Name: a guide to structured illumination tirf microscopy at high speed with multiple colors
Uploaded: 2016-05-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 15 s
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이 작품은 레버 흄 신뢰, 공학 및 물리 과학 연구위원회에서 교부금에 의해 지원되었다 [EP / H018301 / 1, EP / G037221 / 1] 알츠하이머 리서치 UK [ARUK EG2012A-1]; 웰컴 트러스트 (Wellcome Trust) [089703 / Z / 09 / Z] 의료 연구위원회 [MR / K015850 / 1, MR / K02292X / 1]. 우리는 HEK293 문화의 준비를 위해 각각 LifeAct-GFP의 형질 전환 및 세포질-GFP 세포에 대한 E. Avezov와 M. 루, 감사 및 W. 첸. 우리는 또한 유용한 토론과 제안 현미경의 디자인 지원 K. O&#39;Holleran 감사 및 L. 샤오와 R. Heintzmann.

1. 정리하고 여기 경로를 정렬 <ol><li> 광학 테이블의 구성 요소의 위치를 표시 (광 설치의 개요 그림 1 참조). 대물 별개 렌즈 L3, L4, L5, 상기 SLM은 SLM면은 대물의 초점 평면에 중계한다되도록 각각의 초점 거리의 합으로 각각. </li><li> 현미경 프레임의 필터 큐브 터렛에 멀티 가장자리 다이크로 익 미러 DM4를 삽입합니다. </li><li> 마운트 1 &quot;광장 운동 거울에 두 번째 다이크로 익 미러 DM3를 삽입하고 하나의 초점 거리 거리에 집광 렌즈 L5에서 그것을 놓습니다. 참고 :이 여기 경로 디자인은 두 개의 동일한 이색이 같은 생산 배치에서 가져 DM3 및 DM4 동일한 광학 특성을 확인하기 위해 거울이 통합되어 있습니다. s- 편광 및 P- 축을 현미경 (DM3)에있는 이색 비교 절환되는 다이크로 익 미러 (DM4는)하여 임의 취소 이러한 위치편파 타원의 복굴절에 의해 도입 (도 1). 이 보상은 각 조명 파장에 대해 동일하게 작동합니다. 이 단계에서는 높은 변조 콘트라스트를 유지하는데 필수적이다. </li><li> 여기 경로에있는 렌즈를 삽입하기 전에, 정확한 시스템의 광학 축선을 정의한다. <ol><li> 포탑에서 대물 렌즈 (OB)를 제거하고 정렬 도구에서 나사 대신. 이것은 양쪽 끝이 정렬 디스크와 500 mm 길이 광학 케이지 시스템으로 구성되어 있습니다. </li><li> 두 정렬 디스크의 구멍의 중심을 레이저 (1)로부터 시준 된 참조광을 조정하는 이색 미러 DM3 및 SLM의 대략적인 위치에 위치 이후 일시적 배향 미러를 사용한다. 세 개의 이색 미러 및 미러 DM2를 사용하여도 1에 도시 된 바와 같이 임시 미러 (1)로부터 레이저 빔을 지향. 는 SLM 위치에 임시 미러는 광축에 대해 수직에 가까워 야한다. <li> 그것이 현미경 본체 들어가기 전에 조대 광축 determined.Insert를 빔 경로에 홍채되면 정렬 공구를 제거하고 상기 빔에 중앙. iris.Reinsert 대물 렌즈 (OB)의 중앙에 작은 구멍 흰색 카드의 조각을 연결합니다. 대물 떠나는 빔이 현재 높은 발산되지만 백색 카드에 표시되며, 렌즈의 후면 표면으로부터 반사 미약있을 것이다 참고. 모든 렌즈들은 코팅 반사 방지하더라도, 동축 정렬을 보장하기 위해 사용될 수있다 약한 다시 반사 할 것이다. 빔이 정확히 렌즈에 수직 인 경우,이면 반사 홍채의 중심을 위로 갈 </li><li> 합니다 (SLM 위치에 DM3 및 정렬 미러) 반복 각도 두 개의 거울을 조정할 수에 후면 반사를 중앙에수신 빔 카드. 임시로, 대물 렌즈 (OB)을 제거하고 기준 위치를 만들 천장에 레이저 스폿을 표시한다. </li><li> 테이블의 나사 구멍을 따라 기준 빔의 높이에서 홍채의 쌍을 삽입한다. 빔 광학 테이블의 표면과 평행해야한다. 광축 지금 정의된다. </li></ol></li><li> 집광 렌즈 (L5) 떨어진 목표에서 약 1 초점 거리를 삽입합니다. 기준 빔의 방향을 따라 번역 선형 변환 스테이지 세트에이 렌즈를 마운트합니다. </li><li> 대물 떠나는 빔 시준 및 천장에 기준 지점을 히트하도록 집광 렌즈의 위치 및 각도를 조정한다. 렌즈 다시 조리개와 흰색 카드로 다시 반사를 확인하여 빔에 수직 있는지 확인합니다. 대물 렌즈 (OB)를 제거하고 이미지 릴레이 망원경 (L4)의 제 2 렌즈를 삽입합니다. 참고 : 수의 적절한 시준 비 편향 보장빔 경로 내의 렌즈들의 수가 짝수 인 경우 오전 쉽게 이루어진다. </li><li> 시준을 유지하고, 기준 빔은 여전히​​ 천장에 표시된 지점을 안타 있도록 선형 변환 스테이지를 사용하여이 렌즈의 위치 및 각도를 조정한다. </li><li> 대물 렌즈 (OB)를 교체하고 망원경 (L3)의 제 1 렌즈를 삽입합니다. 이전 단계에서 설명 된 바와 같이, 시준 비 변형을 보장하기 위해 렌즈의 위치 및 각도를 조정한다. </li><li> 칩 표면의 중심에 대한 번역하지 않고 회전을 제공하는 마운트 짐벌의 SLM 칩을 탑재합니다. 참고 : 특정 설치 디자인을 사용하는 SLM에 따라 달라집니다. 는 SLM이 장착하지 않고 공급되는 경우, 그 렌즈 짐벌 마운트에 부착 된 정의 가공 알루미늄 플레이트에 고정한다. </li><li> 렌즈 정렬과 함께, 거울 대신에 SLM을 삽입합니다. 기준 빔은 SLM 칩의 중앙에 위치되도록 상기 SLM의 위치를​​ 조정하고, 조정을광이 두 개의 중계 렌즈들 (L3 및 L4)를 통과하도록 GLE. 기준 빔이 여전히 표시된 지점을 중심으로되어 있는지 확인합니다. </li><li> 확장 및 케플러 빔 확장기를 이용하여 상기 기준 빔을 시준. <ol><li> 조정의 용이성을위한 케이지 시스템의 두 개의 렌즈 (L1 및 L2)를 탑재. </li><li> 센터 렌즈를 제거하고 홍채로 대체하여 참조광의 케이지 시스템. </li><li> 두 개의 렌즈를 삽입하고 전단 간섭계를 사용하여 확장 된 빔을 시준하는 L2의 축 위치를 조정합니다. L2는 하나의 초점 거리를 멀리 SLM의 표면에서해야한다. </li><li> 확장 된 빔은 여전히​​ 두 릴레이 렌즈 L3 및 L4 후 평행되어 있는지 확인합니다. 시준를 확인하기 위해 단지 DM3 후 전단 간섭계를 사용합니다. </li></ol></li><li> 여기 경로는 단일 파장, 커플 빔 경로에 다른 두 레이저에 대해 정렬되면. 여기 사용 경로를 중심으로 두 개의 홍채 통해 각 빔 스티어빔 조합 한 다이크로 익 미러 (DM1 및 DM2). </li></ol> 편광 회 전자의 2 정렬 <ol><li> 입사 편광 45 °에서의 빠른 축으로 LCVR를 탑재합니다. </li><li> 반파 장판 및 교차 편광기 사이 LCVR 삽입함으로써 무채색 반파 장판 (HWP)를 사용하여 LCVR에 입사 한 빔의 미세 조정 편각. 전송 된 전력을 최소화하기 위해 HWP을 돌립니다. 주 : 가변 편광 회 전자의 역할을하기 위해, 액정 지연 기 (LCVR)의 진상 축 정확하게 입사 수직 빔의 편광을 45 °로 정렬되어야한다. LCVR 물리적으로 45 °로 장착되어 있지만, 이것은 거친 정렬된다. 반파 장판은 LCVR 진상 축에 대한 상기 입사 편광 완벽 45 정렬을 보장하기 위해 사용된다. 1/4 파장 판 (QWP)이인가 전압에 의해 제어 각도에서 다시 직선 편광으로 LCVR 의해 유도 된 경사 타원 편광 변환24. </li><li> LCVR 후 1/4 파장 판을 삽입하고 교차 편광판 사이의 전송 전력을 최소화하여 들어오는 편광에 느린 축 정렬을 돌립니다. </li></ol> 배출 경로 (3) 정렬 <ol><li> 조악 스테이지 마이크로 미터 슬라이드 및 투과광을 이용하여 카메라를 배치합니다. <ol><li> 현미경의 접안을 사용하여 레티클에 초점이 위치에서 대물 렌즈를 고정합니다. </li><li> 대략 카메라 중앙 스크린에 이미지를 관찰하여 초점에 레티클의 이미지를 가져올 수있는 카메라 위치를 이동한다. 주 : 외부 필터 휠 그때 사용되는 경우 레이저가 켜져 때 필터 큐브 따라서 접안이 사용되어서는 안, 방출 필터를 포함하지 않을 것이다. </li></ol></li><li> 미세 형광 비드의 샘플을 이용하여 카메라의 위치를​​ 조정한다. <ol><li> A # 1.5 커브 글라스에 100 nm의 여러 가지 빛깔의 구슬 한 방울의 확산에 의해 형광 구슬의 단층을 준비합니다. D에 남겨주세요공예는​​ 커브 글라스에 구슬을 흡수하고 물에 다시 젖어있다. </li><li> 침수 오일 목적에 비드 샘플을 놓습니다. 미세 형광 비드 층에 초점이되도록 카메라의 위치를​​ 조정한다. 초점이 발견 된 후 대물 렌즈의 위치를​​ 조정하지 마십시오. 주 : SLM이 시료면에 공역 인면에 있어야 같이, SLM의 위치는 렌즈 릴레이 대물 고정되어야한다. 초점을 조정, 샘플 축 대신 피에조 Z 스테이지를 사용하는 목적을 움직인다. </li></ol></li><li> 비트 맵 파일과 같은 적절한 SIM 바이너리 격자 패턴을 생성한다. <ol><li> (3) 동일하게 이격 된 위상 시프트와 함께 3 각 패턴 방위 : 2D / TIRF-SIM 들어 9 바이너리 격자 이미지의 시리즈를 생성한다. 이어서 이진 화상을 생성하기 위해 임계 화인가 오프셋 위상 회전 된 2 차원 정현파에서 (예를 들어 MATLAB 사용) 이러한 수치를 생성한다. 예제 코드에 대한 보충 코드 파일을 참조하십시오. </li><li> alignmen에 대한t 목적은 또한 윈도우 정렬 격자가 외부에서 발생 될 필요는 없다.