We thank Joung Jang and Xin Guan for technical assistance. We thank Dr. Rory McQuiston of Virginia Commonwealth University for setting up our first patch clamp rig and advices on experimental procedures. We thank Dr. Samuel Wu for suggestions on voltage clamp recording. The work is supported by NIH grants EY013811, EY022228 and a vision core grant EY002520. C-KC is the Alice R. McPherson Retina Research Foundation Endowed Chair at the Baylor College of Medicine.

윤리 승인 - 기관 동물 관리의 승인과 의학의 베일러 대학의위원회를 사용할 때 동물 주제와 관련된 절차, 규칙 및 연구 동물을위한 건강 지침의 국립 연구소의 규정에 따라 실시 하였다. 1. 외부 및 내부 솔루션 <ol><li> 망막 박리시 이후 전기 생리 녹음에 외부 솔루션으로 포유 동물의 링거액을 사용합니다. 기록의 날 (칼슘)없이 10 배 원액에서 포유 동물의 링거액을 준비하고 carbogenation 15 분 (95 % O 2, 5 % CO 2) 후 염화칼슘 2 드롭 현명한을 추가합니다. 최종 1X 용액은 (mM 단위로)의 NaHCO3 0.8 나 2 HPO 4 0.1의 NaH 2 PO 4,이 CaCl2를 1 황산 10 D 글루코오스 (120)의 NaCl, 5 KCl을 25. </li><li> SAC 진동을 특성화하기 위해 두 개의 내부 솔루션을 사용합니다. 테스트성인 마우스 망막 신경절 세포에 장기간 전체 셀 패치 클램프 녹음에 준비된 솔루션의 유용성과는 사용할 때까지 -20 ° C에서 500 μL 씩의 확인 배치를 저장합니다. <ol><li> 막 잠재적 인 진동을 기록, (mm 단위)가 포함 된 칼륨 기반 내부 솔루션을 사용 : 125 K-글루코 네이트, 8 염화나트륨, 4 ATP-마그네슘, 0.5 리튬 GTP, 5 EGTA, 10 HEPES 및 0.2 % biocytin (/ w V). KOH와 7.3의 pH를 조정합니다. </li><li> (100 CS-메탄, 8 염화나트륨, 4 ATP-마그네슘, 0.5 리튬 GTP, 5 EGTA, 10 HEPES 0.2 % biocytin : 흥분성과 억제 성 시냅스 후 전류를 기록, (mm 단위)가 포함 된 세슘 기반 내부 솔루션을 사용 w / V). CsOH와 7.3의 pH를 조정합니다. </li></ol></li></ol> 기록의 날 2. 준비 <ol><li> 개방 구멍 니트로 셀룰로오스 멤브레인을 제조하기 위해, 수동으로 무딘 16 G 주사기 바늘로 이루어진 사용자 정의 펀칭기로 막을 펀치 개의 깨끗한 유리 플레이트 사이의 평탄 막. 도매상에 대한, 망막 마운트 직경 중앙 구멍을 0.2 mm을 직경 1-1.2 mm이다 4 큰 구멍으로 그것을 둘러싸고 있습니다. </li><li> 전극에 내부 솔루션을로드하기위한 사용자 정의 백필 필라멘트하려면 중간에 10 μL 피펫 팁을 용해하고 냉각 및 경화 될 때까지 부드럽게 녹아 부분을 길게. 직전, 사용이 약간 긴 패치 피펫보다 때까지 필라멘트를 잘라 깨끗한 면도날을 사용합니다. </li><li> 내부 필라멘트와 붕규산 유리 관에서 프로그램 풀러에 패치 피펫을 당깁니다. 실험 당일 가능한 Micropipette 제조 및 즉시 사용합니다. 참고 : 열 : 기록 주머니를 들어, 우리는 다음과 같은 풀러 설정 사용 484; 당기 : 0; 속도 : 25; 시간 지연 : 1; 압력 : 400, 462 붕규산 튜브의 OD 및 ID의 램프 값은 각각 1.65 mm, 1.0 mm이다. 피펫의 저항은 10-14 MΩ이다. </li><li> 한 시간 조직 수확하기 전에, 샤키하여 내부 용액의 튜브를 해동&gt; 30 분 동안 소용돌이에 겨. </li></ol> 3. 망막 해부 <ol><li> 동물이 발가락 핀치에 응답을 잃을 때까지 산소에 4 % 이소 플루 란으로 동물을 마취. 자궁 전위에 의해 동물을 희생. </li><li> 멀리 직선 지적 홍채 가위로 시신경 헤드 1-2mm의 시신경 오프 모두의 시선을 잘라. </li><li> 혈액을 제거하고 carbogenated 포유 동물 링거액에서 그들을 젖어 깨끗한 종이 타월에 눈알을 굴립니다. 23 G 바늘로 윤부에 구멍을 펀치와 마이크로 가위로 윤부를 따라 절단하여 시선을 이등분. 미세 집게를 사용하여 각막과 렌즈를 제거합니다. <ol><li> 망막 전체 마운트를 들어, 부드럽게 미세 집게와 색소 상피 오프 전체 망막 박리 및 시신경의 머리를 향해 가장자리에서 4 1.5-2 mm 직교 인하합니다. </li></ol></li><li> 접시에 천공 니트로 셀룰로오스 막 담가 부드럽게 그것을 통해 망막을 드래그GCL면을 위로. 전체 마운트 망막을 준비 할 때 중앙 홀에 시신경의 머리를 놓습니다. 또 다른 깨끗한 접시에 망막과 멤브레인을 전송합니다. 