The work presented here is supported by the Singapore National Research Foundation under CREATE program (NRF-Technion): The Regenerative Medicine Initiative in Cardiac Restoration Therapy Research Program and by the Public Sector Funding (PSF) 2012 from the Science and Engineering Research Council (SERC) under the Agency for Science, Technology and Research (A*STAR).

주 :이 프로토콜은 표면 에칭 (도 1b) 및 압출 기반 bioprinter (도 1C) 10 배압 이용한 로봇 분배 시스템 (도 1A)의 사용을 설명한다. 폴리스티렌 표면의 1. 수정 <ol><li> 폴리스티렌 조직 배양 플레이트 에칭 인쇄 모두의 높이 일관성을 망치고, 중앙 위쪽 활 경향 때문에 1mm 폴리스티렌 시트를 사용한다. 주 : 폴리스티렌 시트 세포 부착을 위해 변형되지 않은 때, 플라즈마 처리가 수행된다. </li><li> 산소 플라즈마 처리. <ol><li> 우선, 플라즈마 시스템에 연결된 산소 실린더 레귤레이터 2 바의 압력을 선택한다. 그런 다음 컴퓨터의 제어판에 다음 조건에 입력 플라즈마 시스템을 전환 : 150 W, 산소의 30 sscm, 10 분 (전력, 가스 흐름과 시간을 각각 참조). </li><li> 폴리스티렌 substrat 배치플라즈마 챔버에 전자 문을 밀봉 제어판의 시작 버튼을 누릅니다. 소 태아 혈청에서 산소 플라즈마 처리 폴리스티렌 기판을 담가 3 회 1X 인산 완충 생리 식염수 (PBS)를 세척하기 전에 2 시간 동안 37 ℃에서 배양한다. </li></ol></li></ol> 2. 프로그램의 인쇄 패턴 <ol><li> 스타일러스 또는 메스로 먼저 에칭에 표면을 프로그램을 사용합니다. <ol><li> 스타일러스를 사용하는 경우가 쐐기 및 고정 될 때까지, 분배 주사기 (중 5 또는 10 ㎖)의 노즐에 (큰 관심과 함께 내부에서) 1.5 mm 직경의 섬유 바늘을 삽입합니다. 이 인쇄 아암의 클램프기구에 고정 될 수 있도록 메스를 사용하는 경우, 라운드 처리 메스를 선택한다. 주 : 스타일러스가 더 메스 블레이드보다 곡선 패턴을 에칭. </li><li> 먼저 bioprinted 배열을 만들려고 할 때, XY 좌표를 생성하기 위해 번호를 축으로 그래프 용지에 원하는 패턴을 스케치합니다. 그럼 내가스프레드 시트 소프트웨어 (그림 2)에 에칭 / bioprinted 패턴의 좌표 nput. 참고 : &quot;원하는 패턴&quot;선형, S 자형, 또는 원형 등의 다양한 모양이 될 수 있습니다. 여기에 설명 된대로 선택은 심근에 중간 엽 줄기 세포의 분화에 대한 평행 직선 라인으로 필요한 실험 모델에 따라 달라집니다. 캐터 그래프 기능이 제안 플롯 패턴의 시각화를 허용한다. </li><li> 인쇄 / 분배 소프트웨어를 엽니 다. &quot;&gt; 프로그램을 프로그램 추가&quot;를 선택하여 프로그램을 설정하는 &quot;포인트를 추가, 편집&gt;&quot;다음을. X를 보냅니다 y는 함수를 사용하여 소프트웨어 분배 / 인쇄에 스프레드 시트에서 얻은 좌표 값을 &quot;복사 및 붙여 넣기&quot;. </li><li> 표면 상으로 스타일러스 / 잉크 노즐을 배치하기 위해 각각 실행하기 전에 로봇의 &quot;Z&quot;의 높이를 보정. <ol><li> 인쇄 / 분배 소프트웨어에서의 &quot;로봇&quot;옵션을 선택 변경 모드 및 &quot;클릭# 34; 그리고 &quot;교육 모드&quot;옵션을 활성화합니다. 