이 프로젝트는 부분적으로 Zentrales Innovationsprogramm Mittelstand에 (ZIM) 데 Bundesministeriums 대 Wirtschaft 싶게 에네르기 -KF3010902AJ4에 의해 투자된다. 발행 수수료는 BG 외상 병원 튀빙겐, 독일에 의해 덮여있다.

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저자는 더 경쟁 관심이 없음을 선언합니다. 작품의 어떤 부분은 없었 또는 게시를 위해 고려중인 현재 또는 다른 곳에 게시 된있다.

골격 표면하여 임플란트를 기능적 내구성을 결정 생체 내에서 주변 조직과의 상호 작용에서 중요한 역할을한다. 따라서, 지지체의 생체 적합성의 지지체 상에 플레이 팅 세포를 이용한 시험 관내 분석법 (SCP1 세포주)에 의해 연구된다. 얇고 광학적으로 투명 지지체와 잘 작동 현미경 기술은 가난 생체 적합성을 연구하는 불투명 발판 적합합니다. 이것은 불투명 지지체 상당한 왜곡없이 15 침투하는 광을 방지 주로 때문이다. 부분적으로 이러한 문제점을 극복하기 위해, 우리는 이것과 각종 형광체를 사용하는 니트 제조 티타늄 지지체의 ON / 셀 평가 방법을 확립한다. 티타늄 와이어 폴딩 하였다 편성을 가능하게하기 위해, 재료는 강한 부식성 및 독성 물질 (윤활제, 매염제, 전기와 접촉트레이스는 발판에 /에 남아있는 경우 지지체의 생체 적합성을 변경할 수있는 솔루션을), -polishing. 개발 된 간접 형광 프로토콜의 도움 (프로토콜 5)와 함께 우리는 골격 구조를 시각화 할 수 있습니다. 또한, 예를 들면 지지체 특성, 재료의 두께, 각각의 기공 크기와 모양 또는 결합 밀도는 ImageJ에 사용하여 분석 하였다. 미세 화상 골격뿐만 아니라 지지체 표면에 불순물을 시각화 허용 높은 확대 된 표면 형광.도 3b 따라서 성공적으로 개발 세정 프로토콜 확증 결과를 나타낸다. 이 간접 염색 프로토콜의 원리를 쉽게 예, 배양 시간에 영향을 미치는 크기와 해당 확산 기공, 고려 개별 지지체 특성을 가지고, 다른 불투명 지지체에 재생 될 수있다. 또한, 비계 및 현미경 설정의 자동 형광 플로리다의 선택에 영향을 미치는uorophores를 사용합니다. 온라인 도구의 형광 스펙트럼 뷰어는 적절한 형광을 선택하는 데 도움이 될 수 있습니다. 셀 금속 상호 작용은 지지체에 세포의 접착 패턴을 분석함으로써 간접적으로 조사되었다. 프로토콜 6은 GFP 형질 전략을 사용하여 배양 시스템에서의 비 투명 지지체 상에 도금되는 경우에 세포가 시험관 내에서 감시 될 수있는 방법의 방법을 설명한다. 시험 관내 분석법의 예비 결과에 기초하여, 그러한 조성물, 마이크로 지형 거칠기 16 표면 특성은 접착 성을 확립하고 표적 세포의 확산에 중요한 역할을 할 것으로 예측되고있다. 티타늄은 생체 따라서 세포 부착 (도 4 참조)에 대한 기본을 제공하는 기재를 주형으로 작용 될 수된다. 임플란트 표면 토포 그래피는 셀 (16)의 행동에 영향을보고되었다. 본 연구에서는 / 세포 성장 분석확산 및 생존 가능성 정량 측정과 결합하여 형광 염색 기술을 사용. 분석 미묘한 세포 %의 생존 능력의 변화와 골격 물질에 따라 확산 한 것으로 밝혀졌습니다. 그러나, 전환 분석 (미토콘드리아 활동을) 레사 주린에 의해 정량적으로 평가 세포의 기능은 크게 골격 물질에 의해 영향을받지 않았다. 변환 레사 주린 의한 미토콘드리아 활성의 측정은 세포 독성이되지 않는 이점을 가지고있어 긴 배양 기간 동안 반복적으로 수행 될 수있다. 특별한주의가 배경 신호 (거짓 긍정적 인 결과를) 누적되지 않도록에 잔류 레사 주린 작업 용액 떨어져 세척 할 때 수행해야합니다. 이러한 장점에도 불구하고, 레사 주린 변환 분석은 발판에 확산 셀에 대한 정보를 제공하지 않습니다. GFP의 감염 세포 따라서하여의를 시각화 할 수 있도록 (GFP 신호가 14 일 이상 일정하게 유지) 긴 배양 기간에 걸쳐 추적 할 수 있습니다발판 표면에 pecific 성장 패턴. 깊은 지지체에 세포의 시각화는 여전히 임플란트의 절개가 필요합니다 따라서 골격 물질에 의해 제한된다. 이들 두 기술의 조합을 쉽게 배양 시간은 관심있는 세포 유형에 적용 할 수있을 것을 고려하면, 다른 종류의 세포에 전달 될 수있는 큰 이점을 갖는다. 그러나 치료는 예를 들어 다른 불투명 비계,이 방법을 전송할 때주의가 필요하다, 콜라겐 일반적으로 강한 녹색 자동 형광 (17)을 나타내는 골격을 기반으로. 이 경우 다른 형광 태그를 사용할 수 있습니다. 위에서 언급 한 두 가지 방법의 조합에 따라서 여러 가지 장점이있다 (표 2 참조)를 갖는다. 비계 특성, 예를 들면, 인공 지지체 내부에 크기 힘 트랩 세포 기공. 충분한 영양이 공급하는 경우,이 세포는 죽고 서라운드의 세포 생존에 영향을 미치는 단백질 분해 효소를 분비 수 있습니다세포 / 조직을 보내고. 우리와 니트 티타늄 발판에 라이브와 죽은 세포를 시각화 할 수있는 형광 기반의 염색 프로토콜을 적용 할 수 있었다. 간접 형광 염색 프로토콜과 마찬가지로,이 염색 프로토콜의 원리를 쉽게 다른 비 투명 지지체로 전달 될 수있다. 그렇게하는 동안, 각 골격 등록 정보, 예를 들어, 기공의 크기와 해당 확산뿐만 아니라 가능한 자동 형광 현미경 설정은 배양 시간 및 사용 된 형광 물질의 선택에 영향을 미칠 수있는 고려 될 수있다. 여기서 다시 온라인 도구 형광 스펙트럼 뷰어는 적절한 형광을 선택하는 데 도움이 될 수 있습니다. 요약하면, 시험 관내 결과는 제안 니트 티탄 핵 이식 모델 생물학적 프로필을 갖는 것을 나타낸다. 이 자료에 대한 중간 엽 기질 전구 세포 (SCP-1 세포)의 초기 부착 제안이이 티타늄 합금 임플란트 물질에난 생체 적합성이다. 우리가 다른 지형적 파라미터의 관계를 분석되지 않았지만, 지지체 표면 개질 차별화 (18)뿐만 아니라 세포 부착 증식을 향상 수있다. 지지체와 세포 간의 최적의 호환성은 주변 조직으로 잘 주입 통합의 가능성을 높이기 때문에 치료 19 일 후에 생체 내에서 수명이 향상된다. 위의 언급 한 테스트 설정을 사용하여 측정 및 표면 수정에 의해 유도 된 지지체의 생물학적 성능 개선을 시각화 할 수있는 가능성을 열어. 수정되지 않은 임플란트 디자인을 통해 생리 활성 표면과 발판의 환경 설정은 골관절염 연골 통합의 측면에서 더 나은 성능 (20)를 제안한다. 이 연구는 또한 그것의 기계적 특성 및 생체 활성이 6,7보고 된 니트 티타늄 임플란트의 다른 보고서에 의해 강화된다.

