We are grateful to Drs. Mike S. Brown and Joseph L. Goldstein for their agreement to publish this method according to the methods described in their publications. We appreciate Dr. Peter Espenshade for sharing the GFP-SCAP plasmid. This work was supported by NIH grants NS072838 and NS079701 to D.G., American Cancer Society Research Scholar Grant RSG-14-228-01-CSM to D.G., and OSUCCC Pelotonia Postdoctoral Fellowship to C.C. We also appreciate the support from the Ohio State Neuroscience Core (P30 NS038526) and OSUCCC Translational Therapeutic Program seed grant and start-up funds to D.G.

인간의 세포 1. 검색 내생의 SCAP 단백질 <ol><li> 세포 배양 및 치료 <ol><li> 시드 ~ 1 × 106 U87의 5 % 소 태아 혈청 (FBS)으로 보충 된 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM)와 10cm 접시에 세포는 처리 전 24 시간 동안 CO 2, 37 ℃에서 세포를 배양한다 5 %. </li><li> 인산 완충 식염수 (PBS)로 한번 세포를 세척 한 다음 12 시간 동안 (5 mM)을하거나하지 않고 새로운 글루코스 DMEM 배지에 세포를 전환. </li></ol></li><li> 세포 막 분수 및 핵 추출물의 제조 <ol><li> 세척 세포는 한 번 PBS로 4 ℃에서 5 분 동안 1,000 XG에 1 ml의 PBS로 긁어, 원심 분리기. </li><li> 된 10 mM HEPES-KOH (PH 7.6), 10 mM의 KCl을 1.5 밀리미터의 MgCl 2, 1 mM의 나트륨 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA), 1 mM의 나트륨 에틸렌 글리콜 디아민 테트라 아세트산 (EGTA), 250 mM의 함유 빙냉 완충액에서 재현 탁 셀 수 크로스, 및 프로테아제 억제제의 혼합물 (5 μg / ㎖ 펩 스타틴 A, 10 μg의 / ㎖ 류 펩틴, 0.5 mM의 페닐 메틸 설 포닐 플루오 라이드 (PMSF), 1 mM 디티 오 트레이 톨 (DTT) 및 25 μg의 / ㎖ N 아세틸 레우-의 Leu-Norleu-AL 30 분 (ALLN)) 얼음 에다가요. </li><li> 핵을 분리하는 5 분 동안 4 ° C에서 890 XG에 22 G의 X를 통해 1 1/2 바늘 30 회 원심 분리기를 세포 추출물을 전달합니다. </li><li> 막 분획 (단계 1.2.7)의 분리 상층 액을 사용합니다. 버퍼 C (20 mM의 HEPES / KOH pH를 7.6, 0.42 M의 NaCl, 2.5 % (v / v) 글리세롤, 0.1 ml의 핵 펠렛을 재현 탁 1.5 밀리미터의 MgCl 2, 1 mM의 나트륨 EDTA, 1 mM의 나트륨 EGTA 및 혼합물 단백질 분해 효소 억제제 (5 μg의 / ㎖ 펩 스타틴 A, 10 μg의 / ㎖ 류 펩틴, 0.5 mM의 PMSF, 1 mM의 DTT, 25 μg의 / ㎖ ALLN)). </li><li> 4 ° C에서 20 분 동안의 microcentrifuge에 20,000 XG에서 60 분 원심 분리기 4 ° C에서 정지를 돌립니다. 상청액 &quot;핵 추출물&quot;로 지정된다. </li><li> (5 배 로딩 버퍼 10 분 (31)를 100 ° C에서 핵 추출물을 가열SDS-PAGE를 실시하기 전에 2.5 mM 트리스 - 염산의 pH 6.8, 10 % SDS, 50 % 글리세롤, 12.5 %의 β-머 캅토 에탄올, 청색 0.05 % 브로 모 페놀). </li><li> 4 ℃에서 20 분 동안 20,000 XG에서 원래 890 XG에 스핀에서 뜨는을 원심 분리기. 후속 웨스턴 블롯 분석을 위해, 0.1 SDS 용해 완충액 (10 mM 트리스 - 염산 pH를 6.8, 100 mM의 염화나트륨, 1 % (v / v)의 소듐 도데 실 설페이트 (SDS), 1 mM 나트륨 EDTA ml의 1의 펠릿을 용해 mM의 나트륨 EGTA). 이것은 &quot;막 분수&quot;지정됩니다. 참고 : 우리는 막 펠렛 20,000 XG에 20 분을 사용합니다. 10 10 XG - 20 분은 브라운과 골드 스타 인 연구소 (15)로부터 논문에 사용되어왔다. </li><li> 30 분 동안 37 ° C의 막 분획을 부화 브래드 포드 (Bradford) 단백질 분석에 의해 단백질 농도를 결정한다. SDS-PAGE에 샘플을 실시하기 전에 1 ㎕의 100 배 브로 모 페놀 블루 솔루션을 추가합니다. </li><li> 10 % SDS-PAGE 겔 (39)의 전체 막 단백질 50 μg의 -로드 (25). 젤을 실행80 V에서 15 분 동안, 다음 130 V로 변경하고 다른 115 분 동안 실행합니다. 130 분 39 140mA에서 전송합니다. <ol><li> 웨스턴 블롯 분석을 위해, 전체 SCAP 단백질을 검출하기 위해 항 SCAP 항체를 사용한다. 내부 통제로, 단백질 이황화 이성화 효소 (PDI), 응급실 상주 단백질 (40)를 사용합니다. SREBP-1의 N 말단 대역을 검출하도록 안티 SREBP-1 항체를 사용한다. 핵 추출물 (31)에 대한 내부 통제로 라민를 사용합니다. </li></ol></li></ol></li></ol> 인간의 세포 2. 분석 SCAP의 N의 -glycosylation <ol><li> 세포 배양, 형질 및 치료 <ol><li> 멤브레인 분석을 위해, DMEM와 10cm 접시 시드 ~ 1 × 106 HEK293T 세포는 5 % FBS로 보충하고 형질 감염 전 24 시간 동안 CO 2, 37 ℃에서 세포를 배양한다 5 %. </li><li> 혈청 배지를 감소 1 ml의 8 μg의 GFP-SCAP 플라스미드 (박사 피터 Espenshade의 선물) (22) 부드럽게 혼합 - 4 희석. </li><li> 플라스미드를 포함하는 혈청 배지를 감소 1ml를 직접 피펫 팅하여 16 μl의 DNA 형질 전환 시약 부드럽게 혼합 - 8을 추가합니다. </li><li> 실온에서 25 분 동안 형질 감염 시약 / 플라스미드 복합체 인큐베이션. </li><li> 신선한 매체와 세포에 형질 단지를 추가하고 5 % CO 2, 37 ℃에서 24 시간 동안 문화를 계속합니다. </li><li> PBS로 한번 세척하고 또는 tunicamycin (1 μg의 / ㎖)는 N -glycosylation 억제제의 존재 또는 부재하에 글루코스 (5 mM)을하지 않고 12 시간 동안 세포를 처리한다. </li></ol></li><li> 단계 1.2.1, 1.2.2, 1.2.3 및 1.2.7에 설명 된대로 세포막 알약을 준비합니다. </li><li> SCAP의 N의 -glycosylation의 검출 <ol><li> 트립신 단백질 분해 <ol><li> 10 mM의 HEPES · KOH (PH 7.4), 10 mM의 KCl을 1.5 밀리미터의 MgCl 2, 1 mM의 나트륨 EDTA, 100 mM의 NaCl을 함유하는 완충액 114 μL에 GFP-SCAP 과발현 세포 막 펠렛을 재현 탁. </li><li> 57 품어81에서 30 ° C에서 30 분 동안 58 μl의 총 부피의 부재 또는 트립신 1 μL (1 μg의 / μL)의 존재 하에서 막 단백질의 리터 씩. </li><li> 대두 트립신 억제제 2 μL (400 부)을 첨가하여 반응을 중지. </li></ol></li><li> 펩티드 - N- 글리코시다 제 F에 의한 탈 글리코 실화 (MALDI 스펙트럼은 PNGase F) <ol><li> MALDI 스펙트럼은 PNGase F 후속 처리에 대해서는 3.5 % (중량 / 부피) SDS 7 % (부피 / 부피)를 포함하는 용액 10 ㎕를 각 샘플에 2- 머 캅토 에탄올을 추가합니다. </li><li> 10 분 동안 100 ℃에서 가열 한 후, 연속적으로 0.5 M 인산 나트륨 (PH 7.5), 10 % (v / v)의 Nonidet 12 × 프로테아제 억제제와 P-40, 2 μL 7 μL 7 μL (0.5 U 추가 MALDI 스펙트럼은 PNGase F.의 / μL) </li><li> 3 시간 동안 37 ° C에서 배양 한 후, 5 배 로딩 완충액 (312.5 mM 트리스 - 염산 pH를 6.8, 10 % SDS, 50 % 글리세롤, 12.5 %의 β 머 캅토 에탄올, 0.05 % 브로 모 페놀 블루)를 첨가하여 반응을 중지. 10m 100 ° C의 혼합물을 가열및 SDS-PAGE에 따라. 10 % SDS-PAGE 겔 (39)의 총 멤브레인 단백질의 25-50 μg의로드. 다음 다른 115 분 동안 130 V로 변경, 15 분 동안 80 V에서 젤을 실행합니다. 130 분 동안 140mA에서 전송합니다. </li><li> 웨스턴 블롯를 들어, N의 -glycosylation 총 SCAP 단백질을 검출하기 위해 10 μg의 / ㎖ 방지 SCAP (9D5) 항체를 사용합니다. </li></ol></li></ol></li></ol> 인간의 세포에서 GFP-SCAP를 사용하여 검출 골지에 ER에서 SCAP 인신 매매의 (3) <ol><li> DMEM와 60mm 접시 시드 2.5 × 105 U87 세포는 5 % FBS로 보충하고 형질 감염 전 24 시간 동안 CO 2, 37 ℃에서 세포를 배양한다 5 %. </li><li> 0.5 ml의 4 μg의 GFP-SCAP 플라스미드 감소 혈청 배지를 희석 혼합한다. </li><li> 직접으로 0.5 ml의에게 플라스미드를 포함하는 감소 된 혈청 배지를 피펫 팅에 의해 8 μl의 DNA 형질 전환 시약을 추가하고 부드럽게 섞는다. </li><li> 방에서 25 분 동안 형질 전환 시약 / 플라스미드 복합체를 품다온도. </li><li> 신선한 매체와 세포에 형질 단지를 추가하고 5 % CO 2, 37 ℃에서 24 시간 동안 문화를 계속합니다. </li><li> 유리 커버 슬립 (22mm × 22mm)를 포함하는 6 웰 플레이트에 10 × 10 4 세포와 24 시간 동안 37 ° C, 5 % CO 2에서 문화를 계속 - 5 시드. </li><li> PBS로 한번 세척하고 또는 tunicamycin (1 μg의 / ㎖)의 존재 또는 부재하에 글루코스 (5 mM)을하지 않고 12 시간 동안 세포를 처리한다. </li><li> PBS로 한 번 세포를 씻으 10 분 동안 4 % 포름 알데히드에 고정합니다. </li><li> 의 커버 슬립을 반전, PBS로 세포를 세 번 씻으 antifade 시약과 함께 슬라이드에 장착하고, 매니큐어를 사용하여 커버 슬립을 밀봉. </li><li> 레이저 스캐닝 공 초점 현미경 (41)의 63X 기름 침지 목표를 사용하여 GFP-SCAP 거래를 확인합니다. </li></ol>

