Name: selective harvesting of marginating-hepatic leukocytes
Uploaded: 2016-07-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
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The authors and this work were supported by NIH/NCI grant # R01CA172138 (to SBE).

윤리 정책 : 동물 과목을 포함하는 절차는 텔 아비브 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다. 1. 쥐 프로토콜 <ol><li> 준비 <ol><li> PBS 헤파린 (30 유닛 / ml) 용액을 준비 인산 1 ㎖ 당 방부제없는 헤파린 30 단위 첨가하여 실온 (RT)에서 사용되는 식염수 (PBS) 1X 버퍼 용액. 동물 당 35 ml의를 계산합니다. </li><li> 기포를 제거하는 연동 펌프 라인과 나비 바늘을 통해 헤파린 PBS를 통과한다. </li><li> (중력 (건조) 설정에 적어도 30 분 동안 121 ° C에서 오토 클레이브) 가위 2 쌍, 무딘 칼날 집게, 2 지혈제 및 치아 조직 포셉 - 수술 도구를 소독. </li></ol></li><li> MH-백혈구의 간 및 컬렉션의 관류 <ol><li> 8 %의 이소 플루 란의 과다 복용으로 동물을 안락사. 예방 조치로서, 이소 플루 란을 포함하는 50 ML 튜브를 배치그 흉강을 열 때까지 쥐의 머리 주위 -soaked 패드. </li><li> 호흡 중단시 즉시 간 및 심폐 복잡한을 노출 복막와 가슴 충치를 엽니 다. 이 과정을 통해 출혈하지 마십시오. <ol><li> 특히, 상부 가슴 캐비티 수준으로 그들을 통해 절단 리브를 향해 대각선 양쪽에 손상을 내장하지 않고 낮은 복부 정중선 점에서 절개, 진행을 시작합니다. </li></ol></li><li> 약 분 내 (~ 250 그램 동물에서 6 ml)에 가능한 한 많은 혈액을 수집 주사기로 우심실에서. </li><li> 관류의 수집을 가능하게하는, 마음에 가능한 한 가까운 지혈과 꼬리 대정맥을 클램프. </li><li> 포털 정맥을 노출, 실험자의 오른쪽에있는 동물 외부 장과 장소를 잡아 당깁니다. </li><li> 가능한 꼬리 같이 문맥으로 연동 펌프 (25)에 연결된 G IV 카테터, 삽입하지만 비장 정맥에 주동이. </li><li> 지혈에 꼬리 대정맥에 5 ML의 주사기에 연결된 25 G 나비 바늘을,,, 삽입합니다. </li><li> 약 3 ml / 분의 속도로 연동 펌프의 전원을 켜고 조심스럽게 주사기로 혈액으로 오염 관류의 첫 번째 ml의를 수집합니다. 관류 색이 교대로 (약 3 ~ 5 ㎖) 붉은 창백한 때까지 계속합니다. 간장의 색이 밝은 갈색으로 변화하고 있음을 알 수 있습니다. </li><li> 연동 펌프를 정지하지 않고, 20 ml의 수확 주사기와 5 ml의 수확 주사기 교체 관류 고속화 (최대 4 ml / 분)을 이용 간 관류 적어도 20ml를 수집. 연속적으로 포집 주사기 내로 관류 흐름을 모니터링하고, (대정맥 벽 붕괴 통해 바늘을 방해 할 수있는) 너무 강한 진공을 피한다. </li><li> 간장의 색이 밝은 갈색으로 변합니다 때 관류을 종료합니다. </li></ol></li><li> 백혈구 추출 <oL&gt; <li> 24 400 XG에서 10 분 동안 관류 액을 원심 분리기 기음. </li><li> 뜨는을 기음 </li><li> 10 분 동안 400 XG에 10 ml의 PBS, 원심 분리기를 추가하고 뜨는을 대기음. 