Name: isolation of high-density lipoproteins for non-coding small rna quantification
Uploaded: 2016-11-28T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
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This work was supported by awards from the National Institutes of Health, National Heart, Lung and Blood Institute to K.C.V. HL128996, HL113039, and HL116263. This work was also supported by awards from the American Heart Association to K.C.V. CSA2066001, D.L.M POST26630003, and R.M.A. POST25710170.

1. HDL 정제 (~ 5.5 일) <ol><li> 밀도 구배 초 원심 분리 (DGUC, ~ 5 일) <ol><li> 신선한 정맥 혈액에서 분리 된 혈장 9 mL의 100 배 산화 방지제의 90 μL를 추가합니다. </li><li> 단계 1.1.1 (0.0278 g / mL의 KBr을 플라즈마)에서 플라즈마의 9 용액에 0.251 g을 KBr을 추가하여 1.025 g / mL의 1.006 g / ㎖에서 KBr을 가진 플라즈마 밀도를 조정합니다. 모든 소금은 실온에서 용해 및 튜브를 초 원심 분리기 및 모든 거품이 위로 상승하기 위해 전송 될 때까지 플라즈마를 바위. </li><li> 벤드 끝에서 90 ° 1cm로 18 G 바늘의 끝은, 베벨면이 위쪽을 향. 주사기와 18 게이지 바늘을 사용하여, 조심스럽게 플라즈마 (표 1)을 통해 오버레이 솔루션 # 1의 3 mL를 넣습니다. 참고 : 구부러진 바늘이 모든 VLDL / IDL, LDL을 보장하고, HDL 오버레이와 혼합하지 않고 제거됩니다. </li><li> 튜브 및 carefu의 메 니스 커스 위로부터 3mm 공간 -이 떠나는 상단 기포의 대부분을 제거에서야 베드로 SW-40Ti 양동이에 튜브를 배치합니다. </li><li> 균형에 (뚜껑 포함) 각 버킷의 무게를, 정확히 반대 버킷 (버킷 + 모자)와 균형 : # 5, # 3 # 6 # 4, # 2 # 1. 참고 :이 버킷 균형과 항상 일치해야합니다. </li><li> (자료 목록) 초 원심 분리기의 회 전자를 놓습니다. A # 4 중간 브레이크와 4 ° C에서 24 시간 동안 274,400 XG에 원심 분리기. </li><li> 조심스럽게 양동이에서 회 전자에서 양동이와 튜브를 제거합니다. </li><li> 조심스럽게 주사기와 구부러진 바늘을 사용하여 오버레이의 상단 층에서 2 mL를 제거합니다. 이 4 저장 될 수 VLDL / IDL 분획 것 ° C 또는 -80 기음. </li><li> VLDL / IDL의 부분을 제거한 후, 샘플 (플라즈마)의 나머지 7 mL로 수집하고 15 ML 원뿔 튜브에 배치합니다. 오버레이 용액 # 2 (표 1) 9 mL의 샘플 볼륨을 준비한다. </li><li> 1.080 g을 1.025 g / ㎖에서 샘플의 농도를 조정 / KBr을 가진 mL를 사용하여9 mL의 시료 또는 0.0828 g 약 0.746 g을 KBr / 샘플 용액을 KBr. 모든 KBr을 (약 20 분)에 용해시키고 보장 기포가 위로 상승하면서 튜브를 초 원심 분리기에 전송 될 때까지 조심스럽게 샘플을 바위. </li><li> 주사기와 바늘로 조심스럽게 샘플 (표 1)을 통해 오버레이 솔루션 # 3의 3 mL를 넣습니다. 튜브의 상단에 메 니스 커스 (meniscus)에서 3mm 공간 - 2 둡니다. </li><li> 튜브의 상단에 남아있는 거품의 대부분을 제거하고 조심스럽게 SW-40Ti 양동이에 가득 초원 심 분리기 튜브를 배치합니다. </li><li> 균형에 (뚜껑 포함) 각 버킷을 달아 정확히 1.1.5에서와 같이, 반대 버킷 + 모자와 균형. </li><li> 초 원심 분리기의 회 전자를 배치 (재료의 목록 참조). A # 4 중간 브레이크와 4 ° C에서 24 시간 동안 274,400 XG에 원심 분리기. </li><li> 조심스럽게 양동이에서 회 전자에서 양동이와 튜브를 제거합니다. </li><li> 조심스럽게 주사기를 사용하여 오버레이의 상층 (2)로부터 용액을 제거 할NT를 바늘. 이 4 저장 될 수있는 LDL 분획 것 ° C 또는 -80 기음. </li><li> LDL 분획을 제거한 후, 샘플 (플라즈마)의 나머지 대략 7 mL로 수집하고 새로운 15 ML 원뿔 튜브에 배치합니다. 1.080 g / ㎖ 용액 # 4 (표 1)를 9 mL의 최대 샘플 (혈장)의 용적을 가지고. </li><li> 1.30 g에 1.080 g / ㎖에서 샘플의 농도를 조정 / KBr을 샘플의 각 mL를 위해 KBr을을 9 mL의 시료 (플라즈마)에 3.33 g을 KBr을 사용하거나 0.37 g과 용액. 바위 또는 약간의 모든 KBr을 (염)이 용해 될 때까지 샘플을 선동하고 튜브를 초 원심 분리기에 전송합니다. </li><li> 주사기와 바늘로 조심스럽게 샘플 (표 1)을 통해 오버레이 솔루션 # 5의 3 mL를 넣습니다. </li><li> 튜브의 상단에 메 니스 커스 (meniscus)에서 2 3mm 공간을 떠나, 튜브의 상단에 남아있는 거품의 대부분을 제거하고 조심스럽게 SW-40Ti 양동이에 가득 초원 심 분리기 튜브를 배치합니다. </li><li> (각 버킷 무게상기 균형에 모자), 정확히으로 1.1.5에서와 같이, 반대 버킷 + 모자와 균형. </li><li> 초 원심 분리기의 회 전자를 배치 (재료의 목록 참조). A # 4 브레이크와 4 ° C에서 48 시간 동안 274,400 XG에 원심 분리기. </li><li> 조심스럽게 양동이에서 회 전자에서 양동이와 튜브를 제거합니다. </li><li> 조심스럽게 주사기와 구부러진 바늘을 사용하여 오버레이의 상위 계층에서 약 2 mL로 제거합니다. 이것은 4 ℃ 또는 -80 ℃에서 저장 될 수있는 HDL 분획이다. 참고 : DGUC HDL 다음은 높은 염 용액을 제거하기 위해 투석 할 수있다. </li><li> 밀폐 된 투석 슬리브 (10,000 MW 컷오프)에 수집 된 HDL의 비율을 배치하고 1 L 1X PBS에서 하룻밤 투석, 투석합니다. 변경 투석 버퍼 (1X PBS) 24 시간 이상 3 회. 자기 교반 바와 PBS의 부드러운 교란은 투석이 향상됩니다. </li><li> BCA 방법을 사용하여 8-HDL DGUC의 단백질 농도를 결정한다. </li></ol></li><li> 고속 단백질 액체 색도그래피 (FPLC) 또는 크기 배제 크로마토 그래피 (~ 6 시간) <ol><li> 0.22 μm의 마이크로 원심 필터를 통해 500 μL에 DGUC-HDL (총 단백질)의 1.2 mg의 필터 주입 직전에, (재료의 목록 참조). 주 : 0.22 μm의 필터 이전에 0.45 ㎛의 마이크로 필터를 통해 원심 DGUC-HDL 샘플의 추가 필터링 일부 샘플에 요구 될 수있다. </li><li> 필터링 된 DGUC-HDL 샘플을 수집 FPLC (채우기) 주입 주사기를로드하고 주사기에 기포가 FPLC에 주입하기 전에이 없는지 확인. </li><li> 2.6 MPa의 압력에 제한이 0.3 mL / 분으로 FPLC 유량을 설정한다. 주입 전에 샘플 버퍼 0.2 컬럼 부피 (약 15 mL)로 열 평형. FPLC (주입 루프) 악기에 버퍼의 3 mL의 시료를 주입하고 실행을 시작합니다. 72 분획 총 1.5ml의 분획을 수집한다. </li></ol></li></ol> 2. 