만성 허리 통증은 다 인성 질환이다. 퇴행성 디스크 질환의 최소 침습적 치료 방법에 대한 관심은 1950 년대 이후 성장했다. 오늘날, 척추의 분절 다중 융합은 가장 널리 사용되는 치료는 상태가 될 때까지. 이후,이 방법은 종종 영향을받는 세그먼트 1, 2의 이동성의 한계에 이르게의 전 치환술 시대의 탐사는 넓은 관심이되었다. 전체 디스크 교체 및 핵 교체에 상당한 발전 만성 허리 통증 1을 치료하는 좋은 대안이되고있다. 거대한 진전에도 불구하고, 방법 중 어느 것도 임상 적으로 평가되지 않았다. 덜 엄격한 핵 이식은 전체 디스크 교체에 유망한 대안을 나타내는 섬유륜이 3,4 그대로 것이어야한다. 그러나, 시장에 현재 존재하는 핵 이식은 종종 추체, 전위, 디스크 및 t의 수직 높이 손실의 변화와 같은 합병증과 연관된필요한 관련 기계 강성 5 그는 부족. 현재의 문제점을 해결하기 위하여, 티탄 니트 와이어로 이루어지는 신규 한 핵 이식이 성공적 6 개발되었다. 때문에 독특한 니트 구조로, 새로 개발 된 인공 지지체는 예를 들어, 고유 생체 역학적 특성, 감쇠 기능, 기공 크기, 적재 능력 및 신뢰성 (7)을 보여 주었다. 이 새로운 핵 임플란트의 생체 적합성 시험을 목표 임플란트의 불투명 특성 기인 (광) 분석 기술에 심각한 제한을 도시. 생체 적합성을 테스트하기 위하여, 세포 - 금속의 상호 작용이 중요한 역할을한다 8-10. 세포와 지지체 사이의 상호 작용은 호스트 시스템 내에 더 주입 통합 안정화 때문에 필요하다. 그러나, 점점 증식 깊이는 지지체의 기계적 성질을 변경할 수있다. inves의 목표발판 표면은 세포 부착, 증식 및 분화 또는를위한 기반을 제공하는지 여부 tigate 금속은 세포 생존에 영향을 미치는 여부가 불투명 불투명 지지체에 /에서 세포 이미징의 공통 잘 알려진 문제를 해결하는 것이 중요하다. 이 제한 여러 형광을 극복하기 위해 기반 기술을 탐구 하였다. 기업은 살아있는 세포, 세포 구획, 또는 특정 세포 상태 (11)를 시각화 형광체의 넓은 범위를 제공한다. 이 실험 형광체 가장 우리 형광 현미경을 맞추기 위해 온라인 툴 스펙트럼 시청자의 도움으로 선택되었다. 온 세포의 추적을 허용하는 osteochondro-전구 세포는 1) 형광체 (녹색 형광 단백질 / GFP) 표지 : 불투명 니트 티타늄 지지체의 /에 부착 세포 거동의 분석을 위해 개발 된 전략들은 다음을 포함 지지체, 2) 측정 가능성 (미토chondrial 활동) 세포, 3) 시각화 세포 - 세포와 지지체에서 세포 물질의 상호 작용. 절차는 쉽게 다른 부착 세포 및 기타 비 투명 또는 불투명 지지체에 전사 될 수 있다는 장점을 갖는다. 또한, 생존 및 증식 패턴은 며칠에 걸쳐 모니터링 할 수있다 따라서, 이것은 지지체 재료 또는 세포의 제한된 양으로 사용될 수있다. 본 연구는 세포 생존율을 측정 불투명 니트 티타늄 지지체의 ON / osteochondro-전구 세포의 성장 패턴을 시각화 현재 프로토콜의 성공적 사용을 설명한다. 또한, 개발 된 프로토콜 골격 불순물을 결정하고 세척 프로토콜을 확인하기 위해 사용될 수있다.