부드럽게 몰타 십자가 모양과 구멍을 통해 네 개의 모서리를 배치하기 위해 미세 페인트 브러시와 망막을 평평. <ol><li> 망막의 일부가 한 번에 조사 할 경우, 색소 상피 세포가 부착 상태를 유지하여 면도날 3-4 개로 단계 3.3에서 제조 한 각각의 아이 컵 잘랐다. carbogenated 외부 용액에 빛에서 사용되지 않는 부분을 보호하고 12 시간 내에서 사용합니다. </li></ol></li><li> 건조 필터 종이와 니트로 셀룰로오스 멤브레인을 가릴와 집게로 유리체 및 내부 경계 막 및 페인트 브러시를 제거합니다. </li><li> 모든 망막 가장자리가 완전히 바닥에 밀봉 된 유리 커버 슬립으로 기록 챔버로 어셈블리를 전송하기 전에 막에 부착되어 있는지 확인하십시오. 커버 슬립과 rehydrat에 진공 그리스와 멤브레인을 고정외부 솔루션 망막 전자. 어셈블리 아래에 공기 방울 트랩에주의하지 말라. </li><li> 직립 현미경의 무대에 챔버를 설정합니다. 분당 ~ 3 ㎖의 속도로 따뜻한 (34-35 ℃) carbogenated 외부 용액으로 관류 챔버. </li><li> 미분 간섭 대비 (DIC) 및 / 또는 표면 형광 아래 GCL 및 INL 뉴런을 볼 수있는 60 배 물 침지 렌즈를 사용하여 먼저 10 배 대물 렌즈에서 망막을 검사합니다. tdTomato 발현 보안 인증을 시각화 흰색은 554 나노 미터의 여기 필터 및 581 나노 미터의 방출 필터와 조합 된 LED 광원을 사용한다. </li></ol> 평면 마운트 망막 4. 전체 셀 패치 클램프 녹음 <ol><li> 사용자 지정 백업 광고 필라멘트에 주사기 필터를 통해 내부 솔루션을 필터링합니다. </li><li> 갓 뽑아 마이크로 피펫으로 필라멘트를 삽입하고 솔루션&gt;의은 전극 와이어를 커버 할 때까지 끝 근처의 내부 솔루션을 분배5mm. 가압 또는 튜브에 연결된 10 ㎖ 플라스틱 주사기의 플런저를 당김으로써 조정될 수있는 전극 내부의 압력을 통해 흡입 극 전극 홀더 상에 마이크로 피펫을 고정. </li><li> 목적 아래 피펫을 찾아 망막 위 ~ 100 μm의 아래로 가져. 전류 종동 모드 (I = 0)에서 DC가 기립 DC 전압 신호를 제로로 오프셋을. 이 욕에있는 동안 피펫을 고정 크기의 구형파 전류를 주입 전류 클램프 (I 클램프) 모드에서 피펫 저항을 측정하고 Raccess 노브를 돌려서 차이를 중화. 옴의 법칙에 의해 피펫 저항을 계산하기 위해 Raccess 노브에 읽기를 사용합니다. </li><li> 천천히 10 μm의 망막 위의 전극에 ~를 가져온다. 전극에 긍정적 인 압력을 적용합니다. 이 망막에 접근 피펫 팁 근처의 반사 변화를보십시오. 신속하게 그러나 부드럽게 GCL에 피펫을 강제하고 긍정적 인 pressu을 감소즉시 다시. </li><li> 표지 된 신경 세포를 향해 피펫을 이동합니다. 다른 신경, 혈관과 뮐러 세포의 endfeet 접촉하지 마십시오. 전극의 막힘을 방지하기 위해 필요한 경우 더 긍정적 인 압력을 적용합니다. </li><li> 딤플이 보일 때까지 레이블 신경 세포의 중간 선 근처에 피펫 팁을 배치합니다. 긍정적 인 압력을 해제하고 세포막은 피펫 팁에 다시 반송 할 수 있습니다. </li><li> 기가 옴 밀봉의 형성을 돕기 위해 피펫 20 120 pA에 부정적인 전류를 적용합니다. 피펫으로 세포막을 당길 필요 부드러운 흡입을 적용한다. 세포막을 파열 인감 형성 후 5 분을 기다립니다. 이 누출 된 내부 솔루션은 superfusion에 의해 삭제 될 수 있습니다. 부드럽게 흡인 막 파열. </li><li> 막 파열 후 현재 클램프 모드에있는 동안, 다리의 균형을 전환하고 Raccess 노브를 사용하여 조정합니다. 주 : 어떤 경우 SAC 같은 작은 세포의 경우, 단지 약간의 조정이 필요하다. Alternatively, 기록 흥분성 각각 (0 MV 주위)에 (-75 MV 주변) 클로라이드의 반전 전위에서 셀과 글루타메이트를 유지하여 전압 클램프 모드 (V 클램프)의 억제 시냅스 전류. 확인하고 가끔 망막 및 / 또는 미세 조작기 드리프트를 수용하기 위해 필요한 경우 피펫 위치를 조정합니다. </li><li> 신선에 (예 CNQX, AP5, 피크로 톡신, tubocurarine 등) 및 채널 변조기 (예 flupirtine, 도파민 meclofenamic 산 등) 시냅스 차단제 준비 과정 및 약물 치료 전후 막 전위 또는 전류 변화를 기록 할 냉동 주식에서 실험의 날. carbogenated 링거액과 함께 약물을 희석. 관류를 통해 일괄 적으로 적용 할 수 있습니다. </li><li> 녹화 후, 부드럽게 소마에서 피펫을 제거합니다. 깨끗한 접시에 실에서 어셈블리를 전송합니다. 분리 및 천공 HOL하지 않고 다른 평평 니트로 셀룰로오스 막에 망막을 재 부착ES는 고정 동안 망막 평탄도를 확인합니다. </li><li> RT에서 30 분 동안 4 % 파라 포름 알데하이드에 침지하여 망막 수정. 니트로 셀룰로오스 막에서 망막을 제거하고 1X PBS로 광범위하게 그것을 씻어. 4 ° C (14)에 0.4 % 트리톤 X-100과 1X PBS에 희석 염료 결합 된 스트렙 타비 딘과 O / N 염색으로 기록 된 세포의 형태를 알 수있다. antifade 매체에서 망막을 마운트하고 스캐닝 공 초점 현미경을 사용하여 기록 된 세포를 관찰합니다. 참고 : 휘발성과 독성이 파라 포름 알데히드를 포함하는 절차는 안전을위한 초안 챔버에서 수행되어야한다. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

