Name: multimodal quantitative phase imaging with digital holographic microscopy accurately assesses intestinal inflammation and epithelial wound healing
Uploaded: 2016-09-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multimodal Quantitative Phase Imaging with Digital Holographic Microscopy Accurately Assesses Intestinal Inflammation and Epithelial Wound Healing at JoVE.com

We thank Faekah Gohar for proofreading the manuscript. We thank Sonja Dufentester and Elke Weber for expert technical assistance.

모든 동물 실험은 독일어 동물 보호법에 따라 지역 윤리위원회합니다 (Landesamt 대 투르, UMWELT 싶게 Verbraucherschutz, LANUV, 독일)에 의해 승인되었다. 뮌스터 대학의 지역 윤리위원회는 조직 학적 및 현미경 분석을위한 인체 조직의 사용을 승인했다. 1. 동물 및 재료 <ol><li> 지역 동물 보호 법률에 따라 여성 또는 20g (25)에 무게 필요한 DSS 감수성 균주의 수컷 마우스, 집을 사용합니다. 설치류 특별한 차우을 제공하고, 임의 량의 물을 마시는 멸균. </li><li> 멸균 된 수돗물 5 일 : 덱스 트란 황산 나트륨 (36,000-50,000 다 DSS, 분자량) V / 승 3 %를 투여하여 급성 DSS 대장염을 유도한다. 참고 : DSS의 힘 제조 업체 및 배치에 따라 매우 다양하다. 질병 활성의 유도를 위해 먼저 공급 업체에서 제공하는 DSS를 테스트하는 다에 대한ILY 체중은 신뢰할 수있는 객관적 지표입니다. </li><li> 결장 조직 샘플의 조직 학적 평가를 위해 실험 끝에 CO 2 통기 (또는 국가 기관 가이드 라인을 지정)에 의해 마우스를 안락사. </li></ol> 2. 실험 설정 DSS-대장염과에서 시험관 상처 치유 분석 실험 <ol><li> 세포 배양 및 상처 치유 분석의 설립. <ol><li> 37 ° C에서 95 % 습도 및 5 % CO 2 환경의 카코 -2 세포를 성장한다. 10 % 소 태아 혈청 (FBS) 및 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신을 RPMI 배지를 사용한다. </li><li> 높은 문화 인서트 35mm 배양 접시에 4 × 10 5 세포 / cm 2의 밀도 씨 카코 2 세포 (그림 4A 참조). 참고 : 삽입은 상처 영역을 나타내는 정의 된 셀 여유 공간을 분석하기로 분리 된 두 개의 셀 적용 영역을 생성합니다. </li><li> 이일 seedin 후 매체 변경지. 먼저 자동 피펫을 사용하여 세포 파편과 잔류 매체를 흡입에 의해 수행, 인산염 완충 생리 식염수 100 ㎕ (PBS)로 세척하고 신선한 RPMI 매체 또는 혈청 박탈 매체를 추가합니다. </li><li> 상처 치유 행동의 변화를 감지하는 20 ng를 EGF / ㎖의 혈청 또는 2 μg의 마이 토마 이신 C / ㎖의 혈청 혈청 박탈 매체 (0.1 % FBS)에서 24 시간 동안 배양 세포. 24 시간 동안 세포를 제어하는​​ 정상 RPMI 매체를 추가합니다. </li><li> 문화의 24 시간 후, 제거하고 단계 3.4에 설명 된대로 문화 삽입을 취소하고 DHM을 수행합니다. </li></ol></li><li> 급성 DSS 대장염의 유도 <ol><li> (w / v)의 DSS 솔루션을 3 %를 얻기 위해 물을 멸균 100 ㎖에 DSS의 3g을 녹인다. 7 일간 쥐 광고 무제한에 물을 마시는 대신에이 솔루션을 제공합니다. 마우스 / 하루 DSS-용액 5 ㎖를 계산합니다. 제어 마우스 광고 임의로위한 DSS없이 멸균 된 물을 제공합니다. </li></ol></li><li> 쥐와 인간의 결장의 저온 유지 섹션의 준비<ol><li> 실험의 끝에 CO 2 취입 마우스 안락사. </li><li> 개복술 (23)에 의해 동물의 복부를 해부하다. 조심스럽게 핀셋을 사용하여 전체 대장을 제거하고 수술 가위를 사용하여 회장 및 직장 끝을 잘라. 직장 끝까지 맹장에서 길이 방향 가위로 결장을 잘라 콜론을 엽니 다. PBS (24)로 세척 한 다음 핀셋을 사용하여 표본에서 모든 배설물을 제거합니다. </li><li> 안쪽으로 곡선 점막과 직장 끝으로 맹장에서 길이 방향으로 새싹 목화와 전체 대장을 감아 스위스 롤을 준비합니다. 최적의 절삭 온도 OCT () 화합물에 결장 샘플을 포함하고 더 사용할 때까지 -80 ℃에서 냉동 보관하십시오. </li><li> 최적의 절삭 온도 10월 화합물 수술 표본에서 인간의 대장 조직을 포함하고 더 사용할 때까지 -80 ℃에서 냉동 보관하십시오. </li><li> cryoto의 도움으로 OCT의 화합물 내장 표본의 7 μm의 두께의 컷 섹션시험에 날 직전. 주 : 최적 샘플 두께는 조사중인 지속성 및 조직 유형의 분산 특성에 따라 달라진다. 인한 양적 DHM 위상 콘트라스트 영상에서 빛의 산란에 결장 조직 노이즈&gt; 10 ㎛의 원인이 크게 증가 슬라이스 두께를 사​​용하여 설명 된 실험에 대한 두께의 샘플을 &lt;5 ㎛의은 크라이 절단 공정 손상 유도 된 인공물에 대한 높은 위험을 표시하는 동안. </li><li> 유리 개체 캐리어의 슬라이드에 섹션을 전송합니다. </li></ol></li></ol> 3. 기술 장비, 디지털 홀로그램의 수집 및 평가 용 소프트웨어 및 절차 <ol><li> 양적 세포 및 조직의 영상을위한 디지털 홀로그램 현미경 <ol><li> 도 1에 나타낸 바와 같이, 생균 촬상 25 축외 마하 젠더 디지털 홀로그램 현미경 시스템을 사용한다. 현미경이 장착되어 있는지 확인10X 현미경 렌즈 35 mm의 직경을 갖는 유리 물체 운반기 슬라이드와 배양 접시의 홀더와 현미경 단계는 가열 챔버 정량적 위상 촬상 25 생리 37 ° C의 온도 및 소프트웨어를 보존한다. 참고 : 예를 들어, 켐퍼 등 26 Langehanenberg 등 27에 설명 된대로... 주 : 또는 시야 현미경 살아있는 세포의 양적 위상 이미징 해부 조직 슬라이드를 수행 할 수있는 유사한 시스템을 사용한다. </li><li> 면도 현미경 렌즈와 렌즈 클리닝 용지 먼지 또는 기타 오염물을 제거하기 위해 현미경의 제조자가 권장하는 세정제 (예, 에탄올)와 콘덴서. </li><li> 백색광 조명 &quot;의&quot; &quot;시야&quot;영상 모드 스위치를 선택 DHM 현미경의 이미지 수집 소프트웨어를 시작합니다. 쾰러 - illumin 확인(다르게는, 표준 화상 취득 소프트웨어가이 단계에서 사용될 수있다), 화상 취득 소프트웨어의 라이브 영상 창에서 샘플을 관찰하면서 현미경 제조사 권장 샘플 ATION. 주 : 이미지 세기가 시야에 균일하게 분산되어야하며 샘플 위치는 현미경의 초점 거리를 가진 광학 재 집속 중 조작해야한다. </li><li> 레이저 빛 &quot;의&quot;백색광 조명 및 스위치 &quot;OFF&quot;설정 &quot;DHM&quot;영상 모드를 선택합니다. 레이저 광 조명을 균질인지 확인 (즉, 광 강도가 균일 DHM 현미경 영상 수집 소프트웨어의 라이브 영상 창에 분포된다) 및 오프 액시스 캐리어 간섭 줄무늬 패턴이있는 충분한 콘트라스트 나타나는지 관찰 촬영 한 이미지 (디지털 홀로그램). </li></ol></li><li> 이미징을위한 저온 유지 부의 제조DHM와 <ol><li> (두께, 유리 개체 캐리어에 그라 이오 스탯 섹션 : 7 μm의, 2.3에 설명 된대로) 샘플을 냉장고에서. RT 정상 대기에서 약 5 분 동안 샘플을 해동. </li><li> 그 버퍼가 완전히 피복 될 때까지 피펫을 이용하여 조직 절편 상에 매체를 삽입 100 ㎕의 인산 완충 식염수 (PBS) - (50)를 추가한다. 깨끗한 유리 커버 슬립 (유리 두께 170 μm의)와 샘플을 커버. 주 : 동안 건조 굴절률의 상당한 변화와 샘플의 산란 특성을 유도 할 수있다. </li><li> 유리 캐리어와 커버 슬립의 바닥은 빛의 산란을 유도 할 수 먼지 및 기타 오염 청소되어 있는지 확인합니다. 샘플은 밝은 필드 현미경 및 DHM와 조사에 대한 준비가되어 있습니다. </li></ol></li><li> DHM와 조직 절편의 정량적 인 위상 이미지 <ol><li> 디지털 홀로그램 현미경에 스위치 이미징의 10 배 현미경 렌즈를 선택합니다. 제 i 시작마법사 수집 상기 DHM 현미경의 소프트웨어와 밝은 파일 영상 모드를 선택합니다. </li><li> 현미경 대물 렌즈에 대향하는 커버 슬립, 현미경 슬라이드 홀더) (2)에 기술 된 바와 같이, 조직 슬라이드를 놓는다. </li><li> DHM 현미경의 시야 조명 &quot;의&quot;전환합니다. 