<table><tbody><tr><td>6/24/48 well plates, T25/ T75 culture flask</td><td>Greiner Bio-One GmbH</td><td>*</td><td></td></tr><tr><td>* 24 well plates</td><td>Greiner Bio-One GmbH</td><td>CELLSTAR 662 160</td><td></td></tr><tr><td>* 48 well plates</td><td>Corning Incorporated USA</td><td>3548</td><td></td></tr><tr><td>* 6 well plates</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>* T25</td><td>Greiner Bio-One GmbH</td><td>690 175</td><td></td></tr><tr><td>* T75</td><td>Greiner Bio-One GmbH</td><td>658 175</td><td></td></tr><tr><td>Acetic acid, purum &amp;ge; 99.0%</td><td>Carl Roth</td><td>3738.4</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Carl Roth</td><td>5025.1</td><td></td></tr><tr><td>Axioplan-2&amp;nbsp;</td><td>Carl Zeiss, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biological safety cabinets</td><td>Thermo Scientific</td><td>safe 2020</td><td></td></tr><tr><td>Calcein acetoxymethyl ester (calcein AM)</td><td>Sigma</td><td>17783</td><td></td></tr><tr><td>Cell Culture Incubtator</td><td>Binder, Tuttlingen, Germany</td><td>9040-0078</td><td></td></tr><tr><td>Filter unit (0.22 &amp;micro;m)</td><td>Millipore, IRL</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuges 5810 R And 5417 R</td><td>Thermo Fisher Scientific, NY</td><td>Megafuge 40R</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td><td>Carl Roth</td><td>4720.2</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s PBS without Ca &amp;amp; Mg</td><td>Sigma</td><td>H15-002</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 99%</td><td>&amp;nbsp;SAV liquid prod. GmBH</td><td>475956</td><td></td></tr><tr><td>Ethidium homodimer</td><td>Sigma</td><td>46043</td><td></td></tr><tr><td>EVOS Fluorescence imaging system</td><td>Life technologies</td><td>AMF4300</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FCS)</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Hausser Scientific, PA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma</td><td>14533-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Knitted titanium nucleus implant</td><td>Buck co &amp;amp; KG,Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MEM Alpha Modification with Glutamine w/o nucleoside</td><td>Sigma</td><td>E15-832</td><td></td></tr><tr><td>Omega microplate Reader</td><td>BMG Labtech,Germany</td><td>FLUOstar Omega</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Sigma</td><td>P11-010</td><td></td></tr><tr><td>Resazurin sodium salt</td><td>Sigma</td><td>199303-1G</td><td></td></tr><tr><td>Sulforhodamine B sodium salt</td><td>Sigma</td><td>S1402-1G</td><td></td></tr><tr><td>Test tube rotator</td><td>Labinco B.V.,The Netherlands</td><td>Model LD-76</td><td></td></tr><tr><td>TRIS (hydroxymethyl) aminomethan</td><td>Carl Roth</td><td>AE15.1</td><td></td></tr><tr><td>Triton</td><td>Carl Roth</td><td>3051.2</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue 0.5%</td><td>Carl Roth</td><td>CN76.1</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA</td><td>Sigma</td><td>L11-004</td><td></td></tr></tbody></table>

imaging cell viability on non-transparent scaffolds &#8212; using the example of a novel knitted titanium implant

Intervertebral disc degeneration and disc herniation is one of the major causes of lower back pain. Depletion of extracellular matrix, culminating in nucleus pulposus (NP) extrusion leads to intervertebral disc destruction. Currently available surgical treatments reduce the pain but do not restore the mechanical functionality of the spine. In order to preserve mechanical features of the spine, total disc or nucleus replacement thus became a wide interest. However, this arthroplasty era is still in an immature state, since none of the existing products have been clinically evaluated.
This study intends to test the biocompatibility of a novel nucleus implant made of knitted titanium wires. Despite all mechanical advantages, the material has its limits for conventional optical analysis as the resulting implant is non-transparent. Here we present a strategy that describes in vitro visualization, tracking and viability testing of osteochondro-progenitor cells on the scaffold. This protocol can be used to visualize the efficiency of the cleaning protocol as well as to investigate the biocompatibility of these and other non-transparent scaffolds. Furthermore, this protocol can be used to show adherence pattern of cells as well as cell viability and proliferation rates on/in the scaffold. This in vitro biocompatibility testing assay provides a propitious tool to analyze cell-material interaction in non-transparent and opaque scaffolds.

