우리는 Engelman 실험실에서 레트로 바이러스 통합 사이트 시퀀싱을위한 NGS 프로토콜을 확립하는 것이 중요했다 우리의 동료 스티븐 휴즈와 조언 헨리 레빈에 감사하고 있습니다. 이 작품은 AI039394과 (ANE에) AI052014 및 AI060354 (AIDS 연구를위한 하버드 대학 센터) 건강의 미국 국립 연구소에 의해 부여 지원되었다.

The authors have nothing to disclose.

게놈 분포 패턴의 매핑을 통한 바이러스 감염의 초기 단계에서 레트로 바이러스 통합 위치의 분석을위한 프로토콜은 기술되어있다. 이 프로토콜은 레트로 바이러스 감염 가능한 모든 세포 유형에 적용 가능하다. 또한, 상기 분석 파이프 라인은 6.4 × 10 -5의 MOI로 감염 개시의 게놈 DNA에 상당 희석액에서 고유 삽입 부위의 충분한 수를 복구 할 가능성 매우 민감하다. 세포의 작은 분획은 프로 바이러스 통합 항구 것이다 낮은 바이러스 부하를 포함 할 수있다 감염된 환자의 시료에 적용 할 때 감도는 프로토콜 특히 유용한다. 이 필드 36,38,41-43에서 이전의 방법론 논문과 일치,이 프로토콜의 생물 정보학 부분에 여러 단계 시퀀스 데이터의 큰 파일을 처리하기위한 사용자 정의 스크립트의 개발 혜택을 누릴 것입니다. BLAT (58)는 엄마는하지만이 프로토콜에 설명 된 유틸리티를 pping, 사용자가 적절한 대안이 될하기 위해 나비 넥타이 67 (http://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml) 찾을 수 있습니다. 대안 정보학 파이프 최근 몰 로니 뮤린 백혈병 바이러스 (MoMLV) 삽입 부위 (19)의 판정에 대해보고 하였다. 그것은 공개적으로 사용할 수 있으며, 그것은 원래의 고유 MoMLV 통합 사이트 수십만를 매핑하는 데 사용 된 점에서 매우 강력한 독립 소프트웨어로 개발한다는 점에서 그 파이프 라인에 유용합니다. 최근 아데노 관련 바이러스 및 TOL2을 포함하도록 확장되었다 그러나, 사용할 수있는 소프트웨어가 원래 구체적으로보고 MoMLV 데이터 세트를 다시 분석하기 위해 설계되었습니다, 그래서 실험 디자인 (도구의 기능을 대체하기 위해 파이프 라인을 사용자 정의 할 필요가있을 것입니다 재 프로그래밍과 AC / DS의 트랜스포존)는 68 벡터. 또한, 그 프로토콜은 사전 통합 사이트의 생성을 설명 .bed파일,하지만 게놈 주석을 관련의 할지도 사이트에 필요한 특정 단계를 배치하지 않았다. 독자는 여기에 설명 된 프로토콜을 사용하여 생성 된 NGS 서열을 분석하는 데 유용 현재 원고의 검토 중에 출시 된 &quot;벡터 통합 사이트 분석&quot;서버 69, 찾을 수 있습니다. 레트로 바이러스 통합 사이트 데이터 세트를 분석하기 위해 임의의 프로토콜을 사용할 경우 특정 시점이 강조되어야한다. 탠덤 여러 라이브러리를 제조 할 때 상당한 잠재력은 샘플의 교차 오염에 대한 필요성이 존재한다. 심지어 샘플 크로스 토크의 매우 작은 수준은 사용 불가능한 NGS 실행 렌더링의 수준에 결과를 모호하게 할 수 있습니다. 따라서 모든 습식 벤치 작품은 살균, 전용 층류 후드 또는 PCR 워크 스테이션에 완료되어야한다. 피펫 및 뉴 클레아없는 물과 같은 시약의 세트는 통합 사이트 증폭에 전적으로 헌신해야합니다. 각 라이브러리 제조 고유 링커의 사용 가능성을 제한 할 수있다또한 크로스 오버의 식별을 허용 교차 증폭과 원시 FASTA 파일의 각 도서관에서 읽습니다. 이 게놈 DNA를 단편화하는 제한 효소 소화에 비해 초음파를 사용의 장점과 단점을 고려하는 것이 중요합니다. 한편, 초음파 전단 포인트 비교적 랜덤 분포를 제공하지만, 후속 적으로 필요한 DNA 수리 및 A-테일링 단계 일관 제한 효소 생성 끈 단부 수행 결찰에 비해 링커 결찰 생성물의 수율을 감소시킨다. 한편, 제한 효소 절단은 변함없이 복구 된 데이터의 일부 바이어스를 소개 전단 점의 덜 출납 집단을 제공한다. 두 경우 모두 상류 LTR 서열을 폐기하는 제한 효소를 이용하는 것 (도 1) 게놈에서 해당 위치의 상류에 놓여 삽입 부위의 작은 부분의 손실을 초래한다. 