일단 선택되면, 소프트웨어는 로봇의 &quot;조그&quot;기능을 가능하게한다. </li><li> 조그하려면 먼저 메뉴 표시 줄에서 다음 명령을 선택하여 기본 위치로 로봇을 초기화; &quot;로봇&gt; 메카 초기화는&quot;다음 &quot;로봇&gt; 조그&quot;를 선택합니다. 입력 패턴의 기원에 정확하게 스타일러스를 배치하는 데 필요한 &quot;X 및 Y 슬롯&quot;의 (mm 단위) 수치. </li><li> 다음으로, &quot;Z 슬롯&quot;의 입력 (mm 단위) 수치는 표면과 접촉 스타일러스 또는 프린팅 노즐을 배치하지만 굴곡하지 않거나 표면 덴트. 이 점은 &quot;Z&quot;시작 값으로 지정됩니다. 주 : 각 홈의 깊이는 시스템의 Z 높이를 이용하여 용이하게 변경 될 수있다. 40, 80 및 170 ㎛ 인 홈은 1 mm 두께의 폴리스티렌 시이트 (도 4 및 표 1)의 표면으로 절단하는 것으로 입증된다. </li></ol></li><li> 상기 p-을 선택좌표 점의 각각에 대한 RINT 명령, 즉, &quot;선 분배의 시작&quot;은을 종료 로봇에 신호를 &quot;선 분배의 끝을&quot;중간 점을 지정하고 &quot;전달 라인&quot;첫 번째 점과 인쇄 개시를 정의 인쇄 실행. </li><li> 상단 메뉴 표시 줄에서 다음과 명령을 선택하여 로봇에 프로그램을 통신 : &quot;로봇&gt; C &amp; T 데이터를 보내기&quot;. </li><li> &quot;실행&quot;모드로 로봇을 변경하여, 에칭 / 인쇄 실행을 시작합니다. 상단 메뉴 표시 줄에서 &quot;&gt; 실행 모드 스위치 모드 변경&gt; 로봇&quot;을 선택하여이 작업을 수행합니다. </li><li> 로봇 디스펜서 콘솔에서 녹색 &quot;시작 버튼&quot;을 눌러 인쇄 절차를 시작합니다. </li></ol></li></ol> 3. 준비 및 인쇄 세포 함유 젤라틴 Bioink을 <ol><li> 최소 필수 중간 알파 중간 (αMEM)에서 2 % 젤라틴을 용해 (10 % FBS와 2 %의 항생제 / antimycot 보충2 시간 동안 60 ° C에서 IC)는 bioink 용액을 제조 하였다. </li><li> 예비 배양 αMEM / 10 % FBS를 사용하여 10cm의 조직 배양 접시에 70 % 합류하는 중간 엽 줄기 세포를 발현하는 적색 형광 단백질 (RFP-MSC들). 37 ° C에서 5 분 동안 1X 트립신 EDTA 용액으로 중간 피막을 제거하여 서스펜션에 부착 된 세포를 분리. </li><li> 5 분 1,000 XG에서 원심 분리하여 세포를 펠렛과 뜨는을 제거합니다. 1X PBS 0.5 ㎖ 중의 세포 펠렛을 재현 탁하고 혈구를 이용하여 세포 밀도를 계산. </li><li> bioink 상온으로 식힌 후, 부드럽게 5 × 6 셀 ML -1의 최종 농도를 달성하기에 bioink RFP-엽 줄기 세포의 현탁액에 충분한 양으로 혼합한다. </li><li> 밀봉 노즐 프린팅 주사기로 세포 베어링 bioink 붓는다. 인쇄 가능한 점도를 달성하기 위해 4 ° C에로드 된 주사기를 진정. </li><li> 자동화 된에로드 된 주사기를 놓습니다로봇 분배 시스템의 공압 라인을 연결하고. 주사기 루어 봉인을 제거하고 인쇄 노즐을 부착합니다. </li><li> 5mm에서 0.05 MPa의 배압을 사용하여 얇은 라인으로 cellularized bioinks 돌출 / 27 G 바늘 / 노즐을 통하여 10 ㎖ 주사기로부터 초 쓰기 속도가 미리 프로그램 증착 다음, 폴리스티렌 필름 표면 상 (원주 위에 추천 테이퍼) 2.1 단계에 설명 된 패턴은 사전 식각 홈 상에 cellularized bioink을 배치합니다. </li><li> 실온에서 1 시간 배양 후, 도립 형광 현미경을 이용하여 시청하기 전에 24 시간 (세포가 감지 에칭 특성에 반응 할 수 있도록)에 전지 (10 % FBS 및 항생 물질로 보충) 10 ml의 성장 배지를 추가 부화 10 배 배율에서. </li></ol>