학습 목표에 기초하여, 그대로 조제를 사용하여, 또는 추가적인 정제를 (예를 들면, 밀도 구배 분리)을 수행. <ol><li> 구체적으로, 층 50 CC 폴리 프로필렌 원심 분리 튜브에서 밀도 구배 분리 질량 4㎖를 통해 관류 액 4 mL로. 휴식을 끄고 30 분 동안 754 XG, 실온에서 튜브를 스핀. </li><li> 수동 피펫으로 밀도 구배 분리 - 상층 액 계면에서의 단핵 층을 구하는 PBS로 세척하고, 5 ML 튜브에 삽입합니다. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. 마우스 프로토콜 <ol><li> 준비 <ol><li> 인산 1 ㎖ 당 방부제없는 헤파린 30 단위 첨가하여 실온 (RT)에서 사용되는 헤파린 PBS (30 단위 / ml) 용액을 준비 식염수 (PBS) 1X solutio 완충엔. 동물 당 20 ㎖를 계산합니다. </li><li> 기포를 제거하는 연동 펌프 라인과 나비 바늘을 통해 헤파린 PBS를 통과한다. </li><li> (중력 (건조) 설정에 적어도 30 분 동안 121 ° C에서 오토 클레이브) 가위 2 쌍, 무딘 칼날 집게, 2 지혈제 및 치아 조직 포셉 - 수술 도구를 소독. </li></ol></li><li> MH-백혈구의 간 및 컬렉션의 관류 <ol><li> 8 %의 이소 플루 란의 과다 복용으로 동물을 안락사. 예방 조치로서, 그 흉강을 열 때까지 마우스의 머리 주위에 이소 플루 란 젖은 패드를 포함하는 15 ML 튜브를 놓습니다. </li><li> 침대에 마우스의 사지를 고정합니다. </li><li> 그대로 다이아 프램의 하부 측면을 유지, 간 및 호흡 중단시 즉시 심폐 복잡한을 노출 복막와 가슴 충치를 엽니 다 (A 배수 흉강 풀을 만들 수 있습니다). 이 과정을 통해 출혈하지 마십시오. <ol><li> 특히, 아래에 절개를 시작합니다가슴 위쪽 캐비티 수준으로 그들을 통해 절단 대각선으로 갈비뼈를 향해 양쪽에 복부 정중선 손상 내부 장기가없는 점, 진행,. </li></ol></li><li> 간문맥 노출되도록, 실험자의 오른쪽 바깥 동물 장내 장소를 철수. </li><li> 지라 정맥에 포털 정맥 주동이에 연동 펌프에 연결된 30g 바늘을 삽입합니다. </li><li> 흉강에서 관류의 배수 및 수집 할 수 있도록 다이어프램 위의 하대 정맥을 잘라. </li><li> 약 3 ml / 분의 속도로 연동 펌프의 전원을 켜고 조심스럽게 흉강 풀에서 혈액으로 오염 관류의 제 3 ㎖를 수집합니다. </li><li> 이 관류를 폐기하십시오. 필요한 경우 생리 식염수를 사용하여 다시 같은 세척을 반복 한 경우에만 다음 간 관류를 수집하기 시작합니다. </li><li> 다시 개시까지 ㎖ / 분 (4)의 속도로 관류 및 사용 흉강에서 관류 액 10 ㎖를 수집주사기에 연결된 나비입니다. </li><li> 간장의 색이 밝은 갈색으로 변합니다 때 관류을 종료합니다. </li></ol></li><li> 백혈구 추출 <ol><li> 원심 분리기 (400)의 X g에서 10 분 동안 관류. </li><li> 뜨는을 대기음. </li><li> 10 분 동안 400 XG에 10 ml의 PBS, 원심 분리기를 추가하고 학습 목표를 바탕으로 뜨는을 대기음, 그대로 준비를 사용하거나 추가 정제를 (예를 들어, 밀도 구배 분리)를 실시하고 있습니다. <ol><li> 구체적으로, 층 50 CC 폴리 프로필렌 원심 분리 튜브에서 밀도 구배 분리 질량 4㎖를 통해 관류마다 4 용액. 휴식을 끄고 30 분 동안 754 XG, 실온에서 튜브를 스핀. </li><li> 수동 피펫으로 밀도 구배 분리 - 상층 액 계면에서의 단핵 층을 구하는 PBS로 세척하고, 5 ML 튜브에 삽입합니다. </li></ol></li></ol></li></ol>