높은 처리량 작은 RNA시퀀싱 (sRNAseq ~ 구일) <ol><li> RNA 분리 (~ 1 일) <ol><li> 제조자의 지시에 따라서 비색 키트를 사용하여 총 콜레스테롤 수준을 결정함으로써 DGUC-HDL FPLC에 대응하는 분획을 확인한다. DGUC-HDL을 함유하는 분획 7 FPLC -이 FPLC 셋업을 사용하여, 6 찾으려. </li><li> DGUC-HDL FPLC 분획의 모든 볼륨 (약 8 -1 0 mL를 풀 1.45 ML의 부분의 볼륨)를 수집하고 사용하여 집중 10 kDa의 분자량 컷 - 오프 원심 필터 유닛 1 시간 동안 4,000 XG에 4 ° C에서 또는 HDL 농축까지 약 100 μL입니다. </li><li> HDL을 모아서 농축하고 BCA 방법을 사용하여 8 HDL 총 단백질 농도를 정량화. </li><li> 세트의 각 샘플에서 분주 할 수 있습니다 최대 1 mg의 HDL 총 단백질의 높은 농도를 결정합니다. 예를 들어, 각 샘플의 전체 단백질 HDL 동일한 양으로부터 RNA를 분리. </li><li> 사용 RNA 분리를 수행수정 된 프로토콜 (자료 목록 참조). <ol><li> 1 분 동안 페놀 용해 시약 (재료의 목록 참조) 시료와 소용돌이의 10 배 볼륨을 추가합니다. </li><li> 실온에서 5 분간 인큐베이션. </li><li> 클로로포름 (단계 2.1.5.1에서 사용되는 페놀 용해 시약 용적의 20 %)를 첨가하고, 15 초 동안 격렬하게 진탕. </li><li> 3 분 - 2 실온에서 품어. </li><li> 냉장 원심 분리기에서 4 ° C에서 12,000 XG에 15 분 동안 원심 분리기. </li><li> 상간 피하는 새로운 튜브 상부 수성 상을 전송. </li><li> 1 분 동안 수성 상 및 와류에 100 % 에탄올 1.5 부피를 추가한다. </li><li> 적어도 1 시간 또는 하룻밤 -80 ° C에서 보관 샘플. </li><li> 제공된 미니 열을 사용하여 RNA 분리 프로토콜을 계속합니다. </li><li> 30 μL의 RNase없는 H 2 O로 용출 처음 2 분 동안 저속 (2,000 XG)에서 프릿, 스핀에 직접 15 μL H 2 O의 추가다음 1 분 동안 고속 (최대)에 스핀. H 2 O의 추가 15 μL로이 단계를 반복합니다 </li></ol></li><li> 즉시 -80 ° C에서 스르나 라이브러리 생성 또는 저장소에 진행합니다. </li></ol></li><li> 라이브러리 생성 (~ 6의 시간) <ol><li> 아래에 설명 된대로 PCR 증폭 한 수정으로 제조업체의 지침에 따라 같이 스르나 라이브러리 생성 키트 프로토콜을 사용하여 스르나의 cDNA 라이브러리를 준비합니다. <ol><li> 0.5 μL DNase의 /의 RNase없는 H 2 O를 포함하는 얼음에 PCR의 mastermix을 준비, 15 μL PCR 믹스 (PML) 1 μL RNA PCR 프라이머 (RP1) 샘플 당 (오류를 피펫 팅을위한 추가 10 % 포함). </li><li> PCR을 16.5 μL 각 (cDNA를) 시료에 혼합 추가합니다. </li><li> 다중 각 시료에 인덱스 / 바코드 번호를 할당하고 샘플 (해당 번호에) 1 μL PCR 프라이머 색인을 추가합니다. </li><li> 의 microfuge를 사용하여 빠른 스핀을 수행합니다. 참고 : 전체 볼륨해야지금 샘플 당 30 μL합니다. </li><li> 표 2 및 3에 설명 된 바와 같이 PCR 증폭 용 사이클링 조건을 수행한다. </li></ol></li></ol></li><li> 크기 스르나 도서관 어댑터 제거 선택 : 어댑터 (~ 1.5 시간) <ol><li> 대상 : 다음 크기 매개 변수와 제조업체의 지침에 따라 자동 DNA 크기 선택기를 사용하여 라이브러리 크기 선택을 수행하는 156 bp의 시작 : 135 bp의, 끝 : 177 bp의, 범위 신고 : 브로드. </li></ol></li><li> DNA 정리 (~ 0.5 시간) <ol><li> 정리 크기 선택 제조업체의 지침에 따라 스르나의 cDNA. </li><li> 깨끗한 용출 및 2 × 7 μL DNase의 /의 RNase없는 H 2 O와 스르나의 cDNA 집중 </li></ol></li><li> 정량화 및 평가 스르나의 cDNA 라이브러리 수율 및 품질 (~ 1의 시간) <ol><li> manufact의 당 (자재 목록)을 bioanalyzer에 고감도 DNA 칩을 이용 스르나의 cDNA 라이브러리의 품질과 크기를 평가의 urer의 지시. </li><li> 제조자의 지시에 따라, 고감도 DNA 분석 (자재 목록)를 사용하여 개별 스르나 cDNA 라이브러리 농도를 정량화. 주 : 플로우 셀 가능하면 같은 차선에서 실행되는 다른 지수와의 모든 샘플을 가지고하는 것이 좋습니다. 하나 이상의 레인이 필요한 경우, 적절한 경우 및 제어 샘플을 혼합한다. </li></ol></li><li> 높은 처리량 스르나 시퀀싱 (~ 7 일) <ol><li> 풀 개인은 몰 농도에 따라 스르나 라이브러리를 색인. </li><li> 2.5.2 - 화면 bioanalyzer에 고감도 DNA 칩을 이용하여 2.5.1 에서처럼 라이브러리 DNA 농도를 측정 품질 스르나 라이브러리를 풀링. </li><li> 제조업체의 지침 (자료 목록)에 따라 시퀀싱 라이브러리 qPCR에 정량 키트를 사용하여 적절한 순서 깊이를 보장하기 위해 어댑터 콘텐츠 정량 PCR (qPCR에)을 수행합니다. </li><li> 하나의 읽기를 사용하여 순서를 수행, 50 (B)25 M은 제조업체의 지침에 따라, / 샘플을 읽고 - P 프로토콜은 약 20의 깊이에 도달합니다. </li></ol></li></ol> 3. 데이터 분석 (~ 1 일) <ol><li> 역 다중화 된 시료의 전처리 원시 fastq 파일 (자료 목록)에, 사용 설명서의 지시에 따라, bcl2fastq2를 사용합니다. </li><li> 어댑터 9 트림 및 제거 Cutadapt를 사용하여 &lt;읽고 사용자 설명서 지침 (자료 목록)에 따라 길이 16 뉴클레오티드 (국세청). </li><li> 사용자 설명서 지침 (자료 목록)에 따라, NGSPERL 프레임 워크 removeSequenceInFastq 기능을 사용하여 어댑터 이월 (CTACAGTCCGACGATC) : 스톱 솔루션 시퀀스를 포함하는 스르나 라이브러리에 존재하는 오염 시퀀스 (CCACGTTCCCGTGG STP)를 제거합니다. </li><li> 사용자 설명서 지침 (자료 목록)에 따라, FastQC이 양적 과학 센터 (CQS) 도구를 사용하여 품질 관리 측정을 수행합니다. </li><li> &quot;동일&quot;의 비 중복 목록을 생성 (축소 redunda를 읽고NT를 읽기) 기록 사본 번호는 사용 설명서의 지시 재료 (목록)에 따라, CQSTools를 사용하여. </li><li> 사용자 설명서 지침 (자료 목록)에 따라, (-a -m 100 --best --strata -v 1 옵션) 정렬은 Bowtie1.1.2 1 불일치를 허용하여 인간 게놈에 읽습니다. </li><li> 정렬, 계산을 읽을 수행하고 사용자 설명서의 지시에 따라, NGSPERL를 사용하여 요약 작업을 초래한다. </li><li> 스프레드 시트 파일로 내보낼 수 테이블을 변환합니다. </li><li> 당 매핑의 miRNA (RPMM)를 읽으로 그 클래스 (예,의 miRNAs의 총 수 읽기) 및 보고서 신호 판독의 표준화가 총에 특정 클래스 (예를 들어,의 miRNAs)의 읽습니다. (예를 들면, RPMM = (은 miR-X는 / miRNA의 총 # *이 1,000,000) 읽습니다). </li><li> 낮은 수준과 높은 수준의 차동 소프트웨어로 일반 단일 컬러 기술로 입력 정상화 카운트 테이블은 사용자 설명서 지침 (자료 목록)에 따라 분석한다. 참고 : 현재, 아니 잘 특성화 하우스 키핑 유전자가 / SRNHDL-스르나에 관해서. 스파이크의 제어가 사용될 수 있지만, 문제가 될 수있다. 총 단백질 입력 또는 볼륨을 HDL하는 정규화하는 것이 좋습니다. 가장 중요한 것은 실시간 PCR 또는 정량 PCR을 사용하여의 miRNAs와 sRNAs을 정량화하기 위해 다양한 전략 중 하나에 의해 시퀀싱 결과를 확인하는 것이 좋습니다. </li></ol>