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The authors declare they have no competing financial interest.

이 과정의 중요한 단계는 프로세스가 기능에 세포 침전을 허용 출혈 / bioink 확산없이 인쇄 전단 응력 세포 사멸없이 세포를 제공하고 불필요한 리니지쪽으로 분화를 유발하지 않아야 같이 줄기 세포의 실제 bioprinting 전달된다. 예상 된 셀의 정렬이 발생하지 않으면, bioink 점도는 인쇄의 적합성을 평가한다. bioink는 세포 패턴 중합체 표면에 침전 할 수 있다는 것이 중요하다. bioink 중합체의 농도는 감소 될 수 있거나 그것의 온도는 점도를 감소시키고 셀의 침강을 촉진하는 (37 ° C에서 최대까지) 증가 하였다. 그러나 이러한 감소는 / 블리드 후 인쇄를 확산하기 위해 bioink의 원인이 될 수 있습니다. 여기에서 우리는 2 % 젤라틴 1X PBS에 용해 (V / w)을 사용하는 것이 좋습니다. 세포 농도가 인쇄 후 작게 나타나는 경우 인쇄에 의한 전단 응력을 위태롭게 할 수있다인쇄 된 세포 (7)의 생존. 이전과 같은 레사 주린의 fluoresence (7)의 활성화로 생존 분석을 사용하여 인쇄 한 후 bioink의 셀을 선택합니다. bioprinted 줄기 세포가 표면에 접촉하지만 일치하지 않는 경우 또한, 다음 인쇄 중에 전단 응력이 불필요한 분화 경로를 트리거링함으로써 다 능성을 감소 할 수있다. 포스트 인쇄 stemness은 같은 CD 29 10,19,20으로 줄기 세포 마커를 사용하여 형광 활성화 된 셀 정렬 (FACS) 분석에 의해 평가 될 수있다. 이 전단 응력은 세포에 악영향을 갖는 것을 발견된다면, bioink 인쇄 점도가 추가 또는 알긴산 등을 얇게 전단 가진 bioink 중합체로 대체함으로써 감소 될 수 있고, 플루로 닉 F127, 히알루 론산, 젤란 검, 젤라틴 메타 크릴 레이트, 폴리에틸렌 산화물 19, 21-25. 마지막으로 최적화 될 수있는 다른 특징은 프린트 배압, bioink 셀 밀도를 포함노즐 직경. 배압은 bioink의 점도 최적화가 필요하며 이산 깨지지 추적을 얻기 위해 변경 될 수있다. 높은 세포 농도는 bioink 점도를 증가시키고, 상기 프린트 헤드를 방해 할 수있다. 그러나, 이러한 압출 공정은 다른 bioprinting 방법 (26, 27)보다 상대적으로 높은 세포 밀도의 인쇄를 허용 않는다. 잉크 노즐 게이지의 선택은 작은 직경의 노즐은 미세 추적을 생성 할 수 있지만 막히는 경향이되기 때문에 고려되어야한다. 테이퍼 노즐은 동일한 유량 원통형 노즐로하지만 따라서 세포 생존 28 개선 낮은 전단 응력에서 달성 될 수 있기 때문에 더 잘 작동하는 것으로 밝혀졌다. 배압 보조 증착법 인해 최소 프로그래밍 스텝 길이, 예컨대, 잉크젯 및 레이저를 이용한 방법 등의 다른 셀의 인쇄 방법보다 더 적은 해상도를 압출 bioprinting로하고, 상기 확산 EMERGbioink을 보내고. 그러나, 배압 압출 장비는 가장 쉽게 에칭 스타일러스의 포함을 위해 수정된다. PDMS 성형이어서, 포토 리소그래피를 이용한 패터닝과 같은 마이크로 그루브 제조하는 다른 방법은 로봇 에칭보다 훨씬 더 많은 단계를 갖고있어서 새로운 12,15,29-31 기존 패턴을 수정하거나 제조 덜 다재다능하다. 이 방법은 하나 이상의 세포 유형의 위치, 방향 및 배치가 중요 세포 상호 작용의 시험 관내 연구를위한 도구를 제공한다. 여러 유형의 세포를 포함하는 중간 엽 줄기 세포, 섬유 아세포 및 평활근 세포 표면 상에 정렬 홈 1,10,14,18 알려져있다. 여기에 제시된 에칭 패턴, 수정 매우 빠르고 쉽게 재 인쇄 할 수 있습니다. 홈을 가진 표면 패터닝 세포 부착, 형태, 이전의 연구에서 사용 된 세포의 분화 된 줄기 이것은 관심사이다. 또한, 전t는 신경 및 근골격 조직 공학 (18), (32, 33)에 적용되고있다. 그루브는 여러 종류의 세포에 대한 세포 분화 또는 표현형 조절에 중요한 역할을 수행하기 때문에,이 방법은, 홈을 만들 분화를 돕기와 스크린이 수행 될 수 있도록 분리 된 행의 셀을 증착하는데 사용될 수있다. 현재, 우리는 휴대 방향이 심장 조직 12-14,34의 기능에 중요 한, 심근 세포 시트의 생산을위한 세포의 이방성 세포 배열을 촉진하기 위해이 방법을 평가한다. 여기 시연 접근 방식은 결국 사라집니다 가용성 bioink을 사용한다. 더 영구적 하이드로 범위가 요구되는 경우, 다음 미생물 트랜스 글 루타 미나 제의 포함은 링크를 교차하며 셀 (9), UV가 crosslinkin을 시작한 35이. Bioinks도 메타 크릴 레이트 중합체를 이용할 수에 악영향없이 젤라틴 계 것과 단백질 히드로 안정화cytocompatible 방식으로 36 셀 베어링 하이드로 겔의 g. 그러나, 우리의 경험에서 그것이 발견 된 해당 폴리 비교할 때 하이드로 겔 중합체 표면 (보다 용이하게 박리), 및 더 cytocompatible 환경 사이의 향상된 상호 작용을 부여 된 트랜스 글 루타 미나 가교 (에틸렌 글리콜) 디 아크릴 레이트 (PEGDA), 하이드로 겔 (37).

