This work was supported by Basic Science Research Program through the National Research Foundation of Korea (NRF) funded by the Ministry of Education (2015R1A6A3A01020610 to HJP) and a grant from the Korean Health Technology R&amp;D Project, Ministry for Health, Welfare and Family Affairs, Republic of Korea (HI15C0493 to SJH).

본 연구에서는 마우스는 연세대 학교 연세 실험 동물 연구 센터의 특정 병원균이없는 시설에서 유지 하였다. 모든 동물 실험은 연세대 학교 연세 실험 동물 연구 센터의 국제 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인 된 프로토콜을 사용하여 한국 식품 의약품 안전청 지침에 따라 실시 하였다. 솔루션 1. 준비 <ol><li> RPMI 1 % 2 % 페니실린 - 스트렙토 마이신에 소 태아 혈청 (FBS)을 희석하여 2 % RPMI 배지를 준비 </li><li> 전체 RPMI 미디어를 준비합니다. RPMI 미디어는 FBS의 10 %, 페니실린 - 스트렙토 마이신의 1 %, L- 글루타민의 1 %, 50 μM 2- 머 캅토 에탄올을 추가합니다. </li><li> 형광 활성화 된 셀 정렬 (FACS) 버퍼를 준비합니다. FBS의 2 %에 그래서, 보충 인산 완충 식염수 (PBS)를 수행합니다. </li><li> T 세포 분리 버퍼를 준비합니다. 이렇게하려면, FBS의 2 %, 2 MM의 ethylenediaminetetraa와 PBS를 보완cetic 산. </li></ol> 비장 림프구 2. 분리 <ol><li> 이전 19 설명 된 바와 같이 순진 또는 LCMV CL13에 감염된 마우스에서 비장을 제거하고 2 % RPMI 배지 10 ㎖를 포함하는 X 15mm 배양 접시 60mm에 배치합니다. 참고 :이 연구의 실험에서, 5 ~ 6 주령에 C57B1L / 6J 암컷 마우스 꼬리 정맥을 통해 정맥 주사를 통해 LCMV CL13의 2 × 10 6 플라크 형성 단위 (PFU)를 받았다. 16 일 후 감염 (16 D 파이) (25)에 쥐를 희생. 분석 GE의 일치 순진 마우스는 같은 날이었다. </li><li> 50 ㎖의 튜브에 세포 여과기를 넣고 2 % RPMI 배지 2 ㎖로 씻어. 70 μm의 셀 스트레이너에 비장를 놓고 주사기의 플런저를 사용하여 분쇄. 2 % RPMI 배지 2 ㎖로 셀 스트레이너를 씻어 50 ML 튜브에서 제거합니다. </li><li> 4 ℃에서 5 분 동안 300 XG에 2 % RPMI 매체와 원심 분리기로 튜브를 입력합니다. 뜨는을 취소하고를 재현 탁ACK 용균 완충액 1 ㎖의 세포 펠렛. 5 분 동안 실온 (RT)에서 샘플을 인큐베이션. 참고 : 위의 표시 ACK 용균 버퍼의 볼륨이 하나의 비장입니다. 풀링 비장 샘플 따라 볼륨을 확장 할 수 있습니다. </li><li> 4 ℃에서 10 분 동안 300 XG에 2 % RPMI 매체와 원심 분리기로 튜브를 입력합니다. 상층 액을 제거하고 완전한 RPMI 배지에서 1 × 107 세포 / ml의 농도로 세포를 재현 탁. 참고 : 트리 판 블루 만 혈구를 사용하여 염색되지 않은 세포를 살고 카운트 라이브 셀 카운팅, 얼룩 세포하십시오. </li></ol> 지라 기존의 T (T의 전환) 세포와 T의 등록 세포의 3 표현형 참고 : T의 등록 세포 분리하기 전에 다양한 항체와 세포를 염색 및 유동 세포 계측법에 의해을 분석하여 순진하거나 감염된 마우스에서 분리 된 비장 림프구의 표현형을 검사합니다. <ol><li> 세포의 50 μl를 전송새로운 U 바닥 96 웰 플레이트의 각 웰에 전체 비장 림프구 중 (5 × 105 세포) 및 웰 당 FACS 완충액 150 μL를 추가한다. 4 ℃에서 2 분 300 XG에 원심 분리기. </li><li> 상층 액을 버린다. 세포 펠렛을 선동하고 잘 당 FACS 버퍼의 200 μl를 추가합니다. 4 ° C (2 회)에서 2 분 동안 300 XG에 원심 분리기. </li><li> 다음 항체 및 시약 잘 당 FACS 버퍼의 50 μL에 염색 세포 표면 마커에 대한 항체 칵테일을 준비합니다. 안티 CD4 보라색 염료, 항 CD25 녹색 염료, 항 PD-1 바이올렛 염료 항 CD8를 PerCP-Cy5.5 염료 및 세포 생존 검출 시약 근적외선 (IR​​) 형광 반응성 염료. 주 : 상기 활성화 된 T 등록 세포의 표현형을 분석은 항 CD103 (23, 25)은 세포 표면 마커 염색을 첨가 할 수있다. </li><li> 웰 당 항체 칵테일 중 50 μL와 세포 펠렛을 재현 탁. 4 ℃에서 어둠 속에서 20 분 동안 품어. 로 두 번 세포를 씻으4 ° C에서 2 분 동안 300 XG에 원심 분리하여 FACS 버퍼입니다. </li><li> 마지막 세척 단계 후, 상층 액을 가만히 따르다 및 제조 업체의 프로토콜에 따라 제조 고정 버퍼 100 ㎕와 4 ° C에서 어둠 속에서 20 분 동안 세포를 고정합니다. </li><li> 4 ° C에서 2 분 동안 300 XG에 원심 분리하여 (제조사의 프로토콜에 따라 제조)을 permeabilization 세척 버퍼로 두 번 세포를 씻으십시오. </li><li> Foxp3의 세포 내 염색 용 항체 용액을 제조하고, 반대로 Foxp3의 항체 용액 50 μL와 세포 펠렛을 재현 탁. 주 : 상기 항 CTLA이 단계에서 첨가 될 수있다 T 전환율 및 T의 등록 세포의 표현형을 분석. </li><li> 4 ° C에서 어둠 속에서 20 분 동안 품어 및 단계 3.6를 반복합니다. 최종 세척 단계 후, FACS 완충액 200 μL에서 세포 펠렛을 재현 탁하고 유동 세포 계수기 (25)에 의해 세포의 표현형을 조사한다. </li><li> 게이트 살아있는 세포의 popula기. CD4 + 또는 CD8 + T 세포 중에서 PD-1 + 세포 - LCMV CL13 감염 동안 전환율 T 세포의 표현형 분석을 위해 Foxp3의 빈도를 조사한다. 주 : 실험 결과를 바탕으로, Foxp3의 비율 - PD-1 +는 LCMV CL13 16 D 파이에서 CD4 + 및 CD8 + T 세포 집단을 모두 50 % 이상이다. <ol><li> T의 등록 셀의 주파수 및 표현형을 분석, CD4 + T 세포 사이 Foxp3의 + 또는 + Foxp3의 PD-1 + 세포의 빈도를 조사한다. 주 : 실험 결과를 바탕으로, Foxp3의 + 또는 + Foxp3의 PD-1 + 세포의 비율은 각각, CD4 + T 세포 집단에서 20 % 이상이다. </li></ol></li></ol> CD4 + CD25 + T의 등록 세포의 4. 분리 참고 : 모든 시약의 볼륨은 아래에 표시된위한1 × 10 (7) 총 비장 세포의 세포 수를 시작. <ol><li> 순진하고 LCMV 만성적으로 감염된 마우스를 사용하여 2 절에 설명 된대로 세포를 준비합니다. T 세포 격리 완충액 10 ㎖를 첨가하여 세포를 세척 하였다. 4 ℃에서 10 분 동안 300 XG에 원심 분리기. 완전히 뜨는을 취소하고 버퍼의 40 μL의 세포 펠렛을 resuspend. </li><li> 자기 세포 분리 장치를 사용하여 CD4 + T 세포 농축을 위해, 바이오틴 항체 칵테일 중 10 μl를 넣고 잘 혼합한다. 4 ℃에서 10 분 동안 품어. </li><li> 버퍼의 30 μL, 비 CD4 + T 세포의 라벨링에 대한 안티 - 비오틴 마이크로 비드의 20 μL와 CD25 + 세포의 형광 라벨에 대한 CD25-PE 항체의 10 μl를 추가합니다. 잘 혼합하고 어둠 속에서 15 분 동안 품어. </li><li> 완충액 2 ㎖를 첨가하고 세포 찌꺼기를 제거하기 위해 새로운 50 ㎖ 튜브에 40 μm의 셀 스트레이너를 통해 셀을 통과한다. 4 ° C에서 10 분 동안 300 XG에서 원심 분리하여 세포를 씻으십시오.완전히 뜨는을 취소하고 최대 1.25 × 10 (8) 세포의 밀도로 500 μL 버퍼에 세포 펠렛을 resuspend. </li><li> 칼럼에 세포를 적용하고 열을 통과 레이블이없는 세포를 수집합니다. 4 ℃에서 10 분 동안 300 XG에 버퍼와 원심 분리기 2 ㎖를 추가하여 열을 씻으십시오. 완전히 뜨는을 취소하고 버퍼의 90 μL에 고립 된 CD4 + T 세포를 재현 탁. </li><li> CD25 + 세포의 자기 표시를 들어, 안티 - PE 마이크로 비즈의 10 μl를 추가 잘 혼합, 4 ° C에서 어둠 속에서 15 분 동안 품어. </li><li> 버퍼 2 ㎖를 추가하고 4 ℃에서 10 분 동안 300 XG에서 원심 분리하여 세포를 씻는다. 완전하게 상층 액을 제거하고 최대 1 × 108 세포의 밀도로 완충액 500 μL에서 세포 펠렛을 재현 탁. </li><li> CD4 + CD25 + T의 등록 세포를 풍부하게하기 위해, 긍정적 인 선택을위한 칼럼에 세포를 적용하고, 콜 럼을 씻어완충액 2 ㎖를 첨가하여 N. 세탁 세 번 반복합니다. </li><li> 열이 최종 세척 단계 후 비면 컬럼 상 완충액 1 mL를 넣어 자화 표지 CD4 + CD25 +, 플런저를 사용하여 세포 플러시. </li><li> 반복 고립 된 CD4 + CD25 + T의 등록 세포의 순도를 향상시키기 위해 4.8-4.9 단계를 반복합니다. 