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T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genomic+analysis+of+erythrocyte+microRNA+expression+in+sickle+cell+diseases.">The genomic analysis of erythrocyte microRNA expression in sickle cell diseases.</a> PLoS One. 3, e2360 (2008).</li><li>Balzano, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNA+Stability+in+Frozen+Plasma+Samples.">miRNA Stability in Frozen Plasma Samples.</a> Molecules. 20, 19030-19040 (2015).</li><li>Redgrave, T. G., Roberts, D. C., West, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+plasma+lipoproteins+by+density-gradient+ultracentrifugation.">Separation of plasma lipoproteins by density-gradient ultracentrifugation.</a> Anal Biochem. 65, 42-49 (1975).</li><li>Cheung, M. C., Wolf, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effect+of+ultracentrifugation+on+apolipoprotein+A-I-containing+lipoprotein+subpopulations.">Differential effect of ultracentrifugation on apolipoprotein A-I-containing lipoprotein subpopulations.</a> J Lipid Res. 29, 15-25 (1988).</li><li>Kunitake, S. T., Kane, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+affecting+the+integrity+of+high+density+lipoproteins+in+the+ultracentrifuge.">Factors affecting the integrity of high density lipoproteins in the ultracentrifuge.</a> J Lipid Res. 23, 936-940 (1982).</li><li>Laurent, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meeting+report:+discussions+and+preliminary+findings+on+extracellular+RNA+measurement+methods+from+laboratories+in+the+NIH+Extracellular+RNA+Communication+Consortium.">Meeting report: discussions and preliminary findings on extracellular RNA measurement methods from laboratories in the NIH Extracellular RNA Communication Consortium.</a> J Extracell Vesicles. 4, 26533 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