셀 배치의 고의적 인 패턴은 생체 내 세포 조직 1 모방 문화의 형성을 가능하게한다. 사실, 여러 종류의 세포 사이의 상호 작용에 대한 연구는 공간 배치 2,3를 구성하여 도움을받을 수 있습니다. 대부분 패터닝 시스템은 촉진 또는 후속 수동 셀 증착하여 세포 부착을 방지하기위한 표면 개질 방법에 의존한다. Bioprinting 세포 분포 하나 이상의 공간 및 시간 제어를 제공합니다. 이러한 기능 이외에도 bioprinting 기하학적 복합체 지지체 (4)를 생성하기위한 기술적으로 간단 신속하고 비용 효과적인 방법 인 것으로 설명되었다. 그것은 컴퓨터 디자인 소프트웨어를 이용하고, 제조 공정 4에 셀의 도입을 허용한다. Bioprinting 시스템의 기반이 레이저로 자신의 작업 원칙을 기준으로 분류 된, 잉크젯 기반 또는 4 압출 기반. 그것은 실제 시간 프레임 내에서 임상 적 4-6 크기의 조직 구조의 제작을 허용하기 때문에 압출 bioprinting가 가장 유망한 것으로 설명되었다. 이것은 셀 베어링 하이드로 bioink 기계적 또는 배압 이용한 압출 하나에 의해 수행된다. 여기에서 제시된 방법에서는, 배압을 채용 하였다. 언급 한 바와 같이, 세포를 cytocompatible bioink에 전달된다. 이러한 bioink는 유해한 전단 응력을 생성하지 않고 세포의 전달을 지원하고, 붕괴 또는 7-10 ( &quot;잉크 블리드」라 함)의 확산없이 인쇄 된 트레이스의 무결성을 유지하기에 충분한 점성이어야한다. 그들의 접착면과 세포의 상호 작용은 세포 행동에 영향을 미치는 것으로 알려져있다. 표면 토포 그래피는 셀 형상, 방향 (11), 그리고 심지어 표현형을 제어 할 수있다. 특히, 그루브 및 채널의 제조를 유도하는 것으로 입증되었다여러 세포 유형에 뻗어, 가늘고 긴 형태. 이 형태의 도입이 능성과 능성 세포의 표현형에 영향을 미치는 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, 홈에 정렬 될 때, 중간 엽 줄기 세포 (MSC)를 통해 합성 10,14-17 수축 표현형을 채택 심근 12,13 및 혈관 평활근 세포쪽으로 분화의 증거를 보여준다. 채널 또는 홈을 정렬 셀은 예를 깊은 반응성 이온 에칭, 전자빔 리소그래피, 직접 레이저 인쇄, 펨토초 레이저, 포토 리소그래피 및 플라즈마 건식 에칭 (18), 다수의 방법을 통하여 폴리머 표면에 생성 될 수있다. 이러한 접근은 종종 시간 소모 복잡한 장치를 필요로 생성 된 패턴의 형상에 한정 될 수있다. 또한, 그들은 bioprinting와 패턴을 동기화하지 않고 즉시 cellularization을 허용하지 않습니다. 자동화의 배위 제어 이동분배 시스템은 솔루션의 증착을 위해 복잡한 패턴을 따를 수 있습니다. 여기서 우리는 마이크로 제어 이동이 셀 방향에 대한 채널을 만드는 데 이용 될 수있는 방법을 보여줍니다. 날카롭게 스타일러스 또는 메스 압출 주사기 대신에 상기 프린트 헤드에 부착되고, 장치는 묘화 소프트웨어의지도하에 중합체 표면을 에칭 할 수있다. 상기 방법은 패턴 디자인에 융통성을 제공하며 일반적으로 폴리스티렌, PTFE, 폴리 카프로 락톤과 같은 생체 공학에 사용되는 고분자 재료에 적용 가능하다. 에칭에 후속 단계로, 세포를 긁어 홈에 직접 bioprinted 수있다. 여기에 사용 된 젤라틴 bioink는 추적을 유지하고 침착 세포가 에칭 기능을 감지 할 수 있도록 모두 할 수 있었다. 에칭 홈에 bioprinted 중간 엽 줄기 세포는 별개의 라인에서 그들을 따라 연장하는 것으로 입증되었다.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Robotic Dispensing System</td><td>Janome</td><td>2300N</td><td></td></tr><tr><td>Plasma Machine</td><td>Femto Science</td><td>Covance</td><td></td></tr><tr><td>USB Microscope</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optical Microscope</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Software&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spreadsheet</td><td>Excel</td><td>Excel</td><td></td></tr><tr><td>Printing Co-ordinate Software</td><td>Janome</td><td>JR C-Points</td><td></td></tr><tr><td>Imaging Software</td><td>National Institutes of Health (NIH)</td><td>ImageJ</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stylus (Blade)</td><td>OLFA</td><td>AK-5</td><td></td></tr><tr><td>5 ml printing syringe</td><td>San-ei Tech</td><td>SH10LL-B</td><td></td></tr><tr><td>30 G printing needle</td><td>San-ei Tech</td><td>SH30-0.25-B</td><td></td></tr><tr><td>1 mm polystyrene sheets</td><td></td><td>Purchased locally</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Invitrogen&amp;nbsp;</td><td>10270-098</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gelatin from porcine skin, Gel strength 300, Type A</td><td>Sigma Aldrich</td><td>9000-70-8</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;MEM</td><td>Invitrogen</td><td>41061-029</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotc antimycotic</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5955-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Red Fluorescent Protein Mesenchymal Stem Cells (RFP-MSCs)</td><td>Cyagen Biosciences Incorporation</td><td>RASMX-01201</td><td></td></tr></tbody></table>

automated robotic dispensing technique for surface guidance and bioprinting of cells

이 원고는 자동 로봇 분배 시스템을 이용하여 하이드로 겔 bioink 이러한 기능으로 세포의 직접적인 전달 하였다 셀 가이드 기능의 도입을 설명한다. 이 세포는쪽으로 침전 및 기능을 감지 할 수 있습니다로 특정 bioink가 선정되었다. 분배 시스템은 보조 배압의 프린트 헤드를 사용하여 하이드로 겔 bioinks 생세포를 bioprints. 그러나, 날카롭게 스타일러스 또는 메스 프린트 헤드를 교체하여, 분배 시스템은 또한 표면 식각 지형 신호를 생성하기 위해 사용될 수있다. 스타일러스의 이동은 X, Y 10 μm의 단계 및 Z 방향으로 프로그램 될 수있다. 패터닝 홈은 홈 &#39;방향과 정렬 긴 형태를 채택하도록 영향을, 중간 엽 줄기 세포를 배향 할 수 있었다. 패터닝은 직선, 동심원 및 정현파에 플로팅 소프트웨어를 사용하여 설계 될 수있다. 후속 절차, 석면에모세포 및 중간 엽 줄기 세포는 배압 구동 압출 헤드에 bioprinting 들면 2 % 젤라틴 bioink 현탁시켰다. 셀 베어링 bioink이어서, 에칭에 사용 된 것과 같은 프로그램 된 좌표를 사용하여 인쇄 하였다. bioprinted 셀 감지 에칭 홈의 방향을 따라 그 긴 방향으로 입증 된 바와 같이 에칭 된 기능에 대응할 수 있었다.