많은 실험실이 준비 15-18을 마운트 평평에서 GCL 신경 세포에서 기록했지만, 우리의 절차는 INL 뉴런에서 기록 할 수 있습니다. 우리는 이에 성공 일상적인 레코딩을위한 중요한 몇 가지 단계를 강조한다. 망막의 신선도 및 평탄성 기록 피펫을 관통 중요하다. 이 점에있어서, 상기 천공 된 니트로 셀룰로오스 막에 대한 망막의 확고한 부착 최우선 적시 재수 (단계 3.4-3.6)이어서 용액의 과도 흡수에 의해 달성된다. 이 짧은 기간 동안, 보통 미만 30 초, 유리체는 느슨한 젤리처럼 동작 및 박리 할 수있다. 유리체 수동 용액 17,19 또는 18,20 효소 작업에 의해 제거되어 여러 문서 절차에 비해 우리의 기술이 더 효율적이다. 또 다른 자주 사용되는 방법은 각 셀에 대해 빈 패치 피펫을 사용하여 떨어져 내 경계 막 찢어하는 것입니다21, 22를 기록합니다. 우리는 망막을 해체 두려워 인열 방법을 추구하지 않았다. 그러나, 어느 정도 투명한 젤리 같은 유리체 오프를 박리하는 시간에 막에서 망막을 제거 할 수 있습니다. 이 때문에, 니트로 셀룰로오스 막에 대한 망막의 유지가 INL 뉴런를 기록하기위한 필수적으로 실행을 필요로하는 단계이다. 좋은 방법은 잘 평평 완전히 수화 된 니트로 셀룰로스 멤브레인을 사용하는 것이다. 여기서 주목할 점은 기록 가능 영역 사이의 명백한 트레이드 오프 (즉, 펀칭 구멍의 크기), 망막의 평탄성과 막에의 부착 탄력. 더 큰 기록 윈도우가 바람직하지만, 더 큰 펀칭 구멍 망막 첨부 적은 막 영역이 존재한다는 것을 의미한다. 유사하게, 작은 구멍을 통해 망막 장착하는 확고한 부착을 보장하지만, 평탄성이 저하 될 수 있고, 그래서 기록 영역이다. 로 유리체를 통해 전극을 삽입하려면GCL 및 INL는 (단계 4.4), 우리는 전극 걸림을 방지하는 정압을 적용한다. 망막에 침투 할 때이 압력의 즉각적인 감소는 또한 염색 배경을 감소 및 진동을 보존하는 것이 중요합니다. 중요한 체크 포인트는 침투와 인감, GCL 신경 및 INL 뉴런 60 초 내에 바람직하게는 30 초를 얻기까지의 시간을 단축하는 것입니다. 또 다른 중요한 점은 기가 옴 시일의 형성 후, 막 파열되기 전에 5 분의 대기 시간이다. 이러한 대기 기간은 상기 전극의 경로에서 유출 된 내부 용액의 클리어링을 보장하고 높은 칼륨 함량이 일시적으로 이웃하는 신경 세포 탈분극 및 진동을 방해 할 수 있기 때문에 칼륨 계 내부의 용액이 사용되는 경우 특히 적합하다. 마지막으로, 우리의 방법 (단계 4.7)의 다소 비 전통적인 기능은 셀 접근 우리하는 기가 옴 시일을 형성하고 전류 클램프 MO하에 전체 세포 액세스 있다는드, 우리의 초기 전기 생리 녹음으로 우리를 도와 버지니아 커먼 웰스 대학의 박사 로리 McQuiston에 의해 권고있다. 이 방법은 침입시 신속하게 저항 변화 (오실로스코프를 통해 볼 수) 전압 변화에 의해 촬영 된 전체 세포 수준에서 막 전위의 갑작스러운 스윙에서 기록 된 세포를 보호 할 수 있습니다. 우리의 방법의 다른 유용한 특성은 양으로 하전 된 인지질 막 유치 도움 시일 형성을 용이하게 전극 팁에인가되는 네거티브 전류이다. 횡 망막 회로 보존에 관해서는, 망막 (20)의 가로로 얇게 제조 제안되었다. 이 방법이 효율적 가로 확장 돌기 및 기록을위한 촬상 IPL 시냅스 연결을 노출하지만, 수직 통로 불행히도 파괴되고, 따라서이 방법은 제한된 용도로 사용될 수있다. 마지막으로, 개선은 우리의 구현조직 준비 및 기록 절차는 OFF-보안 인증 (7) 등의 INL 뉴런의 일상적인 목표로 녹음 할 수 있습니다. 다양한 조명 조건에서 기록 패치 클램프의 바깥 얼기 층 근처 바이폴라 세포와 수평 세포를 대상으로, 두 광자 이미징을 통합 및 대비가 현미경을 강화함으로써 이제 평면 마운트 준비 가능 간주됩니다.