4 ° C에서 10 분 동안 300 XG에서 원심 분리하여 FACS 완충액으로 세포를 씻으십시오. 상층 액을 제거하고 완전한 RPMI 배지에서 2 × 106 세포 / ml의 농도로 격리 CD4 + CD25 + T에 등록 세포를 재현 탁. </li><li> 단리-CD4 + CD25 + T의 등록 세포의 순도를 확인하려면 총 격리-CD4 + CD25 + T의 등록 세포에서 2 × 10 5 세포를 사용합니다. FACS 완충액 50 μL 안티 CD4 FITC를 함유 세포 생존율이 거의 IR 형광 반응성 염료 시약을 검출하여 세포를 염색. 참고 : CD25는 이미 분리시 PE로 표지 하였다. </li><li> 4 ℃에서 어둠 속에서 20 분 동안 품어. 4 ° C에서 2 분 동안 300 XG에서 원심 분리하여 FACS 완충액으로 세포를 씻으십시오. 세정 후, FACS 완충액 100 ㎕의 세포 펠렛을 재현 탁하고 유동 세포 계측법에 의해 순도를 확인한다. </li><li> 게이트 라이브 세포 인구. T의 등록 세포의 순도를 분석, CD4 + CD25 + 세포의 비율을 확인. 주 : 실험 결과를 바탕으로, 정제 된 세포 중 CD4 + CD25 + 세포의 비율은 약 80 % 이상이다. </li></ol> CD8 + T 세포와 CD8 + T 세포의 라벨링 5. 분리 참고 : 모든 시약의 볼륨은 아래에 표시된 1 × 10 (7) 총 비장의 시작 세포 수에 대한 것입니다. <ol><li> 순진 마​​우스를 사용하여 2 절에 설명 된대로 세포를 준비합니다. T 세포 분리 버프 10 ㎖를 첨가하여 세포를 씻어어. 4 ℃에서 10 분 동안 300 XG에 원심 분리기. 완전히 뜨는을 폐기하고, 버퍼의 40 μL의 세포 펠렛을 resuspend. </li><li> 자기 세포 분리 시스템을 사용하는 CD8 + T 세포의 분리를 위해, 비 CD8 + T 세포 비오틴 표지 용 항체 칵테일 중 10 μl를 넣고 잘 혼합한다. 4 ℃에서 5 분 동안 품어. </li><li> 버퍼의 30 μL 및 안티 - 비오틴 마이크로 비즈의 20 μl를 추가합니다. 잘 믹스 4 °​​ C에서 10 분 동안 배양한다. </li><li> 칼럼에 세포를 적용하고 열을 통과 레이블이없는 세포를 수집합니다. 버퍼 세번 2ml를 첨가하여 열을 씻는다. </li><li> 4 ℃에서 10 분 동안 300 XG에 원심 분리기. 완전히 뜨는을 취소하고 버퍼 2 ㎖에 고립 된 CD8 + T 세포를 재현 탁. </li><li> 분리 된 세포의 순도를 확인하려면, FACS 버퍼에 항체 용액 50 μl를 준비합니다. 절연 CD8 + T의 CEL 중에서 2 × 105 세포를 재현 탁항체 용액 50 μL에 LS. 참고 : 안티 - CD8 FITC 추가, 항체 용액을 제조하고, 세포 생존 검출 시약 (근적외선 형광 반응 염료) FACS 버퍼로합니다. </li><li> 4 ℃에서 어둠 속에서 20 분 동안 품어. 4 ° C에서 2 분 동안 300 XG에서 원심 분리하여 FACS 완충액으로 세포를 씻으십시오. 세정 후, FACS 완충액 100 ㎕의 세포 펠렛을 재현 탁하고, 유세포 분류법으로 세포의 순도를 확인한다. </li><li> 게이트 라이브 세포 인구. CD8 + T 세포의 순도를 확인하기 위해, CD8 + T 세포의 비율을 확인. 주 : 실험 결과를 바탕으로, 정제 된 세포 중 CD8 + 세포의 비율은 약 90 % 이상이다. </li><li> 격리 된 CD8 + T 세포에 PBS를 추가합니다. 4 ℃에서 10 분 동안 300 XG에 원심 분리기. 상층 액을 버린다. PBS에 1 × 107 세포 / ml의 농도로 단리 CD8 + T 세포를 재현 탁. </li><li> CD8 + T 가전에 레이블을 지정하려면시험 관내 억제의 분석을위한 LLS은 RT에서 5 μM의 농도를 얻기 위해 PBS에 세포 증식 추적 바이올렛 염료 희석. 참고 : 본 연구에 사용 된 세포 증식 추적 바이올렛 염료의 대략 여기 및 발광 피크는 각각 405 및 450 나노 미터이다. </li><li> 15 ㎖의 튜브에 세포 증식 추적 보라색 염료 (5 μM) 세포 현탁액 (CD8 + T 세포를 1 × 107 세포 / ml)의 균등 한 양을 혼합하고 37 ° C에서 20 분간 인큐베이팅 하였다. 튜브마다 10 분을 소용돌이. </li><li> 감기 전체 RPMI 미디어와 튜브를 입력하고 실온에서 10 분 동안 튜브를 둡니다. 실온에서 10 분 동안 300 XG에 원심 분리기. 완전하게 상층 액을 제거하고 예열 된 완전한 RPMI 배지로 2 × 106 세포 / ml의 농도로 세포를 재현 탁. RT에서 15 분 동안 세포를 인큐베이션. </li></ol> 6. CD4 + CD25 + T를 &lt;사용하여 체외 억제 분석 설정서브&gt; 등록 번호 및 CD8 + T 세포 <ol><li> 항 CD3 / CD28 코팅 구슬을 준비하려면, 관의 15 ㎖ (2.5 μL / 1 × 10 5 세포)에 자석 구슬의 적절한 볼륨을 전송합니다. PBS의 동일한 볼륨을 추가하고 혼합한다. 4 ° C에서 2 분 동안 300 XG에서 원심 분리하여 세척하고 상층 액을 버린다. 전체 미디어의 자기 구슬을 (50 μL / 웰) 희석. </li><li> CD4 + CD25 + T의 등록 세포의 나누어지는 50 μL U-바닥 96 웰 플레이트의 웰 당 (1 × 10 5 세포 / 웰). 응답자 T (T의 RESP)와 같은 CD8 + T 세포 세포 물론 당 (1 × 10 5 세포 / 웰)의 50 μl를 추가합니다. 물론 당에 희석 항 CD3 / CD28 코팅 구슬의 50 μl를 추가합니다. 참고 : 다음과 같이 제어 우물을 설정할이 단계, 레이블 및 : 없음 항 CD3 / CD28 코팅 구슬 &quot;만 자극되지 CD8 + T 세포를&quot;; &quot;CD8 + T 세포 만&quot;항 CD3 / CD28 코팅 구슬; &quot;CD8 + T 세포 만&quot;항 CD3 / CD28 코팅 구슬;&quot;. T의 등록 세포 만 &quot;항 CD3이 / CD28 코팅 구슬 T의 등록 세포는 T의 서로 다른 비율로 전체 미디어와 공동 배양 T의 인공 호흡기 세포에 의해 희석 될 수있다 RESP 세포 : T 세포의 레지 (1 : 0.25-1 : 1). </li><li> 200 μL의 총 부피에 대한 모든 우물에 50 μL 또는 미디어의 적절한 볼륨을 추가합니다. 호일로 접시를 덮고 72 시간 동안 37 ° C에서 CO 2 배양기에서 배양한다. </li></ol> CD8 + T 세포 7. 분석 CD8의 + T 세포 증식 및 사이토 카인 생산 <ol><li> 사이토 카인 생산 분석을 위해, 문화 3 일 후, 물론 다른 플레이트에 각각의 상층 액을 분리하여 효소 면역 분석법 (ELISA)을 수행합니다. 주 : 상등액을 분취하고 -70 ℃에서 저장 될 수있다. 이 실험에서, 항 마우스 IFN-γ 항체 - 코팅 된 플레이트는 IFN-γ 생산 일치를 검출하는 데 사용제조 업체의 프로토콜에 보내고. 단일 세포 수준에서 CD8 + T 세포 증식의 IFN-γ 생산을 결정하기 위해, 세포 내 사이토 카인 염색법을 행할 수있다. </li><li> 각 우물에서 뜨는을 분리 한 후, 4 ° C (3 회)에서 2 분 동안 300 XG에 FACS 버퍼와 원심 분리기로 세포를 포함하는 접시를 씻으십시오. </li><li> 세척 후, 상층 액을 버린다. 증식 된 CD8 + T 세포의 염색 항체 칵테일 중 50 μL와 세포 펠렛을 재현 탁. 4 ℃에서 어둠 속에서 20 분 동안 품어. 참고 : FACS 버퍼에 방지 CD4 FITC, 안티 - CD8를 PerCP-Cy5.5 및 세포 생존 검출 시약 (근적외선 형광 반응 염료)를 추가, 항체 칵테일을 준비합니다. 참고 사항 : CD44 또는 CD69 각종 마커에 대한 항체는 CD8 + T 세포의 활성화를 확인하는 다른 항체와 결합 될 수있다. CD8 + T 세포가 이미 증식 추적 V로 표지 된 기억단계 5.10에서 iolet 염료. </li><li> 4 ° C에서 2 분 동안 300 XG에서 원심 분리하여 두 번 씻으십시오. 마지막 세척 단계 후, 상층 액을 제거하고, 고정 버퍼 100 ㎕와 4 ° C에서 어둠 속에서 20 분 동안 세포를 고정합니다. </li><li> 4 ° C에서 2 분 동안 300 XG에서 원심 분리하여 두 번 씻으십시오. FACS 완충액 200 μL로 세포를 재현 탁하고 유동 세포 계측법에 의한 세포 증식 추적 바이올렛 염료 표지 된 CD8 + T 세포의 증식을 측정한다. <ol><li> 게이트 생균 중 CD8 + T 세포 집단. 세포 증식 추적 바이올렛 염료 및하기 식에있어서 CD8 + T 세포 희석액의 희석에 따른 분할 전적인 세포의 비율을 측정한다. 억제 % = [(T의 등록 세포의 부재하에 증식 된 CD8 + T 세포의 % - T에 등록 세포의 존재 하에서 증식 된 CD8 + T 세포의 %) / (%에서 증식 된 CD8 + T 세포T 세포의 등록의 유무)] X (100)는 또한 소프트웨어 (25) 유동 세포 계측법을 사용하여 데이터를 분석한다. </li></ol></li></ol>

