 줄 포커를 사용하여 3 % 메틸 셀룰로오스에 유충을 전송, 슬라이드에 (얼음에 4 ° C로 유지 된) 3 % 메틸 셀룰로오스의 충분한 양을 적용 (0.41 mm 직경의 낚시 줄 유리 모세관의 끝)이 메틸 셀룰로오스 희석되지 않는다 (따라서 과잉 EM 드레인) 및 원하는대로 유충 위치로 약속하다를 생성한다. </li><li> 단기 (&lt;20 분)의 경우, 수직 오일 에멀젼의 목적으로 고배율 라이브 영상은, 방법 희박로 커버 슬립과 애벌레를 탑재합니다. <ol><li> 에 시아 노 아크릴 레이트 기반의 접착제 (순간 접착제)를 사용하여유리 슬라이드의 일단에 AA 22mm X 30mm의 coverslip에 연결합니다. 커버 슬립에 인접한 슬라이드에 3 % 메틸 셀룰로오스의 세선을 넣어 전체 보어 파스퇴르 피펫으로 슬라이드에 유충을 전송 포커를 사용한다. 는 메틸 셀룰로오스를 희석되지 않도록 초과 EM을 제거합니다. </li><li> 포커를 사용하여 부드럽게 커버 슬립 옆에 그들의 머리와 함께 (오른쪽 이미지에 담낭을 측면이 위로 간 더 많은 이미지 왼쪽) 자신의 양쪽에있는 메틸 셀룰로오스에 애벌레를 놓습니다. </li><li> 부드럽게 두 번째 커버 슬립의 코너에서 스팟 순간 접착제는 애벌레를 브리징, 장착 된 커버 슬립에 커버 슬립 및 슬라이드의 다른 한쪽 끝을 배치합니다. 이 단계 동안이나 그 유충이 손상되지 않은 상태로 유지하면서 이미지 있도록 목적으로 과잉 압력을 적용하지 않도록 조심해서. </li></ol></li><li> 장기의 경우, 수직 침지 목적으로 고배율 영상은, 아가로 오스에 애벌레를 탑재합니다. 아가로 오스 다음 전송 1.2 % 낮은 용융의 작은 나누어지는에 유충을 추가배양 접시에 아가로 오스의 작은 볼륨에서 애벌레. <ol><li> 빨리 아가로 오스 응고 전에 포커와 애벌레를 놓습니다. 아가로 오스는 2 ~ 3 분 동안 건조 건조되는 것을 방지하기 위해 신선한 EM 완벽 아가로 오스를 포함 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 장기의 경우, 역 목적으로 고배율 영상은, 아가로 오스의 유리 바닥 접시에 애벌레를 탑재합니다. <ol><li> 얼음에 금속 블록 쿨. 과도한 냉각 및 유충의 동결을 방지하기 위해 조직에 의해 분리 된 금속 블록에 접시를 놓습니다. 접시에 애벌레를 전송하고 티슈로 위킹하여 EM을 제거합니다. </li><li> 유충의 상단에 28 ° C 낮은 용융 아가로 오스 (1.2 %)의 하락을 놓고 즉시 포커 (아래 최상의 이미지에 왼쪽 간, 아래로 담낭 이미지 오른쪽)에 위치. 추위 블록에서 요리를 제거 2 ~ 3 분 동안 건조 할 수 있도록하고, 아가 로스를 커버하는 신선한 EM의 충분한 볼륨을 추가 (~ 2-5 ㎖). </li></ol></li></ol> 5. 식품 섭취시험 <ol><li> 6.4 μM BODIPY C 16 함유 난황 리포솜 공급의 마지막에, 플라스틱이 1.5 ㎖의 튜브 10 세정 유충 최소 EM 풀을 제거하고 동결 스냅. 샘플을 몇 달 동안 빛으로부터 보호 -80 ° C에서 저장 될 수있다. 참고 : 가능하면 여러 복제를 수집합니다. (사용되는 동일한 클러치에서 이상적으로 유충) 배경 지질 형광에 대한 정상화를이 단계에서 unfed 애벌레를 수집하는 것이 중요하다. </li><li> 수정 후 Bligh-다이어 지질 추출 3,21을 수행합니다. <ol><li> 얼음 샘플 (2 O를 사용할 수 있습니다 대안 정제 H) 100 ㎕를 균질화 버퍼 (20 mM 트리스 - CL, 1 mM의 EDTA)를 추가합니다. (1 초 오프 1 초 5 초 총)는 마이크로 팁의 초음파기와 얼음에 균질화. 그 애벌레 완전히 균질화를 확인; 하지 않을 경우, 반복합니다. 13 ml의 일회용 유리 배양 관에 전송 (다른 유리관이 사용될 수있다). 참고 : 클로로포름은 위험합니다; 이후의 모든 지질 전을 수행화학 후드에서 실온에서 견인 단계. </li><li> (: 메탄올 클로로포름) 2 : 사용 균질화 버퍼의 각 100 μL, 1의 375 μl를 추가합니다. 소용돌이 30 ~ 60 초, 사용 100 ㎕를 균질화 버퍼 당 클로로포름, 소용돌이 30 초 125 μl를 추가, 10 분을 품어. </li><li> 200 mM 트리스 산도의 125 μl를 추가 7.5 사용 100 ㎕를 균질화 버퍼 (빛으로부터 보호 2,000 X g, 5 분, RT) 소용돌이 30 초, 원심 분리기 당. 조심스럽게 원심 분리기에서 샘플을 제거합니다. 상부상은 수성이다 유생 파편의 인터페이스 및 하부 유기상 (지질을 포함)은 이들 두 개의 단계로 구분된다. </li><li> 깨끗한 유리 피펫 하단 유기상을 수집하고 깨끗한 13 mL 유리 튜브로 옮긴다. 주 : 계면의 성상 및 유생 파편을 피하기 위해주의; 오염이 발생하는 경우, 원심 분리 단계 및 배열 회수 반복한다. 상단, 수성 상을 폐기; 그것을 제거하고이를 폐기하는 것이 도움이 될 수 있습니다유기상을 수집하기 전에 단계. 샘플 1 개월까지 -80 ℃에서 저장 될 수있다. </li><li> 빛으로부터 보호하면서 진공 유기상 (0.12 기압)을 건조. 이 지질 용해도가 감소하므로 액체가 증발 후 샘플을 건조 계속하지 마십시오. 2의 지질을 재현 탁 : 얼음에 저장 : 1 (메탄올 클로로포름). 클로로포름의 최적 량 : 메탄올 용액을 사용하는 측정 방법에 따라, 낮은 시작하고 필요에 따라 희석을 계속합니다. 일반적인 지침은 10 풀링 유충 10 μl를 사용하는 것입니다. </li></ol></li><li> 채널 화 TLC 판에 균등 간격으로 전체 샘플 볼륨을 파악하고 정기적으로 생체 분자 영상 (예를 들어, 형광 플레이트 리더)에 사용되는 레이저 스캐너와 함께 접시를 검사합니다. 510-665 nm 내지 500-650 nm의 최대 발광의 여기 최대 값을 가진 물질의 목록에 포함 된 형광 리피드 유사체를 들어, 520 nm의 발광 회수를 가진 488 nm의 레이저를 사용하여. <ol><li> 이미징 소프트웨어 각 스폿의 총 형광 정량화. 참고 : 자연스럽게 쌍, unfed 애벌레 샘플의 형광을 뺀 배경 지질 형광을 발생에 대한 올바른. </li></ol></li></ol>