도 2에 도시 된 바와 같이, 3 방향 각각에 대해 작은 원형 구멍으로 윈도 윙 된 격자 패턴을 생성하지만, 수동 통해 사용자에 의해 전환 될 수있다 SLM의 소프트웨어. 참고 : 최적의 회전 각도의 토론과 격자 패턴 생성 코드 16, 20의 예 참조를 참조하십시오. </li></ol></li><li> (예를 들어 MetroCon 용) 제조업체의 소프트웨어를 사용하여 SLM에 비트 맵 이미지를 업로드합니다. <ol><li> 은 SLM 제어 소프트웨어를로드하고 &quot;연결&quot;을 클릭합니다. </li><li> 은 &quot;레퍼토리&quot;탭에서 레퍼토리 파일을 열고 파일에 포함 된 주문 실행의 수를 확인하는 &quot;로드&quot;를 클릭합니다. 주어진 예 레퍼토리 파일에서 오 러닝 주문이 있습니다. </li><li> 클릭 SLM의 레퍼토리 파일을 업로드 &quot;이사회에 보내기&quot;. </li><li> 비트 맵 이미지가 업로드 될 때까지 기다립니다차 장치가 자동으로 재부팅하기 위해. 참고 : 격자 비트 맵 이미지와 순서를 정의하는 파일이 포함 된 예 레퍼토리 파일은, 보충 코드 파일로 포함되어 있습니다. 은 &quot;.repz&quot;파일은 ZIP 파일 아카이브 소프트웨어를 사용하여 열 수 있습니다. </li></ol></li><li> (예 : 0 °의 경우) 제 1 방위를위한 SLM에 격자, 윈도우를 정렬을 표시합니다. <ol><li> 은 SLM 제어 소프트웨어에서, &quot;상태&quot;탭을 선택합니다 (이 &quot;1&quot;을 주문을 실행하는 예제 파일의 경우) 실행 순서의 번호를 입력합니다. </li><li> 정렬 격자의 실행 순서를 변경하려면 &quot;선택&quot;을 클릭합니다. 참고 :이 샘플 비행기에 작은 원형 영역을 조명합니다. 은 SLM 표면이 올바르게 시료면에 접합 된 경우,이 지역의 가장자리에 초점 크게 될 것입니다. 격자 패턴은 L3의 초점 여러 회절 차수를 생성합니다 : 0 차 반사의 반사 후면 판SLM은 SLM 장치 특정 내부 구성 요소의 회절로부터 발생하는 것을 -1 격자, 또한 약한 고차에 대응 한 명령 (예., 화소 에지의 SLM 픽셀 요철의 내부 배선 반사) . 모든하지만 -1과 +1 주문은 필터링해야합니다. </li></ol></li><li> 공간 마스크 (SM)이 L3의 초점 위치에 빔 경로 내로는 X의 Y 스테이지를 장착 넣고 만 원하는 제 주문 전달되도록 광축에 대해 그 위치를 번역. 직접 공간 필터 후, 두 개의 원형 빔을 볼 수 있습니다. 주 : 공간 마스크 바늘을 이용하여 알루미늄 박으로 6 구멍을 펀칭에 의해 제조된다. 구멍은 모든 레이저 파장에 대한 1 차 빔을 통과하기에 충분히 커야한다. 공간적 마스크의 상세한 분석은 기준 (20)에 주어진다. </li><li> 다시 옆에 정렬 격자의 방향 (60 °, 실행 순서 2)를 표시필요한 경우 첫 번째 주문의 위치를​​ 조정, 공간 마스크를 통해하게되어 있는지 확인합니다. </li><li> 최종 방향 (120 °, 실행 순서 3)에 대해 반복합니다. </li><li> 카메라의 형광 비드 층의 이미지를 확인합니다. 도 2에 도시 된 바와 같이 두 개의 원형 빔이 중첩하지 않은 경우 반복적으로 상기 대물 렌즈와 카메라의 위치를 조절하여 샘플 평면을 재배치. </li><li> 초점이 이미지를 가져올 두 개의 빔을 중첩하는 목표 위치를 조정합니다. 경우에 다시 초점과 미세 조정으로 목표 이미지를 가져 오도록 카메라 위치를 두 개의 원은 여전히​​ 볼 수 있습니다. 두 개의 빔이 겹쳐 하나의 원형 영역의 초점이 될 때까지이 과정을 반복합니다. </li><li> 샘플 평면의 위치가 설정되면, 고정 된 목표 위치를 유지한다. </li><li> 이미지 488 nm의 여기 파장, 예를 들면, 형광 염료 용액을 TIRF 조명을 확인하기 위해 10의 용액을 사용하여81; M 로다 민 6G. <ol><li> 초점 염료 샘플을 가져와. 두 개의 빔이 올바른 TIRF 각도로 입사 한 경우 하나의 분자가 높은 배경없이 표시되며, 원형 구멍의 가장자리가 초점이 될 것입니다. 정렬 및 정렬되지 TIRF 빔의 예는 그림 2B-D를 참조하십시오. </li><li> 차례로 윈도우 격자의 각 방향을 표시하고 세 방향이 TIRF 조명을 제공하는 두 빔이 시료면에 겹쳐 있는지 확인합니다. 빔의 위치를​​ 미세 조정은 다이크로 익 미러 DM3을 조정함으로써 이루어질 수있다. 주의 : 다른 파장은 축상 색수차 인해 약간 다른 위치에 집중되어 있지만, 이것은 중요하지 않으며, 적용에 의해 보정 될 수있는 일정한 제 2 파장 여진 전에 샘플 위치 Z 오프셋. </li></ol></li></ol> 4. 시스템 동기화 및 교정 <ol><li> 비드 단층의 배치목적에 충분한 및 초점 가져온다. </li><li> 상기 제 1 패턴의 방향 (0 °)에 대해 차례로 3 개의 위상 시프트 된 이미지들의 각각을 표시하기 위해 제어 소프트웨어를 이용하여 SLM 프로그램. <ol><li> 는 SLM 제어 소프트웨어를 사용 예 레퍼토리 순서 4를 실행으로 전환. </li><li> 긍정적 인 글로벌 노출 기간 동안 하나의 음의 TTL 트리거 신호 : 출력이 신호를 (예를 들어 HCImage에 대한) 인수 소프트웨어를 사용하여 카메라를 구성합니다. 각각 &quot;노출&quot;, 및 출력 트리거 극성 1, 2 &quot;긍정적&quot;및 &quot;네거티브&quot;카메라의 &quot;고급 카메라 속성&quot;에서 소프트웨어, 설정 출력 트리거 종류 1과 2에서. </li><li> 은 &quot;트리거&quot;동축 케이블을 사용하여 각각 SLM의 &quot;마침&quot;입력, 카메라의 출력 1과 2를 연결합니다. 지금은 SLM 카메라에 동기화된다. </li></ol></li><li> 세 일련의 이미지를 획득. <ol><li> 은 &quot;순서&quot;창에서, 선택# 34; 스캔 유형으로 하드 디스크 기록 &quot;및 3 프레임 수를 설정합니다. </li><li> 3 프레임을 획득하기 위해 &quot;시작&quot;을 클릭합니다. 은 SLM 패턴은 각각의 노출에 따라 변경됩니다. 이미지의 형광 구슬은 3 각 이미지 사이에 오프 점멸 표시됩니다. 점멸의 양은 정현파 조명 패턴의 변조 콘트라스트의 개 판독한다. </li></ol></li><li> 방위각 편광 지정된 패턴 방향 그러므로 높은 변조 콘트라스트를 달성하기 위하여 커스텀 소프트웨어를 사용하여 LCVR로 여기 레이저의 편광을 돌린다. <ol><li> LCVR 교정 소프트웨어를로드합니다. </li><li> 각각 최소 및 최대 전압 0, 8을 입력합니다. </li><li> 편광 회전 &quot;LCVR 전압 스윕&quot;을 클릭합니다. 주 : LCVR 난연성이 온도의 함수이며, 심지어 온도 조절 일상 드리프트 할 수있다. 이 단계에서, 최적의 방위각 분극 sweepi 의해 경험적으로 발견시료에 입사 편광 회전의 영향을 최소 및 최대 전압의인가 전압 겨. 변조 콘트라스트 각 전압 피크 (25) 및 콘트라스트가 다음 단계에서 사용된다 달성 전압에 대해 계산된다. </li><li> 완료 될 때까지 교정 과정 기다린 측정 된 전압을 확인합니다. </li></ol></li><li> 나머지 두 패턴의 방향 (60 ° 및 120 °) 및 여기 파장 각각에 대해이 교정 과정을 반복한다. </li><li> LCVR, 레이저, 발광 필터 휠과 피에조 Z 스테이지 (26)와 카메라 노출을 동기화합니다. 이를 위해, 시스템에 대해 마스터 클럭 소스로 고속 데이터 획득 (DAQ) 보드를 사용하고, SLM의이 레이저를 변조 출력 신호를 사용 LED를 사용하여 (도 3b 참조). 주의 : 특정 구현에 사용되는 성분이지만, 디지털 배출량에 대한 고속 DAQ 보드의 사용에 의존gger 동기화 소프트웨어를 통해 제어하는​​ 아날로그 전압을 이용하여 LCVR의 제어는 추천된다. 이 프로토콜에 사용되는 제어 소프트웨어의 요청에 따라 사용할 수 있습니다. </li><li> 때문에 축 색수차로, 각 파장에 대해, 또한 Z 오프셋 샘플 단계에 적용 할 수 있습니다. <ol><li> 상기 제 1 파장 (예. 488 ㎚) 다음 두 번째로 전환 (예. 640 ㎚)에서 여러 가지 빛깔의 구슬 단층 샘플에 초점을 맞춤으로써 실험적으로 오프셋 (offset)를 결정합니다. 구슬은 지금 초점이 될 것입니다. </li><li> 비드를 집중할 필요 하였다 Z 위치의 변화를 측정한다. 이 후, 압전 Z 스테이지에 여기 파장이 변경 될 때마다 적용될 수 오프셋. </li></ol></li><li> 는 SLM 제어 소프트웨어를 사용 TIRF-SIM 필요한 9 바이너리 격자 이미지의 전체 시리즈에 SLM 실행 순서를 전환. 이 예제 레퍼토리에 주문 0을 실행합니다. </li><li> 카메라 제어 소프트웨어를 사용하여 비드 샘플 9 화상을 취득. <ol&gt; <li> 카메라 소프트웨어의 &quot;순서&quot;창에서 스캔 유형으로 &quot;하드 디스크 녹화&quot;를 선택하고 9 프레임 수를 변경합니다. </li><li> 이미지를 수집하기 위해 &quot;시작&quot;을 클릭합니다. </li><li> &quot;저장 버퍼 이미지&quot;창에서 이미지 유형으로 &quot;TIFF&quot;를 선택하고 확인을 클릭하여 TIFF 파일로 획득 된 영상을 저장합니다. </li></ol></li><li> 표준 TIRF 이상 해상도의 향상을 검증 상업적 또는 커스텀 소프트웨어를 사용하여 원시 TIFF 이미지로부터 초 해상도 영상을 복원. 참고 : 우리는 사용자 정의 재건 코드가 집에서 박사 린 샤오 (27)에 의해 선진국 사용하는 우리의 현미경은. </li></ol>