예비 결과는 설명 새로운 핵 이식뿐만 아니라 좋은 댐핑 기능을 가지고뿐만 아니라 SCP-1 세포와 생체 적합성 인 것으로 나타났다. 임플란트의 제조 공정 동안, 강한 부식성 및 독성 물질 (윤활제, 매염제, 전기 연마 용액)와 접촉한다. 간접 형광 염색하는 기술을 사용하여, 우리는 잔여 불순물을 시각화하고, 결과적으로, 골격에 물질 부하의 상당한 감소를 도시하는 클리닝 프로토콜을 최적화 할 수 있었다. (3)이 성립 세정 프로토콜의 효율을 나타낸다. 프로토콜 부 (6) 트랜스 상당한에 설명 된대로 셀 재 계면에서 발생하는 이벤트에 의해 결정된다 치환술 치료에 사용되는 임플란트의 성공.도 4는 도금의 24 시간 후 지지체에 부착 된 세포를 나타낸다SCP-1 세포의 fection 효율은 우리가 지지체 (도 2 참조)에 화상 기질 간엽 전구 세포의 성장 패턴을 수 있으므로 관찰되었다. 직접 시각화는 지지체의 생체 적합성을 확인하고 또한 지지체 표면에 부착 패턴 (그림 4)를 보여줍니다. 형광 염색은 지지체 표면에의 확산과 함께 세포의 상호 작용을 조사하기 위해 추가로 수행 될 수있다. 형광 성공적 지지체에 일정 기간 동안 세포 사멸 및 증식을 조사하기 위해 적용되었다. 라이브 죽은 염색 이미지 염색이 성공적으로 일정 기간 동안 세포의 퍼센트의 가능성을 확인하는 발판에서 수행 할 수있는 방법을 예시. 모든 셀에 6 파란색 핵 염색을 보여줍니다 (3342 헥스)를 그림, 빨간색 형광 표지 (에티 디움 호모 다이머) 죽은 세포, 그리고 생존 엄마와 같은 칼 세인-AM의 통합을위한 녹색 표지rker. 칼 세인 AM은 세포의 세포질 칼슘 이온의 존재 하에서 밝은 녹색의 형광을 나타내는 칼 세인으로 변환된다. 훽스트 33342이 세포 DNA 내로의 세포벽은 투과하고하게 인터이다. 이 방법은 모든 세포는 파란색 핵 (그림 6 참조)이 표시됩니다. 티듐 호모 다이머는 세포벽 투과성 아니다 따라서만이 인터 칼 죽은 세포의 DNA 내로. 이 방법은 죽은 세포가 빨간색으로 핵을 표시합니다. 또한, 세포 생존 및 주 위에 지지체에 세포 수의 증가를 접어 전환 분석을 레사 주린 의해 정량화하고, 그래프 (도 7)을 표시. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54537/54537fig1.jpg" /> 도 1 : 세포 혈구 카운팅 챔버 조립체 (A) 설정.. (B) 계산 챔버의 그림 4 × 4 계수 챔버는 세포 COU에 사용NT를. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54537/54537fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54537/54537fig2.jpg" /> 그림 2. GFP 형질 전환 효율 SCP1 세포 포지티브 광고 GFP- 형질 전환 효율을 나타내는 강한 녹색 형광을 나타낸다. 스케일 바 = 1000 μm의, 4 배 확대. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54537/54537fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54537/54537fig3.jpg" /> 그림 3 : Sulforhodamine B 염색 부정적인 이미지 캡처 청소하기 전에 (A) 비 계.. 화살표 발판에 독성 / 부식성 물질의 존재를 나타냅니다. (세정 후의 프로토콜 B) 비계. 스케일 바 = 1000 μm의, 4 배 확대. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54537/54537fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/54537/54537fig4.jpg" /> 도 4 :. 비계 GFP 신호에 SCP1 세포 내 접착 패턴 편성 티타늄 지지체의 표면 상에 세포 부착 및 성장 패턴을 나타낸다. 스케일 바 = 1000 μm의, 4 배 확대. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54537/54537fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/54537/54537fig6.jpg" /> 그림 6 : 인공 지지체에 세포의 공동 형광 염색 (. <st룽&gt;가) 훽스트 핵 염색 (청색) 및 (B) 칼 세인 AM 세포질 염색 (녹색). (C) 화살표 인해 에티 디움 호모 다이머-1 얼룩 (적색)의 흡수에 죽은 세포의 존재를 나타냅니다. (D)는 병합 된 이미지를 보여줍니다. 스케일 바 = 1000 μm의, 4 배 확대. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54537/54537fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 7" src="/files/ftp_upload/54537/54537fig7.jpg" /> 도 7 : 레사 주린 변환 분석 형광을 방출하고 색채 변화를 겪는 최종 생성물 (레조 루핀 (resorufin))에 산화 환원 염료 (레사 주린)의 (A) 생물 환원 반응.. (B) 셀이 0.75 밀리그램 / ㎤의 밀도를 지지체에 도금 때 미토콘드리아 활성을 측정 하였다. 데이터는 플로리다를 사용하여 수집기반 측정 기기를 uorescence. 정의 된 시점 (x 축)에서 590nm의 (Y 축)에서의 형광 강도를 정량 세포 생존율 측정 (예 = 540 nm의 엠 = 590 ㎚)의 결과로서 도시된다. 유의성은 오차 막대로 표시되는 양방향 ANOVA 및 평균의 표준 오차 (SEM)을 사용하여 측정 하였다. 발판 물리적 특성을 고려하여, 예를 들어, 함께, 0.75 밀리그램 / ㎤의 밀도 발판이 생체 적합성 특성에 사용 된 기공 크기 및 기계적 특성 (예를 들면, 댐핑 기능). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54537/54537fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 미디어 구성 요소 </td><td> 집중 </td></tr><tr><td> 기저 αMEM 미디어 (%) </td><td> (90) </td></tr><tr><td>혈청 (%) </td><td> (10) </td></tr><tr><td> 펜 / 연쇄상 구균 (%) </td><td> 1 </td></tr></tbody></table> 표 1 : 세포 배양 (αMEM) 미디어 조성물. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 문제 </td><td> 원인 </td><td> 해결책 </td></tr><tr><td> 비 투명 지지체에 세포 생존 영상 </td><td> 비계는 왜곡없이 침투하는 빛을 방지 </td><td> 셀 평가를 위해 형광 기반 이미징 기술을 사용합니다. </td></tr><tr><td> 형광 강도의 간섭 </td><td> 자동 형광 배경 신호 </td><td> 형광에주의하고 특히 비계의 특성에 따라 적절한 사용합니다. </td></tr><tr><td> 문화 기간 동안 인공 지지체에 세포 생존 능력 평가 </td><td> 아르 자형오랜 시간에 걸쳐 epeated 측정 </td><td> 광고 GFP 바이러스 입자와 세포를 형질. </td></tr><tr><td> 불투명 지지체에 세포의 기능 평가 </td><td> 형광 영상 법은 패턴 분석 확산 만 셀을 허용한다. </td><td> 이미징 기법을 조합하여 변환 분석 (정량 세포 생존율 측정) 레사 주린 수행한다. </td></tr></tbody></table> 표 2 : 요약 테이블 : 불투명 지지체에 세포 생존 이미징 문제 해결.