현미경 스테이지에 샘플을 놓고 관심의 조직 영역은 실시간 감시 창에 표시되는지 확인합니다. 현미경의 초점 거리를 사용하여 이미지의 선명도 향상. 주 :뿐만 아니라 관심 영역이없는 조직 슬라이드의 영역도 시야에 존재한다. </li><li> 화상 획득 소프트웨어를 사용하여 크게 집중 샘플의 명 시야 이미지를 캡처. </li><li> 선택 &quot;DHM&quot;영상 모드, 레이저 광 조명 &quot;의&quot;백색광 조명 &quot;OFF&quot;로 설정하고 전원을 켭니다. 3 밀리 초 이하 홀로그램 기록에 대해 &quot;노출 시간&quot;을 선택하여 그 hologr을 관찰aphic 축외 간섭 줄무늬는 촬상 수집 소프트웨어의 라이브 영상 창의 적절한 콘트라스트 나타나는 디지털 홀로그램을 포착. </li><li> 명 시야 이미지와 다른 샘플 영역 디지털 홀로그램 충분한 수를 기록 할 때까지 3.3.5 - 반복 단계 3.3.3. 홀로그램 인수가 완료되었습니다. </li></ol></li><li> DHM 영상에 대한 상처 치유 분석의 준비 <ol><li> DHM 측정시 안정적인 온도 조건을 보장하기 위해 3 시간 전에 실험의 시작 - 약 1 DHM 현미경의 페트리 접시 가열 챔버에 전환합니다. </li><li> 필요한 장비 (2.3에서 설명하는 상처 치유 분석을위한 배양 접시)와 작업대 준비 : 피펫, 핀셋, 페트리 접시 용 유리 뚜껑, 4- (2- 히드 록시 에틸) -1- 피페 라진 에탄 술폰산 (HEPES)은 생리 학적으로 세포 배양 배지를 버퍼링 무균 환경에서 샘플 준비를위한 온도 (37 °의 C). 참고 : </stroNG&gt; 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM)를 10 % 태아 새끼를 낳다 혈청 (FCS), 20 mM의 HEPES (4- (2- 히드 록시 에틸) -1- 피페 라진 에탄 술폰산) 및 850 ㎎ / ℓ의 NaHCO3로 구성된다. </li><li> 페트리 접시에서 플라스틱 뚜껑을 제거하고 피펫으로 세포 배양 배지를 제거합니다. 핀셋을 사용하여 배양 접시 바닥에서 삽입물을 제거합니다. </li><li> 사균 상처 영역에 남아있는 세포 성분 (예, 혈청)을 제거하기 위해 버퍼링 한 ML HEPES 세포 배양 배지로 2 회 - 샘플 1을 씻는다. 2 ml의 HEPES를 버퍼링 세포 배양 배지를 추가하고 유리 뚜껑 페트리 접시를 캡. </li><li> 유리 뚜껑과 배양 접시 바닥 먼지 및 기타 오염 청소되어 있는지 확인합니다. 샘플 DHM와 시간 경과 관찰을위한 준비가되어 있습니다. </li></ol></li><li> DHM와 체외에서 상처 치유의 연속 멀티 모드 모니터링 <ol><li> 이전에 3 시간 - DHM 현미경 약 1의 페트리 접시 가열 챔버에 전환실험의 시작에 DHM 측정 중에 안정된 온도 조건을 보장한다. </li><li> 디지털 홀로그램 현미경 &quot;의&quot;스위치, 영상의 10 배 현미경 렌즈를 선택합니다. DHM 현미경의 이미지 수집 소프트웨어를 시작하고 &quot;시야&quot;영상 모드를 선택합니다. 페트리 접시의 가열 챔버는 생리적 온도 (37 ° C)를 작동하는지 확인합니다. </li><li> DHM 현미경의 가열 실 (4)에 기재된 바와 같이 제조 된 상처 치유와 분석 페트리 접시), 놓는다. </li><li> 명 시야 촬상 모드를 선택하고 DHM 현미경 화상 취득 소프트웨어를 실시간 감시 창을 보면서 현미경 스테이지 샘플 위치. 샘플의 원하는 영역이 크게 백색광 조명 아래에 초점을 맞춘 나타납니다 것을 관찰한다. </li><li> 흰색에서 샘플의 서로 다른 영역의 명 시야 이미지 (상처 영역과 합류 세포와 주변 지역을) 캡처화상 획득 소프트웨어 및 문서 모양 세포 밀도와 균일 광 조명과. </li><li> DHM 현미경의 &quot;시야&quot;영상 모드를 선택합니다. DHM 현미경 화상 획득 소프트웨어를 실시간 감시 창 백색광 조명 하에서 적절한 상처 영역을 선택한다. 상처 영역은 죽은 세포없이 혈청 유적에서 무료로 확인하고 양측이 바람직 직선 테두리가 하나의 균일 한 세포 층을 포함 있는지 확인합니다. </li><li> DHM 현미경 화상 획득 소프트웨어 시야 촬상 모드의 초기 창상 면적 백색광 이미지를 캡처. </li><li> 레이저 조명 &quot;의&quot; &quot;DHM&quot;모드 스위치를 선택, 백색광 조명 &quot;OFF&quot;로 설정합니다. 홀로그램 기록 다음 3 밀리의 노광 시간 (간섭 줄무늬가 t의 화상 취득 소프트웨어의 라이브 영상 창의 적절한 콘트라스트 나타나는 홀로그램 축외 관찰 선택그는 현미경을 DHM)와 디지털 홀로그램을 캡처합니다. </li><li> 화상 획득 소프트웨어 DHM 모드 샘플 홀로그램을 포착하여 화상 품질을 확인하기 위해 DHM 현미경 재구성 소프트웨어 정량적 위상 이미지를 재구성. </li><li> DHM 현미경 화상 획득 소프트웨어 경과 홀로그램 취득 - (5 분 예 3) 적절한 시간 지연을 선택한다. </li><li> 샘플 만 홀로그램 취득 중에 레이저 광이 조사되는 화상 취득 소프트웨어의 시간 경과 획득 모드를 선택한다. </li><li> 상처 치유 분석의 시간 경과 DHM 관찰을 시작합니다. </li><li> , 의도 한 시간 후 시간 경과 수집을 중지 시야의 영상 모드를 선택하고 백색광 영상에서 샘플의 마지막 모습을 문서화합니다. </li></ol></li><li> 해부 조직 디지털 홀로그램을 재구성하고 정량화 파라미터로서 평균 굴절률을 결정조직 밀도 <ol><li> 켐퍼 외. 26 Langehanenberg 외. (27)에 기술 된 바와 같이, 예 DHM 현미경의 소프트웨어 해부 조직의 디지털 홀로그램 양적 위상 이미지를 재구성. </li><li> 관심 (로아) (19)의 적절하게 선택 지역에서 다른 조직 층 (상피 세포, 점막하, 기질)의 평균 위상차 Δφ를 결정합니다. </li><li> 굴절계를 사용하여 또는 대안 문헌 적절한 값을 이용하여 상기 매립 매체의 굴절률을 결정한다. (일반 매립 매체 굴절률 값 : 물 = 1.334 N 28 N 인산염 식염수 (PBS) = 1.337 29 없음 세포 배양 배지 = 1.337-1.339 29,30 버퍼링). </li><li> 평균 위상차 19 값과 다른 조직의 층의 굴절률을 계산 <img alt="식 (1)"SRC = &quot;/ 파일 / ftp_upload / 54460 / 54460eq1.jpg&quot;/&gt; (1) 참고 : 식으로. 상기 해부 조직의 두께 D (여기서는이 7㎛) 한 λ는 (λ = 532 nm의 여기) 레이저 광의 파장이고, n은 매질 여기 매립 매체 (굴절률이다 매체 = N PBS N 아베 - 굴절계에 의해 결정 = 1.337). </li></ol></li><li> 재구성과 일련의 관찰 상처 치유 시간 경과에서 디지털 홀로그램을 평가 <ol><li> DHM 현미경 소프트웨어 (26, 27)와 상처 치유 관찰하는 동안 얻은 시간 경과 홀로그램 시리즈에서 양적 위상 이미지를 재구성. </li><li> 최대 위상 콘트라스트 이미지에 양적 위상 이미지의 각 시리즈를 정상화. </li><li> 당 될 수 영상 분할하여 정량적 DHM 위상 이미지의 셀에 의해 커버되는 영역 S의 C를 결정자유 소프트웨어 셀 프로파일을 사용하여 형성 (www.cellprofiler.org 31). </li><li> 면적 S C가 세포 Δφ 셀의 평균 위상차를 계산한다. </li><li> 면적 S의 15 ℃에서의 평균 위상차 Δφ 셀로부터 셀룰러 건조 질량 DM 검색 <img alt="식 (2)" src="/files/ftp_upload/54460/54460eq2.jpg" /> (2) 주 :이 DM 셀룰러 건조 질량을 나타내고, 수학 식에서, S C는 세포 및 α = 0.002 ㎡ / kg에 의해 점유되는 영역을 제공한다. </li><li> 적분 셀룰러 굴절률 n 개의 셀 및 세포 배양 배지 N 매질의 굴절률을 결정한다. (30)에 기술 된 바와 같이 부유 세포는 별도로 실험적으로 n 개의 셀을 결정하고 굴절계와 n 개의 매체를 측정한다. 알터상대적으로 n 개의 셀 (30)과 중간 29, 30 N에 대한 문헌 값을 사용합니다. </li><li> λ, Δφ 셀, 셀 N 및 N 매체 26,32으로부터 평균 셀 두께 d 셀 계산 <img alt="식 (3)" src="/files/ftp_upload/54460/54460eq3.jpg" /> (삼) 참고 : 식으로. 세 파라미터 D 셀 λ는 레이저 광의 파장 평균 셀 두께를 나타내고있다, Δφ 전지는 평균 위상차를 나타내고, 셀 및 N 중, N은 정수 셀룰러 굴절률과 주위 매체의 굴절율이다. </li></ol></li></ol>