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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+vertebrate+digestive+function+and+lipid+metabolism.">Imaging vertebrate digestive function and lipid metabolism.</a> Drug Discov Today Dis Models. 10 (1), (2013).</li><li>Andre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+fatty+acid+binding+protein+gene+expression+reveals+the+cephalocaudal+patterning+during+zebrafish+gut+morphogenesis.">Intestinal fatty acid binding protein gene expression reveals the cephalocaudal patterning during zebrafish gut morphogenesis.</a> Int J Dev Biol. 44 (2), 249-252 (2000).</li><li>Shimada, Y., Hirano, M., Nishimura, Y., Tanaka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+fluorescence-based+assay+system+for+appetite-regulating+gene+and+drug+screening.">A high-throughput fluorescence-based assay system for appetite-regulating gene and drug screening.</a> PLoS One. 7 (12), 52549 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

여기에 설명 된 기술은 연구자, 지질이 풍부한 피드 유생 제브라 치료 라이브 유충식이 지질을 시각화 처리 한 애벌레 음식 섭취를 정량화 할 수있다. 성공을 보장하기 위해 특별한주의는 몇 가지 중요한 단계에 주어져야한다. 상업 닭고기 달걀 변화; 잠재적 인 변동성을 최소화하기 위해 우리는 오메가 -3 지방산에 대한 풍부한되지 않은 케이지가없는 닭에서 유기농 계란에 대한 모든 분석을 수?...