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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+alloantibodies+induce+a+postnatal+immune+response+that+limits+engraftment+following+in+utero+hematopoietic+cell+transplantation+in+mice.">Maternal alloantibodies induce a postnatal immune response that limits engraftment following in utero hematopoietic cell transplantation in mice.</a> J Clin Invest. 119 (9), 2590-2600 (2009).</li><li>Allakhverdi, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+CD103+identifies+human+regulatory+T-cell+subsets.">Expression of CD103 identifies human regulatory T-cell subsets.</a> J Allergy Clin Immunol. 118 (6), 1342-1349 (2006).</li><li>Camisaschi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LAG-3+expression+defines+a+subset+of+CD4(+)CD25(high)Foxp3(+)+regulatory+T+cells+that+are+expanded+at+tumor+sites.">LAG-3 expression defines a subset of CD4(+)CD25(high)Foxp3(+) regulatory T cells that are expanded at tumor sites.</a> J Immunol. 184 (11), 6545-6551 (2010).</li><li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+GARP+selectively+identifies+activated+human+FOXP3++regulatory+T+cells.">Expression of GARP selectively identifies activated human FOXP3+ regulatory T cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (32), 13439-13444 (2009).</li><li>Myers, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-2-independent+and+TNF-alpha-dependent+expansion+of+Vbeta5++natural+regulatory+T+cells+during+retrovirus+infection.">IL-2-independent and TNF-alpha-dependent expansion of Vbeta5+ natural regulatory T cells during retrovirus infection.</a> J Immunol. 190 (11), 5485-5495 (2013).</li></ol>