이 프로토콜은 고순도의 HDL에 높은 처리량 시퀀싱 또는 실시간 PCR에 의해 miRNA가 다른 sRNAs을 정량화하기 위해 설계되었습니다. 어떠한 접근 방식으로, 특별한 고려가 정화 HDL 및 RNA의 처리의 각 단계에 부여하고 sRNAs 정량화한다. 이 프로토콜은 플라즈마의 ≥ 2 mL로 시작하는 프로젝트를 위해 설계되었습니다. 그러나 고품질의 RNA 분석을 성공적으로 친 화성 크로마토 그래피를 이용하여 인간 또는...

세포 외 비 코딩 작은 RNA를 (sRNAs)는 질병 바이오 마커 및 잠재적 인 치료 대상의 새로운 클래스를 나타낼 가능성 세포 간 통신 (1)를 용이하게한다. 스르나의 가장 널리 연구 유형은 대략 길이가 22 국세청하며 더 이상 전구체 형태 및 기본 증명서 2에서 처리되는 마이크로 RNA (miRNA의)입니다. 전사적의 miRNAs는 단백질 - 전기 변환 및 mRNA의 분해 (2)의 유도의 억제를 통해 유전자 발현을 조절하는 것으로 입증되었다. 그럼에도 불구하고,의 miRNAs는 sRNAs 많은 종류의 하나입니다; sRNAs가 부모의 tRNA (tRNA의 유래 sRNAs, TDR), 작은 핵 RNA를 (스르나 유래 sRNAs, sndRNA), 작은 핵소체의 RNA (snoRNA 파생 sRNAs, snRNA), 리보솜 RNA를에서 절단 될 수있는 (sRNAs, RDR을 rRNA의 유래 ) RNA를 Y (yDR) 및 기타 다른 RNA를 1. 이 소설 sRNAs의 몇 가지 예는 miRNA가 유사한 기능을하는 것으로보고되었다; 그러나, 생물학적 쿵푸유전자 조절의 역할 3-6 가능성이 있지만 이러한 sRNAs의 많은 nctions가 결정되어야 남아있다. 가장 흥미로운의 miRNAs 및 기타 sRNAs는 타액, 혈장, 소변, 담즙를 포함하는 세포 외 체액에서 안정적으로 존재한다. 세포 외 sRNAs 가능성이 세포 외 소포 (EV), 지질 단백질, 및 / 또는 세포 외 리보 핵산 단백질 복합체와의 연결을 통해 RNases로부터 보호됩니다. 이전에, 우리는 지질 단백질, 즉 고밀도 지단백질 (HDL), 플라즈마 7 전송의 miRNAs을보고했다. 본 연구에서는 HDL은 순차적 밀도 구배 초 원심 분리 방법 (DGUC), 고속 단백질 액체 크로마토 그래피 (크기 배제 크로마토 그래피 겔 여과, FPLC), 및 친 화성 크로마토 그래피 (안티 - 아포 지단백 AI (apoA-I) 면역를 사용하여 분리 하였다 ) 7. 실시간 PCR 기반 저밀도 어레이 개별 miRNA의 분석 모두 사용하여 miRNA의 레벨은 HDL을 정량 치료에서 분리 된네와 콜레스테롤 혈증 환자 7. 이 방법을 사용하여, 우리는의 miRNAs 프로필 및 고순도 HDL 준비의 특정의 miRNAs를 정량화 할 수 있었다. 2011 년부터, 우리는 친 화성 크로마토 그래피는 HDL의 순도를 향상 있지만, 항체 포화 크게 수율을 제한하고 엄청난 비용이 될 수 있다고 판단했다. 현재, 우리의 프로토콜은 다운 스트림 RNA 분리 및 스르나의 정량화를위한 ​​고품질의 HDL 샘플을 생산 FPLC, 다음 DGUC의 2 단계 연속 탠덤 방법을 권장합니다. 때문에 높은 처리량 예를 들어 sRNAs (sRNAseq),의 miRNAs의 순서 및 기타 비 miRNA의 스르나 클래스의 증가에 대한 인식의 최근 진보, sRNAseq는 현재 최첨단의 miRNA 및 스르나 프로파일입니다. 따라서, 우리의 프로토콜은 정량화의 miRNAs와 sRNAseq를 사용하여 HDL 샘플의 다른 sRNAs을 권장합니다. 그럼에도 불구하고, HDL로부터 분리 된 총 RNA는 또한 개별의 miRNAs 다른 sRNAs 정량화 또는 실시간 PCR A를 사용 sRNAseq 결과를 검증하기 위해 사용될 수있다pproaches. 여기에 우리가 수집, 정제, 정량, 데이터 분석 및 고순도 HDL-sRNAs의 검증을 위해 상세 프로토콜을 설명합니다. 이 논문의 전반적인 목표는 인간 혈장에서 분리 된 고순도의 HDL에 스르나 정량의 타당성과 과정을 설명하는 것입니다.