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저자는 공개 아무것도 없어.

본 명세서 간 관류 방법은 선택적 수확 할 수 있으며 간 백혈구 marginating의 고유 인구 공부. 또한 피트 셀 3이라고 간 NK 세포, 간장 정현파에있는 독특한 NK 세포군을 구성한다. 그들은 쥐, 마우스 (17)과 인간 (18, 19)에서 발견된다. 절연 주변 NK 세포에 비해 피트 셀 작은 세포질 과립 (20)의 더 많은 수, 및 LFA-1 (12) 표면 항원의 이상 발현이 나타났다, YAC-1 및 CC531s 표적 세포 라인 (20)에 대하여 높은 세포 독성을 증명 . 또한, 절연 혈액 NK 세포와 달리 세포 덩이 NK 내성 P815 세포를 용균 할 수있다. 랫트와 유사 구덩이 세포, 인간 간 NK 세포는 NK 세포 18,19 순환 비교하여 NK-K562 민감한 표적 세포에 대해 높은 독성을 가지고, 강한 NK를 Lyse 표적 세포 18에 도시 하였다. Overal간 구체적 고유 다양한 질병에 관여하는 바와 같이 L이 면역이 장기 내에 조사되어야하고, MH 구획의 실질 세포, 쿠퍼 및 성상 세포와 구별되어야한다. 소개에 자세히 설명 된 바와 같이, 우리의 관류 방법은 선택적으로 수확 MH 백혈구의 일반적인 기계적 연마 / 생물학적 분해 과정을 통해 유리하다, 더 나은의 무결성, 활동 및 MH 백혈구의 생리적 환경을 보존. 사실, NK 세포 독성을 평가, 우리의 접근 방식을 통해 수확 MH 백혈구는 NK 세포의 비슷한 숫자에도 불구하고, 기계적 연마 과정을 통해 수확 백혈구보다 현저하게 높은 NK 세포 독성을 나타내었다. 간장 관류 기술은 동물 연구 만 동작 가능하다. 생물학적 의문을 제기 할 수있다 면역 구획 사이 그러나이 방법에서 얻은 특정 통찰력이 표시에 대해 언급 차이알 단독 백혈구 순환에 따라 관찰의 임상 적 의의. 다른 면역 구획에 면역 지수를 측정 동물 연구는 순환의 각 면역 지수가 반영 또는 MH 실에서의 수준과 상관되는 정도를 제안 할 수 있습니다. 흥미있는 관측은 관류 MH-NK 세포 만 동물 (21)의 연역적 면역 자극 다음 표적 세포에 대하여 현저한 세포 독성 활성을 입증한다 마우스에서이 기술을 채용을 말한다. 기술의 몇 가지 중요한 측면을 표시해야합니다. 모두 쥐와 생쥐에서 흉강은 호흡의 완전한 정지 다음 널리 즉시 열, 최소한의 출혈되어야한다. 쥐에서, 심장 혈액의 최대 양이 관류 전에 철회하는 것이 좋습니다. 그것은 문맥에서 혈압을 감소하고 쥐에서, 심장으로부터 채혈을 권장되지이 과정을 계속 통해 어렵게 바늘을 삽입 할 수 있습니다. 하나의 바늘이 안정된 위치에 대한 간으로 문맥의 입구에 삽입으로부터의 거리가 충분하다는 것을 보장하기를 원하는 모든 허용으로이 니들 삽입, 비장의 정맥에 인접하지만 입쪽 이루어져야 로브는 관류하세요. 표면에 평행하므로 혈관 벽 파열의 위험이 최소화되는 동안 바늘은 문맥에 삽입되어야한다. 관류 수집 용 꼬리 대정맥에 바늘을 삽입하는 동안 래트에서, 관류의 전위 누출을 피하기 위해 가능한 한 좁은 입구 포인트를 유지하는 것이 중요하다. 마우스에서, 불필요한 혈액 오염을 방지하기 위해, 다른 혈관이나 폐 파열없이 흉강 내부 대정맥 잘라 조숙하게하는 것이 중요하다. 연동 펌프를 사용하는 주요 장점은 내부 및 사이 관류 속도 위에 안정적이고 통제동물. 문맥의 파열을 방지하기 위해, 전체 과정 동안에 낮은 유속을 유지하는 것이 중요하다. 간 관류 첫 밀리리터가 혈액으로 오염 된 바와 같이, 그들이 폐기되어야한다. 동물 사이의 표준화를 달성하기 위해, MH의 관류 수집을 시작하는 기준은 밝은 갈색 (아닌 특정 볼륨의 컬렉션)에 어두운 갈색의 색상 전환을 기반으로합니다. 절차를 수행 함께 여러 오작동이 발생할 수 있지만, 대부분은 되돌릴 수 있습니다. PBS를이 간으로 수혈되는을 통해 바늘이 밖으로 미끄러 져의 경우는 약간 더 주동이의 위치에 바늘을 재 삽입 (더 나은 가시성을 달성하기 위해), 연동 펌프를 중지 창자의 주변 지역을 흡수하는 것이 좋습니다, 펌프를 다시 시작합니다. 본원에 기재된 간 관류 방법은 비교적 간단한 공정에 MH 백혈구 집단의 선택을 수확 할 수있다. 주어진이 인구는 고유 한 특징이 다른 면역 구획에서 백혈구와 비교하고, 유기체의 생물학적 및 임상 적 의의를 가질 수있다 표시됩니다 다른 구획에서 백혈구가 MH 인구의 프로파일을 반영하지 않을 수 있으므로 가능한 경우, 우리는이 방법의 사용을 권장합니다. 이 기술은 인간 행할 아니므로 또한, 우리는 또한 특히 간 관련 프로세스 및 질병을 공부 MH 특성과 상관 관계 특정 순환 바이오 마커를 명확히하기 위해 동물을 사용하는 것이 좋습니다.