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	<li>Ru, P., Williams, T. M., Chakravarti, A., Guo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+metabolism+of+malignant+gliomas.">Tumor metabolism of malignant gliomas.</a> Cancers (Basel). 5, 1469-1484 (2013).</li><li>Moon, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Scap/SREBP+pathway+is+essential+for+developing+diabetic+fatty+liver+and+carbohydrate-induced+hypertriglyceridemia+in+animals.">The Scap/SREBP pathway is essential for developing diabetic fatty liver and carbohydrate-induced hypertriglyceridemia in animals.</a> Cell metabolism. 15, 240-246 (2012).</li><li>Guo, D., Bell, E. H., Chakravarti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+metabolism+emerges+as+a+promising+target+for+malignant+glioma+therapy.">Lipid metabolism emerges as a promising target for malignant glioma therapy.</a> CNS Oncology. 2, 289-299 (2013).</li><li>Guo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AMPK+agonist+AICAR+inhibits+the+growth+of+EGFRvIII-expressing+glioblastomas+by+inhibiting+lipogenesis.">The AMPK agonist AICAR inhibits the growth of EGFRvIII-expressing glioblastomas by inhibiting lipogenesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 12932-12937 (2009).</li><li>Menendez, J. A., Lupu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+acid+synthase+and+the+lipogenic+phenotype+in+cancer+pathogenesis.">Fatty acid synthase and the lipogenic phenotype in cancer pathogenesis.</a> Nat Rev Cancer. 7, 763-777 (2007).</li><li>Guo, D., Cloughesy, T. F., Radu, C. G., Mischel, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMPK:+A+metabolic+checkpoint+that+regulates+the+growth+of+EGFR+activated+glioblastomas.">AMPK: A metabolic checkpoint that regulates the growth of EGFR activated glioblastomas.</a> Cell Cycle. 9, 211-212 (2010).</li><li>Goldstein, J. L., DeBose-Boyd, R. A., Brown, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+sensors+for+membrane+sterols.">Protein sensors for membrane sterols.</a> Cell. 124, 35-46 (2006).</li><li>Shao, W., Espenshade, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+Roles+for+SREBP+in+Metabolism.">Expanding Roles for SREBP in Metabolism.</a> Cell metabolism. 16, 414-419 (2012).</li><li>Nohturfft, A., Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+lipid+metabolism+in+membrane+biogenesis.">Coordination of lipid metabolism in membrane biogenesis.</a> Annual review of cell and developmental biology. 25, 539-566 (2009).</li><li>Jeon, T. I., Osborne, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SREBPs:+metabolic+integrators+in+physiology+and+metabolism.">SREBPs: metabolic integrators in physiology and metabolism.</a> Trends in endocrinology and metabolism: TEM. 23, 65-72 (2012).</li><li>Sato, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assignment+of+the+membrane+attachment,+DNA+binding,+and+transcriptional+activation+domains+of+sterol+regulatory+element-binding+protein-1+(SREBP-1).">Assignment of the membrane attachment, DNA binding, and transcriptional activation domains of sterol regulatory element-binding protein-1 (SREBP-1).</a> The Journal of biological chemistry. 269, 17267-17273 (1994).</li><li>Sakai, J., Nohturfft, A., Goldstein, J. L., Brown, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+sterol+regulatory+element-binding+proteins+(SREBPs)+at+site-1+requires+interaction+with+SREBP+cleavage-activating+protein.+Evidence+from+in+vivo+competition+studies.">Cleavage of sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs) at site-1 requires interaction with SREBP cleavage-activating protein. Evidence from in vivo competition studies.</a> The Journal of biological chemistry. 273, 5785-5793 (1998).</li><li>Sakai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+complexes+between+the+COOH-terminal+domains+of+sterol+regulatory+element-binding+proteins+(SREBPs)+and+SREBP+cleavage-activating+protein.">Identification of complexes between the COOH-terminal domains of sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs) and SREBP cleavage-activating protein.</a> The Journal of biological chemistry. 272, 20213-20221 (1997).</li><li>Hua, X., Nohturfft, A., Goldstein, J. L., Brown, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sterol+resistance+in+CHO+cells+traced+to+point+mutation+in+SREBP+cleavage-activating+protein.">Sterol resistance in CHO cells traced to point mutation in SREBP cleavage-activating protein.</a> Cell. 87, 415-426 (1996).</li><li>Nohturfft, A., Brown, M. S., Goldstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topology+of+SREBP+cleavage-activating+protein,+a+polytopic+membrane+protein+with+a+sterol-sensing+domain.">Topology of SREBP cleavage-activating protein, a polytopic membrane protein with a sterol-sensing domain.</a> The Journal of biological chemistry. 273, 17243-17250 (1998).</li><li>Nohturfft, A., Hua, X., Brown, M. S., Goldstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recurrent+G-to-A+substitution+in+a+single+codon+of+SREBP+cleavage-activating+protein+causes+sterol+resistance+in+three+mutant+Chinese+hamster+ovary+cell+lines.">Recurrent G-to-A substitution in a single codon of SREBP cleavage-activating protein causes sterol resistance in three mutant Chinese hamster ovary cell lines.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 13709-13714 (1996).</li><li>Espenshade, P. J., Hughes, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+sterol+synthesis+in+eukaryotes.">Regulation of sterol synthesis in eukaryotes.</a> Annu Rev Genet. 41, 401-427 (2007).</li><li>Yang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crucial+step+in+cholesterol+homeostasis:+sterols+promote+binding+of+SCAP+to+INSIG-1,+a+membrane+protein+that+facilitates+retention+of+SREBPs+in+ER.">Crucial step in cholesterol homeostasis: sterols promote binding of SCAP to INSIG-1, a membrane protein that facilitates retention of SREBPs in ER.</a> Cell. 110, 489-500 (2002).</li><li>Yabe, D., Brown, M. S., Goldstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insig-2,+a+second+endoplasmic+reticulum+protein+that+binds+SCAP+and+blocks+export+of+sterol+regulatory+element-binding+proteins.">Insig-2, a second endoplasmic reticulum protein that binds SCAP and blocks export of sterol regulatory element-binding proteins.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 12753-12758 (2002).</li><li>Yabe, D., Xia, Z. P., Adams, C. M., Rawson, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+mutations+in+sterol-sensing+domain+of+SCAP+block+interaction+with+insig+and+render+SREBP+cleavage+insensitive+to+sterols.">Three mutations in sterol-sensing domain of SCAP block interaction with insig and render SREBP cleavage insensitive to sterols.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 16672-16677 (2002).</li><li>Espenshade, P. J., Li, W. P., Yabe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sterols+block+binding+of+COPII+proteins+to+SCAP,+thereby+controlling+SCAP+sorting+in+ER.">Sterols block binding of COPII proteins to SCAP, thereby controlling SCAP sorting in ER.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 11694-11699 (2002).</li><li>Nohturfft, A., Yabe, D., Goldstein, J. L., Brown, M. S., Espenshade, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+step+in+cholesterol+feedback+localized+to+budding+of+SCAP+from+ER+membranes.">Regulated step in cholesterol feedback localized to budding of SCAP from ER membranes.</a> Cell. 102, 315-323 (2000).</li><li>Sakai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sterol-regulated+release+of+SREBP-2+from+cell+membranes+requires+two+sequential+cleavages,+one+within+a+transmembrane+segment.">Sterol-regulated release of SREBP-2 from cell membranes requires two sequential cleavages, one within a transmembrane segment.</a> Cell. 85, 1037-1046 (1996).</li><li>Wang, X., Sato, R., Brown, M. S., Hua, X., Goldstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SREBP-1,+a+membrane-bound+transcription+factor+released+by+sterol-regulated+proteolysis.">SREBP-1, a membrane-bound transcription factor released by sterol-regulated proteolysis.</a> Cell. 77, 53-62 (1994).</li><li>Brown, M. S., Goldstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+proteolytic+pathway+that+controls+the+cholesterol+content+of+membranes,+cells,+and+blood.">A proteolytic pathway that controls the cholesterol content of membranes, cells, and blood.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 11041-11048 (1999).</li><li>Rawson, R. B., DeBose-Boyd, R., Goldstein, J. L., Brown, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Failure+to+cleave+sterol+regulatory+element-binding+proteins+(SREBPs)+causes+cholesterol+auxotrophy+in+Chinese+hamster+ovary+cells+with+genetic+absence+of+SREBP+cleavage-activating+protein.">Failure to cleave sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs) causes cholesterol auxotrophy in Chinese hamster ovary cells with genetic absence of SREBP cleavage-activating protein.</a> J Biol Chem. 274, 28549-28556 (1999).</li><li>Zelenski, N. G., Rawson, R. B., Brown, M. S., Goldstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+topology+of+S2P,+a+protein+required+for+intramembranous+cleavage+of+sterol+regulatory+element-binding+proteins.">Membrane topology of S2P, a protein required for intramembranous cleavage of sterol regulatory element-binding proteins.</a> J Biol Chem. 274, 21973-21980 (1999).</li><li>Goldstein, J. L., Brown, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Century+of+Cholesterol+and+Coronaries:+From+Plaques+to+Genes+to+Statins.">A Century of Cholesterol and Coronaries: From Plaques to Genes to Statins.</a> Cell. 161, 161-172 (2015).</li><li>Espenshade, P. J., Cheng, D., Goldstein, J. L., Brown, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autocatalytic+processing+of+site-1+protease+removes+propeptide+and+permits+cleavage+of+sterol+regulatory+element-binding+proteins.">Autocatalytic processing of site-1 protease removes propeptide and permits cleavage of sterol regulatory element-binding proteins.</a> The Journal of biological chemistry. 274, 22795-22804 (1999).</li><li>Guo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SCAP+links+glucose+to+lipid+metabolism+in+cancer+cells.">SCAP links glucose to lipid metabolism in cancer cells.</a> Mol Cell Oncol. 3, (2016).</li><li>Cheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose-Mediated+N-glycosylation+of+SCAP+Is+Essential+for+SREBP-1+Activation+and+Tumor+Growth.">Glucose-Mediated N-glycosylation of SCAP Is Essential for SREBP-1 Activation and Tumor Growth.</a> Cancer Cell. 28, 569-581 (2015).</li><li>Shao, W., Espenshade, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sugar+Makes+Fat+by+Talking+to+SCAP.">Sugar Makes Fat by Talking to SCAP.</a> Cancer Cell. 28, 548-549 (2015).</li><li>Guo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGFR+signaling+through+an+Akt-SREBP-1-dependent,+rapamycin-resistant+pathway+sensitizes+glioblastomas+to+antilipogenic+therapy.">EGFR signaling through an Akt-SREBP-1-dependent, rapamycin-resistant pathway sensitizes glioblastomas to antilipogenic therapy.</a> Sci Signal. 2, 82 (2009).</li><li>Guo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+LXR+agonist+promotes+GBM+cell+death+through+inhibition+of+an+EGFR/AKT/SREBP-1/LDLR-dependent+pathway.">An LXR agonist promotes GBM cell death through inhibition of an EGFR/AKT/SREBP-1/LDLR-dependent pathway.</a> Cancer Discov. 1, 442-456 (2011).</li><li>Guo, D., Bell, E. H., Mischel, P., Chakravarti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+SREBP-1-driven+lipid+metabolism+to+treat+cancer.">Targeting SREBP-1-driven lipid metabolism to treat cancer.</a> Curr Pharm Des. 20, 2619-2626 (2014).</li><li>Bell, E. H., Guo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomarkers+for+malignant+gliomas.">Biomarkers for malignant gliomas.</a> Malignant Gliomas, Radiation Medicine Rounds. 3, 339-357 (2012).</li><li>Geng, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+SOAT1+suppresses+glioblastoma+growth+via+blocking+SREBP-1-mediated+lipogenesis.">Inhibition of SOAT1 suppresses glioblastoma growth via blocking SREBP-1-mediated lipogenesis.</a> Clin Cancer Res. , (2016).</li><li>Ru, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feedback+Loop+Regulation+of+SCAP/SREBP-1+by+miR-29+Modulates+EGFR+Signaling-Driven+Glioblastoma+Growth.">Feedback Loop Regulation of SCAP/SREBP-1 by miR-29 Modulates EGFR Signaling-Driven Glioblastoma Growth.</a> Cell Rep. , (2016).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition). , (2012).</li><li>Uehara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S-nitrosylated+protein-disulphide+isomerase+links+protein+misfolding+to+neurodegeneration.">S-nitrosylated protein-disulphide isomerase links protein misfolding to neurodegeneration.</a> Nature. 441, 513-517 (2006).</li><li>Miyashita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+microscopy+for+intracellular+co-localization+of+proteins.">Confocal microscopy for intracellular co-localization of proteins.</a> Methods Mol Biol. 1278, 515-526 (2015).</li><li>Cao, J., Guo, S., Arai, K., Lo, E. H., Ning, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+extracellular+signaling+utilizing+a+glycoproteomic+approach:+lectin+blot+surveys,+a+first+and+important+step.">Studying extracellular signaling utilizing a glycoproteomic approach: lectin blot surveys, a first and important step.</a> Methods Mol Biol. 1013, 227-233 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