<table><tbody><tr><td>Ultracentrifuge&amp;nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>A99839</td><td>Optima XPN-80</td></tr><tr><td>Ultracentrifuge Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>331362</td><td>SW-41Ti</td></tr><tr><td>AKTA Pure FPLC System</td><td>GE Healthcare</td><td>29018224</td><td></td></tr><tr><td>3x FPLC Superdex 200 Increase Columns In-line</td><td>GE Healthcare</td><td>28990944</td><td>10/300 gl</td></tr><tr><td>SynergyMx</td><td>BioTek Instruments</td><td>7191000</td><td></td></tr><tr><td>Tabletop centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004525</td><td>Sorvall ST40R</td></tr><tr><td>Refrigerated centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>22629867</td><td>5417R (purchased through USA Scientific)</td></tr><tr><td>Microfuge&amp;nbsp;</td><td>USA Scientific</td><td>2631-0006</td><td></td></tr><tr><td>PippenPrep</td><td>Sage Science</td><td>PIP0001</td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer&amp;nbsp;</td><td>Agilent</td><td>G2938B</td><td></td></tr><tr><td>High Sensitivity DNA Assay</td><td>Agilent</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Sequencing Library qPCR Quantification Kit</td><td>Illumina</td><td>SY-930-1010</td><td></td></tr><tr><td>ProFlex Thermal Cycler</td><td>Applied Biosystems</td><td>4484073</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 12k Flex</td><td>Applied Biosystems</td><td>4471134</td><td></td></tr><tr><td>EpMotion Robot</td><td>Eppendorf</td><td>960000111</td><td>5070</td></tr><tr><td>Ultra-clear centrifuge tubes</td><td>Beckman Coulter</td><td>344059</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Bromide</td><td>Fisher Chemicals</td><td>P205-500</td><td></td></tr><tr><td>15 mL conical tube</td><td>Thermo Scientific</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>Micro-centrifugal filters 0.45 &amp;micro;m</td><td>Millipore</td><td>UFC30HV00</td><td></td></tr><tr><td>Micro-centrifugal filters 0.22 &amp;micro;m</td><td>Millipore</td><td>UFC30GV00</td><td></td></tr><tr><td>miRNAEasy Total RNA Isolation Kits</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td></td></tr><tr><td>Total Cholesterol colormetric kit</td><td>Cliniqa (Raichem)</td><td>R80035</td><td></td></tr><tr><td>10,000 m.w. cut-off centrifugation filter</td><td>Amicon</td><td>UFC801024</td><td>purchased through Millipore</td></tr><tr><td>PCR strip tubes</td><td>Axygen</td><td>PCR-0208-C</td><td>purchased through Fisher</td></tr><tr><td>microRNA RT kit</td><td>Life Technologies</td><td>4366597</td><td>For 1000 reactions</td></tr><tr><td>PCR master mix</td><td>Life Technologies</td><td>4440041</td><td>50 mL bottle</td></tr><tr><td>Pierce BCA kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Clean and Concentrator Kit</td><td>Zymo</td><td>D4014</td><td></td></tr><tr><td>Dialysis tubing</td><td>Spectrum Labs</td><td>132118</td><td>purchased through Fisher</td></tr><tr><td>bcl2fastq2</td><td>Illumina</td><td>n/a</td><td>Software</td></tr><tr><td>Cutadapt</td><td>https://github.com/marcelm/cutadapt</td><td>n/a</td><td>Software</td></tr><tr><td>NGSPERL</td><td>github.com/shengqh/ngsperl</td><td>n/a</td><td>Software</td></tr><tr><td>CQSTools</td><td>github.com/shengqh/CQS.Tools</td><td>n/a</td><td>Software</td></tr><tr><td>Bowtie 1.1.2&amp;nbsp;</td><td>http://bowtie-bio.sourceforge.net</td><td>n/a</td><td>Software</td></tr><tr><td>GeneSpringGX13.1.1</td><td>Agilent</td><td>n/a</td><td>Software</td></tr></tbody></table>

isolation of high-density lipoproteins for non-coding small rna quantification

작은 비 코딩 RNA를의 다양성 (스르나)는 급속하게 확장되고 유전자 조절을 포함한 생물학적 과정에서 자신의 역할이 부상하고있다. 가장 흥미로운 sRNAs은 세포의 외부 발견하고 안정적으로 모든 생물학적 체액에 존재한다. 따라서, 세포 외 sRNAs 질병 바이오 마커의 새로운 클래스를 나타낼 가능성 세포 신호 및 세포 간 통신 네트워크에 참여하고 있습니다. 바이오 마커로서의 가능성을 평가하기 위해, sRNAs 플라즈마, 소변 및 기타 유체에 정량화 할 수있다. 그럼에도 불구하고, 충분히 내분비 신호로서 세포 sRNAs의 영향을 이해하기 위해서는, 캐리어 수송성 및 세포 및 조직은 세포 외 스르나 풀 기여 생물학적 유체 (예, 플라즈마)에 이들을 보호하고, 세포 수있는 조직 된 결정하는 것이 중요 수용성의 세포 외 스르나를 이용. 이러한 목표를 달성하기 위해, 세포 외 캐리어 고순도의 집단을 분리하는 것이 중요스르나의 프로파일 링 및 정량. 우리는 이전에 지질 단백질, 특히 고밀도 지단백질 (HDL)을, 셀 및 HDL-의 miRNAs 사이의 기능적인 마이크로 RNA (miRNA의) 크게 질병에 변경되는 수송 있음을 증명하고있다. 여기서는 상세히 밀도 구배 초 원심 분리 (DGUC)과 고속 단백질 액체 크로마토 그래피 (FPLC)를 탠덤 HDL 분리를 이용하는 새로운 프로토콜 높은 모두 사용 하류 프로파일과의 miRNAs 포함한 모든 sRNAs의 정량 고순도 HDL을 얻었다 -throughput 시퀀싱 및 실시간 PCR 접근법. 이 프로토콜은 HDL에 sRNAs의 조사를 위해 귀중한 자원이 될 것입니다.

이 프로토콜은 높은 처리량 시퀀싱 또는 실시간 PCR (도 1)에 의해 고순도 HDL에 sRNAs의 정량화를 허용하도록 서로 연결 설정 방법의 연속이다. 가능성이 프로토콜의 영향을 설명하기 위해, HDL은 탠덤 DGUC 및 FPLC 방법으로 인간 혈장에서 정제 하였다. HDL로 (콜레스테롤 분포) 대응 수집 FPLC 분획을 농축하고, 총 RNA는 HDL (총 단백질) 1 mg 내지 분리 하였다. 스르나 라?...