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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+doubling+in+live,+multicellular+organisms+via+multifocal+structured+illumination+microscopy.">Resolution doubling in live, multicellular organisms via multifocal structured illumination microscopy.</a> Nat. Methods. 9 (7), 749-754 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

<html> 이와 프로토콜에 설명 된 설치와 같은 맞춤형 TIRF-SIM 시스템은 시판 현미경에 비해 고속으로 다색 초 - 해상도 이미징 할 수있다. 초 - 해상도 기술로서 SIM의 고유 한 이점은 시간적 해상도가 같은 단일 분자 지역화 현미경 (SMLM) 또는 유도 방출 고갈 현미경과 같은 점 주사 방식 (다른 방법에 비해 형광 물질의 광 물리학에 의해 제한되지 않는다는 STED). 여러 가지 빛깔의 영상이 간단하므로이 다른 기술과 달리, SIM은 광전 환성 또는 공핍 형광을 필​​요로하지 않습니다. 여기에보고이 개선 인자 반대로 SIM 및 다발성 SIM을 절편 광학 비 TIRF-SIM 시스템은 일반적으로 실질적으로 1.7 배 이하의 해상도의 향상을 달성 할 수 있고, 상용 시스템은 또한 시스템보다 종종 느리고 덜 유연 이 프로토콜에 발표했다. &quot;&gt;이 기술을 구현하는 두 가지 주요 어려움은, 우선 광학 정렬 절차 걸리는 수고와 시간을 필요로 대물 후면 개구의 TIR 영역 내의 여섯 SIM 빔의 정확한 위치에 대한 필요성이있다. 둘째, 높은 패턴 콘트라스트를 제조 샘플에서의 편광 회전이 낮은 NA 2D-SIM 시스템의 편광 회전이 직선 편광의 방향의 신중한 선택에 의해 회피 될 수있다. 필수적이지만, 이는 TIRF-SIM (25)에 대해 불가능하게된다. 고속 다색 이미징, 전기 - 광 편광 제어가 필요하고, 이는 시스템의 복잡성과 비용을 증가시킨다. 기술의 한계 TIRF-SIM은 종래 TIRF 같은 자연적 생물학적 구조와 산장의 150-200 나노 침투 깊이에 의해 조명 될 수있는 기저 세포 막에있는 프로세스의 관찰에 한정된다. 동안SIM은 종종 STED 또는 SMLM이, 측면 해상도 배로 여전히 기존의 TIRF 현미경에 비해 최소 4 배 5 광자의 필요한 수를 증가 않는 하나 이상의 세포에 덜 photodamaging 것으로 인용된다. 짧은 노출 시간을 갖는 고속 프레임 레이트로 촬상,이 광자의 증가는 증가 된 조명 세기를 이용 필요로한다. 어떤 형광이 고정 또는 저속 이동 샘플, 고휘도 형광 단백질 또는 향상된 광 안정성과 차세대 합성 염료의 SIM 이미징을 위해 사용될 수 있지만 라이브 세포 이미징을 권장합니다. 이 구현은 20 Hz를 초과하는 SIM 프레임 레이트에서 하나의 색상을 묘화 할 수 있지만, 표시 시스템의 다색 화상이 전동 발광 필터 휠의 절환 시간에 의해 제한된다. 인해 sCMOS 카메라 칩의 큰 크기로, 멀티 밴드 방출 필터와 이미지 분할 광학계의 이용이 가능하고 동시에 전을 허용 할더 속도 저하 여러 파장 maging. 또 다른 가능성은 상이한 여기 레이저를 대체하고 여기 광을 거부하는 다중 대역 노치 필터를 사용하는 것이다. 이 구현에서 이진 강유전체 SLM의 사용은 최적이 아니다. 입사광의 대부분은, 공간 마스크에 의해 필터링되는 0 차 반사되어 있으므로 이러한 SLM의 회절 효율은 매우 낮다. 높은 프레임 레이트를 요구하는 애플리케이션을 위해, 촬상 속도를 따라서 레이저 다이오드의 출력 전력에 의해 제한된다. 은 SLM은 멀리 픽셀이 이상적인 반 파장 판을 사용하지 않는 550 nm의 설계 파장과 파장에 대한 편광의 일부 타원율을 소개합니다. 이 추가 LCVR를 사용하여 보상 될 수 있지만, 최적의 해결책은 패턴 발생기로서, 디지털 마이크로 미러 디바이스 (DMD)를 사용할 수있다. 가능한 수정 설치 prese여기 nted 유연하고보다 쉽게 3D-SIM 고속 2D-SIM, SIM 병소 (MSIM) 비선형 SIM (NL-SIM)되도록 다른 영상 방식이 21,34,35 구현 될 수 상용 상품보다 변경된다. 2D-SIM은 빠른 등 주변 소포체로 구조를 이동, 상대적으로 평면 이미징에 적합 할 수있다. 주변 ER 인해 그 평면 구조에 TIRF 산장하지만를 사용하여 조명 할 수있는 것보다 세포 내 깊은 거짓말을하는 것은 무시할 포커스 아웃 배경으로 표준 2D-SIM을 사용하여 몇 군데 할 수 있습니다. 또한, 개선 된 광 단면 재구성 알고리즘의 사용은 빛이 광학적으로 두꺼운 샘플이이기는 축 해상도가 21 배로하지 않아도되는 2D-SIM의 사용을 확장 포커스 아웃 억제. MSIM에서, 샘플은 여기 초점 (36)의 성긴 격자에 의해 조명된다. 이러한 양상은 SM (단순히 공간 마스크를 제거함으로써 구현 될 수있다) 및 편광판을 교체. 은 SLM 이제 진폭 변조기로 작동합니다. 는 SLM에 표시된 이진 SIM 격자는 이미지 평면의 회절 제한된 초점의 크기와 동일하도록 선택 스폿의 크기와, 스폿의 2 차원 격자에 의해 대체 될 수있다. 도 7a에서, 4 x 4 픽셀 사각형의 격자는 13.62 μm의의 물리적 SLM의 픽셀 크기 주어진 샘플로 축소된다 때 150 × 150 나노 미터의 회절 제한 초점을 생성하는 SLM (삽입)에 표시됩니다. 여기 초점 다음 SLM상의 격자 패턴을 시프트에 의해 번역 될 수 있고,이보기의 전체 필드를 조명하기 위해 여러 번 반복된다. 이미지는 각각의 번역 패턴의 위치를​​ 취득 스택이되어 배까지의 향상된 해상도의 복원 영상을 생성하는 후 처리 <img alt="방정식" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq19.jpg" /> 감소 등이 해당 위드 이미지에 비해 아웃 오브 포커스획득 시간은 원시 프레임의 다수로 인해 증가하지만 30.이 양상은 표준 SIM은 염색 적혈구 (도 7c)으로 예를 들어 콘트라스트가 낮은 구조에 대해서는 부적합되는 두꺼운 치밀한 샘플을 영상화하는 데 유용 할 수있다 (이 경우 = 168 N에서) 시야 당이 필요합니다. 리 등에 의해 최근에 제시된 마지막 설치 높은 NA 선형 TIRF-SIM 또는 패터닝 활성화 비선형 SIM (PA NL-SIM)를 사용하도록 변경 될 수있다., 초고 1.7 NA 대물 또는 부가를 사용하여 405 나노 미터 photoactivation 레이저 및 SLM 격자 패턴 (35)의주의 최적화. 미래의 응용 프로그램 SIM은 여전히​​ 빠르게 진화하는 기술과 생명 과학의 많은 응용 프로그램은 미래에 활성화됩니다. 기술의 속도, 해상도, 콘트라스트 향상 및 표준 형광체의 m을 사용하는 능력EAN은 bioimaging 위해 SIM 그러한 촛점 넓은 필드 플랫폼과 같은 종래의 수많은 현미경 시스템을 대체하기 위해 설정된다. 상용 SIM 시스템 결정적들이 수정 분야에서 최근 연구 개발을 구현하기 위해 개발 될 융통성 있으며, 그러나, 많은 연구 실험실의 금융 도달 넘어서는 뛰어난 기술 사양 오늘날 이미 사용할 수 있으며. 이들은 또한 필수적인 능력 에지 생명 과학 연구 절삭 종종 심각한 병목 &#39;손 실험에 적용될&#39;으로 부족하다. 여기에 설명 된 시스템은 특히 예를 들면 재료 및 물리학에서 표면 화학을 연구하기 위해, 재구성 이중층 시스템을 시험 관내 연구를 위해, 세포 표면 근처 동적 프로세스를 연구하기에 적합한 것이다. 2D 재료, 및 기타 여러 응용 프로그램.