간 사인 곡선은 유기체에 중요한 다양한 면역 활동의 많은 백혈구 아형이 포함되어 있습니다. 예를 들어,도 덩이 세포로 알려진 간을 marginating (MH), 자연 살해 (NK) 세포, 특징 형태학 큰 과립 림프구 (LG 생명 과학)와 기능적으로 혈액 - 확립에 대하여 간 저항을 가능 자연 세포 독성 용량 백혈구뿐만 매개 종양 전이. 본 명세서에있어서의 목표는 중요한 독특한 세포 집단 (면역 함)을 연구하기 위해 MH 백혈구 선택적 수확을 가능하게하고, 이러한 특정 세포에 대한 각종 조작의 영향 (예 : 면역 활성)을 규명하는 것이다. 현상 원발 종양을 제거하는 면역 장애에도 불구하고, 암 환자 및 동물 모델에서의 증거는 면역계가 종양 세포, 미세 전이 및 throu 잔여 질병을 순환 제어 할 것을 지시GH 세포 매개 면역 (CMI). 그러나, 생체 내 기능과 인간에서 시험 관내 연구에서 가장자가 종양 세포는 순환 또는 비장 백혈구 1,2- 의한 세포 독성에 내성이 있음을 입증 동물, 이들 사이에 명백한 불일치가있다. 이러한 불일치는 별개 백혈구 모집단, 즉 marginating - 간 (정현파) 백혈구 활성화 NK 세포, 즉 세포 덩이 3들의 모집단의 생체 내 존재에 적어도 부분적으로 기인 할 수있다. 사실, 우리의 실험실에서 출판되지 않은 데이터는 F344 쥐에서 동계 종양 세포 순환 및 비장 백혈구에 내성이 발견되었다 (MADB106가), MH-NK 세포 (4)에 의해 용해 된 것으로 나타났다. 따라서, 순환 백혈구에 의심 &quot;NK 내성&quot;이다 종양 세포 MH-NK 세포에 의해 제어 될 수있다. 주목할만한, 마우스에서 MH-NK의 개선 활동은 면역 생체 내에서 다음 분명하다(폴리 I의 사용을 통해 예 : C 또는의 CpG-C) 자극 (5). 간 특정 NK 세포 (NK-MH)은 내피 세포 및 쿠퍼 세포 부착, 정현파 루멘 내부에 위치하고있다. MH-NK 세포는 단독으로 생리 활성 물질로서 7,8- 리소좀 효소 및 퍼포 granzymes와 같은 산성 포스파타제를 포함하는 조밀 한 구형 입자 및 막대 코어 드 소체 (6)을 특징으로한다. NK 세포를 순환과 비교하여, MH-NK 세포 과립 및 소포 9-11 높은 수 및 크기를 나타낸다. NK 세포 순환에 비해 염증 조건 MH-NK 세포, LFA-1 (12)의 더 높은 발현을 나타내는 것으로 나타났다. 이러한 향상된 발현 MH-NK 세포는 NK 세포 13,14 순환 비해 특정 종양 세포에 대해 세포 독성 더있는 메커니즘을 구성 할 수도있다. nterestingly, 인터루킨 (IL) -2와 시험 관내 인큐베이션에 따라, MH-NK 세포가 확대되고,자신의 번호와 과립의 크기는 프로 Fi를 제작 림 포카 인 활성화 킬러의 (LAK) 세포 (15)와 일치 모두 증가. 액티브 MH 백혈구 독점적 그라인딩과 조직의 생물학적 분해에 기초하는 표준 간 백혈구 수확하는 방법을 통해 얻어 질 수 없다. 본원에 기술 된 우리 관류 방법은 표준 방법에 비해 두 가지 장점을 갖는다. 우선, 관류 방법은 선택적으로 다른 간 구획에서 다른 백혈구에 의한 오염을 방지 MH 백혈구를 수확. 조직 처리 손상 세포 것을 접근하거나 형태를 변경하고, 조직 손상으로 인해 현저 면역 조절 다양한 인자의 방출을 유도 달리 둘째, 더 관류 기술, 무결성, 활동, 및 MH 백혈구의 생리적 환경 보존 활동. 간은 암전 A에 대한 중요한 타겟 기관이다차 다양한 감염 16. MH 전지 고유 특성을 나타내는 바와 같이 이들 병변에 대해 다양한 조건에서이 특정 인구를 연구하는 것이 중요하다. 예를 들어, 다양한하는 BRM에 의한 전신 면역 활성화를주의하는 가치가있다 (예를 들면 폴리 I : C 또는의 CpG-C)가 백혈구 5 순환보다 MH-백혈구 더 활성화하는 것으로 나타났다.

<table><tbody><tr><td>Autoclud Peristaltic pump</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Butterfly needle</td><td>OMG</td><td></td><td>26 G</td></tr><tr><td>Butterfly needle</td><td>OMG</td><td></td><td>21 G*3/4&quot;</td></tr><tr><td>Syringe</td><td>Pic solution</td><td></td><td>1 ml</td></tr><tr><td>Syringe</td><td>Pic solution</td><td></td><td>2.5 ml</td></tr><tr><td>Syringe</td><td>Pic solution</td><td></td><td>5 ml</td></tr><tr><td>Syringe</td><td>Pic solution</td><td></td><td>10 ml</td></tr><tr><td>Syringe</td><td>Pic solution</td><td></td><td>25 ml</td></tr><tr><td>Blunted-edged forceps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scissors</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>hemostat</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tissue forceps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>22 W Fluorescent Daylight Magnifier Lamp</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

selective harvesting of marginating-hepatic leukocytes

Marginating-hepatic (MH) leukocytes (leukocytes adhering to the sinusoids of the liver), were shown to exhibit unique composition and characteristics compared to leukocytes of other immune compartments. Specifically, evidence suggests a distinct pro- and anti-inflammatory profile of the MH-leukocyte population and higher cytotoxicity of liver-specific NK cells (namely, pit cells) compared to circulating or splenic immunocytes in both mice and rats. The method presented herein enables selective harvesting of MH leukocytes by forced perfusion of the liver in mice and rats. In contrast to other methods used to extract liver-leukocytes, including tissue grinding and biological degradation, this method exclusively yields leukocytes from the liver sinusoids, uncontaminated by cells from other liver compartments. In addition, the perfusion technique better preserves the integrity and the physiological milieu of MH leukocytes, sparing known physiological responses to tissue processing. As many circulating malignant cells and infected cells are detained while passing through the liver sinusoids, physically interacting with endothelial cells and resident leukocytes, the unique MH leukocyte population is strategically located to interact, identify, and react towards aberrant circulating cells. Thus, selective harvesting of MH-leukocytes and their study under various conditions may advance our understanding of the biological and clinical significance of MH leukocytes, specifically with respect to circulating aberrant cells and liver-related diseases and cancer metastases.