S.-J.H. has a patent and receives patent royalties related to the PD-1 pathway. The other authors have no financial conflicts of interest.

T 세포의 레지 단지 소수 쥐와 인간에서 존재하지만, 그들은 면역 반응을 조절하고 면역 관용을 유지하는데 중요한 역할을 그들의 기능을 이해하는 것이 중요하다. T의 수와 억제 기능은 만성 바이러스 감염 15-20뿐만 아니라 암의 진행 도중 13,14 세포 증가 REG. 이것은 아마도 계속 항원 자극에 기인한다. 레지 세포 항원 지속성 및 질병 개발 함수 T를 평가하기 위해, 자신의 억제 활성을 측정 할 필요가있다. 여기서는 T에 등록 세포의 생체 표현형 분석 및 CD8 + T 세포와 T에 등록 세포의 시험 관내 공동 배양 시스템을 사용하여 억제 활성을 측정하는 프로토콜을 기술한다. 현재 프로토콜의 중요한 단계는 분석 및 T의 등록 세포의 분리이다. 라이브 갓 절연 T <sub&gt; 등록 세포는 체외에서 명확한 억제 활동을 보여줍니다. 또한 만성 바이러스 감염 동안 T 전환율 및 T의 등록 세포의 표현형을 조사 하였다. 전환율 T 세포, 즉 Foxp3의 - CD4 + 및 CD8 + T 세포는 만성 바이러스 감염 (도 1) 후 세포 활성의 감소를 보였다. 는 PD-1 발현은 모두 T 전환율 세포 집단에서 상향 조절되었다. T의 등록 세포 수 증가까지 조절 PD-1 발현은 만성 바이러스 감염시의 면역 반응의 특징이다. 또한 이러한 TIM-3 및 CTLA-4와 같은 다른 수용체에 대한 저해 방지기구는 choric 바이러스 감염 후 FACS에 의한 T 세포의 표현형을 조사 PD-1과 결합하여 사용될 수있다. 억제 활성을 조사하기 위하여, T의 RESP 세포와 T에 등록 된 T 세포의 등록 1 1로 공 배양의 비율로 공 배양했다나이브 마우스의 T 세포의 등록에 비해 만성적으로 감염된 마우스의 세포는 상당히 CD8 + T 세포 증식 및 IFN-γ 분비를 감소시켰다. 이것은 등록 된 T 세포와 공동 배양 된 CD8 + T 세포의 증식 및 사이토 카인 생산은 역 T에 등록 세포의 억제 기능에 관계하고 있음을 의미한다. 이 프로토콜은 비 등록 된 T 세포와 T 세포의 레지 분리 오염위한 자기 세포 분리 시스템의 사용을 권장하고 있지만 배제 할 수 없다. CD25 종종 활성화 CD4 + T 전환뿐만 아니라 T에 등록 세포에서 과발현으로 Foxp3의-GFP 리포터 생쥐 28-30에서 얻어진 T에 등록 셀은 정확하게 자기 세포 분리 시스템보다 T의 레지 세포의 기능을 연구하기 위해 더 좋은 후보들이다. T의 등록 세포의 억제 기능은 다양한 생체 외 평가 된억제 분석 16,28,31-34. 시험 관내 억제 분석의 장점은 단지 T의 RESP 세포가 T에 등록 세포와 공동 배양하기 때문에 그것은 상기 CD8 + T 세포 반응의 억제에 대한 T에 등록 세포의 직접적인 영향을 평가하는 것이다. CD8 + T 세포뿐만 아니라, CD25 - CD4 + T 세포를 대신 T 세포의 RESP (25)에 사용될 수있다. 이러한 수지상 세포 또는 천연 킬러 세포와 같은 면역 세포에 T의 등록 또는 T 세포의 전환의 영향 실험 조건을 변화시킴으로써 평가 될 수있다. 반복 당 단백질 등 CD103 35 LAG-3 36 분자, CD43 38, CD11a에 38 37 우세 또는 킬러 세포 렉틴 형 수용체 아과 G 부재 (1) (38)는 특정 질환에서 활성화 된 T 등록 세포의 마커로 사용되었다. 이 프로토콜에서, 우리는 같은 PD-1을 사용하여지표는 만성 바이러스 감염시 T의 등록 세포를 활성화 식별합니다. 이 프로토콜은 특정 조건에서의 T 세포 등록 다각적 분석 (표현형 및 기능)에 사용될 수있다.