As an easily accessible part of the central nervous system, the retina has for decades been a useful model in neuroscience studies. Genetic marking of neurons has allowed detailed characterization of synaptic connections in the retina. With many methodologies available to examine function and morphology of retinal neurons, the patch clamp recording technique has been instrumental in our current understanding of vertically transmitted signals in the retina. These signals are originated from photon absorption in photoreceptors and sent to brain visual centers through spiking of retinal ganglion cells (RGCs). Despite a large body of knowledge accumulated thus far, neural diversity in vascularized mammalian retina remains unsolved and obstructs the full appreciation of retinal circuits that subserve normal vision. This is in part because most recordings were performed on retinal slices to trade lateral circuit integrity for access to more proximal retinal neurons1-3. To gain a comprehensive picture on how retina computes visual signals, it is thus desirable to record neurons in flat-mounts wherein lateral connections, large and small, may be better preserved.
When synaptic transmission from photoreceptors to bipolar cells is interrupted due to a defective metabotropic glutamate receptor 6 (mGluR6) signaling pathway in depolarizing bipolar cells4-6 or simply as the result of photoreceptor loss in degenerated retinas7-10, many RGCs exhibit oscillatory activities. These oscillations originate from multiple sources, however the one involving gap junction coupling between AII amacrine cells (AII-ACs) and depolarizing cone bipolar cells (DCBCs) has received the most attention and hence is best understood1,7,11. We have found another source, which persists under pharmacological blockade of the aforementioned AII-AC/DCBC network and drives oscillation of OFF-type SACs in Rho&#916;CTA and Nob mice with deafferentated retinas7,8,12. Here we detail our protocol of preparing retinal flat-mounts for INL neuron recording. This approach uses commercial mouse lines (Jax stock no. 006410 and 007905) to mark cholinergic retinal neurons by fluorescent protein (tdTomato) expression that is identifiable under a fluorescent microscope equipped with contrast enhancing optics. Some experimental results acquired through this approach have been previously reported4,5,7,13.