지난 반 10 년간 슈퍼 해상도 현미경 성숙과 생물학의 손에 전문 광학 연구소에서 움직였다. 상용 현미경 솔루션은 광 초 해상도를 달성하기위한 세 가지 변형이 존재 : 단일 분자 지역화 현미경 (SMLM)는, 배출 플리 현미경 (STED) 및 구조화 된 조명 현미경 (SIM) -1,2- 자극. SMLM는 광 활성화 현지화 현미경 (PALM)과 확률 적 광 재건 현미경 (STORM)와 같은 쉽게 아래로 20 나노 미터로, 주로 인해 광 설치의 단순함과 높은 공간 해상도의 약속, 가장 인기있는 기술이었다. 단일 분자 지역화 비아 다만 초해 현미경 본질적인 절충 제공 : 공간적 해상도가 달성 따라서 시간적 해상도 제한, 개인 형광 지역화 충분한 수의 누적에 의존한다. 영상 역동적 인 과정하나 적절히 또한 이미지를 재구성하는 시간을 충분히 파악 이벤트 획득 동안 움직임 아티팩트를 방지하기 위해 관심있는 구조의 움직임을 샘플링해야하므로 생균의 에스 따라서 문제가된다. 이러한 요구 사항을 충족하기 위해, 생균 SMLM 시연 크게 여기 전력을 증가시킴으로써 형광 단 photoswitching 속도에서 원하는 증가를 수득했고, 이에 의해 샘플의 생존 시간 및 생물학적 관련성 3 제한 광독성 및 산화 스트레스에 차례로 이끈다. SIM 및 SMLM 모두 이상 STED의 명확한 장점은 약 60 나노 미터의 예 측면 해결을위한 두꺼운 샘플 슈퍼 해상도와 이미지가 120 μm의 4까지 깊이의 Organotypic 뇌 조각에 달성되었다 수 있다는 것입니다. SMLM 또는 SIM의 하나의 목적 구현과 같은 깊이의 영상은 실현성이지만, 단일 분자 광 시트 또는 격자 광 시트 마이크 중 하나를 가능하게roscopy 5. 지금까지보기 (6)의 작은 필드 촬상 한정 하였지만 비디오 레이트 STED 또한 입증과 시냅스 소포 이동성을 매핑하는 데 사용되어왔다. 세포 생물학 및 분자 자기 조립 반응 7에서 응용 프로그램 - 그것은 특정 형광의 광 물리 특성에 의존하지으로 많은 시점에서 높은 시간 해상도를 가진 영상을 필요로 (12), 구조화 조명 현미경 (SIM) 매우 적합 할 수있다 조사. SIM이 고유의 장점에도 불구하고, 지금까지의 사용은 주로 고정 된 세포 또는 천천히 움직이는 프로세스를 이미징 할 국한되었습니다. 이는 시판 SIM 시스템의 제한으로 인해 이러한 상품의 포착 프레임 율이 요구되는 정현파 조명 패턴뿐만 아니라 광학 유지 편광을 생성하기 위해 사용되는 격자의 회전 속도에 의해 제한되었다. 상업 SIM의 최신 세대장비는 빠른 이미징 할 수있다 그러나 그들은 중앙 이​​미징 시설하지만 모든 엄청나게 비싸다. 이 프로토콜은 살아있는 세포의 기저 표면 얇은 시료와 가까이 빠른 프로세스를 영상화하는가요 SIM 시스템의 구성에 대한 지침을 제공한다. 이 크게 포커스 배경 신호의 출력을 감소 샘플 (13)에없는 깊이 약 150 nm 이하를 관통하는 조명 패턴을 생성하기 위해 전반사 형광 (TIRF)를 이용한다. TIRF와 SIM을 결합의 아이디어는 SIM 자체 (14)만큼이나 오래된하지만 2006 15 전에 실험적으로 실현되지 않았다. 2009 년 튜 불린과 키네신을 시각화하는 11 Hz에서 16 달성 프레임 속도를보고되었다 TIRF-SIM으로 얻어진 생체 내에서 첫 번째 이미지 다이나믹 두 색 TIRF-SIM 시스템 (17, 18)를 제시하고있다. 최근 단색 두 SIM 빔 (S)의 구조 및 사용을위한 지침템은 최대 18 Hz에서 19, 20의 프레임 속도를 특징으로 제시했다. 여기에 제시된 셋업 TIRF-SIM에서 동작 할 수있는 두개의 세 가지 색상, 20 Hz에서 SIM 초 - 해상도 이미징 할 수있다. 전체 시스템은 거꾸로 현미경 프레임 주위 구성 및 압전 구동 Z 스테이지와 전동 XY 번역 단계를 사용합니다. TIRF-SIM에 필요한 사인 여기 패턴을 생성하기 위해 제공되는 시스템은 강유전체의 공간 광 변조기 (SLM)를 사용한다. 이진 격자 패턴이 SLM 상에 표시하고, 생성 된 ± 1 차 회절 여과 중계 대물 렌즈의 TIR 고리에 집중된다. 필요한 위상 변화와 격자의 회전은 표시 SLM 이미지를 변경하여 적용됩니다. 이 프로토콜은, 구축 및 여기 경로를 정렬하는 방법을 설명 방출 경로의 정렬을 자세히 설명하고, 최적의 정렬을 보장하기위한 테스트 샘플을 제공합니다. 또한 해제<html> 편광 제어 및 구성 요소의 동기화 관련 문제 및 고속 TIRF-SIM에 특히 어려움을 스크라이브한다. 디자인 고려 사항 및 제한 이 프로토콜에서 제시된 TIRF-SIM 시스템을 조립하기 전에, 광학 구성 요소의 선택을 결정하는 몇 가지 고려 된 설계 제약이있다. 광학 부품의 모든 약어는 그림 1을 참조하십시오. 공간 광 변조기 (SLM) 이 서브 - 밀리 세컨드 패턴 전환이 가능한 경우 이진 강유전체 SLM이 설정에서 사용된다. 계조 네마의 SLM이 사용될 수 있지만, 이들은 스위칭 시간을 크게 감소 제공. 또는 화소 오프 각 이진 위상 SLM은주기적인 격자 패턴이 격자 상 회절로서 동작 할 SLM에 표시되므로 경우, 입사면의 파면 오프셋 중 하나 π 0 위상을 부여한다. 엔트 &quot;&gt; 총 내부 반사 (TIR) TIR을 달성하고 산장을 생산하는 유리 샘플 계면에서의 여기 빔의 입사각이 임계각보다 커야 <img alt="방정식" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq1.jpg" /> . 이 소멸 조명 패턴의 필요한 최소 입사각, 따라서 또한 최대 간격 또는 기간을 설정한다. 최대 입사각 <img alt="방정식" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq2.jpg" /> (합격 각도)의 정의로부터 계산 될 수있는 대물 렌즈의 개구 수 (NA)에 의해 제한된다 <img alt="방정식" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq3.jpg" /> . 이것은 아베 공식에 따라 달성 가능한 최소 간격 패턴을 결정 <img alt="방정식" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq4.jpg" /> NA 파장을 연결하는 <img alt="방정식" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq5.jpg" /> 최저 패턴 간격을 <imgALT = &quot;식&quot;SRC = &quot;/ 파일 / ftp_upload / 53988 / 53988eq6.jpg&quot;/&gt;. 실제로, 1.49 NA 오일 침지 TIRF 목적은 약 79 °의 입사각과의 488 nm의 여기 파장을 사용하여 164 nm 인 샘플 최소 패턴주기의 최대 각도를 산출한다. 이들 두 각도는 악기 TIR 조명 (예. TIR 링)과 한 개의 여진 초점을 정확하게 위치해야 달성 정확하게 각 조명 패턴을 생성하기 위해 회전하는 동안, 대물의 뒤쪽 개구의 환을 정의한다. TIRF-SIM 이미지 재구성 패턴 회전 당 세 개의 위상 시프트의 최소의 인수 따라서 SLM 패턴주기가 3의 배수이어야 요구 (도 1 참조). 예를 들어, 488 nm의 조명 9 픽셀과 640 nm의 조명 12 화소의 기간. 쉬어 된 회절 격자를 이용하여 간격 패턴의 서브 픽셀을 포함 최적화 SLM 패턴 디자인의 포괄적 대하여는,은 SLM 파장이에서, 모든 파장의 TIR 링 내부에 있어야 ± 1 주문 그러나 회절 각도를 두 여자의 초점의 Kner 등. (16)와 루 - 발터 등. (20) 위치의 이전 작업을 참조하십시오 매달린. 표준 SIM 들면, 다색 화상이 가장 긴 파장에 대한 격자주기를 최적화하고 짧은 채널 성능의 손실을 용인함으로써 달성 될 수있다. TIRF-SIM의 경우 그러나, 하나의 파장 최적화하면 다른 파장의 초점은 더 이상 TIR 링 내에 있다는 것을 의미합니다. 초점이 후방 개구와 TIR 링 내부 직경의 95 %로되어 예를 들어, 9 화소의 격자주기를 사용하여, 488 nm의 대한 TIRF를 제공하기에 충분하지만, 640 nm 인이 기간은 외부 초점 위치 할 조리개. 이러한 이유로 다양한 화소 패턴의 간격은 각각의 여기 파장에 사용되어야한다. TIRF-SIM 여기 경로의 정렬극히 현미경 본체 (도 1에 DM4), 다이크로 익 미러의 위치의 작은 변화에 민감하므로 더 이상 종래 SIM이다. 회전 필터 큐브 터릿의 사용 대신에 사용 된 여기 파장에 대해 특별히 고정 위치에 유지되고 설계된 단일, 멀티 밴드 다이크로 익 미러를 사용하여, 권장되지 않는다. 단지 고품질 이색 거울이 사용되는 것이 필수적이다. 이들은 적어도 3mm의 두께의 기판을 필요로하며, 종종 제조사 별 &quot;이미징 평면&quot;으로 지정된다. 다른 모든 기판 TIRF-SIM에 견딜 수차 및 이미지 저하로 이어집니다. 편광 제어 TIRF-SIM을 달성하기 위하여 그것의 광축에 대하여 상기 대물 퓨필 평면 내의 방위각 편광 유지되도록 조명 패턴과 동 기적으로 상기 여기 광의 편광 상태를 회전하는 것이 필수적이다 (즉,. s 편광). 편광 제어 광학 정렬은 모터 회전 스테이지 (22)에 예를 들어, 사용되는 특정의 광학 소자에 포켈 셀 (21) 또는 반파 장판을 의존 할 것이다. 이 프로토콜에서 사용자 지정 액정 변수 지연 (LCVR)이 사용되는 파장 범위에 걸쳐 전파 (2π) 난연성을 제공하도록 설계되었습니다 488이 빠른 (~ 밀리 초) 전환을 허용하는 nm의 640. 액정 위상차 판을 사용하는 경우는 고품질의 부품을 사용하는 것이 필수적이다 표준 구성 요소는 일반적으로 리드 카메라 노출 시간의 길이에 걸쳐 일정한 난연성을 제공하기에 충분히 안정되지 않는 조명 패턴 및 낮은 변조 콘트라스트에서 모호 . 액정 지연 제는 강하게 온도 의존 및 온도 제어에 내장이 필요합니다. 동기화 레이저는 SLM과 동기화해야합니다. 이진 강유전체의 SLM 내부적들로 균형된다상태에와 국가 떨어져 사이의 매혹적인. 화소는 하나 또는 그 오프 상태가 아니라 간 스위칭시기에서와 반파 플레이트 역할을한다. 따라서, 레이저는 의해서만 화소의 중간 상태의 패턴 콘트라스트의 저하를 방지하기 위해 SLM의 인 에이블 신호를 통해 LED의 온 / 오프 상태시에서 스위칭되어야한다. 레이저는 디지털 변조 할 수없는 경우는 음향 광학 변조기 (AOM)은 대안 적으로 고속 셔터로 사용될 수있다. 렌즈의 선택 이러한 제한에 기초하여, 샘플 평면 상에 SLM 평면의 사이즈 축소 요구는 원하는 조명 패턴을 결정할 수있다 생성한다. 이 화상 중계 망원경 여진 집광 렌즈 L5에있는 두 렌즈 L3와 L4의 초점 거리의 계산을 허용한다. 이 시스템에서 100X / 1.49NA 오일 액침 대물 렌즈는 488 nm 내지 640 nm의 여기에 사용되며, 따라서 300 및 140mm의 초점 거리를 사용L3 및 L4, 시료면에서 38 nm 인 SLM의 화소 사이즈에 상당 357X 총 축소율을 부여 L5 300 mm의 대. 렌즈의 조합을 사용하여, SLM은 각각 70 ° 및 67 °의 입사각에 대응하는 488nm의 조명 및 샘플을 172, 229 nm의 패턴 간격을 줄 내지 640 12 화소 9 기간 격자. 유리 물 인터페이스의 임계각 따라서 이들 두 패턴 간격이 두 파장 용 TIRF 여기 있도록 61 °로하고, 파장에 무관하다. 37 ° C에서 동작하는 경우, 또는 교정 용 칼라를 구비 한 대물 렌즈 커버 슬립의 두께의 변화에​​ 의해 도입 된 구면 수차의 보정이 유용하다. 이미지 재건 원시 SIM 데이터를 획득 한 후에는 두 단계에서 슈퍼 - 분해 된 이미지를 생성하기 위해 계산 노력의 문제이다. 우선, 조명 패턴을 결정해야모든 이미지 및 둘째, SIM 스펙트럼의 성분을 분리해야하며 효과적인 OTF 지원 (세트를도 6 참조)를 두배로 적절 재결합. 슈퍼 - 분해 된 주파수 성분이 중첩 요소의 잔여 부분으로 인한 아티팩트를 방지 섞이지 최대한 정확하게 할 필요로 투사 조명 패턴의 정확한 지식이 중요하다. 우리는 조명 패턴이 각각 찾을 수있다 구스타프손 외. 요컨대 23 정규화 이차원 정현파 설명 조명 파라미터들의 세트에 의해 도입 된 절차에 따라, 원시 이미지 데이터로부터 귀납적 파라미터 결정 <img alt="방정식" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq7.jpg" /> 여기 패턴 <img alt="방정식" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq8.jpg" /> : <img alt="방정식" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq9.jpg" /> 이에 <img alt="방정식" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq10.jpg" /> 과 <img alt="방정식" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq11.jpg" /> 프린지 대비 각각 각각의 이미지 m의 위상을 시작하는 패턴을 설명합니다. 전파 벡터의 성분 <img alt="방정식" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq12.jpg" /> 과 <img alt="방정식" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq13.jpg" /> 만 다른 방향으로 변경 <img alt="방정식" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq14.jpg" /> 패턴 및 캔의 다른 일정하다고 가정. 조악 오버랩을 최적화하도록 상호 상관 된 이미지 중 하나의 서브 픽셀 시프트를 적용하여 정제 원 화상의 스펙트럼의 교차 상관이 수행되는 웨이브 벡터의 요소를 결정한다. 이는 실제 공간 상 구배의 곱셈을 통해 이루어집니다 <img alt="방정식" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq15.jpg" /> 그 FRE의 서브 픽셀 변화를 유도이는 주파수 - 공간. 실제의 패턴을 추정하기 전에 웨이브 벡터의 양호한 추정을하는 것이 유용하며 이것은 형광 비드 층 묘화에 의해 발견 될 수 있습니다. 시프트 패턴 사이의 위상 단계이므로 <img alt="방정식" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq16.jpg" /> 즉. <img alt="방정식" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq17.jpg" /> 주파수 성분의 분리는 &quot;위상 축&quot;함께 푸리에 변환에 의해 수행 될 수있다. 글로벌 위상 <img alt="방정식" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq18.jpg" /> 그리고 프린지 대비 <img alt="방정식" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq10.jpg" /> 다음, 다른 성분의 복소 선형 회귀를 사용하여 결정될 수있다. 각각의 분리 된 성분은 다음 일반화 위너 필터를 사용하여 결합된다. 일반화 된 위너 필터의 두 파라미터 추출 및 구현에 대한 자세한 설명은 우리가 구스타프손에 독자를 참조등. (23)와 동일한 알고리즘이 사용된다.