The authors have nothing to disclose.

우리는 DHM은 쥐 대장염 모델에서 조직 학적 손상과 인간의 대장 조직 샘플 생체의 정확한 평가를 제공한다는 것을 보여줍니다. 또한, 우리는 DHM 지속적 동시에 세포 변화에 대한 복합 정보를 제공하는 동안 상피 상처 치유를 모니터링 할 수 있습니다 표시. DHM에서 디지털로 촬영 된 홀로그램의 재건 수치 (32)이 수행된다. 따라서, 명 시야 현미경 제르 니케 위상차 미분 간섭 현미경 대조에 비하여, DHM은 선택적 후속 숫자 포커스 보정 (다 초점 화상)와 양적 위상차 (27)를 제공한다. 정량적 인 위상 이미지는 광로 길이의 변화의 판정에 기초하여 이에 이용되는 측정 장치의 매우 독립적이다. 이는 다른 수단에 취득 된 측정 데이터의 비교를 단순화시킨다. 또한, DHM은 OBJE 만 낮은 조명 강도를 필요코네티컷 조명. 이 흠 해부 조직의 침습적 분석을 가능하게하고 살아있는 세포의 장기간 경과 관찰 중 필요한 샘플의 상호 작용의 양을 최소화한다. IBD의 치료 필수품 전반은 크게 두 개의 지난 수십 년에 걸쳐 확대했다. UC와 CD 모두에 효과적이고 허용되는 부작용 프로파일, 신규 최근 임상 34-37 넣고, 인테그린 특이 적 항체를 표적이 항 TNF-α 요법 도입 게다가. 다른 몇몇 유망 에이전트는 현재 IBD 38-40에서의 치료 효과에 대해 평가되고있다. 그러나, 인간에서의 임상 적 사용에 앞서, 이러한 잠재적 인 치료제의 효능 및 안전성은 동물 연구에서 입증되어야한다. DSS에 유도 된 대장염은 높은 재현성 및 저비용 23 때문에 가장 많이 사용되는 뮤린 대장염 모델 중 하나이다. 또한이 모델은 할 수있는 알이렇게 유전자 변형 마우스에 적용될 41 균주. 전신 마커는, 예를 들면, CRP는 동물 모델에서 매우 가변적이며, 대장의 조직 학적 평가 42,43 중증도를 평가하는 가장 유효한 방법을 나타낸다. 그럼에도 불구하고, 채점 시스템에 따라 조직 학적 염증의 정량적 평가는 조사의 전문성과 경험에 크게 의존한다. DHM와 가능한 대물 파라미터에 의해 평가 자동 채점은 이러한 한계를 극복하고, 또한 19 염색의 필요성을 피하고 또한 시간 절약이다. 또한, DHM은 내시경 수술시 얻은 결장 시료뿐만 아니라 점막 샘플을 조사하는데 사용될 수있다. 상피 재생 및 상처 치유 위장 궤양 또는 문 합부 누출 등 여러 가지 병적 인 과정에서 중추적 인 메커니즘입니다. 접근법이 유망한 동안 V 상피 상처 치유를 평가IVO (44)는,이 기술은 정교한 검사 도구를 필요로하고 현재 널리 사용할 수 없습니다. 따라서, 현재 상피 치유는 일반적으로 시험관 9 스크래치 분석에 의해 조사한다. 이러한 분석은 상처 봉합의 유효한 검사를 할 수 있지만, 일반적으로 먼저 평가 10,45 반복 방지 세포 염색을 필요로한다. 또한, 어떠한 셀룰러 데이터 변경이 실험 장치에 병렬로 획득 할 수 없다. 이 사멸 및 괴사 (46)를 구분하고 세포 증식 및 이동 (46)을 평가하기 위해 사용될 수 있기 때문에,이 정보는 크게 중요 할 수있다. 따라서, 가능성이 동시에 검사 DHM 의한 상처 봉합의 모니터링 셀 두께, 건조 질량 또는 조직 밀도를 결정 점막 연구에서 높은 가치가있다. 인간의 IBD 환자의 치료 목표는 지속적으로 지난 수십 년에 걸쳐 변화 한 &lt;SUP&gt; 47. 염증의 초기 컨트롤이 가장 중요 나중에 스테로이드없는 죄 사함이 될 지금 치유를 점막 간주 동안 치료 (48)의 주요 목표입니다. 최근에는 조직 학적 관해도 49 단독 치료 점막 우수 할 수 있다는 것을 가정 하였다. 인간 IBD 가능한 몇 학적 스코어링 시스템이 존재하는 동안 그러나 관찰자 간 변동성 50 높게 유지된다. 따라서, 조직 학적 결장 시료의 평가를위한 표준화 된 방법이 필요하다. DHM이 목표에 기여할 수 있으며, 또한 인간의 IBD 환자와 전향 적 임상 시험에서 평가되어야한다. 제시된 실험 절차에서, 샘플은 고도로 일관된 레이저 광을 이용하여 조명 및 촬상된다. 따라서, DHM의 해상도가 주로 샘플 조명의 어긋남에 의한 빛의 산란 및 회절 효과에 의해 제한된다, 두께 샘플, 먼지 나이러한 광로의 축합 물과 같은 다른 불순물. 정량적 DHM 위상 콘트라스트 영상의 DHM 설치주의 제조 및 정렬 시료에서 매우 정확한 측정 데이터를 얻기 위해 프로토콜의 가장 중요한 단계이다. 철저히 현미경 응축기 현미경 대물이 잡음을 최소화하는 데 필요한 특정의 광학 촬상 소자를 세척. 또한 샘플 캐리어 슬라이드 페트리 접시 뚜껑 아래뿐만 아니라, 이용 된 세포 배양 배지는 입자상 불순물이 없어야한다. 이 신중하게 적용 액체의 모든 구성 요소와 적절한 필터링을 청소함으로써 달성된다. 디지털 홀로그램 및 / 또는 해부 조직의 정량적 DHM 위상 이미지에 노이즈가있는 경우, 유리 캐리어와 커버 슬립이 먼지에 의해 오염 될 수 상세한 트러블 슈팅 팁은 다음과 같다. 이 경우, 알코올 (예를 들면, 순수 에탄올)와 유리 캐리어와 커버 슬립을 청소합니다. 두꺼운 경우해부 조직의 다움은 (&gt; 10 μm의) 빛의 산란에 따라서 결과는, 얇은 조직 섹션을 사용하려고 너무 큽니다. 레이저 광 조명이 균일하게 분산되지 않는 경우, 현미경 용 응축기를 통하여 피사체 조명 정렬. 산란을 유도 효과를 유리 뚜껑의 하부에 물을 응축하면, 가열 실 및 실내 습도의 온도를 확인한다. 경우에 세포 밀도는 하나 이상의 층이 너무 높거나 세포의 성장은 상처 치유 검정의 제조 동안 세포 밀도를 감소시킨다. DHM은 간섭의 원리에 기초 마지막으로, 상기 방법은 각 실험실 환경에 따라 달라질 진동이나 기계적 외란에 민감하다. 그러나, 이러한 영향은 일반적으로 실험 장치의 제조 도중 홀로그래피 기록 용 적절히 선택된 노출 시간 (통상적으로 밀리 초 범위 또는 이하)에 의해 최소화 될 수있다. 요약하자면우리의 결과로 인해 양적으로 거의 자동화 된 방식으로 조직 학적 염증 생체을 평가하는 능력에 DHM 밝은 필드와 같은 제르 니케 상 대비 및 DIC 등 기존의 위상차 영상 현미경 기술을 통해 주요 장점을 보유하고 있음을 보여줍니다. 또한 DHM은 샘플을 최소화 상호 작용 시험관 내에서 상피 상처 치유의 라벨이없는 연속 멀티 모달 평가를 할 수 있습니다. 이 IBD 환자에 DHM의 번역 가능성을 탐구하는 &#39;디지털 병리학&#39; &#39;더욱 확장 된 연구의 측면에서 자동화 된 조직 학적 검사에 대한 방법을 불법 체류자. 또한, DHM 기회가 정량적으로 세포 이동, 형태 및 확산을 연구하는 체외 소설을 제공합니다. 임상에 DHM의 번역은 IBD 진단을 향상시킬 수있는 잠재력을 가지고있다. DHM은 장 염증의 다른 정도의 정량화를 통해 할 수 있습니다으로밀도 변화는 &quot;디지털 병리학」의 관점에서 질환의 대물보다 정확한 평가와 같은 물리적 파라미터 가능 보인다. 대물 평가 IBD 환자의 임상 적 관리에 큰 영향을 끼칠 수있다.