<table><tbody><tr><td>Fixed-stage fluorescent microscope with DIC</td><td>Olympus</td><td>BX51-WI</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulators</td><td>Sutter</td><td>MP-225</td><td></td></tr><tr><td>Patch clamp amplifier</td><td>A-M System</td><td>AM2400</td><td></td></tr><tr><td>AD converter</td><td>National Instrument</td><td>NI-USB-6221</td><td></td></tr><tr><td>Heater controller</td><td>Warner Instrument</td><td>TC-324B</td><td></td></tr><tr><td>Inline heater</td><td>Warner Instrument</td><td>SC-20</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltic pump</td><td>Rainin</td><td>Dynamax</td><td></td></tr><tr><td>pipette puller</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>Glass tube with filament</td><td>King Precision Glass</td><td>Customized</td><td></td></tr><tr><td>Stimulator</td><td>A.M.P.I.</td><td>Master-8</td><td></td></tr><tr><td>Biocytin</td><td>Sigma</td><td>B4261</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S6191</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher</td><td>BP328-1</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S0876</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S5011</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>M1880</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>Sigma</td><td>G6152</td><td></td></tr><tr><td>K-gluconate</td><td>Sigma</td><td>G4500</td><td></td></tr><tr><td>ATP-Mg</td><td>Sigma</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>Li-GTP</td><td>Sigma</td><td>G5884</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E0396</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma</td><td>P5958</td><td></td></tr><tr><td>Cs-methanesulfonate</td><td>Sigma</td><td>C1426</td><td></td></tr><tr><td>CsOH</td><td>Sigma</td><td>232041</td><td></td></tr><tr><td>Syringer filter</td><td>Nalgene</td><td>171</td><td></td></tr><tr><td>1 ml syring</td><td>Rainin</td><td>17013002</td><td></td></tr><tr><td>10 &amp;mu;l pipette tip</td><td>Genesee Scientific</td><td>24-130RL</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin-488</td><td>ThermoFisher</td><td>S-11223</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Lonza</td><td>17-517Q</td><td></td></tr></tbody></table>

patch clamp recording of starburst amacrine cells in a flat-mount preparation of deafferentated mouse retina

포유류의 망막 신경 세포는 여러 종류로 이루어지는 층상 티슈이다. 그 복잡한 시냅스 네트워크 내에서 처리하는 방법을 시각적 신호를 이해하기 위해, 전기 생리 녹음 자주 개별 뉴런 사이의 연결을 연구하는 데 사용됩니다. 우리는 마우스 망막의 GCL (신경절 세포 층) 및 INL 모두 유 전적으로 표시 뉴런의 패치 클램프 기록 (내부 핵 층)에 대한 평면 장착 준비를 최적화했다. 수직 및 횡 방향 모두 연결이 전 구성에 보존되어 있기 때문에 평면 마운트에 기록 INL 신경 세포를 연구하는 많은 측면 구성 요소와 망막 회로를 허용 조각을 통해 선호한다. 우리는 콜린성 스타 버스트 무 축삭 세포 (보안 인증)으로 망막의 거울 트너가 신경 세포의 반응을 비교하기 위해이 절차를 사용하고 있습니다.

ON-와 deafferentated 마우스 망막에서 OFF 형 주머니의 대표적인 녹음은 그림 1에 나타내었다. GCL 및 INL 모두 콜린성 세포를 안정적으로 tdTomato 형광에 의해 식별 및 DIC에서 전체 셀 패치 클램프 녹음 대상이 될 수 있습니다 (그림 1A) 그들의 막 전위 (상단 트레이스) 및 (하단 흔적, 그림 1B)를 구동 시냅스 전류의 진동을 공개합니다. 억제 및 흥분성 시냅스 전류는 전압 클램프 조건 (그림 1B, 바닥 흔적)에서 각각 0 MV과 -75 MV,에서 세포를 잡고 공개됩니다. IPL을 (그림 1C)에서 전형적인 SAC 수지상 arborization 및 층화 수준은 내부적으로 투석 biocytin에 대한 사후 스트렙 타비 딘 염색으로 시각화 할 수 있습니다. 의 리듬과 막 잠재적 인 변동과 시냅스 현재 변경의 빈도 수전력 스펙트럼 밀도를 계산하여 정량화 될 수있다. 약리 봉쇄 또는 그 부족은 막 전위 발진 7 기본 다른 시냅스 메커니즘을 식별하는데 사용될 수있다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54608/54608fig1.jpg" /> 그림 1. 형태와 멤브레인 놉 마우스 망막의 오프 - 스타 버스트 무 축삭 세포의 전위. (A) 두 INL에서 GCL에서 ON-보안 인증 및 OFF-보안 인증은 쉽게 Cre 호텔 구동 tdTomato의 발현에 의해 식별과 기록의 대상이되었다 DIC에서. 나타낸 바와 같이, 스케일 바는 20 μm의 동일. (B) 상단 흔적 바와 같이 오프 - 보안 인증에서 기록 막 잠재적 인 변화입니다. 바닥 흔적 대표 리듬 흥분성 시냅스 현재 가능한 잠재적와 부정맥 억제 시냅스 전류 (IPSC) 막의 진동 드라이브 (EPSC). (C) 기록 세포의 사후 조직 학적 특성은 IPL의 전형적인 SAC 수지상 형태와 계층화 수준을 나타냅니다. 스케일 바는 바와 같이 50 μm의 동일. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54608/54608fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Patch Clamp Recording of Starburst Amacrine Cells in a Flat-mount Preparation of Deafferentated Mouse Retina

이 프로토콜은 평면 장착 준비에서 망막 신경 세포에 전체 셀 패치 클램프 녹음을 수행하는 방법을 보여줍니다.