대표적인 결과는 배압 보조 로봇 디스펜스 시스템은 표면 에칭 bioink 인쇄 (도 1 A) 모두를 행하는 압출 bioprinter 기초로 사용될 수 있다는 것을 보여준다. 이 중합체 표면에 에칭 된 홈의 생성에 사용될 수 있으며, 후속하는 기능 (도 1 B 및 C)에 직접 베어링 셀 bioink를 인쇄. 에칭 및 인쇄 모두 곡선 응용 프로그램 (그림 3 AC)에 필요한 방사형 패턴, 프로그래밍 된 좌표로 선형의 인쇄를 가능하게하는 인쇄 / 분배 소프트웨어에 (그림 2) 입력을 결정한다. Z 축 설정 에칭 홈 깊이의 조절 (도 4 및 표 1)을 허용. 교체 한 후하이드로 겔 프린트 헤드와 촉침 에칭을 조정하는 프로그래밍 동일한 디자인 (도 3 D 및 E) 다음에 에칭 된 홈에 직접 세포 베어링 bioink을 제공하는 로봇 분배 시스템을 사용하기 위해 재사용 될 수있다. 도 5 A와 B에서 관찰 될 수있는 바와 같이 줄기 세포는 안에 bioink 표면 결국 침전 bioprinting으로 시딩하고, 감지 및 이산 라인 내의 에칭의 방향을 따라 신장. 기능의 방향으로 정렬 bioprinting 않고 배지에서 접종 세포 그러나 그들은 bioink 인쇄 된 트레이스 세포 제약 증명, 전면 (도 5 C)에 덮여있다. 에칭 기능하지 않고, 배양 배지에 접종 세포는 어떤 방향 또는 정렬 (그림 5 D)을 표시하지 않습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54604/54604fig1.jpg" /> Figu. (1) 다시 : 자동화 로봇 분배 시스템 (A) 장치는 폴리스티렌 슬라이드 (B) 상에 동심원을 에칭 프린트 헤드의 중심 (주사기 고정) 날카롭게 스타일러스의 포함으로 정의 하였다. 배압 이전에 에칭 된 패턴 (C) 상에 압출하고, 입금 도움으로 프린트 헤드이어서, 셀 베어링 젤라틴 bioink를 압출로 변환 될 수있다. 이 수치는 Bhuthalingam 등의 알에서 수정되었습니다. 2015 10. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54604/54604fig2.jpg" /> 그림 2 : 플롯 XY 스프레드 시트 소프트웨어에서 좌표 여기에 표시된 화면 잡아 그래프 플롯에 의해 도시 된 바와 같이 플롯 XY는 정현파 패턴을 만든 좌표 있음을 보여줍니다.. 이 좌표는 복사 / 붙여 넣기를 사용하여 음모를 꾸미고 소프트웨어에 입력했다기능. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54604/54604fig3.jpg" /> 도 3. 새기 패턴 범용성 묘화 소프트웨어로 프로그래밍 된 좌표는 직선 (A), 사인 (B) 및 동심원 (C)을 에칭 할 수 있었다. 폴리스티렌 에칭 홈을 직접 다음 공정 (D) 및 (E) 중 하이드로 겔과 bioink에 인쇄 될 수있다. 이 그림은 Bhuthalingam 등. 2015 10에서 수정되었습니다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/54604/54604fig4.jpg" /> 도 4 :. 새기 홈 깊이 에칭 된 홈의 깊이는 분배 시스템의 Z 축 제어에 의해 조절 될 수있다. 이미지 (C)에 (A) 오버 헤드보기를 표시하고(E) 내지 (D)의 단면도를 나타낸다. 로봇은 40 깊이 ((A) 및 (D)) (90) ((B) 및 (E)) 및 180 ㎛의 ((C) 및 (F))로 표면을 에칭하도록 프로그래밍되었다. 프로그램 된 깊이와 실제 에칭 깊이의 친밀감을 표 1에 표시됩니다.이 수치는 Bhuthalingam 등. 2015 10에서 수정되었습니다. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/54604/54604fig5.jpg" /> 도 5 : Bioink 중간 엽 줄기 세포를 전달 그루브 (A) 및 (B)과의 세 장형의 형태 및 배향에 의해 입증 된 바와 같이 에칭 된 패턴 상 bioink에서 인쇄 RFP-엽 줄기 세포가 온 시드 세포와 비교하여 특징을 감지 할 수있다. (배지에서 즉,) bioink없이 기능 (C &lt;)&gt; / 강한) 및 비 패턴 표면에 (D. 이 그림은 Bhuthalingam 등. 2015 10에서 수정되었습니다. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 프로그램 된 깊이 (μm의) </td><td> 에칭 홈 깊이 (μm의) </td></tr><tr><td> (40) </td><td> 35 ± 7 </td></tr><tr><td> (90) </td><td> 81 ± 6 </td></tr><tr><td> (180) </td><td> 175 ± 3 </td></tr></tbody></table> 표 1 :.. 폴리스티렌의 실제 식각 깊이에 비해 프로그램의 비교는이 수치는 Bhuthalingam 등 2015 10에서 수정되었습니다.