염증성 장 즉 질환 (IBD), 궤양 성 대장염 (UC) 및 크론 병 (CD)은 위장관 (1)의 특발성 염증성 질환이다. IBD의 기본 병태 생리 및 잠재적 신약 또는 새로운 진단 방법의 평가에 대한 연구는 특히 중요하다. 모두 기초 연구 및 IBD 환자의 임상 관리에서, 장 점막 관심 2,3의 초점이되었다. 점막은 공생 박테리아, 상피 세포 및 장 면역계의 다양한 세포 구성 요소 간의 상호 작용을 직감 4,5 항상성 조율하는 해부학 적 경계를 나타낸다. 그러나, IBD 환자, 조절되지 않는 영구 장 염증은 결국 자체가 지역의 염증 (6)을 악화 상피 장벽 기능의 고장 절정에 달하다 수 있습니다 궤양이나 협착 등의 검출 손상, 점막 연결됩니다. <p클래스 = &quot;jove_content은&quot;&gt; 상피 치유 염증 다음 상피 재생을위한 따라서 중요하다뿐만 아니라 위장 수술 7 일 후 위장관 궤양 또는 문 합부 누출의 치유의 핵심 요구 사항입니다 상처. 상피는 치유 검정 치료 시험 관내 상처 시뮬레이션 장내 염증 8,9의 뮤린 모델 수 권취. 두 시험 관내 및 생체 내 접근법 실험 평가의 정확성을 제한하는 문제점을 가지고있다. 시험관 분석법을 고전 스크래치 분석처럼 형광 발색단와 장기화 염색 절차 또는 형질 전환이 필요합니다. 이들은 종종 10을 자동화 할 수없는 세포 증식 및 이동의 그 불연속 모니터링에 의해 제한된다. 이러한 덱스 트란 황산나트륨 (DSS)에 의해 유도 성 대장염과 같은 생체 내 모델을 자주 인해 나타나는 심각한 변화에 부분적으로 강력한 리드 아웃 부족 실험실 마커에, 엄마부적절한 왕 같은 마커는 대장염 심각도 11, 12을 평가한다. 염증 점막의 조직 학적 분석은 여전히 현재 대장염의 심각도를 결정하는 가장 유효한 방법이지만이, 시험 관내 상피 창상 치유의 분석처럼, 염색을 필요로하고 연구자의 ​​전문성 (13)에 따라 달라집니다. 최근 디지털 홀로그램 현미경 (DHM) 정량적 인 위상 현미경 (14)의 변형이 시험 관내 및 생체 내 15 상피 상처 치료의 평가에 유용한 도구로 확인되었다. DHM은 (OPD)의 광로 길이의 지연을 측정함으로써 조직 농도의 평가를 허용 어느 전망 소설 암 진단 16 ~ 18과 염증 관련 조직 변화 (19)의 정량화. 또한, DHM은 셀 두께, 셀 커​​버 표면적 세포 (단백질) 함량의 양을 측정함으로써 세포 형태 역학의 모니터링을 허용 <sup&gt; 15, 20. 생체 외 분석에서, DHM은 생리 학적 과정, 예를 들면, 세포 부피 및 두께 (21, 22)의 변화를 평가함으로써 셀룰러 투수의 분석을 가능하게한다. 또한, DHM 측정 조사원 관련된 샘플 바이어스를 방지하는 자동화 될 수있다. 여기서는 장내 염증의 뮤린 모델 DHM의 사용을 설명하고, 또한, 라벨없는 시험 관내 분석과 같은 상처 치유 정량적 모니터링 인체 조직 시료의 분석을 적용 DHM. 첫째, 우리는 IBD와 인간의 대장염 마우스 및 조직 섹션에서 다른 대장 벽 층의 염증 변화를 평가한다. DHM 정량적 위상 촬상 절차를 기술 한 결과 취득한 정량적 위상 이미지에 대한 평가를 설명도 현미경 성분, 조직 절편의 제조 및 사용에 대한 자세한 설명을 제공한다. 다음으로, DHM은 요로 감염 될 수 있다는 것을 보여시험관 내에서 상피 상처 치유 복합 지속적인 모니터링하게 안정적 및 세포 막 두께, 건조 질량 및 부피 등 셀룰러 세포의 특성 분석을 서술 약물 유도 세포 생리적 변화에 대한 통찰력을 제공한다.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Azoxymethane (AOM)</td><td>Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany</td><td>A5486</td><td></td></tr><tr><td>Cell Culture Flask</td><td>Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany</td><td>658170</td><td></td></tr><tr><td>Costar Stripette</td><td>Corning Inc., New York, USA</td><td>4488</td><td></td></tr><tr><td>Dextran sulphate sodium (DSS)</td><td>TdB Consulatancy, Uppsala, Sweden</td><td>DB001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/Ham&#039;s F12</td><td>PAA Laboratories - Pasching - Austria</td><td>E15-813</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany</td><td>SPR3196</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td><td>Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany</td><td>E 9884</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Tube 50 ml</td><td>BD Biosciences, Erembodegem, Belgium</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Isopentane (2-Methylbutane)</td><td>Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany</td><td>M32631-1L</td><td></td></tr><tr><td>Methylene blue</td><td>Merck, Darmstadt, Germany</td><td>1159430025</td><td></td></tr><tr><td>Mitomycin C</td><td>Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany</td><td>M4287</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Slides</td><td>G. Menzel, Braunschweig, Germany</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T. Tissue Tek compound&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sakura, Zoeterwonde, Netherlands</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep/Amphotericin B</td><td>Lonza, Verviers, Belgium</td><td>1558</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline, PBS</td><td>Lonza, Verviers, Belgium</td><td>4629</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Lonza, Verviers, Belgium</td><td>3626</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride 0.9%</td><td>Braun, Melsungen, Germany</td><td>5/12211095/0411</td><td></td></tr><tr><td>Standard diet</td><td>Altromin, Lage, Germany</td><td>1320</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Cryomold</td><td>Sakura, Leiden, Netherlands</td><td>4566</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin EDTA</td><td>Lonza, Verviers, Belgium</td><td>7815</td><td></td></tr><tr><td>Vitro &amp;ndash; Clud</td><td>R. Langenbrinck, Teningen, Germany</td><td>04-0002&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;micro;-Dish 35 mm with Culture-Insert, high</td><td>ibidi GmbH, Munich, Germany</td><td>81176</td><td></td></tr><tr><td>DIC Lid for &amp;micro;-Dishes, with a glass insert</td><td>ibidi GmbH, Munich, Germany</td><td>80050</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MICROM HM550</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, USA</td><td>46320</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Digital holographic microscope&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Component&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Model&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Inverted Microscope</td><td>iMIC</td><td>Till Photonics, Graefelfing, Germany</td><td></td></tr><tr><td>Laser</td><td>Compass 315M</td><td>Coherent GmbH, Luebeck, Germany</td><td></td></tr><tr><td>Microscope lens</td><td>Zeiss EC Plan Neofluar 10x/0.3</td><td>Zeiss, Goettingen, Germany</td><td></td></tr><tr><td>CCD camera</td><td>DMK 41BF02</td><td>The Imaging Source, Bremen, Germany</td><td></td></tr></tbody></table>