F344 래트에서 우리는 간 조직의 기계적 분쇄 다음, 전체 간 세포 집단의 세포 독성 (강제 간 관류 간 정현파 수집) MH-NK 세포의 세포 독성을 비교 및​​ 순환 백혈구의 세포 독성에 관한 것이다. 전체 세포 제제는 면역 분석법의 루틴으로 적어도 3 회 세척하고, 목표 세포주로서, 우리는 동종 YAC-1 또는 동계 MADB106 표적 세포주를 사용 하였다. 도 1에 나타낸 바와 같이 4 -, MH-NK 세포는 전체 간세포 집단 (도 1) 모두를 MADB106 및 YAC-1을 표적 세포주 대 (~ 80 % 각각 100 %까지) 심각한 독성을 나타내 반면 순환 백혈구 (도 2 및 3)의 깊이보다 낮은 세포 독성 수준과 동계 MADB106 목표 세포주에 대해 거의 사멸을 표시. 같은 relati기계적으로 처리 간은 또한 세척 및 밀도 구배 분리 (그림 4), 문학의 일반적인 수준을 시행 할 때 세포 독성의 낮은 수준은 분명했다했습니다. 따라서, MH-NK 세포 F344 쥐의 세포 독성 고유하게 높은 수준을 나타낸다. FACS 분석을 실시하고 다음 세포 개체군의 구성에 깊은 차이가 밝혀졌다 : 단핵 세포 (CD161dim), NK 세포 (CD161 밝은), T 세포 (CD3), B 세포 (CD45)를하고, NKT (CD161 및 CD3) 세포. 성숙 프로파일 (CD11b를 / CD27)의 주요 차이는 (그림 5) 다른 구획 사이에 분명했다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53918/53918fig1.jpg" /> 그림 1 :. MH-구획 throu에서 수확 전체 간 세포 인구의 세포 독성 (YAC-1 대상 세포주) MH-NK 세포 (에 MH-NK 세포의 세포 독성의 비교,간에서의 기계적 처리에 의해 수확 된 전체 간암 세포 집단은 최소 수준 (p &lt;0.05)를 표시하면서 YAC-1을 목표 세포주에 대해 심각한 상해 활성을 나타내었다)를 본원에 기재된 방법을 GH. X 축은 이펙터 대 표적 세포의 비율을 나타낸다. 데이터는 SEM ± 평균으로 표시됩니다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53918/53918fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53918/53918fig2.jpg" /> 그림 2 : 백혈구 (YAC-1 대상 세포주를) 순환의 세포 독성에 MH-NK 세포의 세포 독성의 비교. 순환 백혈구 세포 독성의 최소 레벨을 표시하는 동안 (본원에 기재된 방법을 통해 MH 구획에서 수확) MH-NK 세포는 YAC-1을 목표 세포주에 대한 세포 독성을 나타내 깊은(P &lt;0.05). X 축은 이펙터 대 표적 세포의 비율을 나타낸다. 데이터는 SEM ± 평균으로 표시됩니다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53918/53918fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/53918/53918fig3.jpg" /> 도 3 :. (본원에 기재된 방법을 통해 MH 구획에서 수확) 백혈구 (MADB106 표적 세포 라인) MH-NK 세포 순환 세포 독성 MH-NK 세포의 세포 독성을 비교는 동계 MADB106 대해 심각한 독성을 나타내 순환 백혈구 세포 독성 (p &lt;0.05)의 최소 레벨을 표시하면서 세포주를 대상. X 축은 이펙터 대 표적 세포의 비율을 나타낸다. 데이터는 SEM ± 평균으로 표시됩니다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53918/53918fig3large.jpg" target="_blank">여기를 클릭하십시오 t</a>오이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/53918/53918fig4.jpg" /> 그림 4 :. MH-에서 수확 밀도 구배 분리 (YAC-1 대상 셀 라인) MH-NK 세포 (를 통해 세척 및 농축 된 전체 간 림프구의 세포 독성에 MH-NK 세포의 세포 독성의 비교, 세정) 밀도 구배 분리를 통해 농축 하였다 기계 가공, 다음 전체 간 림프구 (까지 (세포 독성이 현저하게 낮은 수준을 표시하는 동안 본 명세서에 설명 된 방법을 통해 구획)는 YAC-1을 목표 세포주에 대해 심각한 독성을 나타내 30 %) (p &lt;0.05) 문헌에서 전형적인 그. X 축은 이펙터 대 표적 세포의 비율을 나타낸다. 데이터는 SEM ± 평균으로 표시됩니다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53918/53918fig4large.jpg" target="_blank">하시기 바랍니다</a>이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/53918/53918fig5.jpg" /> 도 5 :. 단핵구 (CD161dim), NK 세포 : 순환 단핵 상기 MH-단핵구, 전체 간 단핵 세포로부터 단핵구 서브 세트와 NK 세포 서브 세트의 비교는 FACS 분석은 다음 세포 개체군의 조성 분명한 차이를 보여준다 (CD161 밝은), T 세포 (CD3), B 세포 (CD45), 및 NKT (CD161 및 CD3) 세포뿐만 아니라 다른 구획 사이의 성숙 프로파일 (CD11b를 / CD27)의 차이. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53918/53918fig5large.jpg" target="_blank">더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오 이 그림의.</a>