광고 할 수 있습니다 될 수 있습니다 모든 데이터 바이어스라이브러리 준비 중에 프로토콜에서 효소 소화를 생략하고 시퀀싱 데이터에서 상류 LTR 시퀀스를 생성의 무리를 필터링하여 옷을 입고있다. 현재 프로토콜은 매우 민감하고, 가능한 모든 통합의 약 1/3 고유 통합 사이트 21,40 수백만을 발생시킬 수 있지만, 심지어 라이브러리 제제 (REF 최선으로 주어진 실험에서 증폭 될 것으로 예상 될 수있다. (70) 및 게시되지 않은 관찰). 낮은 바이러스 부하를 항구 낮은 MOI 감염 또는 환자의 샘플을 분석 할 때이 합병증을 일으킬 수 있습니다. 이 제한은 반복적으로 동일한 라이브러리 제조를 시퀀싱 및 / 또는 병렬로 동일 DNA 시료 유래의 여러 라이브러리 서열화에 의해 부분적으로 극복 될 수있다. 분석 감도 미래의 증가는 이에 따라 레트로 바이러스 통합 사이트 서열의 더욱 가속도 번역 애플리케이션에 매우 도움이 될 것입니다.

숙주 세포 게놈 내로 바이러스 DNA (vDNA)의 통합은 레트로 바이러스 생활주기에서 필수적인 단계이다. 통합은 안정적으로 삽입 된 프로 바이러스 (1)의 구축을 초래할 두 가지 촉매 공정을 행한다 바이러스 인테그라 제 효소 (IN)에 의해 달성된다. 서브 유닛의 IN 합체 2-4에 의해 함께 고정 단부 vDNA와 고차 intasome 형성 역전사를 통해 생성 된 선형 vDNA의 단부를 결합. 절단 IN 3&#39;- 처리로 알려진 과정에서 서열 3 &#39;하류 불변 5&#39;-CA-3에서의 단부 vDNA&#39;는 &#39;3 오목 떠나는 각 vDNA 5-8 말단에 반응성 히드 록 실기로 종료한다. intasome이어서 호스트의 대형 어셈블리의 일부와 사전 통합 복합체 (PIC) 9-11로 알려진 바이러스 단백질과 핵으로 가져옵니다. 셀룰러 대상 DNA (tDNA)를 발생한 후, I​​N은 3&#39;- 수산기 촉진제 vDNA를 사용UPS는 지그재그 방식으로 tDNA의 상단과 하단 가닥을 절단하고 동시에 가닥 전송 12, 13의 과정을 통해 tDNA 5 &#39;인산 그룹에 vDNA에 합류한다. 로컬 및 글로벌 규모에 레트로 바이러스 전시 통합 사이트 환경 설정. 로컬, 합의 통합 사이트는 약 다섯 vDNA 삽입 사이트 14, 15에서 상류 BP와 하류 10에서 걸쳐 약하게 보존 팔린 드롬 tDNA 시퀀스로 구성되어 있습니다. 전 세계적으로 레트로 바이러스는 특정 염색질 주석 (16)을 대상으로. 엡실론, 렌티 및 spuma을 통해 알파 - 일곱 가지 레트로 바이러스 장군이있다. gammaretroviruses 우선적으로 전사 시작 사이트 (TSSs) 및 활성 증강 영역 18 ~ 20에 통합하면서 HIV-1을 포함 렌티 바이러스는 적극적으로 전사 유전자 (17)의 신체 내에서 통합을 선호. 대조적으로, spumavirus 강하게 heterochrom으로 바이어스이러한 유전자 가난한 얇은 관련 도메인 (21) 등의 ATIC 지역. 지역 tDNA 기본 환경 설정 IN과 tDNA 13,22,23 사이의 핵 단백질 연락처의 특정 네트워크에 의해 결정 큰 부분에 있습니다. 렌티 바이러스 및 gammaretroviruses를 들어, 게놈 주석에 통합 상대는 IN과 동족 세포 요인 24-27 사이의 상호 작용에 의해 지배 큰 부분이다. 요인의 상호 작용 25-27,29-32 각각 로컬 및 글로벌 수준의 통합을 재 타겟팅 전략을 입증 IN-호스트 인 - tDNA 상호 작용 네트워크 13,22,23,28의 세부 사항을 변경 및 중단하거나 다시 엔지니어링. 레트로 바이러스 통합 사이트 카탈로그 사용한 DNA 시퀀싱 방법의 힘은 지난 수십 년 동안 상당히 증가 하였다. 통합 사이트는 연구 33, 34 당 고유 한 사이트의 단지 소수를 산출하기 힘든 정화 및 수동 복제 기술을 사용하여 선구적인 작업에 복구되었다.천 (17)에 수백로 증가 외인성 조직 배양 세포 감염에서 회복 사이트의 수와 필드 변환 인간 및 마우스 초안 게놈 개별 통합 사이트 매핑하는 기능 LTR 호스트 DNA 접합부 LM-PCR 증폭의 조합 18. NGS 방법과 LM-PCR의 최근 조합 라이브러리 깊이 폭등을 보냈습니다. 