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Imaging Cell Viability on Non-transparent Scaffolds &#8212; Using the Example of a Novel Knitted Titanium Implant

여기에서는 불투명 티타늄 지지체에 세포 생존을 검출뿐만 아니라, 골격 불순물 일별을 검출하는 형광 기반 이미징 기술을 제시한다. 이 프로토콜은 비 투명 지지체에 세포 세포 또는 세포 상호 작용 금속을 묘화의 결점이 문제를 해결합니다.

비 투명 공사장 공중 발판에 이미징 세포 생존 - 소설 니트 티타늄 임플란트의 예를 사용하여

Intervertebral disc degeneration and disc herniation is one of the major causes of lower back pain. Depletion of extracellular matrix, culminating in ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.3K 조회수.  Eberhard Karls Universität Tübingen.  여기에서는 불투명 티타늄 지지체에 세포 생존을 검출뿐만 아니라, 골격 불순물 일별을 검출하는 형광 기반 이미징 기술을 제시한다. 이 프로토콜은 비 투명 지지체에 세포 세포 또는 세포 상호 작용 금속을 묘화의 결점이 문제를 해결합니다. 

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Postproduction Processing of Electrospun Fibres for Tissue Engineering

Electrospinning is a commonly used and versatile method to produce scaffolds (often biodegradable) for 3D tissue engineering.1, 2, 3 Many tissues in vivo undergo biaxial distension to varying extents such as skin, bladder, pelvic floor and even the hard palate as children grow. In producing scaffolds for these purposes there is a need to develop scaffolds of appropriate biomechanical properties (whether achieved without or with cells) and which are sterile for clinical use. The focus of this paper is not how to establish basic electrospinning parameters (as there is extensive literature on electrospinning) but on how to modify spun scaffolds post production to make them fit for tissue engineering purposes - here thickness, mechanical properties and sterilisation (required for clinical use) are considered and we also describe how cells can be cultured on scaffolds and subjected to biaxial strain to condition them for specific applications.
Electrospinning tends to produce thin sheets; as the electrospinning collector becomes coated with insulating fibres it becomes a poor conductor such that fibres no longer deposit on it. Hence we describe approaches to produce thicker structures by heat or vapour annealing increasing the strength of scaffolds but not necessarily the elasticity. Sequential spinning of scaffolds of different polymers to achieve complex scaffolds is also described. Sterilisation methodologies can adversely affect strength and elasticity of scaffolds. We compare three methods for their effects on the biomechanical properties on electrospun scaffolds of poly lactic-co-glycolic acid (PLGA).
Imaging of cells on scaffolds and assessment of production of extracellular matrix (ECM) proteins by cells on scaffolds is described. Culturing cells on scaffolds in vitro can improve scaffold strength and elasticity but the tissue engineering literature shows that cells often fail to produce appropriate ECM when cultured under static conditions. There are few commercial systems available that allow one to culture cells on scaffolds under dynamic conditioning regimes - one example is the Bose Electroforce 3100 which can be used to exert a conditioning programme on cells in scaffolds held using mechanical grips within a media filled chamber.4 An approach to a budget cell culture bioreactor for controlled distortion in 2 dimensions is described. We show that cells can be induced to produce elastin under these conditions. Finally assessment of the biomechanical properties of processed scaffolds cultured with or without cells is described.

Electrospun scaffolds can be processed post production for tissue engineering applications. Here we describe methods for spinning complex scaffolds (by consecutive spinning), for making thicker scaffolds (by multi-layering using heat or vapour annealing), for achieving sterility (aseptic production or sterilisation post production) and for achieving appropriate biomechanical properties.

조직 공학을위한 Electrospun의 Fibres의 Postproduction 처리

Electrospinning is a commonly used and versatile method to produce  scaffolds (often biodegradable) for 3D tissue engineering.1, 2, 3 Many tissues in vivo ...