<table><tbody><tr><td>488 nm laser</td><td>Toptica</td><td>iBeam SMART</td><td>with digital modulation</td></tr><tr><td>561 nm laser</td><td>Coherent</td><td>OBIS LS</td><td>with digital modulation</td></tr><tr><td>640 nm laser</td><td>Cobolt</td><td>MLD</td><td>with digital modulation</td></tr><tr><td>Long-pass dichroic mirrors&amp;nbsp;</td><td>Thorlabs</td><td></td><td>for combining excitation beams</td></tr><tr><td>Quad band dichroic mirror</td><td>Chroma</td><td>ZT405/488/561/640rpc</td><td>3 mm thick, TIRF imaging flat, mounted in Olympus BX filter cube</td></tr><tr><td>Quad band dichroic mirror</td><td>Chroma</td><td>ZT405/488/561/640rpc</td><td>From same batch as above, 25 x 25 mm</td></tr><tr><td>1&quot; square kinematic mount</td><td>Edmund Optics</td><td>58-860</td><td></td></tr><tr><td>Glan-Taylor calcite polarizers</td><td>Thorlabs</td><td>GT5-A</td><td>For alignment of LCVR</td></tr><tr><td>Glan-Taylor mount</td><td>Thorlabs</td><td>SM05PM5</td><td></td></tr><tr><td>Achromatic half wave plate</td><td>Thorlabs</td><td>AHWP05M-600</td><td>400-800 nm</td></tr><tr><td>Rotation cage mount</td><td>Thorlabs</td><td>CRM1/M</td><td>For HWP</td></tr><tr><td>Liquid Crystal Variable Retarder</td><td>Meadowlark Optics</td><td>SWIFT</td><td>Custom built to provide full wave retardance over the range 488 to 640 nm.</td></tr><tr><td>LCVR controller</td><td>Meadowlark Optics</td><td>D3060HV</td><td>Two channel high voltage controller for liquid crystal retarders</td></tr><tr><td>Achromatic quarter wave plate</td><td>Meadowlark Optics</td><td>AQM-100-0545</td><td></td></tr><tr><td>Rotation cage mount</td><td>Thorlabs</td><td>CRM1P/M</td><td>For QWP</td></tr><tr><td>10 mm achromatic doublet</td><td>Thorlabs</td><td>AC080-010-A-ML</td><td>For beam expander</td></tr><tr><td>200 mm achromatic doublet</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-200-A-ML</td><td>For beam expander</td></tr><tr><td>Cage XY Translators</td><td>Thorlabs</td><td>CXY1</td><td></td></tr><tr><td>Ferroelectric spatial light modulator</td><td>Forth Dimension Displays</td><td>M0787-00249&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>SXGA-3DM (IFF) Microdisplay Type M249, 1,280 x 1,024 pixels, with driver board</td></tr><tr><td>SLM mounting frame</td><td>Forth Dimension Displays</td><td>M0787-10014</td><td>Fixed to custom built aluminium mount</td></tr><tr><td>&amp;Oslash;50.8 mm Gimbal Mirror Mount</td><td>Thorlabs</td><td>GM200/M</td><td>For SLM mounting</td></tr><tr><td>Two-Axis Linear Translation Stage with Rotating Platform</td><td>Thorlabs</td><td>XYR1/M</td><td>For SLM mounting</td></tr><tr><td>Rail carrier</td><td>Newport</td><td>M-PRC-3</td><td>For SLM mounting</td></tr><tr><td>Precision Optical Rail</td><td>Newport</td><td>PRL-6</td><td>For SLM mounting</td></tr><tr><td>300 mm achromatic doublet lens</td><td>Qioptiq</td><td>G322 273 322&amp;nbsp;</td><td>f = 300 mm, 31.5 mm diameter</td></tr><tr><td>140 mm achromatic doublet lens</td><td>Qioptiq</td><td>G322 239 322</td><td>f = 140 mm, 31.5 mm diameter</td></tr><tr><td>Precision XY Translation Mounts</td><td>Thorlabs</td><td>LM2XY</td><td></td></tr><tr><td>Lens Mounting Adapters</td><td>Thorlabs</td><td>SM2AD32</td><td>For mounting 31.5 mm lenses in 2&quot; mounts</td></tr><tr><td>Translation stages</td><td>Comar</td><td>12XT65</td><td>Dovetail, side drive</td></tr><tr><td>XY Translator with Differential Drives</td><td>Thorlabs</td><td>ST1XY-D/M</td><td>for spatial filter</td></tr><tr><td>Rotation cage mount</td><td>Thorlabs</td><td>CRM1/M</td><td>for spatial filter</td></tr><tr><td>300 mm achromatic doublet</td><td>Thorlabs</td><td>AC508-300-A-ML</td><td>Excitation tube lens</td></tr><tr><td>Automated XY stage with Z-piezo top plate</td><td>ASI</td><td>PZ-2150-XYFT-PZ-IX71&amp;nbsp;</td><td>with MS-2000 controller</td></tr><tr><td>Inverted microscope frame</td><td>Olympus</td><td>IX-71</td><td></td></tr><tr><td>Objective lens</td><td>Olympus</td><td>UAPON100XOTIRF</td><td>100X/1.49NA</td></tr><tr><td>High speed filter wheel</td><td>Prior Scientific</td><td>HF110A</td><td>with Prior ProScan III controller</td></tr><tr><td>Bandpass emission filters</td><td>Semrock</td><td>FF01-525/30, FF01-676/29</td><td></td></tr><tr><td>sCMOS camera</td><td>Hamamatsu</td><td>ORCA Flash v4.0</td><td></td></tr><tr><td>Stage top incubator</td><td>OKO Lab</td><td>H301-K-FRAME</td><td>For live cell imaging, with Bold Line temperature and CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; controllers</td></tr><tr><td>Stainless steel optical posts</td><td>Thorlabs</td><td>TR series</td><td>for mounting optical components</td></tr><tr><td>Post holders</td><td>Thorlabs</td><td>PH series</td><td>for mounting optical components</td></tr><tr><td>Kinematic mirror mounts</td><td>Thorlabs</td><td>KM100</td><td>for mounting 1&quot; mirrors</td></tr><tr><td>Shearing interferometer</td><td>Thorlabs</td><td>SI100</td><td></td></tr><tr><td>100 nm fluorescent microspheres</td><td>Life Technologies</td><td>T-7279</td><td>Tetraspeck</td></tr><tr><td>Rhodamine 6G</td><td>Sigma Aldrich</td><td>83697-250MG</td><td></td></tr><tr><td>8 well glass bottom dishes</td><td>ibidi</td><td>80827</td><td>with #1.5 coverglass</td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>155409</td><td>with #1.5 coverglass</td></tr><tr><td>0.01 mm microscope reticle slide</td><td>EMS</td><td>68039-22</td><td></td></tr><tr><td>CellLight Tubulin-GFP, BacMam 2.0</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10613</td><td></td></tr></tbody></table>