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Selective Harvesting of Marginating-hepatic Leukocytes

Marginating-hepatic leukocytes exhibit unique characteristics and distinct immunological functions compared to other leukocyte populations. Here we describe a method for selective harvesting of this specific hepatic cell population, through forced perfusion of the liver of rats or mice. Marginating-hepatic leukocytes seem critical in determining susceptibility to hepatic-related diseases and metastases.

Marginating-간 백혈구의 선택적 수확

Marginating-hepatic (MH) leukocytes (leukocytes adhering to the sinusoids of the liver), were shown to exhibit unique composition and characteristics ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

5.7K 조회수.  Tel-Aviv University. Marginating-hepatic leukocytes exhibit unique characteristics and distinct immunological functions compared to other leukocyte populations. Here we describe a method for selective harvesting of this specific hepatic cell population, through forced perfusion of the liver of rats or mice. Marginating-hepatic leukocytes seem critical in determining susceptibility to hepatic-related diseases and metastases.

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A Simple and Efficient Method to Isolate Macrophages from Mixed Primary Cultures of Adult Liver Cells

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although the isolation methods of liver macrophages have been well-described4-6, most of these methods require sophisticated equipment, such as a centrifugal elutriator and technical skills. Here, we provide a novel method to obtain liver macrophages in sufficient number and purity from mixed primary cultures of adult rat liver cells, as schematically illustrated in Figure 1.
After dissociation of the liver cells by two-step perfusion method7,8,a fraction mostly composed of parenchymal hepatocytes is prepared and seeded into T75 tissue culture flasks with culture medium composed of DMEM and 10% FCS.Parenchymal hepatocytes lose the epithelial cell morphology within a few days in culture, degenerate or transform into fibroblast-like cells (Figure 2). As the culture proceeds, around day 6, phase contrast-bright, round macrophage-like cells start to proliferate on the fibroblastic cell sheet (Figure 2). The growth of the macrophage-like cells continue and reach to maximum levels around day 12, covering the cell sheet on the flask surface. By shaking of the culture flasks, macrophages are readily suspended into the culture medium. Subsequent transfer and short incubation in plastic dishes result in selective adhesion of macrophages(Figure 3), where as other contaminating cells remain suspended. After several rinses with PBS, attached macrophages are harvested. More than 106 cells can be harvested repeatedly from the same T75 tissue culture flask at two to three day intervals for more than two weeks(Figure 3).The purities of the isolated macrophages were 95 to 99%, as evaluated by flow cytometry or immunocytochemistry with rat macrophage-specific antibodies (Figure 4).The isolated cells show active phagocytosis of polystylene beads (Figure 5), proliferative response to recombinant GM-CSF, secretion of inflammatory/anti-inflammatory cytokines upon stimulation with LPS, and formation of multinucleated giant cells9.
In conclusion, we provide a simple and efficient method to obtain liver macrophages in sufficient number and purity without complex equipment and skills.This method might be applicable to other mammalian species.

A novel method to obtain macrophages from primary culture of rat liver cells is described. This method utilizes the proliferation of macrophages in the culture, followed by shaking of culture flasks and purification by selective attachment to plastic dishes. This technique efficiently provides liver macrophages without complex equipment and skills.

성인 간세포의 혼합 차 문화에서 Macrophages을 분리하는 간단하고 효율적인 방법

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although ...

연구

면역학 및 감염병학

Isolation and Enrichment of Liver Progenitor Subsets Identified by a Novel Surface Marker Combination

During chronic liver injuries, progenitor cells expand in a process called ductular reaction, which also entails the appearance of inflammatory cellular infiltrate and epithelial cell activation. The progenitor cell population during such inflammatory reactions has mostly been investigated using single surface markers, either by histological analysis or by flow cytometry-based techniques. However, novel surface markers identified various functionally distinct subsets within the liver progenitor/stem cell compartment. The method presented here describes the isolation and detailed flow cytometry analysis of progenitor subsets using novel surface marker combinations. Moreover, it demonstrates how the various progenitor cell subsets can be isolated with high purity using automated magnetic and FACS sorting-based methods. Importantly, novel and simplified enzymatic dissociation of the liver allows for the isolation of these rare cell populations with a high viability that is superior in comparison to other existing methods. This is especially relevant for further studying progenitor cells in vitro or for isolating high-quality RNA to analyze the gene expression profile.

Liver injuries are accompanied by progenitor cell expansion that represents a heterogeneous cell population. Novel classification of this cellular compartment allows for the distinguishing of multiple subsets. The method described here illustrates the flow cytometry analysis and high purity isolation of various subsets that can be used for further assays.