규제 T (T의 REG) 세포는 개발 및 기능 1 전사 인자로 forkhead 상자 P3 (Foxp3의)을 표현한다. 또한, T의 등록 세포는 CD25이 림프구 활성화 유전자 3 (LAG-3) (3), 글루코 코르티코이드 - 유도 된 종양 괴사 인자 수용체 (4) 및 세포 독성과 같은 다양한 분자를 발현 T 림프구 회합 단백질 4 (CTLA-4) (5) 그 표면 또는 세포 내 영역에. 바이러스 6,7, 8,9 박테리아, 기생충 10-12 또는 암 13,14 개발 과정에서 병원체 각종 만성 감염 동안 T에 등록 셀은 향상된 억제 기능을 표시 활성화 세포로 분화 될 대상 이펙터 CD4 +와 CD8 + T 세포. 많은 논문 확장 활성화 T에 등록 세포가 손상된 CD8 + T 세포 응 답에 기여한다고 제안했다친구 레트로 바이러스 (FV) 감염 15 ~ 17시 전자. FV 유발 T에 등록 셀은 IFN-γ 또는 그랜 자임 B 발현 및 CD8 + T 세포의 세포 독성 15-17 반응성을 억제한다. 또한, 단순 포진 바이러스 감염 모델에서, 이는 바이러스 - 특이적인 CD8 + T 세포 및 immunopathogenic CD4 + T 세포를 18-20의 침윤 심각한 조직 손상의 확대 결과 CD4 + CD25 + T에 등록 세포의 고갈을보고 하였다. 림프 구성 맥락 수막염 바이러스의 복제 13 균주 만성적으로 감염된 마우스 (LCMV CL13) 21-24 널리 만성 바이러스 감염 동안 효과기 T 세포 (T의 EFF) 및 T의 등록 세포의 표현형 및 기능을 특성화하는데 사용되어왔다. 영구 LCMV 감염시 바이러스 관련 T EFF의 세포는 점차적으로 자신의 이펙터 기능을 잃고 지쳐 T (T의 배기) 세포가된다. 한편, T에서레지 세포는 바이러스 특이 적 T 세포 반응 (25)을 억제하는 능력을 강화한다. T 개의 EFF 셀의 작동 능력의 감소는 이러한 T EFF 세포 억제 성 수용체의 상향 조절, 항원 제시 세포의 변경 기능, 면역 조절 사이토 카인의 생산 및 증가 된 주파수 또는 T의 등록 향상된 기능 등 여러 가지 요인들에 의해 설명 될 수있다 세포 26. T 세포 억제에 관여하는 요소 중에서, 프로그램 된 세포 사멸 단백질 -1 (PD-1) 발현 T의 배기 세포와 T에 등록 세포 널리 항원 지속성 및 억제 환경의 특징으로 간주되어왔다. 최근에는 T의 등록 셀의 PD-1 경로의 폐색 및 제거를 향상 T 세포의 기능을 야기한다는보고 LCMV 만성 감염시 바이러스로드 (27)가 감소 하였다. 또한, T의 등록 세포는 LCMV (23, 25)와 쥐의 만성 감염시 활성화 </s업&gt;과 억제 기능 (25)을 강화한다. PD-1은 높은 T에 등록 세포뿐 아니라 T의 배기 세포 발현되며, PD-1 T에 등록 세포에 의해 발현 수준은 T 세포의 증식 (25)을 억제하는 그들의 억제 기능의 강도와 상관 관계. 여기서는 LCMV CL13 및 나이브 마우스로부터 단리 휴지 T에 등록 세포 감염 쥐로부터 분리 활성화 T 등록 세포의 특성을 비교하는 방법을 설명한다. 더욱이, 우리는 활성화 된 T 세포의 레지 분리 및 표현형 생체 검사뿐만 아니라 시험 관내에서의 억제 활성을 측정하기위한 일련의 처리를 설명한다.

<table><tbody><tr><td>FITC Rat Anti-Mouse CD4</td><td>RM4-5</td><td>BD Biosciences</td><td>553047</td></tr><tr><td>Cytofix/Cytoperm</td><td></td><td>BD Biosciences</td><td>554714</td></tr><tr><td>U-Bottom Tissue Culture Plates</td><td></td><td>BD Biosciences</td><td>353077</td></tr><tr><td>Fixation buffer</td><td></td><td>BD Biosciences</td><td>554655</td></tr><tr><td>FITC Rat Anti-Mouse CD25</td><td>7D4</td><td>BD Biosciences</td><td>553072</td></tr><tr><td>Cell strainer, 70 mm</td><td></td><td>BD Biosciences</td><td>352350</td></tr><tr><td>Cell strainer, 40 mm</td><td></td><td>BD Biosciences</td><td>352340</td></tr><tr><td>Brilliant Violet 421 Anti-mouse CD279 (PD-1)</td><td>29F.1A12</td><td>BioLegend</td><td>135217</td></tr><tr><td>Brilliant Violet 605 Anti-Mouse CD4</td><td>RM4-5</td><td>Biolegend</td><td>100547</td></tr><tr><td>APC Anti-Mouse/Rat Foxp3&amp;nbsp;</td><td>FJK-16s</td><td>eBioscience</td><td>17-5773</td></tr><tr><td>Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set</td><td></td><td>eBioscience</td><td>00-5223</td></tr><tr><td>PerCP-Cyanine5.5 Anti-Mouse CD8a</td><td>53-6.7</td><td>eBiosicence</td><td>45-0081</td></tr><tr><td>Mouse IFN-gamma Platinum ELISA</td><td></td><td>eBiosicence</td><td>BMS606</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td></td><td>GE Life Sciences</td><td>SH30027</td></tr><tr><td>PBS (1x)</td><td></td><td>GE Life Sciences</td><td>SH30256</td></tr><tr><td>ACK Lysing Buffer</td><td></td><td>Gibco</td><td>A10492-01</td></tr><tr><td>L-Glutamine, 200 mM solution</td><td></td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>25030</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin, 10,000 U/ml</td><td></td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>10378-016</td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit</td><td></td><td>Life technologies</td><td>L-34975</td></tr><tr><td>CD8a&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; T Cell Isolation Kit, mouse</td><td></td><td>Miltenyibiotec</td><td>130-104-075</td></tr><tr><td>CD4&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; CD25&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; Regulatory T Cell Isolation Kit, mouse</td><td></td><td>Miltenyibiotec</td><td>130-091-041</td></tr><tr><td>MACS Separation Columns, LD columns</td><td></td><td>Miltenyibiotec</td><td>130-042-901</td></tr><tr><td>MACS Separation Columns, LS columns</td><td></td><td>Miltenyibiotec</td><td>130-042-401</td></tr><tr><td>EDTA, 0.5 M (pH 8.0)</td><td></td><td>Promega</td><td>V4231</td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td></td><td>Sigma Life Science</td><td>M7522</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td></td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SH30919.03</td></tr><tr><td>CellTrace Violet Cell Proliferation Kit</td><td></td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C34557</td></tr><tr><td>BD Canto II flowcytometer</td><td></td><td>BD Biosciences</td><td></td></tr><tr><td>Flowjo</td><td></td><td>TreeStar</td><td></td></tr><tr><td>Hematocytomer</td><td></td><td>Marienfeld superior</td><td></td></tr></tbody></table>

phenotypic and functional analysis of activated regulatory t cells isolated from chronic lymphocytic choriomeningitis virus-infected mice

전사 인자로서 Foxp3를 표현 규제 T (T의 REG) 세포, CD4 + T 세포의 서브 세트이다. T의 등록 세포는 면역 반응을 조절함으로써 면역 관용과 항상성 유지에 중요한 역할을한다. T의 등록 세포의 주요 역할은 효과기 T (T의 EFF) 세포의 증식 및 IFN-γ, TNF-α 및 IL-2와 같은 사이토 카인의 생성을 억제하는 것이다. EFF는 T 세포의 기능을 억제하는 T 세포의 레지 능력 영구 병원체 감염, 암 개발 중에 향상된 것이 증명되었다. 휴식 또는 염증 상태에서 T 세포에 등록하는 기능, 마우스 또는 인간 T 등록 세포를 이용한 시험 관내 억제 분석 다양한 고안되었다을 명확히한다. 본 연구의 주된 목적 표현형과 휴식 사이 억제 기능의 차이와 활성화 T의 등록과 비교하는 방법을 개발하는 것이다세포. 활성화 된 T 레지 세포를 분리하기 위해, 마우스, 림프 구성 맥락 수막염 바이러스 (LCMV) 클론 13 (CL13)을 LCMV 만성 피로를 감염시켰다. LCMV CL13 감염된 마우스의 비장으로부터 분리 된 T 세포는 등록 나이브 마우스로부터 단리 된 T 세포를 등록 쉬고 비하여 활성화 된 표현형 향상된 억제 활성을 모두 나타내었다. 여기서는 등록 된 T 세포 휴식에서 활성화 된 T 세포를 등록 구별 생체 표현형 분석을위한 기본 프로토콜을 설명한다. 더욱이, 우리는 완전히 활성화 T에 등록 세포의 억제 활성의 측정을위한 프로토콜을 기술한다.