본 연구는 인간 세포의 막 분획을 분리과 웨스턴 블롯을 이용하여 SCAP의 N의 -glycosylation 총 단백질의 검출을위한 시료의 준비를위한 프로토콜을 설명한다. 우리는 더 GFP - 라벨 및 공 초점 현미경을 사용하여 SCAP 거래를 모니터링하는 방법을 제공한다. 이 방법은 구체적으로는, 막 단백질을 분석하는데 사용 된 N SCAP -glycosylation 및 피킹을 조사하기위한 중요한 도구이다. 다른 N -glycan 사슬을 인식하고 N을 -glycosylated 단백질 (42)을 식별하기 위해 각종 렉틴을 사용하는 방법과 비교하여, 여기에 설명 된 우리의 방법은 SCAP 단백질 단편의 당화를 식별 이주 시프트 단백질 - 결합 N은 -glycan 제거 MALDI 스펙트럼은 PNGase F를 사용하고, 검출 AA 540-707. 렉틴 방법의 한계는 특정 인식하는 렉틴의 적절한 유형의 식별에 의존 <em&gt; N은 -glycan. 우리의 MALDI 스펙트럼은 PNGase F 절단 방법은 SCAP N의 -glycosylation를 분석하는 간단한 절차를 제공합니다. 또한,이 방법은 또한 2 균질화 후에 인간 환자 또는 동물의 조직에 SCAP의 -glycosylation N 단백질의 수준을 분석하기 위해 적용될 수있다. 우리의 연구는 암과 대사성 질환에서 지질 대사의 서명을 분석 할 수있는 새로운 도구를 제공합니다. 본 연구에서는 인간의 세포에서 N의 -glycosylation 및 인신 매매의 분석에 사용 GFP 표지 SCAP의 플라스미드는 햄스터 기원합니다. SCAP 단백질 540-707 단편 만 단백질 및 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포주 (15)에서와 같이 햄스터 SCAP의 N의 -glycosylation를 검출 할 수있는 아미노산에 대해 발생되는 SCAP 항체 (IgG의-9D5). 아미노산에 대한 항체는 450 -도 1에 나타낸 바와 같이 인간 SCAP (500)의 인간 세포에서 내인성 SCAP 단백질을 검출 할 수있다 SCAP N의 -glyco를 검출.인간 SCAP (707)의 단편 - 인간 세포 또는 조직에 sylation, 우리는 아미노산에 대해 (540), 특정 항체를 개발할 필요가있다. 또한, 특정 렉틴의 확인은 결합 된 N SCAP는 SCAP -glycan 인간 N -glycosylation (42)을 분석하는 다른 방법을 인식한다. 또한, SCAP 바인딩 각 N -glycan 체인의 구성과 구조를 정의 (N263, N590과 N641)은 골지체로 ER에서 SCAP 인신 매매의 기본 메커니즘에 대한 우리의 이해를 촉진 할 것이다. 또한, N의 SCAP -glycosylation의 검출을위한 최적의 결과를 얻기 위해, 우리는 브라운 및 골드 스타 인 연구소 (15)로부터 공보에 기재된 방법에서 변형 된 우리의 실험 조건에 따라 약간의 반응 매개 변수를 조절. 성공적 SCAP 단백질과 N의 -glycosylation를 검출하기 위해, 막 분획과 핵 추출물의 품질이 매우 중요. 우리는 직접 얼음 위로 시료를 넣어 회피 37 ° C에서 배양 막 분획 후, 단백질 농도를 결정 하였다. 여기에 기재된 방법은 널리 암, 심혈관 질환, 당뇨병, 비만 연구를 포함한 다양한 분야에 적용될 수있다.