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Automated Robotic Dispensing Technique for Surface Guidance and Bioprinting of Cells

This protocol describes a bioprinting methodology using an automated robotic depositing system that incorporates etched topographical guidance cues with the precision deposition of a cell bearing hydrogel bioink. The printed cells are directly delivered to the etched features and are able to sense and orientate with them.

세포의 표면지도 및 Bioprinting에 대한 자동화 된 로봇 분배 기법

This manuscript describes the introduction of cell guidance features followed by the direct delivery of cells to these features in a hydrogel bioink using ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

6.4K 조회수.  Nanyang Technological University. This protocol describes a bioprinting methodology using an automated robotic depositing system that incorporates etched topographical guidance cues with the precision deposition of a cell bearing hydrogel bioink. The printed cells are directly delivered to the etched features and are able to sense and orientate with them.

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Prescribed 3-D Direct Writing of Suspended Micron/Sub-micron Scale Fiber Structures via a Robotic Dispensing System

A 3-axis dispensing system is utilized to control the initiating and terminating fiber positions and trajectory via the dispensing software. The polymer fiber length and orientation is defined by the spatial positioning of the dispensing system 3-axis stages. The fiber diameter is defined by the prescribed dispense time of the dispensing system valve, the feed rate (the speed at which the stage traverses from an initiating to a terminating position), the gauge diameter of the dispensing tip, the viscosity and surface tension of the polymer solution, and the programmed drawing length. The stage feed rate affects the polymer solution&#8217;s evaporation rate and capillary breakup of the filaments. The dispensing system consists of a pneumatic valve controller, a droplet-dispensing valve and a dispensing tip. Characterization of the direct write process to determine the optimum combination of factors leads to repeatedly acquiring the desired range of fiber diameters. The advantage of this robotic dispensing system is the ease of obtaining a precise range of micron/sub-micron fibers onto a desired, programmed location via automated process control. Here, the discussed self-assembled micron/sub-micron scale 3D structures have been employed to fabricate suspended structures to create micron/sub-micron fluidic devices and bioengineered scaffolds.

Here, we present a protocol to fabricate freely-suspended, micron/sub-micron scale polymer fibers and &#8220;web-like&#8221; structures generated via automated direct writing procedure by means of a 3-axis dispensing system.

일시 중단 된 마이크론 / 서브 마이크론 스케일 섬유 구조의 3 차원 직접 쓰기는 로봇 디스펜스 시스템을 통해 처방

A 3-axis dispensing system is utilized to control the initiating and terminating fiber positions and trajectory via the dispensing software. The polymer ...

연구

공학

The Submerged Printing of Cells onto a Modified Surface Using a Continuous Flow Microspotter

The printing of cells for microarray applications possesses significant challenges including the problem of maintaining physiologically relevant cell phenotype after printing, poor organization and distribution of desired cells, and the inability to deliver drugs and/or nutrients to targeted areas in the array. Our 3D microfluidic printing technology is uniquely capable of sealing and printing arrays of cells onto submerged surfaces in an automated and multiplexed manner. The design of the microfluidic cell array (MFCA) 3D fluidics enables the printhead tip to be lowered into a liquid-filled well or dish and compressed against a surface to form a seal. The soft silicone tip of the printhead behaves like a gasket and is able to form a reversible seal by applying pressure or backing away. Other cells printing technologies such as pin or ink-jet printers are unable to print in submerged applications. Submerged surface printing is essential to maintain phenotypes of cells and to monitor these cells on a surface without disturbing the material surface characteristics. By printing onto submerged surfaces, cell microarrays are produced that allow for drug screening and cytotoxicity assessment in a multitude of areas including cancer, diabetes, inflammation, infections, and cardiovascular disease.

This 3D microfluidic printing technology prints arrays of cells onto submerged surfaces. We describe how arrays of cells are delivered microfluidically in 3D flow cells onto submerged surfaces. By printing onto submerged surfaces, cell microarrays were produced that allow for drug screening and cytotoxicity assessment in a multitude of areas.

연속 흐름 Microspotter을 사용하여 수정 된 표면에 세포의 침수 인쇄

The printing of cells for microarray applications possesses significant challenges including the problem of maintaining physiologically relevant cell ...

생체공학

Robotic Production of Cancer Cell Spheroids with an Aqueous Two-phase System for Drug Testing

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing both mono-culture and co-culture spheroids in a high throughput 96-well plate format is described in this work. This approach utilizes an aqueous two-phase system to confine cells into a drop of the denser aqueous phase immersed within the second aqueous phase. The drop rests on the well surface and keeps cells in close proximity to form a single spheroid. This technology has been adapted to a robotic liquid handler to produce size-controlled spheroids and expedite the process of spheroid production for compound screening applications. Spheroids treated with a clinically-used drug show reduced cell viability with increase in the drug dose. The use of a standard micro-well plate for spheroid generation makes it straightforward to analyze viability of cancer cells of drug-treated spheroids with a micro-plate reader. This technology is straightforward to implement both robotically and with other liquid handling tools such as manual pipettes.

A protocol for robotic printing of cancer cell spheroids in a high throughput 96-well plate format using an aqueous two-phase system is presented.

약물 테스트를위한 수성 2 단계 시스템으로 암 세포 타원체의 로봇 생산

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing ...