라이브러리 고유 시퀀스 19-21,39 수백만 얻을 수 DNA 클러스터링의 사용을 통해 시퀀싱하는 동안 특히 pyrosequencing는 수십 고유 통합 사이트 30,35-38 수천 정도의 수득 하였다. 여기에서 우리는 증폭 DNA 클러스터링 NGS를 사용하여 레트로 바이러스 통합 사이트를 시퀀싱에 최적화 된 LM-PCR 프로토콜을 설명합니다. 상기 방법은 이에 sequen 전에 추가 어댑터에 결찰 공정에 대한 요구를 배제, 증폭 된 DNA 분자에 따라서 직접 PCR 프라이머에 어댑터 서열을 요구하고 통합한다(40)을 향. 생물 정보학 분석 파이프 라인은, 게놈 기능을 관련의 독특한 통합 사이트 매핑 LTR-호스트 DNA 접합에 대한 원시 시퀀싱 데이터의 분석에서, 또한 일반적으로 설명한다. 이 분야에서 종래 방법론 36,38,41-43 프로토콜에서 설정된 우선 순위에 따라서, 사용자는 스크립트 정보학 파이프 라인의 특정 단계의 완료를 돕기 위해 개발 될 수있다. 유틸리티 및 프로토콜의 민감도 감염 대략 다수 1.0 (MOI)뿐만 아니라,이 DNA의 적정 계열에 감염된 조직 배양 세포에서 HIV-1 삽입 부위를 증폭하여 시퀀싱 한 매핑 대표 데이터로 도시되어 6.4 × 10 -5의 대략 동등한 MOI을 얻었다 15625 :에 감염되지 않은 세포의 DNA를 희석 한 최대 희석 단계를 5 배.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965-084</td><td>Standard cell culture medium, compatible with HEK293T cells</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH 30088.03</td><td>Different lots of serum may need to be pre-screened for optimal viral production</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Corning</td><td>30-002-Cl</td><td>Antibiotics to be added to DMEM</td></tr><tr><td>Phosphate-Buffered saline</td><td>Mediatech</td><td>21-040-CV</td><td>Used to wash cells</td></tr><tr><td>Trypsin EDTA</td><td>Corning</td><td>25-053-CI</td><td>Used to detach adherent cells from tissue culture plates</td></tr><tr><td>PolyJet</td><td>SignaGen Laboratories</td><td>SL100688</td><td>DNA transfection reagent</td></tr><tr><td>0.45 &amp;micro;m Filters</td><td>Thermo Scientific</td><td>09-740-35B</td><td>Used to filter virus particle-containing cell culture media</td></tr><tr><td>Turbo DNase</td><td>Ambion</td><td>AM2239</td><td>Used to degrade carryover plasmid DNA from virus stocks</td></tr><tr><td>HIV-1 p24 Antigen Capture Assay</td><td>ABL Inc.</td><td>5447</td><td>Used to quantify yield of virus production</td></tr><tr><td>DNeasy Blood &amp;amp; Tissue Kit</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td>Used to purify genomic DNA from cells</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Covaris</td><td>S2</td><td>With this model of sonicator perform two