지질 대사의 규제 완화는 암과 대사성 질환 1-6의 일반적인 특성이다. 이러한 프로세스에서, 스테롤 조절 요소 결합 단백질 (SREBPs) 전사 인자의 계열은 흡수 및 콜레스테롤, 지방산의 합성 및 인지질 7-10에 중요한 유전자의 발현을 조절하는 중요한 역할을한다. SREBP-1a에서, SREBP-1C 및 SREBP-2를 포함 SREBPs는 두 개의 횡단 도메인 (7)의 미덕에 의해 소포체 (ER) 막에 결합 비활성 전구체로 합성된다. SREBPs의 N 말단이 표적 유전자 (11)의 전이 활성화를위한 DNA 결합 도메인이 포함되어 있습니다. SREBP 전구체의 C- 말단 절단 SREBP-활성화 단백질 (SCAP) (12, 13), SREBP 안정성 14-16 활성의 조절에 중추적 인 역할을하는 polytopic 막 단백질에 결합한다. implemen전사 기능 테이션은 두 단백질 분해 효소가 순차적으로 SREBP을 절단하고 지방을 생성하는 유전자 (7)의 전이 활성화의 핵으로 들어간다는 N- 말단 단편을 해제 골지에 응급실에서 SCAP / SREBP 복합체의 전위가 필요합니다. 이 과정에서, ER 막에 스테롤의 수준은 ER 7,17에서 SCAP / SREBP 복합체의 종료를 제어 할 수 있습니다. 높은 스테롤 조건 스테롤은 SCAP 또는 ER 상주 결합 인슐린 - 유도 유전자 단백질 -1 (Insig-1) 또는 -2 (Insig-2)에서 SCAP / SREBP 착체를 보유 Insigs으로 SCAP의 연결을 강화 ER 18 ~ 20. 스테롤 수치가 감소하면, SCAP는 Insigs로 해리. 이것은 일반적인 코트 단백질 (COP) II 단지와 SCAP 상호 작용을 할 수있는 SCAP 구조적 변화로 이어집니다. 복잡한 신진 소포로 SCAP / SREBP 복합체의 결합을 매개하고 골지 (21, 22)에 ER에서의 전송을 지시합니다. transloc시골지에 ATION, SREBPs 순차적으로 N 말단 7,23-29의 출시로 이어지는 사이트 1 및 사이트-2 단백질 분해 효소에 의해 분해된다. SCAP 단백질 N은 아스파라긴에 올리고당을 -linked 세 운반 (N)는 N263, N590과 N641 (15)를 배치합니다. 우리는 최근이 사이트에서 SCAP의 포도당 매개 N의 -glycosylation 낮은 스테롤 조건 30-32에서 골지체로 ER에서 SCAP / SREBP 거래를위한 필수 조건입니다 것으로 나타났습니다. (NNN은 QQQ하는) 글루타민에 세 아스파라긴의 돌연변이를 통해 SCAP의 글리코 실화의 손실 SCAP의 단백질과 SREBP 활성화 (31)의 감소의 불안정성에 SCAP / SREBP의 복잡하고 결과의 인신 매매를 사용하지 않습니다. 우리의 최근의 데이터는 또한 SREBP-1의 높은 아교 모세포종에서 활성화 및 SCAP의 N -glycosylation 4,31,33,34에 의해 규제됩니다 보여줍니다. 타겟팅 SCAP / SREBP-1 신호는 악성 종양과 신진 대사의 치료에 새로운 전략으로 부상1,3,35-38 yndromes. 따라서, SCAP 및 N 단백질의 수준을 분석 -glycosylation 인간 세포 및 환자 조직에서의 피킹을 모니터링하기위한 효과적인 방법을 개발하는 것이 중요하다. 응급실에서 SCAP 단백질 (아미노산 540-707)의 내강 영역은 그대로 막은 트립신 (15)으로 처리 할 때 단백질 분해로부터 보호되는 두 개의 N의 -glycosylation 사이트 (N590과 N641)가 포함되어 있습니다. 이 내강 단편 나트륨 도데 실 설페이트 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 (SDS-PAGE)에 의해 15,31 SCAP 개별 당화 변형의 해상도를 허용하도록 충분히 작은 ~ 30 kDa의 분자량을 갖는다. 여기서는 N의 SCAP의 -glycosylation 인간 세포에서 전체 단백질을 검출하는 방법을 제공한다. 이 프로토콜은 브라운 및 골드 스타 인 연구소 15하고 최근 출판 (31)로부터의 공보에 기재된 방법으로부터 유도된다. 프로토콜은 t에서 사용될 수있다그는 포유 동물 세포에서 SCAP 단백질의 연구.