multimodal quantitative phase imaging with digital holographic microscopy accurately assesses intestinal inflammation and epithelial wound healing

즉, 염증성 장 질환의 발생 빈도는, 크론 병과 궤양 성 대장염은 상당히 지난 10 년간 증가했다. IBD의 원인은 알 수없는 남아 있고 현재 치료 전략은 면역 시스템의 불특정 억제를 기준으로합니다. 특히 현저 IBD의 관리를 향상시킬 수있는 장내 염증과 상피 상처 치유를 표적 치료의 개발은, 그러나 이것은 염증성 변화의 정확한 검출을 필요로한다. 현재 잠재적 인 약물 후보는 일반적으로 생체 내 또는 시험 관내 세포 배양 기술을 기반으로, 동물 모델을 이용하여 평가된다. 조직 학적 검사는 일반적으로 샘플 특성을 변경할 수 있으며, 또한, 연구 결과의 해석은 연구자의 전문성에 따라 다를 수있는 세포 또는 관심의 조직 염색 할 필요합니다. 디지털 홀로그램 현미경 (DHM)는 광로 길이 지연의 검출에 기초하여 허용얼룩없는 양적 위상차 영상. 이 결과는 직접적으로 절대 생 물리적 파라미터와 상관 될 수있다. 우리는 굴절률 측정을 기반으로 DHM와 조직 밀도의 변화 측정, 대장염 쥐와 인간의 대장 조직 표본의 다른 레이어에, 염색하지 않고, 염증성 변화를 정량화하는 방법을 보여줍니다. 또한, 우리는 건조 중량 및 마이그레이션 세포의 층 두께로 부상 면적과 형태 학적 매개 변수의 동시 결정 간단한 자동 결정을 통해 DHM을 사용하여 체외 가능 상피 상처 치유의 연속 복합 라벨없는 모니터링을 보여줍니다. 결론적으로, DHM은 가치, 소설, 양적 도구 가능한 매개 변수에 대한 절대 값과 장 염증의 평가, 시험관 내에서 상피 상처 치유의 단순화 정량을 나타내고, 따라서 번역 진단 유 높은 잠재력을 가지고있다그 자체.