분리 및 소설 표면 마커 조합에 의해 확인 된 간 전구 부분 집합의 농축

During chronic liver injuries, progenitor cells expand in a process called ductular reaction, which also entails the appearance of inflammatory cellular ...

발생학

Selective Harvesting of Marginating-pulmonary Leukocytes

Marginating-pulmonary (MP) leukocytes are leukocytes that adhere to the inner endothelium of the lung capillaries. MP-leukocytes were shown to exhibit unique composition and characteristics compared to leukocytes of other immune compartments. Evidence suggests higher cytotoxicity of natural killer cells, and a distinct pro- and anti-inflammatory profile of the MP-leukocyte population compared to circulating or splenic immunocytes. The method presented herein enables selective harvesting of MP-leukocytes by forced perfusion of the lungs in either mice or rats. In contrast to other methods used to extract lung-leukocytes, such as tissue grinding and biological degradation, this method exclusively yields leukocytes from the lung capillaries, uncontaminated with parenchymal, interstitial, and broncho-alveolar cells. In addition, the perfusion technique better preserves the integrity and the physiological milieu of MP-leukocytes, without inducing physiological responses due to tissue processing. This unique MP leukocyte population is strategically located to identify and react towards abnormal circulating cells, as all circulating malignant cells and infected cells are detained while passing through the lung capillaries, physically interacting with endothelial cells and resident leukocytes,. Thus, selective harvesting of MP-leukocytes and their study under various conditions may advance our understanding of their biological and clinical significance, specifically with respect to controlling circulating aberrant cells and lung-related diseases.

Marginating-pulmonary leukocytes exhibit unique characteristics and distinct immunological functions compared to other leukocyte populations. Here we describe selective harvesting of this subpopulation of pulmonary leukocytes, by forced perfusion of the lungs in rats and mice. Marginating-pulmonary leukocytes seem critical in determining susceptibility to blood-borne and lung-related diseases.

Marginating - 폐 백혈구의 선택적 수확

Marginating-pulmonary (MP) leukocytes are leukocytes that adhere to the inner endothelium of the lung capillaries. MP-leukocytes were shown to exhibit ...

Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the lymph nodes where cellular debris and antigens can be surveyed. We are very interested in understanding how the lymphatic vasculature might be involved in inflammation and immune cell function within the liver. However, very little has been published establishing digestion protocols for the isolation of lymphatic endothelial cells (LECs) from the liver or specific markers that can be used to evaluate liver LECs on a per cell basis. Therefore, we optimized a method for the digestion and staining of the liver in order to evaluate the LEC population in the liver. We are confident that the method outlined here will be useful for the identification and isolation of LECs from the liver and will strengthen our understanding of how LECs respond to the liver microenvironment.

The goal of this protocol is to identify lymphatic endothelial cell populations within the liver using described markers. We utilize collagenase IV and DNase and a gentle mincing of tissue, combined with flow cytometry, to identify a distinct population of lymphatic endothelial cells.

림프 내 피 세포의 흐름 Cytometric 분석 Murine 간 소화

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the ...

Protocol for Isolation of Primary Human Hepatocytes and Corresponding Major Populations of Non-parenchymal Liver Cells

Beside parenchymal hepatocytes, the liver consists of non-parenchymal cells (NPC) namely Kupffer cells (KC), liver endothelial cells (LEC) and hepatic Stellate cells (HSC). Two-dimensional (2D) culture of primary human hepatocyte (PHH) is still considered as the &#34;gold standard&#34; for in vitro testing of drug metabolism and hepatotoxicity. It is well-known that the 2D monoculture of PHH suffers from dedifferentiation and loss of function. Recently it was shown that hepatic NPC play a central role in liver (patho-) physiology and the maintenance of PHH functions. Current research focuses on the reconstruction of in vivo tissue architecture by 3D- and co-culture models to overcome the limitations of 2D monocultures. Previously we published a method to isolate human liver cells and investigated the suitability of these cells for their use in cell cultures in Experimental Biology and Medicine1. Based on the broad interest in this technique the aim of this article was to provide a more detailed protocol for the liver cell isolation process including a video, which will allow an easy reproduction of this technique.
Human liver cells were isolated from human liver tissue samples of surgical interventions by a two-step EGTA/collagenase P perfusion technique. PHH were separated from the NPC by an initial centrifugation at 50 x g. Density gradient centrifugation steps were used for removal of dead cells. Individual liver cell populations were isolated from the enriched NPC fraction using specific cell properties and cell sorting procedures. Beside the PHH isolation we were able to separate KC, LEC and HSC for further cultivation.
Taken together, the presented protocol allows the isolation of PHH and NPC in high quality and quantity from one donor tissue sample. The access to purified liver cell populations could allow the creation of in vivo like human liver models.

A technique to isolate human hepatocytes and non-parenchymal liver cells from the same donor is described. The different liver cell types build the basis for functional liver models and tissue engineering. This new method aims to isolate liver cells in a high yield and viability.

차 인간 간세포의 분리 및 비 실질 간 세포의 주요 집단 대응을위한 프로토콜

Beside parenchymal hepatocytes, the liver consists of non-parenchymal cells (NPC) namely Kupffer cells (KC), liver endothelial cells (LEC) and hepatic ...