a guide to structured illumination tirf microscopy at high speed with multiple colors

구조화 된 조명 현미경 (SIM) 광학 수퍼 - 해상도 이미징은 화학적 및 생의학에서 분자 수준에서 프로세스의 시각화를위한 핵심 기술이다. SIM 상용 시스템을 사용할 수 있지만, 사용자 상용 시스템을 능가 할 수있는 실험실에서 설계 시스템, 후자는 일반적으로 이미징 정확도와 속도 측면에서 모두 사용 범용 애플리케이션의 용이성을 위해 설계. 이 문서는 내부 전반사 (TIR)​​ 조명을 사용하고, 100 나노 미터에 이르는 해상도 세 가지 색상에 10 Hz에서 최대에 이미징 할 수있는 SIM 시스템을 구축에 대한 심도있는 가이드를 제공합니다. TIRF 때문에 SIM과의 조합으로, 상기 시스템은 경쟁 기술보다 더 나은 이미지 콘트라스트를 제공한다. 이러한 사양을 달성하기 위해, 몇몇 광학 요소들은 가능​​한 모든 음원 WAV 대한 조명광의 편광 상태와 공간 구조를 통해 자동 제어를 가능하게하는 데 사용되는elengths. 하드웨어 구현 및 제어에 관한 자세한 사항은 최대 포착 프레임 율을 달성을 중시 여기 광 패턴 생성, 파장, 편광 상태, 및 카메라 제어 간의 동기화를 달성하기 위해 제공된다. 시스템 조정 및 교정을위한 단계별 프로토콜이 제시되고 달성 가능한 해상도 개선 이상적인 테스트 샘플에 대해 검증된다. 비디오 레이트 초 - 해상도 이미징 능력은 살아있는 세포로 설명된다.