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Isolation of High-density Lipoproteins for Non-coding Small RNA Quantification

This protocol describes the isolation and quantification of high-density lipoprotein small RNAs.

작은 RNA 정량 비는 코딩을위한 고밀도 지방 단백질의 분리

The diversity of small non-coding RNAs (sRNA) is rapidly expanding and their roles in biological processes, including gene regulation, are emerging. Most ...

isolation-high-density-lipoproteins-for-non-coding-small-rna

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biochemistry

11.3K 조회수.  Vanderbilt University School of Medicine. This protocol describes the isolation and quantification of high-density lipoprotein small RNAs.

비디오: Isolation of High-density Lipoproteins for Non-coding Small RNA Quantification

Isolation of Cognate RNA-protein Complexes from Cells Using Oligonucleotide-directed Elution

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. They are composed of position-dependent, cis-acting RNA elements and unique combinations of RNA binding proteins. Defining the composition of a specific RNP is essential to achieving a fundamental understanding of gene regulation. The isolation of a select RNP is akin to finding a needle in a haystack. Here, we demonstrate an approach to isolate RNPs associated at the 5' untranslated region of a select mRNA in asynchronous, transfected cells. This cognate RNP has been demonstrated to be necessary for the translation of select viruses and cellular stress-response genes.
The demonstrated RNA-protein co-precipitation protocol is suitable for the downstream analysis of protein components through proteomic analyses, immunoblots, or suitable biochemical identification assays. This experimental protocol demonstrates that DHX9/RNA helicase A is enriched at the 5' terminus of cognate retroviral RNA and provides preliminary information for the identification of its association with cell stress-associated huR and junD cognate mRNAs.

This manuscript describes an approach to isolate select cognate RNPs formed in eukaryotic cells via a specific oligonucleotide-directed enrichment. We demonstrate the applicability of this approach by isolating a cognate RNP bound to the retroviral 5' untranslated region that is composed of DHX9/RNA helicase A.

올리고 뉴클레오티드 지시 용출을 사용하여 세포에서 동족 RNA 단백질 단지의 분리

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. ...

연구

생화학

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of virion morphogenesis. Quantitative lipid droplet proteome analysis can be used to identify proteins that localize to or are displaced from lipid droplets under conditions such as virus infections. Here, we describe a protocol that has been successfully used to characterize the changes in the lipid droplet proteome following infection with HCV. We use Stable Isotope Labeling with Amino Acids in Cell Culture (SILAC) and thus label the complete proteome of one population of cells with &#34;heavy&#34; amino acids to quantitate the proteins by mass spectrometry. For lipid droplet isolation, the two cell populations (i.e.&#160;HCV-infected/&#34;light&#34; amino acids and uninfected control/&#34;heavy&#34; amino acids) are mixed 1:1 and lysed mechanically in hypotonic buffer. After removing the nuclei and cell debris by low speed centrifugation, lipid droplet-associated proteins are enriched by two subsequent ultracentrifugation steps followed by three washing steps in isotonic buffer. The purity of the lipid droplet fractions is analyzed by western blotting with antibodies recognizing different subcellular compartments. Lipid droplet-associated proteins are then separated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) followed by Coomassie staining. After tryptic digest, the peptides are quantified by liquid chromatography-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). Using this method, we identified proteins recruited to lipid droplets upon HCV infection that might represent pro- or antiviral host factors. Our method can be applied to a variety of different cells and culture conditions, such as infection with pathogens, environmental stress, or drug treatment.

Lipid droplets are important organelles for the replication of several pathogens, including the Hepatitis C Virus (HCV). We describe a method to isolate lipid droplets for quantitative mass spectrometry of associated proteins; it can be used under a variety of conditions, such as virus infection, environmental stress, or drug treatment.

양적 질량 분광법 분석을위한 지질 물방울 절연

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

A Complete Pipeline for Isolating and Sequencing MicroRNAs, and Analyzing Them Using Open Source Tools

Half of all human transcripts are thought to be regulated by microRNAs. Therefore, quantifying microRNA expression can reveal underlying mechanisms in disease states and provide therapeutic targets and biomarkers. Here, we detail how to accurately quantify microRNAs. Briefly, this method describes isolating microRNAs, ligating them to adaptors suitable for high-throughput sequencing, amplifying the final products, and preparing a sample library. Then, we explain how to align the obtained sequencing reads to microRNA hairpins, and quantify, normalize, and calculate their differential expression. Versatile and robust, this combined experimental workflow and bioinformatic analysis enables users to begin with tissue extraction and finish with microRNA quantification.

Here, we describe a step-by-step strategy for isolating small RNAs, enriching for microRNAs, and preparing samples for high-throughput sequencing. We then describe how to process sequence reads and align them to microRNAs, using open source tools.

MicroRNAs를 격리하고 시퀀싱하고 오픈 소스 도구를 사용하여 분석하기 위한 완벽한 파이프라인

Half of all human transcripts are thought to be regulated by microRNAs. Therefore, quantifying microRNA expression can reveal underlying mechanisms in ...

유전학

Enrichment of Native Lipoprotein Particles with microRNA and Subsequent Determination of Their Absolute/Relative microRNA Content and Their Cellular Transfer Rate

Lipoprotein particles are predominately transporters of lipids and cholesterol in the bloodstream. Furthermore, they contain small amounts of strands of noncoding microRNA (miRNA). In general, miRNA alters the protein expression profile due to interactions with messenger-RNA (mRNA). Thus, knowledge of the relative and absolute miRNA content of lipoprotein particles is essential to estimate the biological effect of cellular particle uptake. Here, a quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR)-based protocol is presented to determine the absolute miRNA content of lipoprotein particles&#8212;exemplified shown for native and miRNA-enriched lipoprotein particles. The relative miRNA content is quantified using multiwell microfluidic array cards. Furthermore, this protocol allows scientists to estimate the cellular miRNA and, thus, the lipoprotein particle uptake rate. A significant increase of the cellular miRNA level is observable when using high-density lipoprotein (HDL) particles artificially loaded with miRNA, whereas incubation with native HDL particles yields no significant effect due to their rather low miRNA content. In contrast, the cellular uptake of low-density lipoprotein (LDL) particles&#8212;neither with native miRNA nor artificially loaded with it&#8212;did not alter the cellular miRNA level.