생물학

Magnetic Cell Selection을 사용한 In Vitro LLEC 배양 확립

Harvest and Primary Culture of Leptomeningeal Lymphatic Endothelial Cells

Leptomeningeal lymphatic endothelial cells (LLECs) are a recently discovered intracranial cellular population with a unique distribution clearly distinct from peripheral lymphatic endothelial cells. Their cellular function and clinical implications remain largely unknown. Consequently, the availability of a supply of LLECs is essential for conducting functional research in vitro. However, there is currently no existing protocol for harvesting and culturing LLECs in vitro.
This study successfully harvested LLECs using a multi-step protocol, which included coating the flask with fibronectin, dissecting the leptomeninges with the assistance of a microscope, enzymatically digesting the leptomeninges to prepare a single-cell suspension, inducing the expansion of LLECs with vascular endothelial growth factor-C (VEGF-C), and selecting lymphatic vessel hyaluronic receptor-1 (LYVE-1) positive cells through magnetic-activated cell sorting (MACS). This process ultimately led to the establishment of a primary culture. The purity of the LLECs was confirmed through immunofluorescence staining and flow cytometric analysis, with a purity level exceeding 95%. This multi-step protocol has demonstrated reproducibility and feasibility, which will greatly facilitate the exploration of the cellular function and clinical implications of LLECs.

저자 스포트라이트: 연수막 림프 내피 세포의 세포 기능 및 잠재적 임상적 영향 밝혀내기 

Leptomeningeal lymphatic endothelial cells (LLECs), a recently identified intracranial cell type, have poorly understood functions. This study presents a reproducible protocol for harvesting LLECs from mice and establishing in vitro primary cultures. This protocol is designed to enable researchers to delve into the cellular functions and potential clinical implications of LLECs.

연수막 림프 내피 세포의 수확 및 1차 배양

Leptomeningeal lymphatic endothelial cells (LLECs) are a recently discovered intracranial cellular population with a unique distribution clearly distinct ...

신경과학

Isolation of Regenerating Hepatocytes after Partial Hepatectomy in Mice

Partial hepatectomy has been widely used to investigate liver regeneration in mice, but the isolation of high yields of viable hepatocytes for downstream single-cell applications is challenging. A marked accumulation of lipids within regenerating hepatocytes is observed during the first 2 days of normal liver regeneration in mice. This so-called transient regeneration-associated steatosis (TRAS) is temporary but partially overlaps the major proliferative phase. Density-gradient purification is the backbone of most existing protocols for the isolation of primary hepatocytes. As gradient purification relies on the density and size of cells, it separates non-steatotic from steatotic hepatocyte populations. Therefore, fatty hepatocytes often are lost, yielding non-representative hepatocyte fractions. 
The presented protocol describes an easy and reliable method for the in vivo isolation of regenerating hepatocytes regardless of their lipid content. Hepatocytes from male C57BL/6 mice are isolated 24-48 h after hepatectomy by a classic two-step collagenase perfusion approach. A standard peristaltic pump drives the warmed solutions via the catheterized inferior vena cava into the remnant, using a retrograde perfusion technique with outflow through the portal vein. Hepatocytes are dissociated by collagenase for their release from the Glisson's capsule. After washing and careful centrifugation, the hepatocytes can be used for any downstream analyses. In conclusion, this paper describes a straightforward and reproducible technique for the isolation of a representative population of regenerating hepatocytes after partial hepatectomy in mice. The method may also aid the study of fatty liver disease.

Lipid-laden hepatocytes are inherent to liver regeneration but are usually lost upon density-gradient centrifugation. Here, we present an optimized cell isolation protocol that retains steatotic hepatocytes, yielding representative populations of regenerating hepatocytes after partial hepatectomy in mice.

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의학

Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. LSECs have a distinct morphology characterized by the presence of fenestrae and the absence of basement membrane. LSECs play essential roles in many pathological disorders in the liver, including metabolic dysregulation, inflammation, fibrosis, angiogenesis, and carcinogenesis. However, little has been published about the isolation and characterization of the LSECs. Here, this protocol discusses the isolation of LSEC from both healthy and nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) mice. The protocol is based on collagenase perfusion of the mouse liver and magnetic beads positive selection of nonparenchymal cells to purify LSECs. This study characterizes LSECs using specific markers by flow cytometry and identifies the characteristic phenotypic features by scanning electron microscopy. LSECs isolated following this protocol can be used for functional studies, including adhesion and permeability assays, as well as downstream studies for a particular pathway of interest. In addition, these LSECs can be pooled or used individually, allowing multi-omics data generation including RNA-seq bulk or single cell, proteomic or phospho-proteomics, and Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing (ATAC-seq), among others. This protocol will be useful for investigators studying LSECs&#39; communication with other liver cells in health and disease and allow an in-depth understanding of the role of LSECs in the pathogenic mechanisms of acute and chronic liver injury.

Here we outline and demonstrate a protocol for primary mouse liver sinusoidal endothelial cell (LSEC) isolation. The protocol is based on liver collagenase perfusion, nonparenchymal cell purification by low-speed centrifugation, and CD146 magnetic bead selection. We also phenotype and characterize these isolated LSECs using flow cytometry and scanning electron microscopy.

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