<table><tbody><tr><td>X-treme GENE HP DNA Transfection Reagent</td><td>Roche</td><td>6366236001</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEMI medium</td><td>Life Technologies</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>trypsin&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T6567</td><td></td></tr><tr><td>soybean trypsin inhibitor</td><td>Sigma</td><td>T9777</td><td></td></tr><tr><td>PNGase F&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P7367</td><td></td></tr><tr><td>Anti-SCAP (9D5) antibody&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-13553</td><td></td></tr><tr><td>GFP antibody&amp;nbsp;</td><td>Roche</td><td>11814460001</td><td></td></tr><tr><td>SREBP-1 antibody (IgG-2A4)</td><td>BD Pharmingen</td><td>557036</td><td></td></tr><tr><td>PDI Antibody (H-17)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-30932</td><td></td></tr><tr><td>Lamin A Antibody (H-102)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-20680</td><td></td></tr><tr><td>SCAP antibody (a.a 450-500)</td><td>Bethyl Laboratories, Inc.</td><td>A303-554A</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s modified Eagle&amp;rsquo;s medium (DMEM) without glucose, pyruvate and glutamine&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Cellgro</td><td>17-207-CV</td><td>Add 1 mM Pyravate and 4 mM Glutamine before use</td></tr><tr><td>22 G x 1 1/2 needle</td><td>BD</td><td>305156</td><td></td></tr><tr><td>pepstatin A</td><td>Sigma</td><td>P5318</td><td></td></tr><tr><td>leupeptin</td><td>Sigma</td><td>L2884</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>43819</td><td></td></tr><tr><td>ALLN</td><td>Sigma</td><td>A6185</td><td></td></tr><tr><td>Nitrocellulose membrane</td><td>GE</td><td>RPN3032D</td><td></td></tr><tr><td>EDTA Solution 0.5 M pH 8.5 100 ml</td><td>VWR</td><td>82023-102</td><td></td></tr><tr><td>EGTA 0.5 M sterile (pH 8.0) 50 ml</td><td>Fisher Scentific</td><td>50255956</td><td></td></tr><tr><td>HyClone FBS</td><td>Thermo scientific</td><td>SH3007103</td><td></td></tr><tr><td>glycerol</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-mercaptoethanol&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>bromophenol blue</td><td>Sigma</td><td>B8026</td><td></td></tr><tr><td>prolong gold antifade reagent with dapi</td><td>Life Technologies</td><td>P36935</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine (200 mM)</td><td>Life Technologies</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>sodium pyruvate</td><td>Life Technologies</td><td>11360-070</td><td></td></tr></tbody></table>

analysis of scap n-glycosylation and trafficking in human cells

Elevated lipogenesis is a common characteristic of cancer and metabolic diseases. Sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs), a family of membrane-bound transcription factors controlling the expression of genes important for the synthesis of cholesterol, fatty acids and phospholipids, are frequently upregulated in these diseases. In the process of SREBP nuclear translocation, SREBP-cleavage activating protein (SCAP) plays a central role in the trafficking of SREBP from the endoplasmic reticulum (ER) to the Golgi and in subsequent proteolysis activation. Recently, we uncovered that glucose-mediated N-glycosylation of SCAP is a prerequisite condition for the exit of SCAP/SREBP from the ER and movement to the Golgi. N-glycosylation stabilizes SCAP and directs SCAP/SREBP trafficking. Here, we describe a protocol for the isolation of membrane fractions in human cells and for the preparation of the samples for the detection of SCAP N-glycosylation and total protein by using western blot. We further provide a method to monitor SCAP trafficking by using confocal microscopy. This protocol is appropriate for the investigation of SCAP N-glycosylation and trafficking in mammalian cells.