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A Guide to Structured Illumination TIRF Microscopy at High Speed with Multiple Colors

This article provides an in depth guide for the assembly and operation of a structured illumination microscope operating with total internal reflection fluorescence illumination (TIRF-SIM) to image dynamic biological processes with optical super-resolution in multiple colors.

여러 색상과 고속에서 구조화 조명 TIRF 현미경에 가이드

Optical super-resolution imaging with structured illumination microscopy (SIM) is a key technology for the visualization of processes at the molecular ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

25.1K 조회수.  University of Cambridge. This article provides an in depth guide for the assembly and operation of a structured illumination microscope operating with total internal reflection fluorescence illumination (TIRF-SIM) to image dynamic biological processes with optical super-resolution in multiple colors.

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Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

TIRF microscopy has emerged as a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules in vitro and in living cells1. The optical phenomenon of total internal reflection occurs when light passes from a medium with high refractive index into a medium with low refractive index at an angle larger than a characteristic critical angle (i.e. closer to being parallel with the boundary). Although all light is reflected back under such conditions, an evanescent wave is created that propagates across and along the boundary, which decays exponentially with distance, and only penetrates sample areas that are 100-200 nm near the interface2. In addition to providing superior axial resolution, the reduced excitation of out of focus fluorophores creates a very high signal to noise ratios and minimizes damaging effects of photobleaching2,3. Being a widefield technique, TIRF also allows faster image acquisition than most scanning based confocal setups.
At first glance, the low penetration depth of TIRF seems to be incompatible with imaging of bacterial and fungal cells, which are often surrounded by thick cell walls. On the contrary, we have found that the cell walls of yeast and bacterial cells actually improve the usability of TIRF and increase the range of observable structures4-8. Many cellular processes can therefore be directly accessed by TIRF in small, single-cell microorganisms, which often offer powerful genetic manipulation techniques. This allows us to perform in vivo biochemistry experiments, where kinetics of protein interactions and activities can be directly assessed in living cells.
We describe here the individual steps required to obtain high quality TIRF images for Saccharomyces cerevisiae or Bacillus subtilis cells. We point out various problems that can affect TIRF visualization of fluorescent probes in cells and illustrate the procedure with several application examples. Finally, we demonstrate how TIRF images can be further improved using established image restoration techniques.

Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful approach to observe structures close to the cell surface at high contrast and temporal resolution. We demonstrate how TIRF can be employed to study protein dynamics at the cortex of cell wall-enclosed bacterial and fungal cells.

미생물에 접속 조직 및 역학 시각화, 총 내부 반사의 형광 현미경을 사용하여

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

연구

생체공학

A TIRF Microscopy Technique for Real-time, Simultaneous Imaging of the TCR and its Associated Signaling Proteins

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex (pMHC) proteins expressed on the surface of antigen presenting cells (APCs). The TCR complex is composed of the ligand binding TCR&alpha;&beta; heterodimer that associates non-covalently with CD3 dimers (the &#949;&delta; and &#949;&gamma; heterodimers and the &zeta;&zeta; homodimer)1. Upon engagement of the receptor, the CD3 &zeta; chains are phosphorylated by the Src family kinase, Lck. This leads to the recruitment of the Syk family kinase, Zap70, which is then phosphorylated and activated by Lck. After that, Zap70 phosphorylates the adapter proteins LAT and SLP76, initiating the formation of the proximal signaling complex containing a large number of different signaling molecules2. 
The formation of this complex eventually results in calcium and Ras-dependent transcription factor activation and the consequent initiation of a complex series of gene expression programs that give rise to T cell differentiation2. TCR signals (and the resulting state of differentiation) are modulated by many other factors, including antigen potency and crosstalk with co-stimulatory/co-inhibitory, chemokine, and cytokine receptors 3-4. Studying the spatial and temporal organization of the proximal signaling complex under various stimulation conditions is, therefore, key to understanding the TCR signaling pathway as well as its regulation by other signaling pathways.
One very useful model system to study signaling initiated by the TCR at the plasma membrane in T cells is glass-supported lipid bilayers, as described previously5-6. They can be utilized to present antigenic pMHC complexes, adhesion, and co-stimulatory molecules to T cells-serving as artificial APCs. By imaging the T cells interacting with the lipid bilayer using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM), we can restrict the excitation to within 100 nm of the space between the glass and the cell surface 7-8. This allows us to image primarily the signaling events occurring at the plasma membrane. As we are interested in imaging the recruitment of signaling proteins to the TCR complex, we describe a two-camera TIRF imaging system wherein the TCR, labeled with fluorescent Fab (fragment antigen binding) fragments of the H57 antibody (purified from hybridoma H57-597, ATCC, ATCC Number:HB-218) which is specific for TCR&beta;, and signaling proteins, tagged with GFP, may be imaged simultaneously and in real time. This strategy is necessary due to the highly dynamic nature of both the T cells and of the signaling events that are occurring at the TCR. This imaging modality has allowed researchers to image single ligands 9-11 as well as recruitment of signaling molecules to activated receptors and is an excellent system to study biochemistry in-situ12-16.

The compartmentalization of proteins either within the plasma membrane or into intracellular locations is one regulatory mechanism that can greatly influence signaling outcomes; hence, to understand signaling it is important to study the spatial and temporal behavior of the proteins involved. We describe here a TIRF microscopy based system to study signal transduction in T cells, but is broadly applicable.

실시간, TCR의 동시 이미징 및 관련 신호 전달 단백질에 대한 TIRF 현미경 기법

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex ...

면역학 및 감염병학

High-Throughput Total Internal Reflection Fluorescence and Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy Using a Photonic Chip

Total internal reflection fluorescence (TIRF) is commonly used in single molecule localization based super-resolution microscopy as it gives enhanced contrast due to optical sectioning. The conventional approach is to use high numerical aperture microscope TIRF objectives for both excitation and collection, severely limiting the field of view and throughput. We present a novel approach to generating TIRF excitation for imaging with optical waveguides, called chip-based nanoscopy. The aim of this protocol is to demonstrate how chip-based imaging is performed in an already built setup. The main advantage of chip-based nanoscopy is that the excitation and collection pathways are decoupled. Imaging can then be done with a low magnification lens, resulting in large field of view TIRF images, at the price of a small reduction in resolution. Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) were imaged using direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM), showing a resolution comparable to traditional super-resolution microscopes. In addition, we demonstrate the high-throughput capabilities by imaging a 500 &#181;m x 500 &#181;m region with a low magnification lens, providing a resolution of 76 nm. Through its compact character, chip-based imaging can be retrofitted into most common microscopes and can be combined with other on-chip optical techniques, such as on-chip sensing, spectroscopy, optical trapping, etc. The technique is thus ideally suited for high throughput 2D super-resolution imaging, but also offers great opportunities for multi-modal analysis.

Chip-based super-resolution optical microscopy is a novel approach to fluorescence microscopy and offers advantages in cost effectiveness and throughput. Here, the protocols for chip preparation and imaging are shown for TIRF microscopy and localization-based super-resolution microscopy.

포토닉 칩을 사용한 고처리량 총 내부 반사 형광 및 직접 적층 광학 재건 현미경

Total internal reflection fluorescence (TIRF) is commonly used in single molecule localization based super-resolution microscopy as it gives enhanced ...

생화학

Cortical Actin Flow in T Cells Quantified by Spatio-temporal Image Correlation Spectroscopy of Structured Illumination Microscopy Data

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell interaction known as the immunological synapse. F-actin is also speculated to play a role in regulating molecular distributions at the membrane of cells including sub-membranous vesicle dynamics and protein clustering. While standard light microscope techniques allow generalized and diffraction-limited observations to be made, many cellular and molecular events including clustering and molecular flow occur in populations at length-scales far below the resolving power of standard light microscopy. By combining total internal reflection fluorescence with the super resolution imaging method structured illumination microscopy, the two-dimensional molecular flow of F-actin at the immune synapse of T cells was recorded. Spatio-temporal image correlation spectroscopy (STICS) was then applied, which generates quantifiable results in the form of velocity histograms and vector maps representing flow directionality and magnitude. This protocol describes the combination of super-resolution imaging and STICS techniques to generate flow vectors at sub-diffraction levels of detail. This technique was used to confirm an actin flow that is symmetrically retrograde and centripetal throughout the periphery of T cells upon synapse formation.

To investigate flow velocities and directionality of filamentous-actin at the T cell immunological synapse, live-cell super-resolution imaging is combined with total internal reflection fluorescence and quantified with spatio-temporal image correlation spectroscopy.

구조화 조명 현미경 데이터의 시공간적 이미지 상관 분광학에 의해 정량화 T 세포에서 대뇌 피질 굴지 흐름

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell ...