우리는 정맥 LCMV CL13의 2 × 10 6 PFU로 주입함으로써 지속적인 바이러스 감염 쥐를 생성합니다. T의 등록 세포 및 만성 바이러스 감염시 T 전환 세포의 표현형 변화를 조사하기 위해, 순진 감염된 마우스에서 얻은 비장 림프구는 다양한 항체로 염색 및 유동 세포 계측법에 의해 분석 하였다. CD4 + T의 전환 (그림 1A, 상단 패널)와 Foxp3의 - - CD8 + T의 전환 (그림 1B, 상단 패널) 셀 (16) 라 파이에서, PD-1은 Foxp3를 모두 상향 조절했다. Foxp3의 + CD4 + T 세포의 레지의 주파수는 나이브 마우스 (도 1a)에서보다 LCMV CL13 감염된 마우스의 두 배 이상이었다. 특히, Foxp3의 + CD4 + T 세포의 레지 대부분은 높은 수준의 발현, 활성화 된 표현형을 표시PD-1이 시점 (그림 1A)에서. 시험 관내 억제 분석을 위해, CD8 + T 세포의 전환 및 CD4 + CD25 + T 세포의 레지 상당수가 필요 하였다. 1 × 10 7 세포 증식 추적 보라색 염료 표지 CD8 + T 세포를 얻기 위해, 순진한 마우스의 두 비장의 비장 세포가 풀링되었다. 2 × 6 또는 CD4 + CD25 + T에 등록 셀 × 106 (3)을 얻기 위해, 순과 LCMV CL13 감염된 마우스에서 적어도 세 비장 각각 모았다. T의 RESP 세포와 같은 CD8 + T 세포는 다른 면역 세포 (도 2A)와 상당한 오염없이 성공적으로 분리 하였다. T 세포의 등록은 또한 80 % 이상의 순도 (도 2B)과 CD25 + CD4 + T 세포의 지배적 인구 단리 될 수있다. 나이브 만성 T에 등록 세포의 억제 기능을 비교하기 위해 분리 된 T의 등록 및 T의 RESP 세포를 3 일 동안 37 ° C에서 항 CD3 / CD28 - 코팅 비드 자극 하에서 함께 배양 하였다. CD8 + T RESP 세포 증식 억제율 (%)은 T 세포의 레지 DESE 의존적 (도 3A)에서 증가 하였다. CD8 + T의 RESP 셀 1의 비율로 만성 T에 등록 세포와 공동 배양 한 경우, 1, CD8 + T의 RESP 세포의 증식이 크게 (도 3b)을 억제 하였다. CD8 + T의 RESP 세포가 만성적으로 감염된 마우스에서보다는 T의 등록에 나이브 마우스로부터 T에 등록 세포 쉬고 활성화 T 등록 세포와 공동 배양시 CD8 + T의 RESP 세포에 의해 IFN-γ의 생산도 현저하게 억제했다 </서브&gt; 셀 용량 의존적으로 (도 3C). <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54138/54138fig1.jpg" /> 그림 1 : 16 D 파이 (A) PD-1 또는 Foxp3의에서 CD25의 발현에 순진 마우스 또는 LCMV CL13에 감염된 생쥐의 비장에 CD4 +와 CD8 + T 세포의 표현형 - CD4 + T의 전환과 Foxp3의 + CD4 + T의 등록 세포. Foxp3의에서 PD-1 또는 CD25의 (B) 표현 - CD8 + T의 전환 세포. 비장 림프구는 CD4, CD8, CD25, PD-1과 Foxp3의에 대한 항체로 염색 하였다. 데이터는 세개의 독립된 실험의 대표 값이다. 패널 A는 기준으로 25에서 수정되었습니다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54138/54138fig1large.jpg" target="_blank">를 클릭하십시오</a><html> 여기이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54138/54138fig2.jpg" /> 도 2 : 나이브 또는 LCMV CL13 감염 쥐로부터 분리 나이브 마우스 및 T의 등록 세포로부터 단리 된 T 세포의 RESP 순도 분리 후에 CD8 + T 세포 (A) 백분율.. 분리 후, CD25을 발현하는 CD4 + T 세포의 레지의 (B) 백분율. (B)의 각 사분면은 CD4 및 CD25의 발현 수준을 결정 하였다. 데이터는 3 개의 독립적 인 실험의 대표입니다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54138/54138fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 레 / ftp_upload / 54138 / 54138fig3.jpg &quot;/&gt; 도 3 : CD8 + T 세포 반응에 대한 활성화 된 T 등록 셀의 영향은 T에 등록 세포 용량 - 의존적으로 T에 등록 세포와 공동 배양 된 CD8 + T 세포 (A) % 억제.. 1 T에 등록 세포와 공동 배양 된 CD8 + T 세포 (B) 확산도 : 1 비율. T 자 등록의 셀 용량 의존적으로 T에 등록 세포와 공동 배양 된 CD8 + T 세포 (C) IFN-γ 생성. CD8 + T 세포의 증식은 증식 된 CD8 + T 세포 및 IFN-γ 분비 세포 증식 추적 바이올렛 염료 희석 측정은 ELISA에 의해 평가 하였다. 세포 증식 추적 바이올렛 염료 표지 된 CD8 + T 세포는 T의 부재 또는 존재하에 3 일간 항 CD3 / CD28 - 코팅 비드로 자극했다 <s순진 또는 만성 감염 마우스 중 하나에서 고립 UB&gt; 등록 번호 세포. 히스토그램에서, 괄호가없는 숫자로 각각와 T 세포의 레지없이 공 배양 CD8 + T 세포의 증식 비율을 나타낸다. 히스토그램 채워진 회색 피크 T의 등록없이 세포 공 배양 CD8 + T 세포의 증식을 나타낸다. 각 그룹은 삼중으로 설계되었다. 막대는 + SEM을 의미 나타냅니다. 이 수치는 기준으로 25에서 수정되었습니다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54138/54138fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Phenotypic and Functional Analysis of Activated Regulatory T Cells Isolated from Chronic Lymphocytic Choriomeningitis Virus-infected Mice

Here, we describe a protocol to analyze the phenotype of regulatory T (Treg) cells isolated from na&#239;ve and chronic lymphocytic choriomeningitis virus-infected mice. In addition, we provide a process to evaluate the suppressive activity of the Treg cells.