도 1은 웨스턴 블롯을 사용하여 자극 포도당 응답 인간 아교 모세포종 U87 세포에서 내인성 단백질 및 SCAP SREBP-1 핵 형태의 검출을 나타낸다. 막 단백질 SCAP는 &quot;막 분획&quot;에서 검출된다. SREBP-1의 핵 형태 (N 말단)이 &quot;핵 추출물&quot;에 검출된다. SCAP 단백질의 수준은 현저하게 포도당의 자극에 의해 강화되고, SREBP-1 핵 형태 (PDI는 ER 막 단백질의 내부 대조군으로서 작용). 이러한 결과는 프로토콜 인간 세포에서 내인성 SCAP 단백질을 검출 할 수 있음을 보여준다. 도 2는 GFP 표지 햄스터 SCAP 발현 HEK293T 세포 자극 tunicamycin 처리 글루코스에 반응하여 SCAP의 N의 총 -glycosylation GFP-SCAP 단백질 수준의 분석을 나타낸다.도 <str옹&gt; 2a는 세 N의 -glycosylation 사이트를 운반하는 ER 막에 걸쳐 SCAP 단백질의 주제 구조를 보여줍니다. AA에게 540 포함 SCAP의 조각 - 응급실에서 6 일 내강 루프에있는 707, 트립신 내성 15 및 사이트 N590과 N641에 N의 -glycosylation의 분석에 사용됩니다. 처리 (AA 540 함유 - 707)보다 높은 중량 밴드 트립신 후도 2b (상부 패널)에 나타낸 바와 같이 하나 또는 두 개의 N은 MALDI 스펙트럼은 PNGase의 글루코스 부재의 존재 하에서 당사슬 (N590 및 N641)를 -linked 함유 SCAP 단백질을 나타낸다 (IgG를-9D5 항체 검출) 또는 tunicamycin. 빠른 SDS-PAGE에서 이동 - MALDI 스펙트럼은 PNGase F의 존재, N 결합 된 올리고당은 단편 (707 AA 540)를 일으키는 원인이되는 SCAP 단백질에서 제거되었습니다. 일관 완전 tunicamycin하여 N의 -glycosylation 개시 프로세스를 차단 하부의 모양으로 표시된 N SCAP의 -glycosylation를 폐지SCAP 조각 (그림 2B, 상단 패널)의 밴드. 또한, (GFP에 대한 항체에 의해 검출 된) 총 GFP-SCAP 단백질 글루코스의 부재 또는 tunicamycin 처리 (도 2b에 도시 된 바와 같이, 하부 패널)로 감소 하였다. 이러한 결과는 프로토콜 SCAP N -glycosylation의 분석에 적합 함을 입증한다. 그림 3은 자극을 포도당에 대한 응답에서 골지체로 ER에서 GFP-SCAP의 인신 매매는 U87 세포에서 tunicamycin 처리에 의해 억제 된 것을 알 수있다. 도 3a에 도시 된 바와 같이, 공 초점 현미경 사진 PDI, 응급실 상주 단백질 (적색)과의 공동 지역화 같이 GFP-SCAP 단백질, 글루코스 부재에서 ER에 존재하는 것으로 나타났다. 대조적으로, 글루코오스의 존재하에 GFP-SCAP은 골지 마커 단백질 Giantin (적색) (도 3b)와 공동으로 현지화 도시 골지로 이동한다. 또한, tunicamycin치료는 골지체 (도 3A와 B)의 ER에서 GFP-SCAP의 포도당 - 유도 피킹을 억제 하였다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54709/54709fig1.jpg" /> 그림 1. 감지 내생 SCAP 단백질과 SREBP-1 U87 세포에서 핵 양식. 막과 12 시간 (5 밀리미터) 또는 포도당없이 무 혈청 배지에서 배양 된 인간의 기본 아교 모세포종 U87 세포에서 핵 추출물의 웨스턴 블롯 분석. 인간 SCAP 단 (450)에 대해 안티 SCAP 항체 - 인간 500 세포에서 내인성 SCAP를 검출하는데 사용되었다. 인간 SREBP-1 407 단편 - SREBP-1의 활성 형 (N 말단)은 단 (301)에 대해 항체를 이용하여 &quot;핵 추출물&quot;에 검출된다. 이 수치는 31의 허가를 수정되었습니다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54709/54709fig1large.jpg" target="_blank">더 큰 versi을 보려면 여기를 클릭하십시오</a>이 그림의에. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54709/54709fig2.jpg" /> 그림 2. SCAP N의 -glycosylation 및 GFP-SCAP 단백질 수준의 웨스턴 블롯 분석.가) SCAP 구조 스패닝은 ER 멤브레인을 통과 보여주는 개략도. 소포체 내강에 상주하며 N- 결합 올리고당에 의해 수정 모두 SCAP 세 아스파라긴 (N) 잔기가 존재한다. SCAP 함유 아미노산 540-707의 단편 트립신 분해에 내성이다. . 그것은 금주 모임 (540)에 대한 IgG의-9D5 항체를 검출 할 수있는 두 개의 N- 연결된 올리고당 수정 다래끼, N590과 N641 포함 - 서양 얼룩 B에 의해 햄스터 SCAP) 상부 SCAP N의 -glycosylation (의 웨스턴 블롯 분석 707 :와 함께 트립신 처리) 또는 GFP-SCAP의 단백질 수준 (낮은 : HEK293T 세포 트랜스에게 가입일 트립신 처리)iently 24 시간 동안 GFP-SCAP로 형질 감염하고 12 시간 동안, 또는 tunicamycin (1 μg의 / ㎖)와, N의 -glycosylation 억제제의 존재 또는 부재하에 글루코스 (5 mM)을가없는 무 혈청 배지에서 배양 하였다. 블롯의 좌측의 숫자는 (IgG의-9D5 항체에 의해 검출 어퍼) SCAP 단백질 (N590 및 N641 사이트)에 대한 N의 -glycosylation 사이트의 수를 나타낸다. GFP-SCAP에 대한 낮은 패널이 GFP 단백질에 대한 항체가 검출되었다. 이 그림은 (31)로부터 허가를 수정되었습니다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54709/54709fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54709/54709fig3.jpg" /> 골지. (A)에 응급실에서 SCAP 인신 매매의 그림 3. 감지, B) 공 초점 현미경 이미지는 GFP-SCAP는 ER에있는 또는 T로 이동하는 것을 보여그는 12 시간 동안 U87 세포에서 tunicamycin (1 μg의 / ㎖) 처리없이와 / 부재 또는 포도당 (5 밀리미터)의 존재 골지. PDI는 ER 염색 (적색) (A)를 보여줍니다. Giantin, 골지 마커 (적색) (B). DAPI (청색) 세포핵 얼룩. 스케일 바는 10 μm의를 나타냅니다. 도 3a는 새로운 데이터이고, 이전에 게시되지 않았습니다.도 3b는 (31)의 허가를 수정되었습니다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54709/54709fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells

우리는 웨스턴 블롯을 사용하여 SCAP의 N의 -glycosylation 총 단백질의 검출을위한 인간 세포로부터 세포막 분획의 분리 및 샘플 제조 수정 방법을 설명한다. 우리는 더 공 초점 현미경을 사용하여 SCAP 거래를 모니터링하는 GFP-표시 방법을 소개합니다. 이 프로토콜은 일반 생물학 실험실에서 사용될 수있다.

SCAP의 분석<em&gt; N</em&gt; 인간 세포의 -glycosylation 및 매매

Elevated lipogenesis is a common characteristic of cancer and metabolic diseases. Sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs), a family of ...

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Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells

8.7K 조회수.  The Ohio State University Comprehensive Cancer Center and College of Medicine.  우리는 웨스턴 블롯을 사용하여 SCAP의 N의 -glycosylation 총 단백질의 검출을위한 인간 세포로부터 세포막 분획의 분리 및 샘플 제조 수정 방법을 설명한다. 우리는 더 공 초점 현미경을 사용하여 SCAP 거래를 모니터링하는 GFP-표시 방법을 소개합니다. 이 프로토콜은 일반 생물학 실험실에서 사용될 수있다. 