디지털 홀로그램 현미경에 대한 DHM 이미지에 대한 일반적인 설정 (DHM) 도 1b에 도시 된 바와 같이 명 시야 촬상 정량적 DHM 위상차 촬상을 수행하기 위해 거꾸로 현미경을 적용 하였다. (25) 상술 한 바와 같이 시스템이하는 DHM 모듈을 부착시킴으로써 변성시켰다. 마하 젠더 구성 (도 1 A)에 YAG 레이저 λ = 532 ㎚) : 디지털 홀로그램을 조명함으로써 주파수의 Nd 배의 빛으로 샘플을 생성 하였다. 해부 조직 유리 캐리어 슬라이드 생체 분석 하였다. .도 1 C에 도시 된 바와 같이, 살아있는 세포 배양 물은 상처 치유 관찰 특수 배양 접시에서 관찰되었다. 샘플을 10 배 MI 통해 투과 조명시에 이미징 된croscope 렌즈 (NA는 0.3 =) 및 튜브 렌즈. 전하 결합 소자 카메라가 약간 기울어 기준 파형과 견본 화상 (오브젝트 파)의 중첩에 의해 발생되는 간섭 패턴 (디지털 축외 홀로그램)을 기록 하였다. 디지털 촬영 된 홀로그램은 공간 위상 홀로그램 선택 사항 26,33를 오토 포커싱과 조합하여 재구성을 이동하여 재구성 하였다. DHM에 의해 쥐 DSS 유발 성 대장염의 평가 급성 대장염 5 일 동안 물을 마시는 덱스 트란 황산 나트륨 (DSS)의 v / w는 3 %의 투여에 의해 쥐에서 유도 하였다. 발현 및 대장염의 과정은 대조군에 비해 처리 군 DSS 진보적 중량 손실을 모니터링 하였다. (그림 2 A는 19 일부터 적용). 심각한 대장균에 내시경, 중간대장 벽의 비후에 의해 반영 TIS 관찰, 혈관 패턴 (예를 들어, 자연 출혈, 빨간색 화살표), 섬유소 삼출물 (흰색 화살표)과 점막 표면 (그림 2B)의 단위의 변경. 헤 마톡 실린 및 에오신의 기존 조직 학적 평가 (HE)은 결장 섹션은 주로 점막하 (그림 2 C 회색 화살표)에있는 제어 동물, 절 DSS 처리의 대장 벽에 표시된 부종을 밝혀 스테인드. 수학 식 1에 의해 검색된 정량 DHM 위상차 이미지와 관련 굴절률 맵을 대응하여, 또한 상기의 조직 변화를 도시. 또한, 256 계조로 부호화 굴절률은 네이티브 염색 조직 샘플의 상피 (백색 화살표) 및 기질 (흑색 화살표) (도 2를 포함한 조직층의 밀도의 차이를 나타내 </st룽&gt; C). 굴절률이 크게 상피뿐만 아니라 건강한 대조군 (도 2 E)에 비해 대장염 마우스의 점막하 간질 감소 하였다. 또한, 임상 적 매개 변수 (체중의 상대적인 손실)과 절대적 물리적 매개 변수 (굴절률) 사이에는 유의 한 상관 관계가 관찰 될 수있다 (R 2 선형 = 0.64, (19)로부터 적응도 2 D). DHM에 의해 인간의 크론 병의 평가 크론 병은 주로 위장관 내시경에 의해 검출 된 장 벽의 현저한 염증 변화에 의해 식별된다. 섬유소 exudat와 특징 매크로 기능은 점막 표면의 단위의 구성, 세로 궤양이온 (도 3 A)의 출혈과 자발적인 (또한 &quot;달팽이 트레일&quot;라 함). 활성 CD 환자에서 조직 샘플의 HE 염색에 의한 조직 학적 평가는 종종 결장 벽뿐만 아니라 점막하 부종을 알 수있다. 수학 식 1에 의해 검색 정량 DHM 위상 콘트라스트 이미지와 관련 굴절률지도를 해당 여기 상피 (그림 3 B)에서 볼 수있는 대장 벽의 염증 매개 성 향상 / 붓기가 발견되었습니다. 또한, 절대 파라미터로서 굴절률이 현저하게 경감의 구절 활성 CD (도 3 C)와 함께 환자의 결장 조직 샘플의 모든 벽 층 (상피 및 점막하 기질)로 감소 하였다. - 시험 관내 상처 치유의 복합 모니터링 </em&gt; 카코 -2 세포 분석은 표준 조건을 제공하기 위해 특수 배양 접시를 사용하여 수행 하였다 상처 치유. 요리는 500 μm의 (그림 4 A)의 간격에 의해 분리되어 두 개의 서로 다른 챔버를 형성하는 문화 인서트가 장착되어 있습니다. 다른 생리 학적 환경을 시뮬레이션하기 위해 세포는 표피 성장 인자 (EGF)에 의해 자극 또는 마이 토마 이신 C의 억제, 치료없이 어느 조사 하였다. DHM 설정 실험의 시작 (그림 4 B) 후 0, 22.5, 45 시간 후 (256 그레이 레벨로 코딩) 대표 양적 DHM 위상 콘트라스트 이미지가 여기에 묘사 된 시간에 프로세스를 치유 상처의 지속적인 모니터링을 할 수 있습니다. 도 5에 잘못된 색으로 의사 3D 플롯 대응하는 세 개의 다이의 셀 층 두께의 공간적 전개를 도시mensions. 광로 길이 지연 셀룰러 굴절률에 기초하여 2, 3 방정식, DHM은 전지 커버 표면적, 평균 셀 두께 및 세포 건조 중량 (셀룰러 특성 시간 모니터링하여 이동, 증식 및 형태 동시에 동적 평가를 허용 그림 4 C). 요약하면,도 4의 데이터는 시야에서 증가 된 평균 셀 두께 상처 영역에 세포의 빠른 이동, 및 더 높은 건조 질량 EGF 시뮬레이션 결과는 대조군 세포에 비해 것을 나타낸다. 억제 세포가 포함 된 c 반면, 미토 마이신은 약간의 실험 과정에서 대조군 세포에 비해 표면적이 감소하여도 약간 낮은 건조 질량의 증가를 나타낸다. 그러나, 평균 셀 두께 모두에 비해 감소 자극 대조군 세포 분명히 나타나는. 그림 1. 디지털 홀로그램 현미경 (DHM). DHM 워크 스테이션 (A)의 도식 설정에 오프 축 설정 활용. 현미경 설정 (모니터, 실시간 영상과 제어 소프트웨어 (1)을 묘사 한 사진 대응 축외 설치 디지털 현미경 (2), (B), 현미경 (녹색 점선)과 시료의 광로 적색으로 표시된 ( 화살표 (C)). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54460/54460fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54460/54460fig2.jpg" /> 그림 2. DHM에 의해 쥐 DSS 유발 성 대장염의 평가. 대장염의 과정은 매일 저를 선행되었다상대 체중과 반복 내시경 추적 검사의 asurement. (19에서 적응) DSS 관리 (A)의 시작 후 4 일에서 상대적 체중의 대규모 손실은 초점 궤양 및 점막 취약점 (B)를 포함하여 설립 대장염의 내시경 적 징후를 동반 하였다. 기존의 HE 염색 저온 유지 섹션의 분석은 점막하 부종, 근층 및 점막에 뚜렷한 점막 염증 침윤의 비후를 한 것으로 밝혀졌습니다. 수학 식 1에 의해 검색된 정량 DHM 위상차 이미지와 관련 굴절률지도 대응 (256 계조로 부호화) 염증 과정 점막하의 부종성 변화를 확인 (C) (흰색 화살표 상피 회색 점막하 블랙 기질을 나타낸다). 상당히 굴절율 (절대 물리적 파라미터, R = 0.6이 선형 상관 관계 체중의 상대적인 감소 (임상 파라미터)4; 크게 상피 세포에서뿐만 아니라 점막하과 정상 대조군에 비해 대장염 마우스의 기질에 감소 하였다 (19)에서 적응 (D가),), (SEM 평균 ±, *** P &lt;0.001;. E) <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54460/54460fig2large.jpg" target="_blank">를 클릭하세요 여기이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54460/54460fig3.jpg" /> DHM 의해 인간 크론 병에서의 평가도 3. 내시경 및 조직 학적으로 확인 크론 병 환자의 결장 조직 샘플을 조사 하였다 (A). HE-염색 점막 지하실의 연장 및 염증 세포의 침윤 표시를 표시. 또한, 점막하 부종과 근층의 고유 층의 확대가 검출되었다. CORR 분석식에 의해 검색 정량 DHM 위상 콘트라스트 이미지와 관련 굴절률지도를 esponding (1) (256 그레이 레벨로 코딩) 또한 상피 세포 (B)에서 (여기에 흰색과 검은 색 스타로 표시) 부종성 변화를 한 것으로 밝혀졌습니다. 평균 굴절률 유의 한 차이가 활성 플레어 (일반 바) 또는 면제 (검은 막대)와 CD 환자의 샘플에서 검출되었다. 이러한 차이는 각 조직 유형에서 볼 수 있습니다에게 (± SEM, *** P &lt;0.001 의미; C)를. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54460/54460fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/54460/54460fig4.jpg" /> 화이트 라이트 현미경 및 DHM에 의한 상피 창상 치유의 그림 4. 모니터링. 배양 된 세포가 트란했다특수 인서트 (빨간색 화살표)와 배양 접시에 sferred. 문화 인서트를 제거하기 전에 세포는 24 시간 동안 EGF 또는 마이 토마 이신 C 중 하나를 처리, 또는 혼자 매체 (자극되지 제어) (A)로 처리 하였다. 배양 인서트 제거한 후, 상처 치유 연속적 시간 경과 DHM 의해 위상차 촬상에 의해 모니터링 하였다. 세포 윤곽이 명확하게 인식 할 수있다. 주제 정량적 DHM 위상차 이미지는 22.5 시간 후, 45 시간 (B) 후에 측정이 끝날 때 실험의 시작 부분에 나타나있다. 패널 (C)는 세포 덮인 표면 (S의 c)에 해당하는 시간 변경, 평균 셀 두께 (D 셀) 및 휴대 건조 질량 (DM)를 보여줍니다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54460/54460fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 그림 5. 정량적 DHM 단계 대비 이미지의 거짓 컬러 코딩 된 의사 3 D 플롯에 의해 세포 계층 형태학 변화의 그림입니다. t = 0도 4b의 양적 DHM 위상 콘트라스트 이미지의 대표 거짓 색으로 구분 의사 3D 플롯, 22.5 시간 후와 45 시간 후 측정의 끝에서, 제어 - 대한 세포 층의 두께의 공간 개발을 설명, 마이 토마 이신은 C-억제 및 3D에서 EGF 자극 세포. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54460/54460fig5large.jpg" target="_blank">이 ​​그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Multimodal Quantitative Phase Imaging with Digital Holographic Microscopy Accurately Assesses Intestinal Inflammation and Epithelial Wound Healing

Accurate assessment of anti-inflammatory effects is of utmost importance for the evaluation of potential new drugs for the treatment of inflammatory bowel disease. Digital holographic microscopy provides assessment of inflammation in murine and human colonic tissue samples as well as automated multimodal evaluation of epithelial wound healing in vitro.

디지털 홀로그램 현미경과 복합 양적 위상 이미징 정확하게 장내 염증과 상피 상처 치유를 평가

The incidence of inflammatory bowel disease, i.e., Crohn&#39;s disease and Ulcerative colitis, has significantly increased over the last decade. The ...

multimodal-quantitative-phase-imaging-with-digital-holographic

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

8.3K 조회수.  University Hospital Münster. Accurate assessment of anti-inflammatory effects is of utmost importance for the evaluation of potential new drugs for the treatment of inflammatory bowel disease. Digital holographic microscopy provides assessment of inflammation in murine and human colonic tissue samples as well as automated multimodal evaluation of epithelial wound healing in vitro. 

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Quantitative Optical Microscopy: Measurement of Cellular Biophysical Features with a Standard Optical Microscope

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of mass, volume, and density on cellular specimens through a combination of bright field and differential interference contrast imagery. Two primary approaches are presented: noninterferometric quantitative phase microscopy (NIQPM), to perform measurements of total cell mass and subcellular density distribution, and Hilbert transform differential interference contrast microscopy (HTDIC)&#160;to determine volume. NIQPM is based on a simplified model of wave propagation, termed the paraxial approximation, with three underlying assumptions: low numerical aperture (NA) illumination, weak scattering, and weak absorption of light by the specimen. Fortunately, unstained cellular specimens satisfy these assumptions and low NA illumination is easily achieved on commercial microscopes. HTDIC is used to obtain volumetric information from through-focus DIC imagery under high NA illumination conditions. High NA illumination enables enhanced sectioning of the specimen along the optical axis. Hilbert transform processing on the DIC image stacks greatly enhances edge detection algorithms for localization of the specimen borders in three dimensions by separating the gray values of the specimen intensity from those of the background. The primary advantages of NIQPM and HTDIC lay in their technological accessibility using &#8220;off-the-shelf&#8221; microscopes. There are two basic limitations of these methods: slow z-stack acquisition time on commercial scopes currently abrogates the investigation of phenomena faster than 1 frame/minute, and secondly, diffraction effects restrict the utility of NIQPM and HTDIC to objects from 0.2 up to 10 (NIQPM) and 20 (HTDIC) &#956;m in diameter, respectively. Hence, the specimen and its associated time dynamics of interest must meet certain size and temporal constraints to enable the use of these methods. Excitingly, most fixed cellular specimens are readily investigated with these methods.

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of cellular mass, volume, and density through a combination of bright field and differential interference contrast imagery.

양이 광학 현미경 : 세포 생물 물리학의 측정​​ 표준 광학 현미경과 특징

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of mass, volume, and density on cellular specimens through a ...