Viability of Bioprinted Cellular Constructs Using a Three Dispenser Cartesian Printer

Tissue engineering has centralized its focus on the construction of replacements for non-functional or damaged tissue. The utilization of three-dimensional bioprinting in tissue engineering has generated new methods for the printing of cells and matrix to fabricate biomimetic tissue constructs. The solid freeform fabrication (SFF) method developed for three-dimensional bioprinting uses an additive manufacturing approach by depositing droplets of cells and hydrogels in a layer-by-layer fashion. Bioprinting fabrication is dependent on the specific placement of biological materials into three-dimensional architectures, and the printed constructs should closely mimic the complex organization of cells and extracellular matrices in native tissue. This paper highlights the use of the Palmetto Printer, a Cartesian bioprinter, as well as the process of producing spatially organized, viable constructs while simultaneously allowing control of environmental factors. This methodology utilizes computer-aided design and computer-aided manufacturing to produce these specific and complex geometries. Finally, this approach allows for the reproducible production of fabricated constructs optimized by controllable printing parameters.

A Cartesian bioprinter was designed and fabricated to allow multi-material deposition in precise, reproducible geometries, while also allowing control of environmental factors. Utilizing the three-dimensional bioprinter, complex and viable constructs may be printed and easily reproduced.

세 디스펜서 데카르트 프린터 사용 Bioprinted 세포를 구축의 생존

Tissue engineering has centralized its focus on the construction of replacements for non-functional or damaged tissue. The utilization of ...

Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and fibroblasts are first isolated, counted and mixed at desired cell ratios. They are co-cultured in individual wells in ultra-low attachment 96-well plates. Within 3 days, beating spheroids form. These spheroids are then picked up by a nozzle using vacuum suction and assembled on a needle array using a 3D bioprinter. The spheroids are then allowed to fuse on the needle array. Three days after 3D bioprinting, the spheroids are removed as an intact patch, which is already spontaneously beating. 3D bioprinted cardiac patches exhibit mechanical integration of component spheroids and are highly promising in cardiac tissue regeneration and as 3D models of heart disease.

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials. 3D bioprinted cardiac patches exhibit mechanical integration of component spheroids and are highly promising in cardiac tissue regeneration and as 3D models of heart disease.

3D Bioprinting을 이용한 Spheroids의 기계적 통합을 보여주는 심장 조직의 생성

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and ...

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic bioprinting to generate a scaffold with multilayer interlacing hydrogel microfibers. To achieve smooth bioprinting, a core-sheath microfluidic printhead containing a composite bioink formulation extruded from the core flow and the crosslinking solution carried by the sheath flow, was designed and fitted onto the bioprinter. By blending gelatin methacryloyl (GelMA) with alginate, a polysaccharide that undergoes instantaneous ionic crosslinking in the presence of select divalent ions, followed by a secondary photocrosslinking of the GelMA component to achieve permanent stabilization, a microfibrous scaffold could be obtained using this bioprinting strategy. Importantly, the endothelial cells encapsulated inside the bioprinted microfibers can form the lumen-like structures resembling the vasculature over the course of culture for 16 days. The endothelialized microfibrous scaffold may be further used as a vascular bed to construct a vascularized tissue through subsequent seeding of the secondary cell type into the interstitial space of the microfibers. Microfluidic bioprinting provides a generalized strategy in convenient engineering of vascularized tissues at high fidelity.

We provide a generalized protocol based on a microfluidic bioprinting strategy for engineering a microfibrous vascular bed, where a secondary cell type could be further seeded into the interstitial space of this microfibrous structure to generate vascularized tissues and organoids.

공학에 대 한 미세 Bioprinting 나가도록 조직 및 Organoids

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both cartilage and skin analogs were fabricated after bioink pre-cellularization utilizing a novel passive mixing unit technique. This technique was developed with the aim to simplify the steps involved in the mixing of a cell suspension into a highly viscous bioink. The resolution of filaments deposited through bioprinting necessitates the assurance of uniformity in cell distribution prior to printing to avoid the deposition of regions without cells or retention of large cell clumps that can clog the needle. We demonstrate the ability to rapidly blend a cell suspension with a bioink prior to bioprinting of both cartilage and skin analogs. Both tissue analogs could be cultured for up to 4 weeks. Histological analysis demonstrated both cell viability and deposition of tissue specific extracellular matrix (ECM) markers such as glycosaminoglycans (GAGs) and collagen I respectively.

Cartilage and skin analogs were bioprinted using a nanocellulose-alginate based bioink. The bioinks were cellularized prior to printing via a single step passive mixing unit. The constructs were demonstrated to be uniformly cellularized, have high viability, and exhibit favorable markers of differentiation.

연골과 피부 조직 아날로그 소설 수동 Bioink Precellularization에 대 한 단위 기술 혼합을 이용 하 여 Bioprinting

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

Affordable Oxygen Microscopy-Assisted Biofabrication of Multicellular Spheroids

Multicellular spheroids are important tools for studying tissue and cancer physiology in 3D and are frequently used in tissue engineering as tissue assembling units for biofabrication. While the main power of the spheroid model is in mimicking physical-chemical gradients at the tissue microscale, the real physiological environment (including dynamics of metabolic activity, oxygenation, cell death, and proliferation) inside the spheroids is generally ignored. At the same time, the effects of the growth medium composition and the formation method on the resulting spheroid phenotype are well documented. Thus, characterization and standardization of spheroid phenotype are required to ensure the reproducibility and transparency of the research results. The analysis of average spheroid oxygenation and the value of O2 gradients in three dimensions (3D) can be a simple and universal way for spheroid phenotype characterization, pointing at their metabolic activity, overall viability, and potential to recapitulate in vivo tissue microenvironment. The visualization of 3D oxygenation can be easily combined with multiparametric analysis of additional physiological parameters (such as cell death, proliferation, and cell composition) and applied for continuous oxygenation monitoring and/or end-point measurements. The loading of the O2 probe is performed during the stage of spheroid formation and is compatible with various protocols of spheroid generation. The protocol includes a high-throughput method of spheroid generation with introduced red and near-infrared emitting ratiometric fluorescent O2 nanosensors and the description of multi-parameter assessment of spheroid oxygenation and cell death before and after bioprinting. The experimental examples show comparative O2 gradients analysis in homo- and hetero-cellular spheroids as well as spheroid-based bioprinted constructs. The protocol is compatible with a conventional fluorescence microscope having multiple fluorescence filters and a light-emitting diode as a light source.