연구

생체공학

Multi-Scale Modification of Metallic Implants With Pore Gradients, Polyelectrolytes and Their Indirect Monitoring In vivo

Metallic implants, especially titanium implants, are widely used in clinical applications. Tissue in-growth and integration to these implants in the tissues are important parameters for successful clinical outcomes. In order to improve tissue integration, porous metallic implants have being developed. Open porosity of metallic foams is very advantageous, since the pore areas can be functionalized without compromising the mechanical properties of the whole structure. Here we describe such modifications using porous titanium implants based on titanium microbeads. By using inherent physical properties such as hydrophobicity of titanium, it is possible to obtain hydrophobic pore gradients within microbead based metallic implants and at the same time to have a basement membrane mimic based on hydrophilic, natural polymers. 3D pore gradients are formed by synthetic polymers such as Poly-L-lactic acid (PLLA) by freeze-extraction method. 2D nanofibrillar surfaces are formed by using collagen/alginate followed by a crosslinking step with a natural crosslinker (genipin). This nanofibrillar film was built up by layer by layer (LbL) deposition method of the two oppositely charged molecules, collagen and alginate. Finally, an implant where different areas can accommodate different cell types, as this is necessary for many multicellular tissues, can be obtained. By, this way cellular movement in different directions by different cell types can be controlled. Such a system is described for the specific case of trachea regeneration, but it can be modified for other target organs. Analysis of cell migration and the possible methods for creating different pore gradients are elaborated. The next step in the analysis of such implants is their characterization after implantation. However, histological analysis of metallic implants is a long and cumbersome process, thus for monitoring host reaction to metallic implants in vivo an alternative method based on monitoring CGA and different blood proteins is also described. These methods can be used for developing in vitro custom-made migration and colonization tests and also be used for analysis of functionalized metallic implants in vivo without histology.

Multi-Scale Modification of Metallic Implants With Pore Gradients, Polyelectrolytes and Their Indirect Monitoring In vivo

In this video, we will demonstrate modification techniques for porous metallic implants to improve their functionality and to control cell migration. Techniques include development of pore gradients to control cell movement in 3D and production of basement membrane mimics to control cell movement in 2-D. Also, a HPLC-based method for monitoring implant integration in-vivo via analysis of blood proteins is described.

모공 그라디언트, 고분자 전해질 및 그들의 간접적 인 모니터링과 금속 임플란트의 멀티 스케일 변경<em&gt; 생체 내</em

Metallic implants, especially titanium implants, are widely used in  clinical applications. Tissue in-growth and integration to these implants in  the ...

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to evaluate new strategies that aim at improving vascularization, reliable methods are required to make the in-growth of new blood vessels into bio-artificial scaffolds visible and quantify the results. Over the past couple of years, our group has introduced a full skin defect model that enables the direct visualization of blood vessels by transillumination and provides the possibility of quantification through digital segmentation. In this model, one surgically creates full skin defects in the back of mice and replaces them with the material tested. Molecules or cells of interest can also be incorporated in such materials to study their potential effect. After an observation time of one&#8217;s own choice, materials are explanted for evaluation. Bilateral wounds provide the possibility of making internal comparisons that minimize artifacts among individuals as well as of decreasing the number of animals needed for the study. In comparison to other approaches, our method offers a simple, reliable and cost effective analysis. We have implemented this model as a routine tool to perform high-resolution screening when testing vascularization of different biomaterials and bio-activation approaches.

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

Vascularization is key to approaches in successful tissue engineering. Therefore, reliable technologies are required to evaluate the development of vascular networks in tissue-constructs. Here we present a simple and cost-effective method to visualize and quantify vascularization in vivo.

전체 피부 결함 모델은 생체의 혈관 신생을 평가하기<em&gt; 생체</em

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to ...

Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring

The development of Tissue Engineered Vessels (TEVs) is advanced by the ability to routinely and effectively implant TEVs (4-5 mm in diameter) into a large animal model. A step by-step protocol for inter-positional placement of the TEV and real-time digital assessment of the TEV and native carotid arteries is described here. In vivo monitoring is made possible by the implantation of flow probes, catheters and ultrasonic crystals (capable of recording dynamic diameter changes of implanted TEVs and native carotid arteries) at the time of surgery. Once implanted, researchers can calculate arterial blood flow patterns, invasive blood pressure and artery diameter yielding parameters such as pulse wave velocity, augmentation index, pulse pressures and compliance. Data acquisition is accomplished using a single computer program for analysis throughout the duration of the experiment. Such invaluable data provides insight into TEV matrix remodeling, its resemblance to native/sham controls and overall TEV performance in vivo.

Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring

A step-by-step protocol for the inter-positional placement of Tissue Engineered Vessels (TEVs) into the carotid artery of a sheep using end-to-end anastomosis and real-time digital assessment in vivo until animal sacrifice.

티슈 엔지니어링 혈관 이식 및 이후의 이식을위한 수술 기법<em&gt; 생체</em&gt; 모니터링

The development of Tissue Engineered Vessels (TEVs) is advanced by the ability to routinely and effectively implant TEVs (4-5 mm in diameter) into a large ...