소장식이 지질 처리를 규제하는 메커니즘은 간 복합 지질 단백 합성 및 대사 조절, 이들 기관은 음식 섭취를 조절하는 중추 신경계 작동 방법 불완전하게 이해된다. 또한 비만, 심혈관 질환, 당뇨, 비 알코올성 지방간 질환의 현재 유행의 빛이 생물 해명 생의학 관심사이다. 세포 배양에서 연구와 마우스는식이 지질과 질병, 그리고 제브라 피쉬 (다니오 레 리오) 사이의 역학적 관계에 대한 우리의 이해의 대부분을 제공 한이 작품을 보완하는 이상적인 모델로 부상하고있다. 제브라 피쉬는 높은 척추 동물 1, 2와 유사한 위장관 (GI) 기관, 지질 대사 및 지질 단백질 수송을 신속하게 개발 및 유전자 다루기 쉬운입니다. 애벌레 제브라 피쉬의 광학 선명도가 생체 내 연구에 용이하게하는 particula그 외 환경로 GI 시스템의 연구 연구의 장점 (즉, 담즙, 미생물은 내분비 시그널링)은 생체가. 따라서, 유전자 취급 용이성 및 conduciveness 조합 연구의 본체와 제브라 애벌레의 촬상 라이브 모델 사실상 불가능 식이 조작 (고지방 3,4, - 콜레스테롤 5, -carbohydrate 다이어트 6,7), 심혈관 질환 (8) 모델의 다양한 당뇨 9, 10, 간 지방증 11-13, 비만 14-16, 신진 대사 통찰력의 호스트를 제공하기 위해 등장하고있다. 대사 연구로 유생 전환 지브라 피쉬의 중요한 양태는 제브라 피쉬와의 고유의 장점을 활용할 새로운 분석법의 개발에 다른 모델 동물 개발 기술의 최적화이다. 이 프로토콜은 기술이 LIPI 애벌레 제브라 피쉬를 공급하기 위해 개발 및 최적화 제공D가 풍부한 식사, 세포 내 해상도로 몸 전체에서식이 지질 처리를 시각화하고, 음식 섭취를 측정한다. 그것은 지방과 콜레스테롤 (지질이 ~ 닭 계란, 60 %가 중성 지방은 콜레스테롤입니다 ~ 5 %가되는 노른자, 35 %의 58 %는 인지질이 구성의 높은 수준을 포함로 닭고기 달걀 노른자는 지방이 풍부한 식사를 구성하기 위해 선택되었다 ). 제브라 피쉬 사료 및 먹이 연대는 랩 17에서 표준화되지 않은으로 닭고기 달걀 노른자는 전형적인 상업 제브라 피쉬 micropellet 식품 (~ 15 %의 지질)과 특정 지방산 종의 알려진 비율과 표준화 공급되는 장점보다 더 많은 지방을 제공합니다. 또한, 달걀 노른자에서 제공하는 형광 지질 유사체는 박층 크로마토 그래피를 통해 신진 대사를 조사, 운송 및식이 지질 (18)의 축적과 같은 중요한 염료 3 복잡한 지질에 공유 결합을 통해 모두 작용하여 지질 방울 포함 이미지 세포 성분을 시각화 (TLC) (19) </sup&gt; 및 고성능 액체 크로마토 그래피 (HPLC) (SAF 미발표 데이타), 총 음식 섭취 20 정량적 분석을 제공한다.