표현형 및 만성 림프 구성 맥락 수막염 바이러스에 감염된 마우스에서 고립 활성화 규제 T 세포의 기능 분석

Regulatory T (Treg) cells, which express Foxp3 as a transcription factor, are subsets of CD4+ T cells. Treg cells play crucial roles in immune tolerance ...

phenotypic-functional-analysis-activated-regulatory-t-cells-isolated

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.7K 조회수.  Yonsei University. Here, we describe a protocol to analyze the phenotype of regulatory T (Treg) cells isolated from naïve and chronic lymphocytic choriomeningitis virus-infected mice. In addition, we provide a process to evaluate the suppressive activity of the Treg cells.

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Adenoviral Transduction of Naive CD4 T Cells to Study Treg Differentiation

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 T cells in vitro with TCR- and co-stimulation in the presence of TGF&beta; and IL-2. This bears enormous potential for future therapies, however, the molecules and signaling pathways that control differentiation are largely unknown.
Primary T cells can be manipulated through ectopic gene expression, but common methods fail to target the most important naive state of the T cell prior to primary antigen recognition. Here, we provide a protocol to express ectopic genes in naive CD4 T cells in vitro before inducing Treg differentiation. It applies transduction with the replication-deficient adenovirus and explains its generation and production. The adenovirus can take up large inserts (up to 7 kb) and can be equipped with promoters to achieve high and transient overexpression in T cells. It effectively transduces naive mouse T cells if they express a transgenic Coxsackie adenovirus receptor (CAR). Importantly, after infection the T cells remain naive (CD44low, CD62Lhigh) and resting (CD25-, CD69-) and can be activated and differentiated into Tregs similar to non-infected cells. Thus, this method enables manipulation of CD4 T cell differentiation from its very beginning. It ensures that ectopic gene expression is already in place when early signaling events of the initial TCR stimulation induces cellular changes that eventually lead into Treg differentiation.

Adenoviral gene transfer into naive CD4 T cells with transgenic expression of the Coxsackie adenovirus receptor enables the molecular analysis of regulatory T cell differentiation in vitro.

나이브 CD4의 아데노 바이러스 형질은 Treg의 분화를 연구하는 세포를 T

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 ...

연구

면역학 및 감염병학

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are upregulated upon this ongoing antigen exposure and contribute to loss of proliferation, reduced cytolytic function, and impaired cytokine production by CD4 and CD8 T cells. In the murine model of LCMV infection, administration of blocking antibodies against these two pathways augmented T cell responses. However, there is currently no in vitro assay to measure the impact of such blockade on cytokine secretion in cells from human samples. Our protocol and experimental approach enable us to accurately and efficiently quantify the restoration of cytokine production by HIV-specific CD4 T cells from HIV infected subjects.
Here, we depict an in vitro experimental design that enables measurements of cytokine secretion by HIV-specific CD4 T cells and their impact on other cell subsets. CD8 T cells were depleted from whole blood and remaining PBMCs were isolated via Ficoll separation method. CD8-depleted PBMCs were then incubated with blocking antibodies against PD-L1 and/or IL-10R&#945; and, after stimulation with an HIV-1 Gag peptide pool, cells were incubated at 37 &#176;C, 5% CO2. After 48 hr, supernatant was collected for cytokine analysis by beads arrays and cell pellets were collected for either phenotypic analysis using flow cytometry or transcriptional analysis using qRT-PCR. For more detailed analysis, different cell populations were obtained by selective subset depletion from PBMCs or by sorting using flow cytometry before being assessed in the same assays. These methods provide a highly sensitive and specific approach to determine the modulation of cytokine production by antigen-specific T-helper cells and to determine functional interactions between different populations of immune cells.

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

We developed an in vitro assay to investigate the role of immunoregulatory pathways in the regulation of cytokine secretion by HIV-specific CD4 T cells.

시험 관내 분석에서 HIV 특정 CD4 T 세포의 이펙터 기능에 면역 경로의 영향을 평가하기

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in mice. Recently, myeloid differentiation factor 88 (MyD88) signaling was shown to be important for initial T cell priming and memory T cell development during WNV NS4B-P38G mutant infection. In this study, two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and an intracellular cytokine staining (ICS) &#8211; were utilized to assess dendritic cells (DCs) and T cell functions. In the T cell priming assay, cell proliferation was analyzed by flow cytometry following co-culture of DCs from both groups of mice with carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) - labeled CD4+ T cells of OTII transgenic mice. This approach provided an accurate determination of the percentage of proliferating CD4+ T cells with significantly improved overall sensitivity than the traditional assays with radioactive reagents. A microcentrifuge tube system was used in both cell culture and cytokine staining procedures of the ICS protocol. Compared to the traditional tissue culture plate-based system, this modified procedure was easier to perform at biosafety level (BL) 3 facilities. Moreover, WNV- infected cells were treated with paraformaldehyde in both assays, which enabled further analysis outside BL3 facilities. Overall, these in vitro immunological assays can be used to efficiently assess cell-mediated immune responses during WNV infection.

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

Two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and intracellular cytokine staining were utilized to measure antigen presenting capacity of dendritic cells and antigen-specific T cell responses to a West Nile virus mutant infection in mice.

웨스트 나일 바이러스 돌연변이 균주의 감염에에서 MyD88 매개 세포 면역 반응의 생체 외 분석

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents autoimmunity. Many approaches involving different model organisms have been utilized to understand the mechanisms controlling helper T cell development and function. However, studies using mouse models have proven to be highly informative due to the availability of genetic, cellular, and biochemical systems. One genetic approach in mice used by many labs involves retroviral transduction of primary helper T cells. This is a powerful approach due to its relative ease, making it accessible to almost any laboratory with basic skills in molecular biology and immunology. Therefore, multiple genes in wild type or mutant forms can readily be tested for function in helper T cells to understand their importance and mechanisms of action. We have optimized this approach and describe here the protocols for production of high titer retroviruses, isolation of primary murine helper T cells, and their transduction by retroviruses and differentiation toward the different helper subsets. Finally, the use of this approach is described in uncovering mechanisms utilized by microRNAs (miRNAs) to regulate pathways controlling helper T cell development and function.

Many experimental systems have been utilized to understand the mechanisms regulating T cell development and function in an immune response. Here a genetic approach using retroviral transduction is described, which is economic, time efficient, and most importantly, highly informative in identifying regulatory pathways.

공부하는 유전 적 접근으로 헬퍼 T 세포의 레트로 바이러스 형질 도입은 메커니즘 자신의 차별화 및 기능 제어

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents ...

Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' pathogens (Listeria monocytogenes, Shigella flexneri, Burkholderia pseudomallei, Francisella tularensis, and Rickettsia spp.) gain access to the infected cell cytosol by physically and enzymatically degrading the primary vacuolar membrane. Once in the cytosol, these pathogens both proliferate as well as generate sufficient mechanical forces to penetrate the plasma membrane of the host cell in order to infect new cells. Here, we show how this terminal step of the cellular infection cycle of L. monocytogenes (Lm) can be quantified by both colony-forming unit assays and flow cytometry and give examples of how both pathogen- and host-encoded factors impact this process. We also show a close correspondence of Lm infection dynamics of cultured cells infected in vitro and those of hepatic cells derived from mice infected in vivo. These function-based assays are relatively simple and can be readily scaled up for discovery-based high-throughput screens for modulators of eukaryotic cell function.

We describe both in vitro and in vivo infection assays that can be used to analyze the activities of host-encoding factors.

셀룰러 및 Organismic 수준 호스트 응답 세균성 병원 체 프로브를 사용 하 여

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' ...

Chronic, Acute, and Reactivated HIV Infection in Humanized Immunodeficient Mouse Models

Humanized NOD/SCID/IL-2 receptor &#947;-chainnull mice recapitulate some features of human immunity, which can be exploited in basic and pre-clinical research on infectious diseases. Described here are three models of humanized immunodeficient mice for studying the dynamics of HIV infection. The first is based on the intrahepatic injection of CD34+ hematopoietic stem cells in newborn mice, which allows for the reconstitution of several blood and lymphoid tissue-confined cells, followed by infection with a reference HIV strain. This model allows monitoring for up to 36 weeks post-infection and is hence called the chronic model. The second and third models are referred to as the acute and reactivation models, in which peripheral blood mononuclear cells are intraperitoneally injected in adult mice. In the acute model, cells from a healthy donor are engrafted through the intraperitoneal route, followed by infection with a reference HIV strain. Finally, in the reactivation model, cells from an HIV-infected donor under antiretroviral therapy are engrafted via the intraperitoneal route. In this case, a drug-free environment in the mouse allows for virus reactivation and an increase in viral load. The protocols provided here describe the conventional experimental approach for humanized, immunodeficient mouse models of HIV infection.

Described here are three experimental approaches for studying the dynamics of HIV infection in humanized mice. The first permits the study of chronic infection events, whereas the two latter allows for the study of acute events after primary infection or viral reactivation.

인간화 면역 결핍 마우스 모델에서 만성, 급성 및 재활성화 HIV 감염

Humanized NOD/SCID/IL-2 receptor &#947;-chainnull mice recapitulate some features of human immunity, which can be exploited in basic and pre-clinical ...

Evaluation of T Follicular Helper Cells and Germinal Center Response During Influenza A Virus Infection in Mice

T Follicular Helper (Tfh) cells are an independent CD4+&#160;T cell subset specialized in providing help for germinal center (GC) development and generation of high-affinity antibodies. In influenza virus infection, robust Tfh and GC B cell responses are induced to facilitate effective virus eradication, which confers a qualified mouse model for Tfh-associated study. In this paper, we described protocols in detection of basic Tfh-associated immune response during influenza virus infection in mice. These protocols include: intranasal inoculation of influenza virus; flow cytometry staining and analysis of polyclonal and antigen-specific Tfh cells, GC B cells and plasma cells; immunofluorescence detection of GCs; enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) of influenza virus-specific antibody in serum. These assays basically quantify the differentiation and function of Tfh cells in influenza virus infection, thus providing help for studies in elucidating differentiation mechanism and manipulation strategy.

This paper describes protocols of evaluating Tfh and GC B response in mouse model of influenza virus infection.

인플루엔자 A 바이러스 감염 중 T 여포 도우미 세포 및 발아 센터 반응 평가

T Follicular Helper (Tfh) cells are an independent CD4+&#160;T cell subset specialized in providing help for germinal center (GC) development and ...

Isolating Central Nervous System Tissues and Associated Meninges for the Downstream Analysis of Immune cells

The central nervous system (CNS) is comprised of the brain and spinal cord and is enveloped by the meninges, membranous layers serving as a barrier between the periphery and the CNS. The CNS is an immunologically specialized site, and in steady state conditions, immune privilege is most evident in the CNS parenchyma. In contrast, the meninges harbor a diverse array of resident cells, including innate and adaptive immune cells. During inflammatory conditions triggered by CNS injury, autoimmunity, infection, or even neurodegeneration, peripherally derived immune cells may enter the parenchyma and take up residence within the meninges. These cells are thought to perform both beneficial and detrimental actions during CNS disease pathogenesis. Despite this knowledge, the meninges are often overlooked when analyzing the CNS compartment, because conventional CNS tissue extraction methods omit the meningeal layers. This protocol presents two distinct methods for the rapid isolation of murine CNS tissues (i.e., brain, spinal cord, and meninges) that are suitable for downstream analysis via single-cell techniques, immunohistochemistry, and in situ hybridization methods. The described methods provide a comprehensive analysis of CNS tissues, ideal for assessing the phenotype, function, and localization of cells occupying the CNS compartment under homeostatic conditions and during disease pathogenesis.

This paper presents two optimized protocols for examining resident and peripherally derived immune cells within the central nervous system, including the brain, spinal cord, and meninges. Each of these protocols helps to ascertain the function and composition of the cells occupying these compartments under steady state and inflammatory conditions.

면역 세포의 다운스트림 분석을 위한 중추신경계 조직 및 관련 수막 분리

The central nervous system (CNS) is comprised of the brain and spinal cord and is enveloped by the meninges, membranous layers serving as a barrier ...

급성 LCMV 감염에서 Early Follicular Helper T-Cell Commitment의 해독

Accessing Early Differentiation of Virus-Specific Follicular Helper CD4+ T Cell in Acute LCMV-Infected Mice

Follicular Helper T (TFH) cells are perceived as an independent CD4+ T cell lineage that assists cognate B cells in producing high-affinity antibodies, thus establishing long-term humoral immunity. During acute viral infection, the fate commitment of virus-specific TFH cells is determined in the early infection phase, and investigations of the early-differentiated TFH cells are crucial in understanding T cell-dependent humoral immunity and optimizing vaccine design. In the study, using a mouse model of acute lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) infection and the TCR-transgenic SMARTA (SM) mouse with CD4+ T cells specifically recognizing LCMV glycoprotein epitope I-AbGP66-77, we described procedures to access the early fate commitment of virus-specific TFH cells based on flow cytometry stainings. Furthermore, by exploiting retroviral transduction of SM CD4+ T cells, methods to manipulate gene expression in early-differentiated virus-specific TFH cells are also provided. Hence, these methods will help in studies exploring the mechanism(s) underlying the early commitment of virus-specific TFH cells.

저자 스포트라이트: 급성 LCMV 문제에서 TFH 세포 분화의 경로 규명

The current study showcases protocols for assessing the early fate commitment of virus-specific TFH cells and manipulating gene expression in these cells.

급성 LCMV에 감염된 마우스에서 바이러스 특이적 여포 도우미 CD4+ T 세포의 조기 분화에 접근

Follicular Helper T (TFH) cells are perceived as an independent CD4+ T cell lineage that assists cognate B cells in producing high-affinity antibodies, ...