비디오: Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells

Glycan Node Analysis: A Bottom-up Approach to Glycomics

Synthesized in a non-template-driven process by enzymes called glycosyltransferases, glycans are key players in various significant intra- and extracellular events. Many pathological conditions, notably cancer, affect gene expression, which can in turn deregulate the relative abundance and activity levels of glycoside hydrolase and glycosyltransferase enzymes. Unique aberrant whole glycans resulting from deregulated glycosyltransferase(s) are often present in trace quantities within complex biofluids, making their detection difficult and sometimes stochastic. However, with proper sample preparation, one of the oldest forms of mass spectrometry (gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS) can routinely detect the collection of branch-point and linkage-specific monosaccharides ("glycan nodes") present in complex biofluids. Complementary to traditional top-down glycomics techniques, the approach discussed herein involves the collection and condensation of each constituent glycan node in a sample into a single independent analytical signal, which provides detailed structural and quantitative information about changes to the glycome as a whole and reveals potentially deregulated glycosyltransferases. Improvements to the permethylation and subsequent liquid/liquid extraction stages provided herein enhance reproducibility and overall yield by facilitating minimal exposure of permethylated glycans to alkaline aqueous conditions. Modifications to the acetylation stage further increase the extent of reaction and overall yield. Despite their reproducibility, the overall yields of N-acetylhexosamine (HexNAc) partially permethylated alditol acetates (PMAAs) are shown to be inherently lower than their expected theoretical value relative to hexose PMAAs. Calculating the ratio of the area under the extracted ion chromatogram (XIC) for each individual hexose PMAA (or HexNAc PMAA) to the sum of such XIC areas for all hexoses (or HexNAcs) provides a new normalization method that facilitates relative quantification of individual glycan nodes in a sample. Although presently constrained in terms of its absolute limits of detection, this method expedites the analysis of clinical biofluids and shows considerable promise as a complementary approach to traditional top-down glycomics.

This article presents an enhanced form of a novel bottom-up glycomics technique designed to analyze the pooled compositional profile of glycans in unfractionated biofluids through the chemical breakdown of glycans into their constituent linkage-specific monosaccharides for detection by GC-MS. Potential applications include early detection of cancer and other glycan-affective disorders.

글리 칸 노드 분석 : 글리코 믹스에 대한 상향식 접근

Synthesized in a non-template-driven process by enzymes called glycosyltransferases, glycans are key players in various significant intra- and ...

연구

화학

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of these glycoproteins possess immunoglobulin (Ig) folds and are central to immune recognition and regulation. Here, we present a platform for the design, expression and biophysical characterization of the extracellular domain of human B cell receptor CD22. We propose that these approaches are broadly applicable to the characterization of mammalian glycoprotein ectodomains containing Ig domains. Two suspension human embryonic kidney (HEK) cell lines, HEK293F and HEK293S, are used to express glycoproteins harbouring complex and high-mannose glycans, respectively. These recombinant glycoproteins with different glycoforms allow investigating the effect of glycan size and composition on ligand binding. We discuss protocols for studying the kinetics and thermodynamics of glycoprotein binding to biologically relevant ligands and therapeutic antibody candidates. Recombinant glycoproteins produced in HEK293S cells are amenable to crystallization due to glycan homogeneity, reduced flexibility and susceptibility to endoglycosidase H treatment. We present methods for soaking glycoprotein crystals with heavy atoms and small molecules for phase determination and analysis of ligand binding, respectively. The experimental protocols discussed here hold promise for the characterization of mammalian glycoproteins to give insight into their function and investigate the mechanism of action of therapeutics.

We present approaches for the biophysical and structural characterization of glycoproteins with the immunoglobulin fold by biolayer interferometry, isothermal titration calorimetry, and X-ray crystallography.

X 선 결정학 및 생물 기술에 의해 면역 글로불린 겹와 Glycoproteins의 특성

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

생화학

Analysis of Endocytic Uptake and Retrograde Transport to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells

Transport of proteins and membranes from the cell surface to the Golgi and beyond is essential for homeostasis, organelle identity and physiology. To study retrograde protein traffic, we have recently developed a versatile nanobody-based toolkit to analyze transport from the cell surface to the Golgi complex, either by fixed and live cell imaging, by electron microscopy, or biochemically. We engineered functionalized anti-green fluorescent protein (GFP) nanobodies &#8212; small, monomeric, high-affinity protein binders &#8212; that can be applied to cell lines expressing membrane proteins of interest with an extracellular GFP moiety. Derivatized nanobodies bound to the GFP reporters are specifically internalized and transported piggyback along the reporters&#39; sorting routes. Nanobodies were functionalized with fluorophores to follow retrograde transport by fluorescence microscopy and live imaging, with ascorbate peroxidase 2 (APEX2) to investigate the ultrastructural localization of reporter-nanobody complexes by electron microscopy, and with tyrosine sulfation (TS) motifs to assess kinetics of trans-Golgi network (TGN) arrival. In this methodological article, we outline the general procedure to bacterially express and purify functionalized nanobodies. We illustrate the powerful use of our tool using the mCherry- and TS-modified nanobodies to analyze endocytic uptake and TGN arrival of cargo proteins.

Retrograde transport of proteins from the cell surface to the Golgi is essential to maintain membrane homeostasis. Here, we describe a method to biochemically analyze cell surface-to-Golgi transport of recombinant proteins using functionalized nanobodies in HeLa cells.

배양된 세포에서 기능성된 Nanobodies를 사용 하 여 Trans Golgi 네트워크 Endocytic 통풍 관 및 역행의 분석

Transport of proteins and membranes from the cell surface to the Golgi and beyond is essential for homeostasis, organelle identity and physiology. To ...

N-glycan Profiling of Glycoproteins by Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography with Fluorescence and Mass Spectrometric Detection

Glycosylation is a vital modification found in proteins. N-glycan profiling of glycoproteins is required to detect novel biomarker candidates and determine glycan alterations in diseases. Most commercially available biopharmaceutical proteins are glycoproteins. The efficacy of these drugs is affected by glycosylation patterns. Therefore, an in-depth characterization method for the N-glycans is necessary. Here, we present a comprehensive approach for qualitative and quantitative analysis of N-glycans using hydrophilic interaction liquid chromatography equipped with fluorescence detection and tandem mass spectrometry (HILIC-FLD-MS/MS). N-glycans were released from glycoproteins with a facile method and labeled by a procainamide fluorophore tag in the strategy. Subsequently, the procainamide labeled N-glycans were analyzed by a HILIC-FLD-MS/MS technique. In this approach, N-glycan structures were confirmed by the tandem mass spectrometric analysis, whereas fluorescence detection was used for the quantitative analysis. An application for data analysis of the detected N-glycan peaks is described in the study. This protocol can be applied to any glycoprotein extracted from various species.

<meta charset="utf8"></head><body>친수성 상호작용을 통한 당단백질의 N-글라이칸 프로파일링: 형광 및 질량 분광 검출을 이용한 액체 크로마토그래피

N-glycan profiling of glycoproteins is essential for discovering novel biomarkers and understanding glycan functions in cellular events. Additionally, N-glycan analysis of protein biopharmaceuticals is very important for human use. In this current article, a high-throughput strategy for identifying and quantifying N-glycan structures was presented using the HILIC-FLD-MS/MS technique.

친수성 상호작용을 통한 당단백질의 N-글라이칸 프로파일링: 형광 및 질량 분광 검출을 이용한 액체 크로마토그래피

Glycosylation is a vital modification found in proteins. N-glycan profiling of glycoproteins is required to detect novel biomarker candidates and ...