rounds of duty cycle, 5%; intensity, 3; cycles per burst, 200; time, 80 sec</td></tr><tr><td>Nuclease-Free Water</td><td>GeneMate</td><td>G-3250-125</td><td>Commercially-available water is recommended to reduce the possibility of sample cross-contamination</td></tr><tr><td>QIAQuick PCR Purification Kit</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td>Used to purify DNA during library construction</td></tr><tr><td>End-It DNA End-Repair Kit</td><td>Epicentre</td><td>ER81050</td><td>Used to repair DNA ends of sonicated DNA samples</td></tr><tr><td>Klenow Fragment (3&#039;-5&#039; exo&amp;ndash;)</td><td>New England Biolabs (NEB)</td><td>M0212S</td><td>Used with dATP to A-tail repaired DNA fragments</td></tr><tr><td>dATP</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0141</td><td>Deoxyadenosine triphosphate</td></tr><tr><td>MseI</td><td>NEB</td><td>R0525L</td><td>Restriction endonuclease for genomic DNA cleavage</td></tr><tr><td>BglII</td><td>NEB</td><td>R0144L</td><td>Restriction endonuclease to suppress amplification of upstream HIV-1 U5 sequence</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>NEB</td><td>M0202L/6218</td><td>Enzyme for covalent joining of compatible DNA ends</td></tr><tr><td>DNA Oligonucleotides</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>custom</td><td>Have the company purify the oligos. HPLC purification suffices for DNAs &amp;lt;30 nucleotides; PAGE purify longer DNAs&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Advantage 2 Polymerase Mix</td><td>Clontech</td><td>639202</td><td>Commercial mix containing DNA polymerase for PCR</td></tr><tr><td>dNTPs (100 mM solutions)</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0181</td><td>Dilute the four chemicals on ice with sterile water to reach the intermediate worrking concentrations of 2.5 mM each dNTP</td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>NanoDrop 2000</td><td>Spectrophotometer for determination of DNA concentration</td></tr><tr><td>Qubit Fluorimeter</td><td>Life Technologies</td><td>Qubit&amp;reg; 