<table><tbody><tr><td>Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulofnate salt)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040-25G</td><td>Anesthesia for larval zebrafish</td></tr><tr><td>Chicken eggs</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Organic, cage-free eggs, not enriched for omege-3 fatty acids</td></tr><tr><td>Ultrasonic processor 3000 sonicator</td><td>Misonix, Inc.</td><td>S-3000</td><td>To make egg yolk liposomes</td></tr><tr><td>Sonabox acoustic enclosure</td><td>Misonix, Inc.</td><td>432B</td><td>To make egg yolk liposomes</td></tr><tr><td>1/8&amp;rdquo; tapered microtip</td><td>Misonix, Inc.</td><td>419</td><td>To make egg yolk liposomes</td></tr><tr><td>Amber vials (4 ml, glass)</td><td>National Scientific</td><td>13-425</td><td>Lipid storage; includes vials, open-top caps, and cap septa</td></tr><tr><td>Incu-Shaker Mini&amp;nbsp;</td><td>Benchmark</td><td>1222U12</td><td>Incubated shaker for feeds</td></tr><tr><td>BODIPY FL C16&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D3821</td><td>Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Hexadecanoic Acid)</td></tr><tr><td>BODIPY FL C12&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D3822</td><td>Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Dodecanoic Acid)</td></tr><tr><td>BODIPY FL C5&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D3834</td><td>Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Pentanoic Acid)</td></tr><tr><td>BODIPY FL C5</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D2183</td><td>Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Propionic Acid)</td></tr><tr><td>TopFluor cholesterol&amp;nbsp;</td><td>Avanti Polar Lipids Inc.</td><td>810255</td><td>Fluorescent lipid analog; 23-(dipyrrometheneboron difluoride)-24-norcholesterol</td></tr><tr><td>Fatty acid-free BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0281-1G</td><td>For TopFluor cholesterol solubilization</td></tr><tr><td>Methyl cellulose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0387</td><td>Mounting media for live larval imaging; 75 x 25 x 1 mm</td></tr><tr><td>Low melt agarose</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP165-25</td><td>Mounting media for live larval imaging; 22 x 30</td></tr><tr><td>VWR microscope slides&amp;nbsp;</td><td>VWR&amp;nbsp;</td><td>16004-422</td><td>Mounting larvae for live imaging</td></tr><tr><td>Coverslips&amp;nbsp;</td><td>Cover Glass</td><td>12-544A</td><td>Mounting larvae for live imaging</td></tr><tr><td>Super glue</td><td>Loctite</td><td>LOC01-30379</td><td>Mounting larvae for live imaging</td></tr><tr><td>FluoroDish (glass bottom dish)</td><td>World Precision Instruments, Inc.&amp;nbsp;</td><td>FD35-100</td><td>Mounting larvae for live imaging; 35 mm dish, 23 mm glass, 0.17 mm glass thickness&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Leica Microsytems</td><td>SP-2, SP-5</td><td>Microscope for high magnification live imaging</td></tr><tr><td>Stereoscope</td><td>Nikon</td><td>SM21500</td><td>Microscope for low magnification live imaging</td></tr><tr><td>Glass culture tubes&amp;nbsp;</td><td>Kimble</td><td>73500-13100</td><td>Lipid extraction; (13 x 100 mm; 13 ml)</td></tr><tr><td>Savant SpeedVac Plus&amp;nbsp;</td><td>ThermoQuest</td><td>SC210A</td><td>Lipid extraction</td></tr><tr><td>Channeled TLC plates</td><td>Whatman Scientific</td><td>WC4855-821</td><td>Food intake assay; LK5D Silica Gel 150 A, 20 x 20 cm, 250 um thick; Discontinued</td></tr><tr><td>Channeled TLC plates</td><td>Analtech, Inc.</td><td>66911</td><td>Food intake assay; Direct replacement for Whatman Scientific TLC plates</td></tr><tr><td>Typhoon 9410 Variable Mode Imager</td><td>GE Healthcare</td><td>9410</td><td>Fluorescent plate reader for food intake assay</td></tr><tr><td>ImageQuant software</td><td>GE Healthcare</td><td>29000605</td><td>Analysis of food intake assay</td></tr><tr><td>5 3/4&amp;rsquo; Wide bore, borosilicate disposable pasteur pipets&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Kimble</td><td>63A53WT</td><td>Transfering larvae</td></tr></tbody></table>

high-fat feeding paradigm for larval zebrafish: feeding, live imaging, and quantification of food intake