Deafferentated 마우스 망막의 플랫 마운트 준비에 별 모양 무 축삭 세포의 패치 클램프 녹음

The mammalian retina is a layered tissue composed of multiple neuronal types. To understand how visual signals are processed within its intricate synaptic ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.2K 조회수.  Baylor College of Medicine.  이 프로토콜은 평면 장착 준비에서 망막 신경 세포에 전체 셀 패치 클램프 녹음을 수행하는 방법을 보여줍니다. 

비디오: Patch Clamp Recording of Starburst Amacrine Cells in a Flat-mount Preparation of Deafferentated Mouse Retina

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

어두운 적응 슬라이스 준비에 마우스 망막 뉴런에서 패치 클램프 레코딩

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

연구

신경과학

An Isolated Retinal Preparation to Record Light Response from Genetically Labeled Retinal Ganglion Cells

The first steps in vertebrate vision take place when light stimulates the rod and cone photoreceptors of the retina 1. This information is then segregated into what are known as the ON and OFF pathways. The photoreceptors signal light information to the bipolar cells (BCs), which depolarize in response to increases (On BCs) or decreases (Off BCs) in light intensity. This segregation of light information is maintained at the level of the retinal ganglion cells (RGCs), which have dendrites stratifying in either the Off sublamina of the inner plexiform layer (IPL), where they receive direct excitatory input from Off BCs, or stratifying in the On sublamina of the IPL, where they receive direct excitatory input from On BCs. This segregation of information regarding increases or decreases in illumination (the On and Off pathways) is conserved and signaled to the brain in parallel.
The RGCs are the output cells of the retina, and are thus an important cell to study in order to understand how light information is signaled to visual nuclei in the brain. Advances in mouse genetics over recent decades have resulted in a variety of fluorescent reporter mouse lines where specific RGC populations are labeled with a fluorescent protein to allow for identification of RGC subtypes 2 3 4 and specific targeting for electrophysiological recording. Here, we present a method for recording light responses from fluorescently labeled ganglion cells in an intact, isolated retinal preparation. This isolated retinal preparation allows for recordings from RGCs where the dendritic arbor is intact and the inputs across the entire RGC dendritic arbor are preserved. This method is applicable across a variety of ganglion cell subtypes and is amenable to a wide variety of single-cell physiological techniques.

This article provides a description of how to dissect and record from the isolated retinal preparation in mouse. In particular, we describe how to record light responses from a fluorescently labeled ganglion cell population and subsequently identify and analyze its morphology.

유전적으로 망막 신경절 라벨 셀에서 라이트 응답을 기록하기 위해 절연 망막 준비

The first steps in vertebrate vision take place when light stimulates the rod and cone photoreceptors of the retina 1.  This information is then ...

Transretinal ERG Recordings from Mouse Retina: Rod and Cone Photoresponses

There are two distinct classes of image-forming photoreceptors in the vertebrate retina: rods and cones. Rods are able to detect single photons of light whereas cones operate continuously under rapidly changing bright light conditions. Absorption of light by rod- and cone-specific visual pigments in the outer segments of photoreceptors triggers a phototransduction cascade that eventually leads to closure of cyclic nucleotide-gated channels on the plasma membrane and cell hyperpolarization. This light-induced change in membrane current and potential can be registered as a photoresponse, by either classical suction electrode recording technique1,2 or by transretinal electroretinogram recordings (ERG) from isolated retinas with pharmacologically blocked postsynaptic response components3-5. The latter method allows drug-accessible long-lasting recordings from mouse photoreceptors and is particularly useful for obtaining stable photoresponses from the scarce and fragile mouse cones. In the case of cones, such experiments can be performed both in dark-adapted conditions and following intense illumination that bleaches essentially all visual pigment, to monitor the process of cone photosensitivity recovery during dark adaptation6,7. In this video, we will show how to perform rod- and M/L-cone-driven transretinal recordings from dark-adapted mouse retina. Rod recordings will be carried out using retina of wild type (C57Bl/6) mice. For simplicity, cone recordings will be obtained from genetically modified rod transducin &alpha;-subunit knockout (T&alpha;-/-) mice which lack rod signaling8.

We describe a relatively simple method of transretinal electroretinogram (ERG) recordings for obtaining rod and cone photoresponses from intact mouse retina. This approach takes advantage of the block of synaptic transmission from photoreceptors to isolate their light responses and record them using field electrodes placed across the isolated flat-mounted retina.

마우스 망막에서 Transretinal 에르그 레코딩 :로드 및 원뿔 Photoresponses

There are two distinct classes of image-forming photoreceptors in the vertebrate retina: rods and cones. Rods are able to detect single photons of light ...