Pulse-chase Analysis of N-linked Sugar Chains from Glycoproteins in Mammalian Cells

Attachment of the Glc3Man9GlcNAc2 precursor oligosaccharide to nascent polypeptides in the ER is a common modification for secretory proteins. Although this modification was implicated in several biological processes, additional aspects of its function are emerging, with recent evidence of its role in the production of signals for glycoprotein quality control and trafficking. Thus, phenomena related to N-linked glycans and their processing are being intensively investigated. Methods that have been recently developed for proteomic analysis have greatly improved the characterization of glycoprotein N-linked glycans. Nevertheless, they do not provide insight into the dynamics of the sugar chain processing involved. For this, labeling and pulse-chase analysis protocols are used that are usually complex and give very low yields. We describe here a simple method for the isolation and analysis of metabolically labeled N-linked oligosaccharides. The protocol is based on labeling of cells with [2-3H] mannose, denaturing lysis and enzymatic release of the oligosaccharides from either a specifically immunoprecipitated protein of interest or from the general glycoprotein pool by sequential treatments with endo H and N-glycosidase F, followed by molecular filtration (Amicon). In this method the isolated oligosaccharides serve as an input for HPLC analysis, which allows discrimination between various glycan structures according to the number of monosaccharide units comprising them, with a resolution of a single monosaccharide. Using this method we were able to study high mannose N-linked oligosaccharide profiles of total cell glycoproteins after pulse-chase in normal conditions and under proteasome inhibition. These profiles were compared to those obtained from an immunoprecipitated ER-associated degradation (ERAD) substrate. Our results suggest that most NIH 3T3 cellular glycoproteins are relatively stable and that most of their oligosaccharides are trimmed to Man9-8GlcNAc2. In contrast, unstable ERAD substrates are trimmed to Man6-5GlcNAc2 and glycoproteins bearing these species accumulate upon inhibition of proteasomal degradation.

We describe a method for analysis of the alteration of N-linked glycans through the early life of glycoproteins after their biosynthesis in mammalian cells. This is achieved by pulse-chase analysis of metabolically labeled glycans, enzymatic release from glycoproteins and examination by HPLC.

포유 동물 세포에 Glycoproteins의 N - 연결 설탕 체인 펄스 체이스 분석

Attachment of the Glc3Man9GlcNAc2 precursor oligosaccharide to nascent polypeptides in the ER is a common modification for secretory proteins. Although ...

생물학

A Spin-Tip Enrichment Strategy for Simultaneous Analysis of N-Glycopeptides and Phosphopeptides from Human Pancreatic Tissues

Mass spectrometry can provide deep coverage of post-translational modifications (PTMs), although enrichment of these modifications from complex biological matrices is often necessary due to their low stoichiometry in comparison to non-modified analytes. Most enrichment workflows of PTMs on peptides in bottom-up proteomics workflows, where proteins are enzymatically digested before the resulting peptides are analyzed, only enrich one type of modification. It is the entire complement of PTMs, however, that leads to biological functions, and enrichment of a single type of PTM may miss such crosstalk of PTMs. PTM crosstalk has been observed between protein glycosylation and phosphorylation, the two most common PTMs in human proteins and also the two most studied PTMs using mass spectrometry workflows. Using the simultaneous enrichment strategy described herein, both PTMs are enriched from post-mortem human pancreatic tissue, a complex biological matrix. Dual-functional Ti(IV)-immobilized metal affinity chromatography is used to separate various forms of glycosylation and phosphorylation simultaneously in multiple fractions in a convenient spin tip-based method, allowing downstream analyses of potential PTM crosstalk interactions. This enrichment workflow for glyco- and phosphopeptides can be applied to various sample types to achieve deep profiling of multiple PTMs and identify potential target molecules for future studies.

Post-translational modifications (PTMs) change protein structures and functions. Methods for the simultaneous enrichment of multiple PTM types can maximize coverage in analyses. We present a protocol using dual-functional Ti(IV)-immobilized metal affinity chromatography followed by mass spectrometry for the simultaneous enrichment and analysis of protein N-glycosylation and phosphorylation in pancreatic tissues.

인간 췌장 조직에서 N-글리코펩티드와 포스포펩티드의 동시 분석을 위한 스핀-팁 농축 전략

Mass spectrometry can provide deep coverage of post-translational modifications (PTMs), although enrichment of these modifications from complex biological ...

<meta charset="utf8"></head><body>Glycomics-Guided Glycoproteomics를 사용한 대장암 조직의 프로파일링

Glycomics-Guided Glycoproteomics Facilitates Comprehensive Profiling of the Glycoproteome in Complex Tumor Microenvironments

Glycosylation is a common and structurally diverse protein modification that impacts a wide range of tumorigenic processes. Mass spectrometry-driven glycomics and glycoproteomics have emerged as powerful approaches to analyze liberated glycans and intact glycopeptides, respectively, offering a deeper understanding of the heterogeneous glycoproteome in the tumor microenvironment (TME). This protocol details the glycomics-guided glycoproteomics method, an integrated omics technology, which firstly employs porous graphitized carbon-LC-MS/MS-based glycomics to elucidate the glycan structures and their quantitative distribution in the glycome of tumor tissues, cell populations, or bodily fluids being investigated. This allows for a comparative glycomics analysis to identify altered glycosylation across patient groups, disease stages, or conditions, and, importantly, serves to enhance the downstream glycoproteomics analysis of the same sample(s) by creating a library of known glycan structures, thus reducing the data search time and the glycoprotein misidentification rate. Focusing on N-glycoproteome profiling, the sample preparation steps for the glycomics-guided glycoproteomics method are detailed in this protocol, and key aspects of the data collection and analysis are discussed. The glycomics-guided glycoproteomics method provides quantitative information on the glycoproteins present in the TME and their glycosylation sites, site occupancy, and site-specific glycan structures. Representative results are presented from formalin-fixed paraffin-embedded tumor tissues from colorectal cancer patients, demonstrating that the method is sensitive and compatible with tissue sections commonly found in biobanks. Glycomics-guided glycoproteomics, therefore, offers a comprehensive view into the heterogeneity and dynamics of the glycoproteome in complex TMEs, generating robust biochemical data required to better understand the glycobiology of cancers.

<meta charset="utf8"></head><body>Glycomics-guided glycoproteomics는 복잡한 종양 미세환경에서 당단백질체의 포괄적인 프로파일링을 용이하게 합니다.

This protocol details the glycomics-guided glycoproteomics method, an integrated omics technology that offers comprehensive insights into the heterogeneous glycoproteome in complex tumor microenvironments required to better understand the glycobiology of cancers.

Glycomics-guided glycoproteomics는 복잡한 종양 미세환경에서 당단백질체의 포괄적인 프로파일링을 용이하게 합니다. 

Glycosylation is a common and structurally diverse protein modification that impacts a wide range of tumorigenic processes. Mass spectrometry-driven ...

SCAP의 분석

요약

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Glycomics-guided glycoproteomics는 복잡한 종양 미세환경에서 당단백질체의 포괄적인 프로파일링을 용이하게 합니다.

Glycomics-guided glycoproteomics는 복잡한 종양 미세환경에서 당단백질체의 포괄적인 프로파일링을 용이하게 합니다.

Glycomics-guided glycoproteomics는 복잡한 종양 미세환경에서 당단백질체의 포괄적인 프로파일링을 용이하게 합니다.