Zebrafish are emerging as a model of dietary lipid processing and metabolic disease. This protocol describes how to feed larval zebrafish a lipid-rich meal, which consists of an emulsion of chicken egg yolk liposomes created by sonicating egg yolk in embryo media. Detailed instructions are provided to screen larvae for egg yolk consumption so that larvae that fail to feed will not confound experimental results. The chicken egg yolk liposomes can be spiked with fluorescent lipid analogs, including fatty acids and cholesterol, enabling both systemic and subcellular visualization of dietary lipid processing. Several methods are described to mount larvae that are conducive to short- and long-term live imaging with both upright and inverted objectives at high and low magnification. Additionally presented is an assay to quantify larval food intake by extracting the lipids of larvae fed fluorescent lipid analogs, spotting the lipids on a thin layer chromatography plate, and quantifying the fluorescence. Finally, critical aspects of the procedures, important controls, options for modifying the protocols to address specific experimental questions, and potential limitations are discussed. These techniques can be applied not only to focused, hypothesis driven inquiries, but also to a variety of screens and live imaging techniques to study dietary lipid metabolism and the control of food intake.

29 ~ 31 ° C에서 로커에 공급되면, 건강 유충 (≥95 %)의 대부분이 1 시간 내에 먹는다. 계란 노른자 에멀젼을 소모하면, 애벌레 소장 컬러로 어둡게. 아주 어두운 장 2 시간 (그림 1)에서 관찰 할 수있다. 애벌레 unfed 또는 공급하지 않을 경우, 소장은 분명 남아있다. 애벌레 먹이 계란 흰자 전시 컬러로 어둡게하지 않는 팽창 장 루멘. <img alt="그?...

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High-fat Feeding Paradigm for Larval Zebrafish: Feeding, Live Imaging, and Quantification of Food Intake

Zebrafish are emerging as a valuable model of dietary lipid processing and metabolic disease. Described are protocols of lipid-rich larval feeds, live imaging of dietary fluorescent lipid analogs, and quantification of food intake. These techniques can be applied to a variety of screening, imaging, and hypothesis driven inquiry techniques.

애벌레 Zebrafish의에 대한 패러다임을 먹이 고 지방 : 수유, 라이브 영상, 식품 섭취의 정량화

Zebrafish are emerging as a model of dietary lipid processing and metabolic disease. This protocol describes how to feed larval zebrafish a lipid-rich ...

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Research

JoVE Journal

Biology

10.4K 조회수.  Carnegie Institution for Science. Zebrafish are emerging as a valuable model of dietary lipid processing and metabolic disease. Described are protocols of lipid-rich larval feeds, live imaging of dietary fluorescent lipid analogs, and quantification of food intake. These techniques can be applied to a variety of screening, imaging, and hypothesis driven inquiry techniques. 

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Experimental Protocol for Examining Behavioral Response Profiles in Larval Fish: Application to the Neuro-stimulant Caffeine

Fish models and behaviors are increasingly used in the biomedical sciences; however, fish have long been the subject of ecological, physiological and toxicological studies. Using automated digital tracking platforms, recent efforts in neuropharmacology are leveraging larval fish locomotor behaviors to identify potential therapeutic targets for novel small molecules. Similar to these efforts, research in the environmental sciences and comparative pharmacology and toxicology is examining various behaviors of fish models as diagnostic tools in tiered evaluation of contaminants and real-time monitoring of surface waters for contaminant threats. Whereas the zebrafish is a popular larval fish model in the biomedical sciences, the fathead minnow is a common larval fish model in ecotoxicology. Unfortunately, fathead minnow larvae have received considerably less attention in behavioral studies. Here, we develop and demonstrate a behavioral profile protocol using caffeine as a model neurostimulant. Though photomotor responses of fathead minnows were occasionally affected by caffeine, zebrafish&#160;were markedly more sensitive for photomotor and locomotor endpoints, which responded at environmentally relevant levels. Future studies are needed to understand comparative behavioral sensitivity differences among fish with age and time of day, and to determine whether similar behavioral effects would occur in nature and be indicative of adverse outcomes at the individual or population levels of biological organization.

Here, we present a protocol to examine larval zebrafish and fathead minnow locomotor activities and photomotor responses (PMR) using an automated tracking software. When incorporated in common toxicology bioassays, analyses of these behaviors provide a diagnostic tool to examine chemical bioactivity. This protocol is described using caffeine, a model neurostimulant.

애벌레에서 행동 응답 프로필을 조사 하기 위한 실험 프로토콜: 신경 흥분 제 카페인에 응용

Fish models and behaviors are increasingly used in the biomedical sciences; however, fish have long been the subject of ecological, physiological and ...