Electrophysiological Characterization of GFP-Expressing Cell Populations in the Intact Retina

Studying the physiological properties and synaptic connections of specific neurons in the intact tissue is a challenge for those cells that lack conspicuous morphological features or show a low population density. This applies particularly to retinal amacrine cells, an exceptionally multiform class of interneurons that comprise roughly 30 subtypes in mammals1. Though being a crucial part of the visual processing by shaping the retinal output2, most of these subtypes have not been studied up to now in a functional context because encountering these cells with a recording electrode is a rare event.
Recently, a multitude of transgenic mouse lines is available that express fluorescent markers like green fluorescent protein (GFP) under the control of promoters for membrane receptors or enzymes that are specific to only a subset of neurons in a given tissue3,4. These pre-labeled cells are therefore accessible to directed microelectrode targeting under microscopic control, permitting the systematic study of their physiological properties in situ. However, excitation of fluorescent markers is accompanied by the risk of phototoxicity for the living tissue. In the retina, this approach is additionally hampered by the problem that excitation light causes appropriate stimulation of the photoreceptors, thus inflicting photopigment bleaching and transferring the retinal circuits into a light-adapted condition. These drawbacks are overcome by using infrared excitation delivered by a mode-locked laser in short pulses of the femtosecond range. Two-photon excitation provides energy sufficient for fluorophore excitation and at the same time restricts the excitation to a small tissue volume minimizing the hazards of photodamage5. Also, it leaves the retina responsive to visual stimuli since infrared light (&gt;850 nm) is only poorly absorbed by photopigments6.
In this article we demonstrate the use of a transgenic mouse retina to attain electrophysiological in situ recordings from GFP-expressing cells that are visually targeted by two-photon excitation. The retina is prepared and maintained in darkness and can be subjected to optical stimuli which are projected through the condenser of the microscope (Figure 1). Patch-clamp recording of light responses can be combined with dye filling to reveal the morphology and to check for gap junction-mediated dye coupling to neighboring cells, so that the target cell can by studied on different experimental levels.

This article depicts the recording of individual cells from fluorescently tagged neuronal populations in the intact mouse retina. By using two-photon infrared excitation transgenetically labeled cells were targeted for patch-clamp recording to study their light responses, receptive field properties, and morphology.

손상 망막의 특성 Electrophysiological GFP - 표현 세포 집단

Studying the physiological properties and synaptic connections of specific neurons in the intact tissue is a challenge for those cells that lack ...

Implementing Dynamic Clamp with Synaptic and Artificial Conductances in Mouse Retinal Ganglion Cells

Ganglion cells are the output neurons of the retina and their activity reflects the integration of multiple synaptic inputs arising from specific neural circuits. Patch clamp techniques, in voltage clamp and current clamp configurations, are commonly used to study the physiological properties of neurons and to characterize their synaptic inputs. Although the application of these techniques is highly informative, they pose various limitations. For example, it is difficult to quantify how the precise interactions of excitatory and inhibitory inputs determine response output. To address this issue, we used a modified current clamp technique, dynamic clamp, also called conductance clamp 1, 2, 3 and examined the impact of excitatory and inhibitory synaptic inputs on neuronal excitability. This technique requires the injection of current into the cell and is dependent on the real-time feedback of its membrane potential at that time. The injected current is calculated from predetermined excitatory and inhibitory synaptic conductances, their reversal potentials and the cell's instantaneous membrane potential. Details on the experimental procedures, patch clamping cells to achieve a whole-cell configuration and employment of the dynamic clamp technique are illustrated in this video article. Here, we show the responses of mouse retinal ganglion cells to various conductance waveforms obtained from physiological experiments in control conditions or in the presence of drugs. Furthermore, we show the use of artificial excitatory and inhibitory conductances generated using alpha functions to investigate the responses of the cells.

This video article illustrates the set-up, the procedures to patch cell bodies and how to implement dynamic clamp recordings from ganglion cells in whole-mount mouse retinae. This technique allows the investigation of the precise contribution of excitatory and inhibitory synaptic inputs, and their relative magnitude and timing to neuronal spiking.

마우스 망막 신경절 세포의 시냅스와 인공 컨덕턴스와 동적 클램프 구현

Ganglion cells are the output neurons of the  retina and their activity reflects the integration of multiple synaptic inputs  arising from specific neural ...

Recording Light-evoked Postsynaptic Responses in Neurons in Dark-adapted, Mouse Retinal Slice Preparations Using Patch Clamp Techniques

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. Retinal neurons in the network comprise of numerous subtypes. More than 10 subtypes of bipolar cells, ganglion cells, and amacrine cells have been identified by morphological studies. Multiple subtypes of retinal neurons are thought to encode distinct features of visual signaling, such as motion and color, and form multiple neural pathways. However, the functional roles of each neuron in visual signal processing are not fully understood. The patch clamp method is useful to address this fundamental question. Here, a protocol to record light-evoked synaptic responses in mouse retinal neurons using patch clamp recordings in dark-adapted conditions is provided. The mouse eyes are dark-adapted O/N, and retinal slice preparations are dissected in a dark room using infrared illumination and viewers. Infrared light does not activate mouse photoreceptors and thus preserves their light responsiveness. Patch clamp is used to record light-evoked responses in retinal neurons. A fluorescent dye is injected during recordings to characterize neuronal morphological subtypes. This procedure enables us to determine the physiological functions of each neuron in the mouse retina.