Three-Dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma Using Collagen-Based Scaffolds

Neuroblastoma is the most common extracranial solid tumor in children, accounting for 15% of overall pediatric cancer deaths. The native tumor tissue is a complex three-dimensional (3D) microenvironment involving layers of cancerous and non-cancerous cells surrounded by an extracellular matrix (ECM). The ECM provides physical and biological support and contributes to disease progression, patient prognosis, and therapeutic response.
This paper describes a protocol for assembling a 3D scaffold-based system to mimic the neuroblastoma microenvironment using neuroblastoma cell lines and collagen-based scaffolds. The scaffolds are supplemented with either nanohydroxyapatite (nHA) or glycosaminoglycans (GAGs), naturally found at high concentrations in the bone and bone marrow, the most common metastatic sites of neuroblastoma. The 3D porous structure of these scaffolds allows neuroblastoma cell attachment, proliferation and migration, and the formation of cell clusters. In this 3D matrix, the cell response to therapeutics is more reflective of the in vivo situation.
The scaffold-based culture system can maintain higher cell densities than conventional two-dimensional (2D) cell culture. Therefore, optimization protocols for initial seeding cell numbers are dependent on the desired experimental timeframes. The model is monitored by assessing cell growth via DNA quantification, cell viability via metabolic assays, and cell distribution within the scaffolds via histological staining.
This model&#39;s applications include the assessment of gene and protein expression profiles as well as cytotoxicity testing using conventional drugs and miRNAs. The 3D culture system allows for the precise manipulation of cell and ECM components, creating an environment more physiologically similar to native tumor tissue. Therefore, this 3D in vitro model will advance the understanding of the disease pathogenesis and improve the correlation between results obtained in vitro, in vivo in&#160;animal models, and human subjects.

Three-Dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma Using Collagen-Based Scaffolds

This paper lists the steps required to seed neuroblastoma cell lines on previously described three-dimensional collagen-based scaffolds, maintain cell growth for a predetermined timeframe, and retrieve scaffolds for several cell growth and cell behavior analyses and downstream applications, adaptable to satisfy a range of experimental aims.

콜라겐 기반 스캐폴드를 사용한 신경모세포종의 3차원 체외 생체모방 모델

Neuroblastoma is the most common extracranial solid tumor in children, accounting for 15% of overall pediatric cancer deaths. The native tumor tissue is a ...

암 연구학

Distinctive Capillary Action by Micro-channels in Bone-like Templates can Enhance Recruitment of Cells for Restoration of Large Bony Defect

Without an active, thriving cell population that is well-distributed and stably anchored to the inserted template, exceptional bone regeneration does not occur. With conventional templates, the absence of internal micro-channels results in the lack of cell infiltration, distribution, and inhabitance deep inside the templates. Hence, a highly porous and uniformly interconnected trabecular-bone-like template with micro-channels (biogenic microenvironment template; BMT) has been developed to address these obstacles. The novel BMT was created by innovative concepts (capillary action) and fabricated with a sponge-template coating technique. The BMT consists of several structural components: inter-connected primary-pores (300-400 &#181;m) that mimic pores in trabecular bone, micro-channels (25-70 &#181;m) within each trabecula, and nanopores (100-400 nm) on the surface to allow cells to anchor. Moreover, the BMT has been documented by mechanical test study to have similar mechanical strength properties to those of human trabecular bone (~3.8 MPa)12.
The BMT exhibited high absorption, retention, and habitation of cells throughout the bridge-shaped (&#928;) templates (3 cm height and 4 cm length). The cells that were initially seeded into one end of the templates immediately mobilized to the other end (10 cm distance) by capillary action of the BMT on the cell media. After 4 hr, the cells homogenously occupied the entire BMT and exhibited normal cellular behavior. The capillary action accounted for the infiltration of the cells suspended in the media and the distribution (active migration) throughout the BMT. Having observed these capabilities of the BMT, we project that BMTs will absorb bone marrow cells, growth factors, and nutrients from the periphery under physiological conditions.
The BMT may resolve current limitations via rapid infiltration, homogenous distribution and inhabitance of cells in large, volumetric templates to repair massive skeletal defects.

A step-by-step generic process to create a bone-like template with engineered micro-channels is presented. High absorption and retention capabilities of the template are demonstrated by capillary action via micro-channels.

마이크로 채널로 독특한 모세관 액션 뼈 같은 템플릿 대형 나폴레옹 결함의 복원에 대한 세포의 모집을 향상시킬 수 있습니다

Without an active, thriving cell population that is well-distributed and stably anchored to the inserted template, exceptional bone regeneration does not ...

Fabrication of Mechanically Tunable and Bioactive Metal Scaffolds for Biomedical Applications

Biometal systems have been widely used for biomedical applications, in particular, as load-bearing materials. However, major challenges are high stiffness and low bioactivity of metals. In this study, we have developed a new method towards fabricating a new type of bioactive and mechanically reliable porous metal scaffolds-densified porous Ti scaffolds. The method consists of two fabrication processes, 1) the fabrication of porous Ti scaffolds by dynamic freeze casting, and 2) coating and densification of the porous scaffolds. The dynamic freeze casting method to fabricate porous Ti scaffolds allowed the densification of porous scaffolds by minimizing the chemical contamination and structural defects. The densification process is distinctive for three reasons. First, the densification process is simple, because it requires a control of only one parameter (degree of densification). Second, it is effective, as it achieves mechanical enhancement and sustainable release of biomolecules from porous scaffolds. Third, it has broad applications, as it is also applicable to the fabrication of functionally graded porous scaffolds by spatially varied strain during densification.

Bioactive and mechanically reliable metal scaffolds have been fabricated through a method which consists of two processes, dynamic freeze casting for the fabrication of porous Ti, and coating and densification of the Ti scaffolds. The densification process is simple, effective and applicable to the fabrication of functionally graded scaffolds.

Biometal systems have been widely used for biomedical applications, in particular, as load-bearing materials. However, major challenges are high stiffness ...