연구

환경과학

Analysis of Liver Microenvironment During Early Progression of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease-Associated Hepatocellular Carcinoma in Zebrafish

Liver cancer is currently the third&#160;leading cause of cancer related death worldwide, and Hepatocellular Carcinoma (HCC) accounts for 75-90% of all liver cancer cases. With the introduction of effective treatments to prevent and treat hepatitis B/C, non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), and the more aggressive form know as non-alcoholic steatohepatitis (NASH), are quickly becoming the number one risk factors to develop HCC in modern societies. To better understand the role NASH has on the development of HCC we designed a NASH-associated HCC zebrafish. The optical clarity and genetic tractability of the zebrafish larvae make them an appealing and powerful model to study the liver microenvironment and immune cell composition using non-invasive fluorescent live imaging. This protocol describes how to use a NASH-associated HCC zebrafish model to investigate the effect of cholesterol surplus in the liver microenvironment and its impact on immune cell composition at early stages of the disease. First, we feed HCC larvae (s704Tg), which express hepatocyte-specific activated beta-catenin, with a 10% high cholesterol diet for 8 days to develop a NASH-associated HCC model. Here we describe how to make use of different transgenic lines to evaluate several early malignancy features in the liver by non-invasive confocal microscopy, such as liver area, cell, and nuclear morphology (hepatocytes area, nuclear area, nuclear:cytoplasmic ratio (N:C ratio), nuclear circularity, micronuclei/nuclear herniation scoring) and angiogenesis. Then, using transgenic lines with tagged immune cells (neutrophils, macrophages, and T cells) we show how to analyze liver immune cell composition in NASH-associated HCC larvae. The described techniques are useful to evaluate liver microenvironment and immune cell composition at early hepatocarcinogenesis stages, but they can also be modified to study such features in other liver disease models.

Here, we present how to generate a non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD)-associated Hepatocellular Carcinoma (HCC) zebrafish model to study the impact of cholesterol surplus on liver microenvironment and immune cell landscape.

제브라피쉬에서 비알코올성 지방간 질환 관련 간세포암의 초기 진행 중 간 미세환경 분석

Liver cancer is currently the third&#160;leading cause of cancer related death worldwide, and Hepatocellular Carcinoma (HCC) accounts for 75-90% of all ...

암 연구학

Automated High-throughput Behavioral Analyses in Zebrafish Larvae

We have created a novel high-throughput imaging system for the analysis of behavior in 7-day-old zebrafish larvae in multi-lane plates. This system measures spontaneous behaviors and the response to an aversive stimulus, which is shown to the larvae via a PowerPoint presentation. The recorded images are analyzed with an ImageJ macro, which automatically splits the color channels, subtracts the background, and applies a threshold to identify individual larvae placement in the lanes. We can then import the coordinates into an Excel sheet to quantify swim speed, preference for edge or side of the lane, resting behavior, thigmotaxis, distance between larvae, and avoidance behavior. Subtle changes in behavior are easily detected using our system, making it useful for behavioral analyses after exposure to environmental toxicants or pharmaceuticals.

Our laboratory developed a novel high-throughput automated imaging system that is useful for the detection of several different behaviors in 7-day-old zebrafish larvae. The system can be used for detecting subtle changes in behavior after the larvae have been exposed to environmental toxicants or pharmaceuticals.

Zebrafish의 유충에 자동으로 높은 처리량 행동 분석

We have created a novel high-throughput imaging system for the analysis of behavior in 7-day-old zebrafish larvae in multi-lane plates. This system ...

신경과학

Quantifying Liver Size in Larval Zebrafish Using Brightfield Microscopy

In several transgenic zebrafish models of hepatocellular carcinoma (HCC), hepatomegaly can be observed during early larval stages. Quantifying larval liver size in zebrafish HCC models provides a means to rapidly assess the effects of drugs and other manipulations on an oncogene-related phenotype. Here we show how to fix zebrafish larvae, dissect the tissues surrounding the liver, photograph livers using bright-field microscopy, measure liver area, and analyze results. This protocol enables rapid, precise quantification of liver size. As this method involves measuring liver area, it may underestimate differences in liver volume, and complementary methodologies are required to differentiate between changes in cell size and changes in cell number. The dissection technique described herein is an excellent tool to visualize the liver, gut, and pancreas in their natural positions for myriad downstream applications including immunofluorescence staining and in situ hybridization. The described strategy for quantifying larval liver size is applicable to many aspects of liver development and regeneration.