We will demonstrate how to prepare retinal slices from the mouse eye and record light responses in retinal neurons. The entire procedure is conducted in dark-adapted conditions.

녹화 패치 클램프 기술을 사용하여 어두운 적응 마우스 망막 슬라이스 준비에 신경 세포의 시냅스 응답 빛-유발

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. ...

Preparation of Horizontal Slices of Adult Mouse Retina for Electrophysiological Studies

Vertical slice preparations are well established to study circuitry and signal transmission in the adult mammalian retina. The plane of sectioning in these preparations is perpendicular to the retinal surface, making it ideal for the study of radially oriented neurons like photoreceptors and bipolar cells. However, the large dendritic arbors of horizontal cells, wide-field amacrine cells, and ganglion cells are mostly truncated, leaving markedly reduced synaptic activity in these cells. Whereas ganglion cells and displaced amacrine cells can be studied in a whole-mounted preparation of the retina, horizontal cells and amacrine cells located in the inner nuclear layer are only poorly accessible for electrodes in whole retina tissue.
To achieve maximum accessibility and synaptic integrity, we developed a horizontal slice preparation of the mouse retina, and studied signal transmission at the synapse between photoreceptors and horizontal cells. Horizontal sectioning allows&#160;(1) easy and unambiguous visual identification of horizontal cell bodies for electrode targeting, and (2) preservation of the extended horizontal cell dendritic fields, as a prerequisite for intact and functional cone synaptic input to horizontal cell dendrites.
Horizontal cells from horizontal slices exhibited tonic synaptic activity in the dark, and they responded to brief flashes of light with a reduction of inward current and diminished synaptic activity. Immunocytochemical evidence indicates that almost all cones within the dendritic field of a horizontal cell establish synapses with its peripheral dendrites. The horizontal slice preparation is therefore well suited to study the physiological properties of horizontally extended retinal neurons as well as sensory signal transmission and integration across selected synapses.

We developed a horizontal slice preparation of the adult mammalian retina with the plane of sectioning parallel to the retinal surface. Dendritic fields of nonradially oriented retinal neurons were not truncated, allowing the study of signal processing with patch-clamp and imaging techniques.

전기 생리 연구 성인 마우스 망막의 수평 슬라이스의 준비

Vertical slice preparations are well established to study circuitry and signal transmission in the adult mammalian retina. The plane of sectioning in ...

Studying Bipolar and Horizontal Neuronal cells in the murine split retina(쥐 분할 망막의 양극성 및 수평 신경 세포 연구)

Split Retina as an Improved Flatmount Preparation for Studying Inner Nuclear Layer Neurons in Vertebrate Retina

Bipolar cells and horizontal cells of the vertebrate retina are the first neurons to process visual information after photons are detected by photoreceptors. They perform fundamental operations such as light adaptation, contrast sensitivity, and spatial and color opponency. A complete understanding of the precise circuitry and biochemical mechanisms that govern their behavior will advance visual neuroscience research and ophthalmological medicine. However, current preparations for examining bipolar and horizontal cells (retinal whole mounts and vertical slices) are limited in their capacity to capture the anatomy and physiology of these cells. In this work, we present a method for removing photoreceptor cell bodies from live, flatmount mouse retinas, providing enhanced access to bipolar and horizontal cells for efficient patch clamping and rapid immunolabeling. Split retinas are prepared by sandwiching an isolated mouse retina between two pieces of nitrocellulose, then gently peeling them apart. The separation splits the retina just above the outer plexiform layer to yield two pieces of nitrocellulose, one containing the photoreceptor cell bodies and another containing the remaining inner retina. Unlike vertical retina slices, the split retina preparation does not sever the dendritic processes of inner retinal neurons, allowing for recordings from bipolar and horizontal cells that integrate the contributions of gap junction-coupled networks and wide-field amacrine cells. This work demonstrates the versatility of this preparation for the study of horizontal and bipolar cells in electrophysiology, immunohistochemistry, and in situ hybridization experiments.

저자 스포트라이트: 접근성 향상 및 실험 가속화를 위한 Split Retina 기법 사용 

This work presents an alternative flatmount retina preparation in which the removal of photoreceptor cell bodies enables faster antibody diffusion and improved patch pipette access to inner retinal neurons for immunohistochemistry, in situ hybridization, and electrophysiology experiments.

Deafferentated 마우스 망막의 플랫 마운트 준비에 별 모양 무 축삭 세포의 패치 클램프 녹음

요약

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손상 망막의 특성 Electrophysiological GFP - 표현 세포 집단

마우스 망막 신경절 세포의 시냅스와 인공 컨덕턴스와 동적 클램프 구현

녹화 패치 클램프 기술을 사용하여 어두운 적응 마우스 망막 슬라이스 준비에 신경 세포의 시냅스 응답 빛-유발

전기 생리 연구 성인 마우스 망막의 수평 슬라이스의 준비

척추동물 망막의 내부 핵층 뉴런 연구를 위한 개선된 평판 준비로서의 망막 분할

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