Visualizing Angiogenesis by Multiphoton Microscopy In Vivo in Genetically Modified 3D-PLGA/nHAp Scaffold for Calvarial Critical Bone Defect Repair

The reconstruction of critically sized bone defects remains a serious clinical problem because of poor angiogenesis within tissue-engineered scaffolds during repair, which gives rise to a lack of sufficient blood supply and causes necrosis of the new tissues. Rapid vascularization is a vital prerequisite for new tissue survival and integration with existing host tissue. The de novo generation of vasculature in scaffolds is one of the most important steps in making bone regeneration more efficient, allowing repairing tissue to grow into a scaffold. To tackle this problem, the genetic modification of a biomaterial scaffold is used to accelerate angiogenesis and osteogenesis. However, visualizing and tracking in vivo blood vessel formation in real-time and in three-dimensional (3D) scaffolds or new bone tissue is still an obstacle for bone tissue engineering. Multiphoton microscopy (MPM) is a novel bio-imaging modality that can acquire volumetric data from biological structures in a high-resolution and minimally-invasive manner. The objective of this study was to visualize angiogenesis with multiphoton microscopy in vivo in a genetically modified 3D-PLGA/nHAp scaffold for calvarial critical bone defect repair. PLGA/nHAp scaffolds were functionalized for the sustained delivery of a growth factor pdgf-b gene carrying lentiviral vectors (LV-pdgfb) in order to facilitate angiogenesis and to enhance bone regeneration. In a scaffold-implanted calvarial critical bone defect mouse model, the blood vessel areas (BVAs) in PHp scaffolds were significantly higher than in PH scaffolds. Additionally, the expression of pdgf-b and angiogenesis-related genes, vWF and VEGFR2, increased correspondingly. MicroCT analysis indicated that the new bone formation in the PHp group dramatically improved compared to the other groups. To our knowledge, this is the first time multiphoton microscopy was used in bone tissue-engineering to investigate angiogenesis in a 3D bio-degradable scaffold in vivo and in real-time.

Visualizing Angiogenesis by Multiphoton Microscopy In Vivo in Genetically Modified 3D-PLGA/nHAp Scaffold for Calvarial Critical Bone Defect Repair

Here, we present a protocol to visualize blood vessel formation in vivo and in real-time in 3D scaffolds by multiphoton microscopy. Angiogenesis in genetically modified scaffolds was studied in a murine calvarial critical bone defect model. More new blood vessels were detected in the treatment group than in controls.

Calvarial 중요 한 뼈 결함 수리 다 현미경 Vivo에서 유전자 변형 3D-PLGA/nHAp 비 계에 의해 신생 시각화

The reconstruction of critically sized bone defects remains a serious clinical problem because of poor angiogenesis within tissue-engineered scaffolds ...

Nondestructive Monitoring of Degradable Scaffold-Based Tissue-Engineered Blood Vessel Development Using Optical Coherence Tomography

Engineered vascular grafts with structural and mechanical properties similar to natural blood vessels are expected to meet the growing demand for arterial bypass. Characterization of the growth dynamics and remodeling process of degradable polymer scaffold-based tissue-engineered blood vessels (TEBVs) with pulsatile stimulation is crucial for vascular tissue engineering. Optical imaging techniques stand out as powerful tools for monitoring vascularization of engineered tissue enabling high-resolution imaging in real-time culture. This paper demonstrates a nondestructive and fast real-time imaging strategy to monitor the growth and remodeling of TEBVs in long-term culture by using optical coherence tomography (OCT). Geometric morphology is evaluated, including vascular remodeling process, wall thickness, and comparison of TEBV thickness in different culture time points and presence of pulsatile stimulation. Finally, OCT provides practical possibilities for real-time observation of the degradation of polymer in the reconstructing tissues under pulsatile stimulation or not and in each vessel segment, by compared with the assessment of polymer degradation using scanning electron microscopic(SEM) and polarized microscope.

A step by step protocol for nondestructive and long-period monitoring the process of vascular remodeling and scaffold degradation in real-time culture of biodegradable polymeric scaffold-based tissue-engineered blood vessels with pulsatile stimulation using optical coherence tomography is described here.

광학 일관성 단층 촬영을 사용 하 여 분해 비 계 기반 조직 설계 혈관 개발의 비파괴 모니터링

Engineered vascular grafts with structural and mechanical properties similar to natural blood vessels are expected to meet the growing demand for arterial ...

Core/shell Printing Scaffolds For Tissue Engineering Of Tubular Structures

Three-dimensional (3D) printing of core/shell filaments allows direct fabrication of channel structures with a stable shell that is cross-linked at the interface with a liquid core. The latter is removed post-printing, leaving behind a hollow tube. Integrating an additive manufacturing technique (like the one described here with tailor-made [bio]inks, which structurally and biochemically mimic the native extracellular matrix [ECM]) is an important step towards advanced tissue engineering. However, precise fabrication of well-defined structures requires tailored fabrication strategies optimized for the material in use. Therefore, it is sensible to begin with a set-up that is customizable, simple-to-use, and compatible with a broad spectrum of materials and applications. This work presents an easy-to-manufacture core/shell nozzle with luer-compatibility to explore core/shell printing of woodpile structures, tested with a well-defined, alginate-based scaffold material formulation.

Presented here is a simple-to-use, core/shell, three-dimensional bioprinting set-up for one-step fabrication of hollow scaffolds, suitable for tissue engineering of vascular and other tubular structures.

관 구조의 조직 공학을 위한 코어/쉘 인쇄 비계

Three-dimensional (3D) printing of core/shell filaments allows direct fabrication of channel structures with a stable shell that is cross-linked at the ...

비 투명 공사장 공중 발판에 이미징 세포 생존 - 소설 니트 티타늄 임플란트의 예를 사용하여

요약

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