The protocol describes high-throughput spheroid generation for bioprinting using the multi-parametric analysis of their oxygenation and cell death on a standard fluorescence microscope. This approach can be applied to control the spheroids viability and perform standardization, which is important in modeling 3D tissue, tumor microenvironment, and successful (micro)tissue biofabrication.

다세포 구상체의 저렴한 산소 현미경 보조 생물 제조

Multicellular spheroids are important tools for studying tissue and cancer physiology in 3D and are frequently used in tissue engineering as tissue ...

Large-Scale, Automated Production of Adipose-Derived Stem Cell Spheroids for 3D Bioprinting

Adipose-derived stromal/stem cells (ASCs) are a subpopulation of cells found in the stromal vascular fraction of human subcutaneous adipose tissue recognized as a classical source of mesenchymal stromal/stem cells. Many studies have been published with ASCs for scaffold-based tissue engineering approaches, which mainly explored the behavior of these cells after their seeding on bioactive scaffolds. However, scaffold-free approaches are emerging to engineer tissues in vitro and in vivo, mainly by using spheroids, to overcome the limitations of scaffold-based approaches.
Spheroids are 3D microtissues formed by the self-assembly process. They can better mimic the architecture and microenvironment of native tissues, mainly due to the magnification of cell-to-cell and cell-to-extracellular matrix interactions. Recently, spheroids are mainly being explored as disease models, drug screening studies, and building blocks for 3D bioprinting. However, for 3D bioprinting approaches, numerous spheroids, homogeneous in size and shape, are necessary to biofabricate complex tissue and organ models. In addition, when spheroids are produced automatically, there is little chance for microbiological contamination, increasing the reproducibility of the method.
The large-scale production of spheroids is considered the first mandatory step for developing a biofabrication line, which continues in the 3D bioprinting process and finishes in the full maturation of the tissue construct in bioreactors. However, the number of studies that explored the large-scale ASC spheroid production are still scarce, together with the number of studies that used ASC spheroids as building blocks for 3D bioprinting. Therefore, this article aims to show the large-scale production of ASC spheroids using a non-adhesive micromolded hydrogel technique spreading ASC spheroids as building blocks for 3D bioprinting approaches.

Here, we describe the large-scale production of adipose-derived stromal/stem cell (ASC) spheroids using an automated pipetting system to seed the cell suspension, thus ensuring homogeneity of spheroid size and shape. These ASC spheroids can be used as building blocks for 3D bioprinting approaches.

3D 바이오프린팅을 위한 지방유래 줄기세포 구상체의 대규모, 자동화 생산

Adipose-derived stromal/stem cells (ASCs) are a subpopulation of cells found in the stromal vascular fraction of human subcutaneous adipose tissue ...

Agarose Fluid Gels Formed by Shear Processing During Gelation for Suspended 3D Bioprinting

The use of granular matrices to support parts during the bioprinting process was first reported by Bhattacharjee et al. in 2015, and since then, several approaches have been developed for the preparation and use of supporting gel beds in 3D bioprinting. This paper describes a process to manufacture microgel suspensions using agarose (known as fluid gels), wherein particle formation is governed by the application of shear during gelation. Such processing produces carefully defined microstructures, with subsequent material properties that impart distinct advantages as embedding print media, both chemically and mechanically. These include behaving as viscoelastic solid-like materials at zero shear, limiting long-range diffusion, and demonstrating the characteristic shear-thinning behavior of flocculated systems. 
On the removal of shear stress, however, fluid gels have the capacity to rapidly recover their elastic properties. This lack of hysteresis is directly linked to the defined microstructures previously alluded to; because of the processing, reactive, non-gelled polymer chains at the particle interface facilitate interparticle interactions-similar to a Velcro effect. This rapid recovery of elastic properties enables bioprinting high-resolution parts from low-viscosity biomaterials, as rapid reformation of the support bed traps the bioink in situ, maintaining its shape. Furthermore, an advantage of agarose fluid gels is the asymmetric gelling/melting transitions (gelation temperature of ~30 &#176;C and melting temperature of ~90 &#176;C). This thermal hysteresis of agarose makes it possible to print and culture the bioprinted part in situ without the supporting fluid gel melting. This protocol shows how to manufacture agarose fluid gels and demonstrates their use to support the production of a range of complex hydrogel parts within suspended-layer additive manufacture (SLAM).

Shear processing during hydrogel formation results in the production of microgel suspensions that shear-thin but rapidly restructure following the removal of shear forces. Such materials have been used as a supporting matrix for bioprinting complex, cell-laden structures. Here, methods used to manufacture the supporting bed and compatible bioinks are described.

부유 된 3D 바이오 프린팅을위한 겔화 동안 전단 처리에 의해 형성된 Agarose 유체 겔

The use of granular matrices to support parts during the bioprinting process was first reported by Bhattacharjee et al. in 2015, and since then, several ...