연구

생체공학

Multimodal Hierarchical Imaging of Serial Sections for Finding Specific Cellular Targets within Large Volumes

Targeting specific cells at ultrastructural resolution within a mixed cell population or a tissue can be achieved by hierarchical imaging using a combination of light and electron microscopy. Samples embedded in resin are sectioned into arrays consisting of ribbons of hundreds of ultrathin sections and deposited on pieces of silicon wafer or conductively coated coverslips. Arrays are imaged at low resolution using a digital consumer like smartphone camera or light microscope (LM) for a rapid large area overview, or a wide field fluorescence microscope (fluorescence light microscopy (FLM)) after labeling with fluorophores. After post-staining with heavy metals, arrays are imaged in a scanning electron microscope (SEM). Selection of targets is possible from 3D reconstructions generated by FLM or from 3D reconstructions made from the SEM image stacks at intermediate resolution if no fluorescent markers are available. For ultrastructural analysis, selected targets are finally recorded in the SEM at high-resolution (a few nanometer image pixels). A ribbon-handling tool that can be retrofitted to any ultramicrotome is demonstrated. It helps with array production and substrate removal from the sectioning knife boat. A software platform that allows automated imaging of arrays in the SEM is discussed. Compared to other methods generating large volume EM data, such as serial block-face SEM (SBF-SEM) or focused ion beam SEM (FIB-SEM), this approach has two major advantages: (1) The resin-embedded sample is conserved, albeit in a sliced-up version. It can be stained in different ways and imaged with different resolutions. (2) As the sections can be post-stained, it is not necessary to use samples strongly block-stained with heavy metals to introduce contrast for SEM imaging or render the tissue blocks conductive. This makes the method applicable to a wide variety of materials and biological questions. Particularly prefixed materials e.g., from biopsy banks and pathology labs, can directly be embedded and reconstructed in 3D.

This protocol targets specific cells in tissue for imaging at nanoscale resolution using a scanning electron microscope (SEM). Large numbers of serial sections from resin-embedded biological material are first imaged in a light microscope to identify the target and then in a hierarchical manner in the SEM.

큰 볼륨 내에서 특정 세포 목표를 찾아내기를 위한 직렬 섹션의 복합 계층적 이미징

Targeting specific cells at ultrastructural resolution within a mixed cell population or a tissue can be achieved by hierarchical imaging using a ...

발생학

Murine Endoscopy for In Vivo Multimodal Imaging of Carcinogenesis and Assessment of Intestinal Wound Healing and Inflammation

Mouse models are widely used to study pathogenesis of human diseases and to evaluate diagnostic procedures as well as therapeutic interventions preclinically. However, valid assessment of pathological alterations often requires histological analysis, and when performed ex vivo, necessitates death of the animal. Therefore in conventional experimental settings, intra-individual follow-up examinations are rarely possible. Thus, development of murine endoscopy in live mice enables investigators for the first time to both directly visualize the gastrointestinal mucosa and also repeat the procedure to monitor for alterations. Numerous applications for in vivo murine endoscopy exist, including studying intestinal inflammation or wound healing, obtaining mucosal biopsies repeatedly, and to locally administer diagnostic or therapeutic agents using miniature injection catheters. Most recently, molecular imaging has extended diagnostic imaging modalities allowing specific detection of distinct target molecules using specific photoprobes. In conclusion, murine endoscopy has emerged as a novel cutting-edge technology for diagnostic experimental in vivo imaging and may significantly impact on preclinical research in various fields.

Murine Endoscopy for In Vivo Multimodal Imaging of Carcinogenesis and Assessment of Intestinal Wound Healing and Inflammation

Small animal imaging techniques allow serial diagnostic examinations and therapeutic interventions in vivo. Recently, the scope of applications has significantly widened and currently includes assessment of colonic tumor development, wound healing and monitoring of inflammation. This protocol illustrates these diverse potential applications of murine endoscopy.

에 대한 쥐의 내시경<em&gt; 생체</em&gt; 발암 및 소장의 평가의 멀티 모달 이미징 상처 치유 및 염증

Mouse models are widely used to study pathogenesis of human diseases and to evaluate diagnostic procedures as well as therapeutic interventions ...

의학

Multimodal Imaging and Spectroscopy Fiber-bundle Microendoscopy Platform for Non-invasive, In Vivo Tissue Analysis

Recent fiber-bundle microendoscopy techniques enable non-invasive analysis of in vivo tissue using either imaging techniques or a combination of spectroscopy techniques. Combining imaging and spectroscopy techniques into a single optical probe may provide a more complete analysis of tissue health. In this article, two dissimilar modalities are combined, high-resolution fluorescence microendoscopy imaging and diffuse reflectance spectroscopy, into a single optical probe. High-resolution fluorescence microendoscopy imaging is a technique used to visualize apical tissue micro-architecture and, although mostly a qualitative technique, has demonstrated effective real-time differentiation between neoplastic and non-neoplastic tissue. Diffuse reflectance spectroscopy is a technique which can extract tissue physiological parameters including local hemoglobin concentration, melanin concentration, and oxygen saturation. This article describes the specifications required to construct the fiber-optic probe, how to build the instrumentation, and then demonstrates the technique on in vivo human skin. This work revealed that tissue micro-architecture, specifically apical skin keratinocytes, can be co-registered with its associated physiological parameters. The instrumentation and fiber-bundle probe presented here can be optimized as either a handheld or endoscopically-compatible device for use in a variety of organ systems. Additional clinical research is needed to test the viability of this technique for different epithelial disease states.

Multimodal Imaging and Spectroscopy Fiber-bundle Microendoscopy Platform for Non-invasive, In Vivo Tissue Analysis

The assembly and use of a multimodal microendoscope is described which can co-register superficial tissue image data with tissue physiological parameters including hemoglobin concentration, melanin concentration, and oxygen saturation. This technique can be useful for evaluating tissue structure and perfusion, and can be optimized for individual needs of the investigator.

멀티 모달 이미징 및 비 침습적에 대한 분광학 섬유 다발 Microendoscopy 플랫폼,<em&gt; 생체</em&gt; 조직 분석

Recent fiber-bundle microendoscopy techniques enable non-invasive analysis of in vivo tissue using either imaging techniques or a combination of ...

Fluorescence-mediated Tomography for the Detection and Quantification of Macrophage-related Murine Intestinal Inflammation

Murine models of disease are indispensable to scientific research. However, many diagnostic tools such as endoscopy or tomographic imaging are not routinely employed in animal models. Conventional experimental readouts often rely on post mortem and ex vivo analyses, which prevent intra-individual follow-up examinations and increase the number of study animals needed. Fluorescence-mediated tomography enables the non-invasive, repetitive, quantitative, three-dimensional assessment of fluorescent probes. It is highly sensitive and permits the use of molecular makers, which allows for the specific detection and characterization of distinct molecular targets. In particular, targeted probes represent an innovative tool for analyzing gene activation and protein expression in inflammation, autoimmune disease, infection, vascular disease, cell migration, tumorigenesis, etc. In this article, we provide step-by-step instructions on this sophisticated imaging technology for the in vivo detection and characterization of inflammation (i.e., F4/80-positive macrophage infiltration) in a widely used murine model of intestinal inflammation. This technique might also be used in other research areas, such as immune cell or stem cell tracking.

Target-specific probes represent an innovative tool for analyzing molecular mechanisms, such as protein expression in various types of disease (e.g., inflammation, infection, and tumorigenesis). In this study, we describe a quantitative three-dimensional tomographic assessment of intestinal macrophage infiltration in a murine model of colitis using F4/80-specific fluorescence-mediated tomography.

검색 및 대 식 세포 관련 Murine 창 자 염증의 정량화에 대 한 단층 형광 중재

Murine models of disease are indispensable to scientific research. However, many diagnostic tools such as endoscopy or tomographic imaging are not ...

Intravital Imaging of Intraepithelial Lymphocytes in Murine Small Intestine

Intraepithelial lymphocytes expressing &#947;&#948; T cell receptor (&#947;&#948; IEL) play a key role in immune surveillance of the intestinal epithelium. Due in part to the lack of a definitive ligand for the &#947;&#948; T cell receptor, our understanding of the regulation of &#947;&#948; IEL activation and their function in vivo remains limited. This necessitates the development of alternative strategies to interrogate signaling pathways involved in regulating &#947;&#948; IEL function and the responsiveness of these cells to the local microenvironment. Although &#947;&#948; IELs are widely understood to limit pathogen translocation, the use of intravital imaging has been critical to understanding the spatiotemporal dynamics of IEL/epithelial interactions at steady-state and in response to invasive pathogens. Herein, we present a protocol for visualizing IEL migratory behavior in the small intestinal mucosa of a GFP &#947;&#948; T cell reporter mouse using inverted spinning disk confocal laser microscopy. Although the maximum imaging depth of this approach is limited relative to the use of two-photon laser-scanning microscopy, spinning disk confocal laser microscopy provides the advantage of high speed image acquisition with reduced photobleaching and photodamage. Using 4D image analysis software, T cell surveillance behavior and their interactions with neighboring cells can be analyzed following experimental manipulation to provide additional insight into IEL activation and function within the intestinal mucosa.