Here, a quantitative real-time polymerase chain reaction-based protocol is presented for the determination of the native micro-RNA content (absolute/relative) of lipoprotein particles. In addition, a method for increasing the micro-RNA level, as well as a method for determining the cellular uptake rate of lipoprotein particles, is demonstrated.

마이크로 로르 나를 사용한 네이티브 단백 입자의 농축과 그에 따른 절대/상대 미세 유 변 함량 및 셀룰러 전송 속도의 후속 측정

Lipoprotein particles are predominately transporters of lipids and cholesterol in the bloodstream. Furthermore, they contain small amounts of strands of ...

Genome-wide Analysis of HDAC Inhibitor-mediated Modulation of microRNAs and mRNAs in B Cells Induced to Undergo Class-switch DNA Recombination and Plasma Cell Differentiation

Antibody responses are accomplished through several critical B cell-intrinsic processes, including somatic hypermutation (SHM), class-switch DNA recombination (CSR), and plasma cell differentiation. In recent years, epigenetic modifications or factors, such as histone deacetylation and microRNAs (miRNAs), have been shown to interact with B-cell genetic programs to shape antibody responses, while the dysfunction of epigenetic factors has been found to lead to autoantibody responses. Analyzing genome-wide miRNA and mRNA expression in B cells in response to epigenetic modulators is important for understanding the epigenetic regulation of B-cell function and antibody response. Here, we demonstrate a protocol for inducing B cells to undergo CSR and plasma cell differentiation, treating these B cells with histone deacetylase (HDAC) inhibitors (HDIs), and analyzing mRNA and microRNA expression. In this protocol, we directly analyze complementary DNA (cDNA) sequences using next-generation mRNA sequencing (mRNA-seq) and miRNA-seq technologies, mapping of the sequencing reads to the genome, and quantitative reverse transcription (qRT)-PCR. With these approaches, we have defined that, in B cells induced to undergo CSR and plasma cell differentiation, HDI, an epigenetic regulator, selectively modulates miRNA and mRNA expression and alters CSR and plasma cell differentiation.

Epigenetic factors can interact with genetic programs to modulate gene expression and regulate B cell function. By combining in vitro B-cell stimulation, qRT-PCR, and high-throughput microRNA-sequence and mRNA-sequence approaches, we can analyze the epigenetic modulation of miRNA and gene expression in B cells.

MicroRNAs 받 클래스 스위치 DNA 재조합 및 플라즈마 세포 차별화에 B 세포 유도에서 mRNAs의 게놈 넓은 분석의 HDAC 억제제 중재 변조

Antibody responses are accomplished through several critical B cell-intrinsic processes, including somatic hypermutation (SHM), class-switch DNA ...

면역학 및 감염병학

Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of endocytic origin were first proposed to function as a way for reticulocytes to eradicate the transferrin receptor while maturing into erythrocytes1, and were later named exosomes. Exosomes are formed by inward budding of late endosomes, producing multivesicular bodies (MVBs), and are released into the environment by fusion of the MVBs with the plasma membrane2. Since the first discovery of exosomes, a wide range of cells have been shown to release these vesicles. Exosomes have also been detected in several biological fluids, including plasma, nasal lavage fluid, saliva and breast milk3-6. Furthermore, it has been demonstrated that the content and function of exosomes depends on the originating cell and the conditions under which they are produced. A variety of functions have been demonstrated for exosomes, such as induction of tolerance against allergen7,8, eradication of established tumors in mice9, inhibition and activation of natural killer cells10-12, promotion of differentiation into T regulatory cells13, stimulation of T cell proliferation14 and induction of T cell apoptosis15. Year 2007 we demonstrated that exosomes released from mast cells contain messenger RNA (mRNA) and microRNA (miRNA), and that the RNA can be shuttled from one cell to another via exosomes. In the recipient cells, the mRNA shuttled by exosomes was shown to be translated into protein, suggesting a regulatory function of the transferred RNA16. Further, we have also shown that exosomes derived from cells grown under oxidative stress can induce tolerance against further stress in recipient cells and thus suggest a biological function of the exosomal shuttle RNA17. Cell culture media and biological fluids contain a mixture of vesicles and shed fragments. A high quality isolation method for exosomes, followed by characterization and identification of the exosomes and their content, is therefore crucial to distinguish exosomes from other vesicles and particles. Here, we present a method for the isolation of exosomes from both cell culture medium and body fluids. This isolation method is based on repeated centrifugation and filtration steps, followed by a final ultracentrifugation step in which the exosomes are pelleted. Important methods to identify the exosomes and characterize the exosomal morphology and protein content are highlighted, including electron microscopy, flow cytometry and Western blot. The purification of the total exosomal RNA is based on spin column chromatography and the exosomal RNA yield and size distribution is analyzed using a Bioanalyzer.

This paper demonstrates methods for the isolation, purification and detection of exosomes, as well as techniques for analysis of their molecular content. These methods are adaptable for exosome isolation from both cell culture media and biological fluids, and can beyond analysis of molecular content also be useful in functional studies.

RNA 함유 Exosomes의 분리 및 특성

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of ...

생물학

Isolation of Small Noncoding RNAs from Human Serum

The analysis of RNA and its expression is a common feature in many laboratories. Of significance is the emergence of small RNAs like microRNAs, which are found in mammalian cells. These small RNAs are potent gene regulators controlling vital pathways such as growth, development and death and much interest has been directed at their expression in bodily fluids. This is due to their dysregulation in human diseases such as cancer and their potential application as serum biomarkers. However, the analysis of miRNA expression in serum may be problematic. In most cases the amount of serum is limiting and serum contains low amounts of total RNA, of which small RNAs only constitute 0.4-0.5%1. Thus the isolation of sufficient amounts of quality RNA from serum is a major challenge to researchers today. In this technical paper, we demonstrate a method which uses only 400 &#181;l of human serum to obtain sufficient RNA for either DNA arrays or qPCR analysis. The advantages of this method are its simplicity and ability to yield high quality RNA. It requires no specialized columns for purification of small RNAs and utilizes general reagents and hardware found in common laboratories. Our method utilizes a Phase Lock Gel to eliminate phenol contamination while at the same time yielding high quality RNA. We also introduce an additional step to further remove all contaminants during the isolation step. This protocol is very effective in isolating yields of total RNA of up to 100 ng/&#181;l from serum but can also be adapted for other biological tissues.