Simultaneous Interference Reflection and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy for Imaging Dynamic Microtubules and Associated Proteins

Several techniques have been employed for the direct visualization of cytoskeletal filaments and their associated proteins. Total-internal-reflection-fluorescence (TIRF) microscopy has a high signal-to-background ratio, but it suffers from photobleaching and photodamage of the fluorescent proteins. Label-free techniques such as interference reflection microscopy (IRM) and interferometric scattering microscopy (iSCAT) circumvent the problem of photobleaching but cannot readily visualize single molecules. This paper presents a protocol for combining IRM with a commercial TIRF microscope for the simultaneous imaging of microtubule-associated proteins (MAPs) and dynamic microtubules in vitro. This protocol allows for high-speed observation of MAPs interacting with dynamic microtubules. This improves on existing two-color TIRF setups by eliminating both the need for microtubule labeling and the need for several additional optical components, such as a second excitation laser. Both channels are imaged on the same camera chip to avoid image registration and frame synchronization problems. This setup is demonstrated by visualizing single kinesin molecules walking on dynamic microtubules.

We present a protocol for implementing interference-reflection microscopy and total-internal-reflection-fluorescence microscopy for the simultaneous imaging of dynamic microtubules and fluorescently labeled microtubule-associated proteins.

동시 간섭 반사 및 전체 내부 반사 형광 현미경 검사 이미징 동적 미세 소관 및 관련 단백질

Several techniques have been employed for the direct visualization of cytoskeletal filaments and their associated proteins. ...

Conducting Multiple Imaging Modes with One Fluorescence Microscope

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to conventional epi-fluorescence microscopy, various imaging techniques have been developed to achieve specific experimental goals. Some of the widely used techniques include single-molecule fluorescence resonance energy transfer (smFRET), which can report conformational changes and molecular interactions with angstrom resolution, and single-molecule detection-based super-resolution (SR) imaging, which can enhance the spatial resolution approximately ten&#160;to twentyfold compared to diffraction-limited microscopy. Here we present a customer-designed integrated system, which merges multiple imaging methods in one microscope, including conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based SR imaging, and multi-color single-molecule detection, including smFRET imaging. Different imaging methods can be achieved easily and reproducibly by switching optical elements. This set-up is easy to adopt by any research laboratory in biological sciences with a need for routine and diverse imaging experiments at a reduced cost and space relative to building separate microscopes for individual purposes.

Here we present a practical guide of building an integrated microscopy system, which merges conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based super-resolution imaging, and multi-color single-molecule detection, including single-molecule fluorescence resonance energy transfer imaging, into one set-up in a cost-efficient way.

실시 한 형광 현미경으로 여러 영상 모드

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to visualize these highly dynamic events, two complementary light microscopy techniques that allow fast imaging of live samples were combined: spinning disk microscopy (SD) for fast and high-resolution volume recording and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy for precise localization and visualization of the plasma membrane. A comprehensive and complete imaging protocol will be shown for guiding through sample preparation, microscope calibration, image formation and acquisition, resulting in multi-color SD-TIRF live imaging series with high spatio-temporal resolution. All necessary image post-processing steps to generate multi-dimensional live imaging datasets, i.e. registration and combination of the individual channels, are provided in a self-written macro for the open source software ImageJ. The imaging of fluorescent proteins during initiation and maturation of adhesion complexes, as well as the formation of the actin cytoskeletal network, was used as a proof of principle for this novel approach. The combination of high resolution 3D microscopy and TIRF provided a detailed description of these complex processes within the cellular environment and, at the same time, precise localization of the membrane-associated molecules detected with a high signal-to-background ratio.

An advanced microscope that permit fast and high-resolution imaging of both, the isolated plasma membrane and the surrounding intracellular volume, will be presented. The integration of spinning disk and total internal reflection fluorescence microscopy in one setup allows live imaging experiments at high acquisition rates up to 3.5 s per image stack.

회전 디스크-총 내부 반사 형광 현미경 검사 법 고급 시각화에 의해 세포 접착 형성

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled single molecules within a sample with a spatial resolution of tens of nanometers. Using either photoactivatable (PAFP) or&#160;photoswitchable (PSFP) fluorescent proteins fused to proteins of interest, or organic dyes conjugated to antibodies or other molecules of interest, fluorescence photoactivation localization microscopy (FPALM) can simultaneously image multiple species of molecules within single cells. By using the following approach, populations of large numbers (thousands to hundreds of thousands) of individual molecules are imaged in single cells and localized with a precision of ~10-30 nm. Data obtained can be applied to understanding the nanoscale spatial distributions of multiple protein types within a cell. One primary advantage of this technique is the dramatic increase in spatial resolution: while diffraction limits resolution to ~200-250 nm in conventional light microscopy, FPALM can image length scales more than an order of magnitude smaller. As many biological hypotheses concern the spatial relationships among different biomolecules, the improved resolution of FPALM can provide insight into questions of cellular organization which have previously been inaccessible to conventional fluorescence microscopy. In addition to detailing the methods for sample preparation and data acquisition, we here describe the optical setup for FPALM. One additional consideration for researchers wishing to do super-resolution microscopy is cost: in-house setups are significantly cheaper than most commercially available imaging machines. Limitations of this technique include the need for optimizing the labeling of molecules of interest within cell samples, and the need for post-processing software to visualize results. We here describe the use of PAFP and PSFP expression to image two protein species in fixed cells. Extension of the technique to living cells is also described.

We demonstrate the use of fluorescence photo activation localization microscopy (FPALM) to simultaneously image multiple types of fluorescently labeled molecules&#160;within cells. The techniques described yield the localization of thousands to hundreds of thousands of individual fluorescent labeled proteins, with a precision of tens of nanometers&#160;within single cells.

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled ...

생물학

Imaging Intermediate Filaments and Microtubules with 2-dimensional Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy

The cytoskeleton, composed of actin microfilaments, microtubules, and intermediate filaments (IF), plays a key role in the control of cell shape, polarity, and motility. The organization of the actin and microtubule networks has been extensively studied but that of IFs is not yet fully characterized. IFs have an average diameter of 10 nm and form a network extending throughout the cell cytoplasm. They are physically associated with actin and microtubules through molecular motors and cytoskeletal linkers. This tight association is at the heart of the regulatory mechanisms that ensure the coordinated regulation of the three cytoskeletal networks required for most cell functions. It is therefore crucial to visualize IFs alone and also together with each of the other cytoskeletal networks. However, IF networks are extremely dense in most cell types, especially in glial cells, which makes its resolution very difficult to achieve with standard fluorescence microscopy (lateral resolution of ~250 nm). Direct STochastic Optical Reconstruction Microscopy (dSTORM) is a technique allowing a gain in lateral resolution of one order of magnitude. Here, we show that lateral dSTORM resolution is sufficient to resolve the dense organization of the IF networks and, in particular, of IF bundles surrounding microtubules. Such tight association is likely to participate in the coordinated regulation of these two networks and may, explain how vimentin IFs template and stabilize microtubule organization as well as could influence microtubule dependent vesicular trafficking. More generally, we show how the observation of two cytoskeletal components with dual-color dSTORM technique brings new insight into their mutual interaction.

The overall goal of this methodology is to give the optimal experimental conditions from sample preparation to image acquisition and reconstruction in order to perform 2D dual color dSTORM images of microtubules and intermediate filaments in fixed cells

중간 필 라 멘 트와 2 차원 직접 확률적 광학 재건 현미경으로 Microtubules 이미징

The cytoskeleton, composed of actin microfilaments, microtubules, and intermediate filaments (IF), plays a key role in the control of cell shape, ...

Multi-color Localization Microscopy of Single Membrane Proteins in Organelles of Live Mammalian Cells

Knowledge about the localization of proteins in cellular subcompartments is crucial to understand their specific function. Here, we present a super-resolution technique that allows for the determination of the microcompartments that are accessible for proteins by generating localization and tracking maps of these proteins. Moreover, by multi-color localization microscopy, the localization and tracking profiles of proteins in different subcompartments are obtained simultaneously. The technique is specific for live cells and is based on the repetitive imaging of single mobile membrane proteins. Proteins of interest are genetically fused with specific, so-called self-labeling tags. These tags are enzymes that react with a substrate in a covalent manner. Conjugated to these substrates are fluorescent dyes. Reaction of the enzyme-tagged proteins with the fluorescence labeled substrates results in labeled proteins. Here, Tetramethylrhodamine (TMR) and Silicon Rhodamine (SiR) are used as fluorescent dyes attached to the substrates of the enzymes. By using substrate concentrations in the pM to nM range, sub-stoichiometric labeling is achieved that results in distinct signals. These signals are localized with ~15&#8211;27 nm precision. The technique allows for multi-color imaging of single molecules, whereby the number of colors is limited by the available membrane-permeable dyes and the repertoire of self-labeling enzymes. We show the feasibility of the technique by determining the localization of the quality control enzyme (Pten)-induced kinase 1 (PINK1) in different mitochondrial compartments during its processing in relation to other membrane proteins. The test for true physical interactions between differently labeled single proteins by single molecule FRET or co-tracking is restricted, though, because the low labeling degrees decrease the probability for having two adjacent proteins labeled at the same time. While the technique is strong for imaging proteins in membrane compartments, in most cases it is not appropriate to determine the localization of highly mobile soluble proteins.

Here, we present a protocol for multi-color localization of single membrane proteins in organelles of live cells. To attach fluorophores, self-labeling proteins are used. Proteins, located in different membranes compartments of the same organelle, can be localized with a precision of ~18 nm.