We describe a method to visualize GFP-labeled &#947;&#948; IELs using intravital imaging of murine small intestine by inverted spinning disk confocal microscopy. This technique enables the tracking of live cells within the mucosa for up to 4 h and can be used to investigate a variety of intestinal immune-epithelial interactions. &#160;

뮤린 소장에서 상피 내 림프구의 활력 영상

Intraepithelial lymphocytes expressing &#947;&#948; T cell receptor (&#947;&#948; IEL) play a key role in immune surveillance of the intestinal ...

면역학 및 감염병학

An Intravital Microscopy-Based Approach to Assess Intestinal Permeability and Epithelial Cell Shedding Performance

Intravital microscopy of the gut using confocal imaging allows real time observation of epithelial cell shedding and barrier leakage in living animals. Therefore, the intestinal mucosa of anesthetized mice is topically stained with unspecific staining (acriflavine) and a fluorescent tracer (rhodamine-B dextran), mounted on a saline solution-rinsed plate and directly imaged using a confocal microscope. This technique can complement other non-invasive techniques to identify leakage of intestinal permeability, such as transmucosal passage of orally administered tracers. Besides this, the approach presented here allows the direct observation of cell shedding events at real-time. In combination with appropriate fluorescent reporter mice, this approach is suitable for shedding light into cellular and molecular mechanisms controlling intestinal epithelial cell extrusion, as well as to other biological processes. In the last decades, interesting studies using intravital microscopy have contributed to knowledge on endothelial permeability, immune cell gut homing, immune-epithelial communication and invasion of luminal components, among others. Together, the protocol presented here would not only help increase the understanding of mechanisms controlling epithelial cell extrusion, but could also be the basis for the developmental of other approaches to be used as instruments to visualize other highly dynamic cellular process, even in other tissues. Among technical limitations, optical properties of the specific tissue, as well as the selected imaging technology and microscope configuration, would in turn, determine the imaging working distance, and resolution of acquired images.

Taking advantage of intravital microscopy, the method presented here enables real-time visualization of intestinal epithelial cell shedding in living animals. Therefore, topically stained intestinal mucosa (acriflavine and rhodamineB-dextran) of anesthetized mice is imaged up to single-cell resolution using confocal microscopy.

장 내 투과성 및 상피 세포 흘리기 성능을 평가하기 위한 인트라바이탈 현미경 기반 접근법

Intravital microscopy of the gut using confocal imaging allows real time observation of epithelial cell shedding and barrier leakage in living animals. ...

Digital Inline Holographic Microscopy (DIHM) of Weakly-scattering Subjects

Weakly-scattering objects, such as small colloidal particles and most biological cells, are frequently encountered in microscopy. Indeed, a range of techniques have been developed to better visualize these phase objects; phase contrast and DIC are among the most popular methods for enhancing contrast. However, recording position and shape in the out-of-imaging-plane direction remains challenging. This report introduces a simple experimental method to accurately determine the location and geometry of objects in three dimensions, using digital inline holographic microscopy (DIHM). Broadly speaking, the accessible sample volume is defined by the camera sensor size in the lateral direction, and the illumination coherence in the axial direction. Typical sample volumes range from 200 &#181;m&#160;x 200 &#181;m&#160;x 200 &#181;m using LED illumination, to 5 mm&#160;x 5 mm&#160;x 5 mm or larger using laser illumination. This illumination light is configured so that plane waves are incident on the sample. Objects in the sample volume then scatter light, which interferes with the unscattered light to form interference patterns perpendicular to the illumination direction. This image (the hologram) contains the depth information required for three-dimensional reconstruction, and can be captured on a standard imaging device such as a CMOS or CCD camera. The Rayleigh-Sommerfeld back propagation method is employed to numerically refocus microscope images, and a simple imaging heuristic based on the Gouy phase anomaly is used to identify scattering objects within the reconstructed volume. This simple but robust method results in an unambiguous, model-free measurement of the location and shape of objects in microscopic samples.

Digital Inline Holographic Microscopy DIHM of Weakly-scattering Subjects

The three-dimensional locations of weakly-scattering objects can be uniquely identified using digital inline holographic microscopy (DIHM), which involves a minor modification to a standard microscope. Our software uses a simple imaging heuristic coupled with Rayleigh-Sommerfeld back-propagation to yield the three-dimensional position and geometry of a microscopic phase object.

약하게 산란 주제의 디지털 인라인 홀로그램 현미경 (DIHM)

Weakly-scattering objects, such as small colloidal particles and most biological cells, are frequently encountered in microscopy. Indeed, a range of ...

생물학

Systematic Scoring Analysis for Intestinal Inflammation in a Murine Dextran Sodium Sulfate-Induced Colitis Model

Murine colitis models are tools that are extensively employed in studies focused on understanding the pathobiology of inflammatory intestinal disorders. However, robust standards for objective and reproducible quantification of disease severity remain to be defined. Most colitis analysis methods rely on limited histological scoring of small segments of intestine, leading to partial or biased analyses. Here, we combine high-resolution image acquisition and longitudinal analysis of the entire colon to quantify intestinal injury and ulceration in the dextran sodium sulfate (DSS) induced model of murine colitis. This protocol allows for the generation of objective and reproducible results without extensive user training. Here, we provide comprehensive details on sample preparation and image analysis using examples of data from DSS induced colitis. This method can be easily adapted to other models of murine colitis that have significant inflammation associated with mucosal injury. We demonstrate that the fraction of inflamed/injured and eroded/ulcerated mucosa relative to the complete length of the colon closely parallels clinical findings such as weight loss amid DSS-induced disease progression. This histological protocol provides a reliable time and cost-effective aid to standardize analyses of disease activity in an unbiased way in DSS colitis experiments.

Systematic scoring of intestinal inflammation using a free computer-assisted system is a powerful tool to quantitatively compare histopathological changes in colitis models characterized by the presence of ulcers and inflammatory changes. Histological colitis score evaluation strengthens clinical observations and facilitates data interpretation.

뮤린 Dextran 나트륨 황산염 유도 대장염 모형에 있는 장 염증을 위한 체계적인 채점 분석

Murine colitis models are tools that are extensively employed in studies focused on understanding the pathobiology of inflammatory intestinal disorders. ...

Evaluation and Quantification of Micro Epithelial Gaps in the Colonic Mucosa using Immunofluorescence Staining

Epithelial cells lining the intestinal mucosa create a physical barrier that separates the luminal content from the interstitium. Epithelial barrier impairment has been associated with the development of various pathologies such as inflammatory bowel diseases (IBD). In the inflamed mucosa, superficial erosions or micro-erosions that corrupt epithelial monolayers correspond to sites of high permeability. Several mechanisms have been implicated in the formation of micro-erosions including cell shedding and apoptosis. These micro-erosions often represent microscopic epithelial gaps randomly distributed in the colon. Visualization and quantification of those epithelial gaps has emerged as an important tool to investigate intestinal epithelial barrier function. Here, we describe a new method to visualize the specific location of where transcellular and paracellular permeability is enhanced in the inflamed colonic mucosa. In this assay, we apply a 10 kDa fluorescent dye conjugated to a lysine fixable dextran to visualize high permeability regions (HPR) in the colonic mucosa. Additional use of cell death markers revealed that HPR encompass apoptotic foci where epithelial extrusion/shedding occurs. The protocol described here provides a simple but effective approach to visualize and quantify micro-erosions in the intestine, which is a very useful tool in disease models, in which the intestinal epithelial barrier is compromised.

Here, we describe a new method to visualize the specific location of where transcellular and paracellular permeability is enhanced in the inflamed colonic mucosa. In this assay, we apply a 10 kDa fluorescent dye conjugated to a lysine fixable dextran to visualize high permeability regions (HPR) in the colonic mucosa.

Epithelial cells lining the intestinal mucosa create a physical barrier that separates the luminal content from the interstitium. Epithelial barrier ...

디지털 홀로그램 현미경과 복합 양적 위상 이미징 정확하게 장내 염증과 상피 상처 치유를 평가

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