3.0</td><td>Fluorometer used to confirm integration site library DNA concentration</td></tr><tr><td>2200 TapeStation System</td><td>Agilent</td><td>G2964AA</td><td>Tape-based assay to confirm integration site library DNA size distribution</td></tr><tr><td>MiSeq</td><td>Illumina</td><td>SY-410-1003</td><td>Used for NGS</td></tr></tbody></table>

amplification, next-generation sequencing, and genomic dna mapping of retroviral integration sites

모두 로컬 및 글로벌 규모에 레트로 바이러스 전시 서명 통합 환경 설정. 여기서는 결찰 매개 PCR (LM-PCR) 증폭 및 차세대 시퀀싱 (NGS)를 사용하여 레트로 바이러스 통합 위치의 다양한 라이브러리 (1)의 생성에 대한 상세한 프로토콜, (2) 각각의 바이러스에의 게놈 위치에 맵핑을 제시 BEDTools 접합을 이용하고, (3)에 대한 통계 관련 데이터를 분석하는 호스트. 감염된 세포로부터 추출한 게놈 DNA를 제한 효소에 의해 또는 초음파 분해에 의해 분열된다. 적합한 DNA 최종 복구 한 후, 이중 가닥의 링커는 DNA 종료에 라이 게이션하고, 반 중첩 PCR은 바이러스의 긴 말단 반복 (LTR) 단부와 결찰 링커 DNA 모두에 상보적인 프라이머를 사용하여 수행된다. 상기 증폭 된 PCR 프라이머는 별도의 어댑터 결찰에 대한 요구 사항을 부정, NGS 동안 DNA 클러스터링에 필요한 시퀀스를 수행한다. 품질 관리 (QC)의 DNA 단편 크기 분포를 평가하고 적응 수행NGS 이전에 DNA의 결합을 어. 시퀀스 출력 파일 LTR 함유 판독 필터링되고 LTR 링커 정의 서열 얻어 자른된다. 트림 숙주 세포 서열은 BLAT를 사용하여 참조 게놈 맵핑하고 참조 게놈의 독특한 지점에 최소 97 % 동일성 필터링된다. 고유 한 통합 사이트는 다양한 게놈 기능에 인접한 염기 (NT) 순서 및 유통 기준에 대해 자세히 조사하고 있습니다. 이 프로토콜을 이용하여, 매우 복잡한 통합 사이트 라이브러리 사흘 게놈 DNA로부터 구성 될 수있다. 통합 사이트 분석에 민감한 조직 배양 세포의 외인성 바이러스 감염을 포함하여 전체 프로토콜에 따라서 약 1-2 주에 수행 될 수있다. 이 기술의 최근의 애플리케이션은 HIV 감염 환자에서 통합 부위의 길이에 관계 분석.

표 4는 대표적인 실험 결과는 감염된 세포 배양 물로부터 통합 사이트 회수 NGS의 감도를 도시한다. 감염되지 않은 세포의 DNA 직렬 평균 모든 세포는 하나의 통합 (40)를 포함하는 감염으로부터 게놈 DNA를 희석하여 사용 하였다. 15,625 : 희석액 (1)의 최대 희석 다섯 단계로 제조 하였다. 적정 시리즈의 게놈 DNA는 초음파에 의해 조각난 또는 제한과 소화에 의해 LM-PCR 다음 MseI 및 BglII에를, 엔도 뉴 클레아했다. 고유 통합 사이트의 수뿐만 아니라, 선택된 게놈 주석에 사이트 매핑 기단의 수는, 상기 프로토콜에 따라 계산 하였다. 데이터 분석은 이론적으로 하나의 15,625에 감염 된 세포에서 준비 도서관에서 발견 한 유일한 통합 사이트 (양의 1 ~ 2 %가 깔끔한 게놈 DNA로부터 회수) 수십를 한 것으로 밝혀졌습니다. </p&gt; 통합 부위의 데이터 세트를 분석 할 때, 임의의 매칭 제어 또는 MRC이라고 무작위 게놈 부위의 유사한 세트로 데이터를 비교하는 것이 중요하다. 대표적인 결과를 제한 효소 절단 또는 초음파에 의해 게놈 DNA를 전단으로 MRC 개의 상이한 데이터 세트가 생성되었다. MRC 랜덤 숨겨 10,000 사이트 설정 게놈 마커로부터의 거리에 대한 정규화없이 생성 반면 MRC ENZ는 임의로 MseI 및 BglII에 제한 효소 절단 부위의 부근에 hg19에서 사이트를 선택함으로써 생성 된 고유 50000 게놈 부위를 함유 하였다. 