This protocol describes a method for extracting small RNAs from human serum. We have used this method to isolate microRNAs from cancer serum for use in DNA arrays and also singleplex quantitative PCR. The protocol utilizes phenol and guanidinium thiocyanate reagents with modifications to yield high quality RNA.

인간 혈청에서 작은 비 암호화 RNA를의 분리

The analysis of RNA and its expression is a common feature in many laboratories. Of significance is the emergence of small RNAs like microRNAs, which are ...

Highly Efficient Ligation of Small RNA Molecules for MicroRNA Quantitation by High-Throughput Sequencing

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide resolution. This technique captures miRNAs by attaching 3&#8217; and 5&#8217; oligonucleotide adapters to miRNA molecules and allows de novo miRNA discovery. Coupling with powerful next-generation sequencing platforms, miR-Seq has been instrumental in the study of miRNA biology. However, significant biases introduced by oligonucleotide ligation steps have prevented miR-Seq from being employed as an accurate quantitation tool. Previous studies demonstrate that biases in current miR-Seq methods often lead to inaccurate miRNA quantification with errors up to 1,000-fold for some miRNAs1,2. To resolve these biases imparted by RNA ligation, we have developed a small RNA ligation method that results in ligation efficiencies of over 95% for both 3&#8217; and 5&#8242; ligation steps. Benchmarking this improved library construction method using equimolar or differentially mixed synthetic miRNAs, consistently yields reads numbers with less than two-fold deviation from the expected value. Furthermore, this high-efficiency miR-Seq method permits accurate genome-wide miRNA profiling from in vivo total RNA samples2.

MicroRNAs (miRNAs) are a widely conserved class of regulatory molecules. Here we describe a miRNA cloning method that relies upon two potent ligation steps followed by high-throughput sequencing. Our method permits accurate genome-wide quantitation of miRNAs.

높은 처리량 시퀀싱에 의한 마이크로 RNA 정량을위한 작은 RNA 분자의 고효율 내고

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide ...

Isolation of Viable Adipocytes and Stromal Vascular Fraction from Human Visceral Adipose Tissue Suitable for RNA Analysis and Macrophage Phenotyping

Visceral adipose tissue (VAT) is an active metabolic organ composed mainly of mature adipocytes and stromal vascular fraction (SVF) cells, which release different bioactive molecules that control metabolic, hormonal, and immune processes; currently, it is unclear how these processes are regulated within the adipose tissue. Therefore, the development of methods evaluating the contribution of each cell population to the pathophysiology of adipose tissue is crucial. This protocol describes the isolation steps and provides the necessary troubleshooting guidelines for efficient isolation of viable mature adipocytes and SVF from human VAT biopsies in a single process, using a collagenase enzymatic digestion technique. Moreover, the protocol is also optimized to identify macrophage subsets and perform mature adipocyte RNA isolation for gene expression studies, which allows performing studies dissecting the interaction between these cell populations. Briefly, VAT biopsies are washed, minced mechanically, and digested to generate a single-cell suspension. After centrifugation, mature adipocytes are isolated by flotation from the SVF pellet. The RNA extraction protocol ensures a high yield of total RNA (including miRNAs) from adipocytes for downstream expression assays. Simultaneously, SVF cells are used to characterize macrophage subsets (pro- and anti-inflammatory phenotype) through flow cytometry analysis.

This protocol provides an efficient collagenase digestion method for isolation of viable adipocytes and stromal vascular fraction-SVF cells from human visceral fat in a single process, including methodology to obtain high-quality RNA from adipocytes and phenotypification of SVF-macrophages through staining of multiple membrane-bound markers for analysis by flow cytometry.

RNA 분석 및 대식세포 표현형에 적합한 인간 내장 지방 조직에서 생존 가능한 지방 세포 및 기질 혈관 분획 분리

Visceral adipose tissue (VAT) is an active metabolic organ composed mainly of mature adipocytes and stromal vascular fraction (SVF) cells, which release ...

의학

Fast and Simplified Method for High Through-put Isolation of miRNA from Highly Purified High Density Lipoprotein

Small non-coding RNAs (miRNAs) have been implicated in a variety of human diseases including metabolic syndromes. They may be utilized as biomarkers for diagnosis and prognosis or may serve as targets for drug development, respectively. Recently it has been shown that miRNAs are carried in lipoproteins, particularly high density lipoproteins (HDL) and are delivered to recipient cells for uptake. This raises the possibility that miRNAs play a critical and pivotal role in cellular and organ function via regulation of gene expression as well as messenger for cell-cell communications and crosstalk between organs. Current methods for miRNA isolation from purified HDL are impractical when utilizing small samples on a large scale. This is largely due to the time consuming and laborious methods used for lipoprotein isolation. We have developed a simplified approach to rapidly isolate purified HDL suitable for miRNA analysis from plasma samples. This method should facilitate investigations into the role of miRNAs in health and disease and in particular provide new insights into the variety of biological functions, outside of the reverse cholesterol transport, that have been ascribed to HDL. Also, the miRNA species which are present in HDL can provide valuable information of clinical biomarkers for diagnosis of various diseases.

MicroRNAs play an important regulatory role and are emerging as novel therapeutic targets for various human diseases. It has been shown that miRNAs are carried in high density lipoproteins. We have developed a simplified method to rapidly isolate purified HDL suitable for miRNA analysis from human plasma.

고도로 정제 된 고밀도 지단백질에서의 miRNA의 높은 넣어 관통 분리에 대한 신속하고 단순화 된 방법

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