Here we demonstrate a method for quantifying liver size in larval zebrafish, providing a way to assess the effects of genetic and pharmacologic manipulations on liver growth and development.

브라이트필드 현미경을 사용하여 애벌레 제브라피시의 간 크기 정량화

In several transgenic zebrafish models of hepatocellular carcinoma (HCC), hepatomegaly can be observed during early larval stages. Quantifying larval ...

발생학

Real Time and Repeated Measurement of Skeletal Muscle Growth in Individual Live Zebrafish Subjected to Altered Electrical Activity

A number of methods can be used to visualize individual cells throughout the body of live embryonic, larval or juvenile zebrafish. We show that live fish with fluorescently-marked plasma membranes can be scanned in a confocal laser scanning microscope in order to determine the volume of muscle tissue and the number of muscle fibers present. Efficient approaches for the measurement of cell number and size in live animals over time are described and validated against more arduous segmentation methods. Methods are described that permit the control of muscle electrical, and thus contractile, activity. Loss of skeletal muscle contractile activity greatly reduced muscle growth. In larvae, a protocol is described that allows reintroduction of patterned electrical-evoked contractile activity. The described methods minimize the effect of inter-individual variability and will permit analysis of the effect of electrical, genetic, drug, or environmental stimuli on a variety of cellular and physiological growth parameters in the context of the living organism. Long-term follow-up of the measured effects of a defined early-life intervention on individuals can subsequently be performed.

Optical clarity is a major advantage for cell biological and physiological work in zebrafish. Robust methods for measurement of cell growth in individual animals are described that permit novel insights into how growth of skeletal muscle and neighboring tissues are integrated with whole body growth.

변경된 전기적 활동을 받은 개별 살아있는 제브라피쉬의 골격근 성장에 대한 실시간 및 반복 측정

A number of methods can be used to visualize individual cells throughout the body of live embryonic, larval or juvenile zebrafish. We show that live fish ...

Microgavage of Zebrafish Larvae

The zebrafish has emerged as a powerful model organism for studying intestinal development1-5, physiology6-11, disease12-16, and host-microbe interactions17-25. Experimental approaches for studying intestinal biology often require the in vivo introduction of selected materials into the lumen of the intestine. In the larval zebrafish model, this is typically accomplished by immersing fish in a solution of the selected material, or by injection through the abdominal wall. Using the immersion method, it is difficult to accurately monitor or control the route or timing of material delivery to the intestine. For this reason, immersion exposure can cause unintended toxicity and other effects on extraintestinal tissues, limiting the potential range of material amounts that can be delivered into the intestine. Also, the amount of material ingested during immersion exposure can vary significantly between individual larvae26. Although these problems are not encountered during direct injection through the abdominal wall, proper injection is difficult and causes tissue damage which could influence experimental results. We introduce a method for microgavage of zebrafish larvae. The goal of this method is to provide a safe, effective, and consistent way to deliver material directly to the lumen of the anterior intestine in larval zebrafish with controlled timing. Microgavage utilizes standard embryo microinjection and stereomicroscopy equipment common to most laboratories that perform zebrafish research. Once fish are properly positioned in methylcellulose, gavage can be performed quickly at a rate of approximately 7-10 fish/ min, and post-gavage survival approaches 100% depending on the gavaged material. We also show that microgavage can permit loading of the intestinal lumen with high concentrations of materials that are lethal to fish when exposed by immersion. To demonstrate the utility of this method, we present a fluorescent dextran microgavage assay that can be used to quantify transit from the intestinal lumen to extraintestinal spaces. This test can be used to verify proper execution of the microgavage procedure, and also provides a novel zebrafish assay to examine intestinal epithelial barrier integrity under different experimental conditions (e.g. genetic manipulation, drug treatment, or exposure to environmental factors). Furthermore, we show how gavage can be used to evaluate intestinal motility by gavaging fluorescent microspheres and monitoring their subsequent transit. Microgavage can be applied to deliver diverse materials such as live microorganisms, secreted microbial factors/toxins, pharmacological agents, and physiological probes. With these capabilities, the larval zebrafish microgavage method has the potential to enhance a broad range of research fields using the zebrafish model system.

We present a novel method for microgavage of larval zebrafish utilizing standard embryo microinjection and stereomicroscopy equipment. We demonstrate that microgavage is a safe and efficient technique useful for delivering controlled amounts of diverse materials specifically into the larval zebrafish intestinal lumen.

Zebrafish 애벌레의 Microgavage

The zebrafish has emerged as a powerful model organism for studying intestinal development1-5, physiology6-11, disease12-16, and host-microbe ...

생물학

가상 현실 상호 작용을 통한 제브라피시 심장 수축 분석

4D Light-sheet Imaging of Zebrafish Cardiac Contraction

Zebrafish is an intriguing model organism known for its remarkable cardiac regeneration capacity. Studying the contracting heart in vivo is essential for gaining insights into structural and functional changes in response to injuries. However, obtaining high-resolution and high-speed 4-dimensional (4D, 3D spatial + 1D temporal) images of the zebrafish heart to assess cardiac architecture and contractility remains challenging. In this context, an in-house light-sheet microscope (LSM) and customized computational analysis are&#160;used to overcome these technical limitations. This strategy, involving LSM system construction, retrospective synchronization, single cell tracking, and user-directed analysis, enables one to investigate the micro-structure and contractile function across the entire heart at the single-cell resolution in the transgenic Tg(myl7:nucGFP) zebrafish larvae. Additionally, we are able to further incorporate microinjection of small molecule compounds to induce cardiac injury in a precise and controlled manner. Overall, this framework allows one to track physiological and pathophysiological changes, as well as the regional mechanics at the single-cell level during cardiac morphogenesis and regeneration.

저자 스포트라이트: 심장 기능의 단일 세포 분석을 위한 제브라피시의 고해상도 4D 광시트 이미징 및 가상 현실

This protocol utilizes light-sheet imaging to investigate cardiac contractile function in zebrafish larvae and gain insights into cardiac mechanics through cell tracking and interactive analysis.

제브라피시 심장 수축의 4D 광시트 이미징

Zebrafish is an intriguing model organism known for its remarkable cardiac regeneration capacity. Studying the contracting heart in vivo is essential for ...

생체공학

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of energy homeostasis and obesity. The small size of zebrafish allows for assays on embryos to be conducted in a 96- or 384-well plate format, Morpholino and CRISPR based technologies promote ease of genetic manipulation, and drug treatment by bath application is viable. Moreover, zebrafish are ideal for forward genetic screens allowing for novel gene discovery. Given the relative novelty of zebrafish as a model for obesity, it is necessary to develop tools that fully exploit these benefits. Herein, we describe a method to measure energy expenditure in thousands of embryonic zebrafish simultaneously. We have developed a whole animal microplate platform in which we use 96-well plates to isolate individual fish and we assess cumulative NADH2 production using the commercially available cell culture viability reagent alamarBlue. In poikilotherms the relationship between NADH2 production and energy expenditure is tightly linked. This energy expenditure assay creates the potential to rapidly screen pharmacological or genetic manipulations that directly alter energy expenditure or alter the response to an applied drug (e.g. insulin sensitizers).

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Zebrafish are an important model organism for the study of energy homeostasis. By utilizing a NADH2 sensitive redox indicator, alamar Blue, we have developed an assay that measures the metabolic rate of zebrafish larvae in a 96 well plate format and can be applied to drug or gene discovery.

높은 처리량<em&gt; 다니오 레 리오 (rerio)</em&gt; 에너지 지출 분석

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of ...

애벌레 Zebrafish의에 대한 패러다임을 먹이 고 지방 : 수유, 라이브 영상, 식품 섭취의 정량화

요약

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이 비디오의 챕터

애벌레에서 행동 응답 프로필을 조사 하기 위한 실험 프로토콜: 신경 흥분 제 카페인에 응용

제브라피쉬에서 비알코올성 지방간 질환 관련 간세포암의 초기 진행 중 간 미세환경 분석

Zebrafish의 유충에 자동으로 높은 처리량 행동 분석

브라이트필드 현미경을 사용하여 애벌레 제브라피시의 간 크기 정량화

변경된 전기적 활동을 받은 개별 살아있는 제브라피쉬의 골격근 성장에 대한 실시간 및 반복 측정

Zebrafish 애벌레의 Microgavage

제브라피시 심장 수축의 4D 광시트 이미징

제브라피시 심장 수축의 4D 광시트 이미징

제브라피시 심장 수축의 4D 광시트 이미징

높은 처리량