독특한 게놈 위치로 다시 매핑 할 수 있습니다 만 사이트는 MRC 데이터 세트에서 사용되어야한다. 순서 바이어스에서 본질적 초음파 가위 게놈 DNA로, MRC 랜덤은 초음파에 의한 DNA의 분열에 의해 생성 된 데이터 세트에 더 적용으로 볼 수있다. 제어 통합의 다른 스타일사이트 데이터 세트는, 단백질의 재조합 반응에 의해 시험 관내에서 intasome 핵 단백질 21 착체 또는 탈 단백 게놈 DNA와 심하게 감염된 세포 (17)로부터 추출 찍어하고 LM-PCR을 다음과 NGS 21 프로토콜을 생성 할 수있다. 통합 사이트의 분포 회수 제한 다이제스트 (비교 깔끔한 샘플 사이)뿐만 아니라 랜덤 MRC ENZ와 MRC에 비교를 위해, 그림 2에 표시됩니다. 대 초음파에 의해 복구 된 통합 사이트의 분포의 비교에 대한 P 값 다음 초음파가 된 CpG 섬에 근접 측면에서 분명 가장 큰 변화로, 효소 검사 모든 주석에 대한 소화 제한에 의해 회수 된 것과 유사했다. 예상 18,65 두 데이터 세트 나온 RefSeq 유전자 및 유전자 D 내에 통합 측면에서 MRCS 크게 차이로서두 데이터 세트의 CpG 섬에 분포 TSSs 상대적인 관점에서 MRCS 유사한 동안 ensity 평균 통합 사이트 주변. 비교적 소수의 HIV-1 통합 사이트 사이트들의 총 수가 증가 회수하는의 CpG 섬 또는 TSS 2.5 KB 내에 맵핑 이후 데이터 집합 (표 4 및도 2) 사이에서 발생할 수있는 변동을 감소시키기 쉽다. 시퀀스 로고 통합 사이트 데이터의 신뢰성을 확인하기 위해도 3에 도시되어있다. 합의 HIV-1 통합 부위 14, 22 (-3) TDG (G / V) TWA (C / B) CHA (7) ( 국제 연합 (EU) 생화학의 기본 코드를 사용하여 작성, 백 슬래시는 vDNA의 위치를​​ 나타냅니다 플러스 가닥에 가입하고 밑줄은 5 bp의 시퀀스는 HIV-1 통합 및 DNA 수리) 두 조각 기술에 의해 제조 라이브러리에 대한 명백한 다음 중복 표시, 확실성의 정도는 감염된 세포의 증가 희석 감소하지만,DNA. 반면에 의해 MRC 데이터 세트에서 정렬 된 임의의 사이트는 기본 환경 설정의 상당한 수준을 생성하지 못했습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53840/53840fig1.jpg" /> 그림 1 :. 통합 사이트 라이브러리 준비의 흐름 차트 그림 (A), 48 시간 이상 HEK293T 세포, 수확 및 필터링 뜨는 형질 초 원심 분리하여 농축 및 바이러스의 적절한 농도와 표적 세포를 감염시켜 바이러스 주식을 생성합니다. 감염 후 최소 5 일, 게놈 DNA를 추출합니다. 섹션 1을 참조하여 추가 실험 자세한 내용은 본문의 2. (B 및 C)의 조각은 제한 효소에 의해 또는 초음파 분해하여 게놈 DNA를 정제 하였다. 제한 효소 칵테일 하류 상류 바이러스 LTR에서 절단이 카운터-선택하는 것이 효소 (예를 들어 BglII에) LM-P에 대한이 포함되어야내부 vDNA 서열 CR 증폭. 녹색 별표 (*)와 (C)의 분기 화살표는 BglII에이 링커 결찰 후 적용되어야 함을 나타낸다. 검은 하이라이트 휴대 순서를 호스트하는 동안 빨간색 하이라이트 바이러스 시퀀스. 묵시적 DNA 브레이크 포인트 (축척되지 않은) &quot;(X)&quot;으로 표시됩니다 HIV-1은 수많은 MseI 및 BglII에 사이트를 포함, 전용 프로토콜에 관련된 사람들이 표시됩니다. 지도 위의 브래킷은 우선적으로 LM-PCR에 의해 증폭 된 U5 - 세포 DNA 영역을 나타낸다. (D) 단편화 된 DNA를 정제하여 (후 엔드 수리 초음파의 경우와 테일) 및 (푸른 색) (E) 호환 비대칭 링커 분자에 결찰. (D)의 마젠타 원은 증폭 될 통합 사이트를 나타냅니다. 링커 단편 가닥의 3 &#39;말단에 별표 아미노 차단 수정 나타낸다. 첫 라운드 LTR 프라이머 (빨간색) 및 링커 프라이머 (파란색)를 사용하여 반 중첩 된 PCR의 (F) 행동 첫 라운드. t에서LTR 프라이머는 서열이 부족 동안 그의 PCR 라운드는 링커 프라이머는 DNA 클러스터링 및 (파란색 링커 프라이머에 녹색 부속으로 그룹화) 시퀀스를 결합 NGS 프라이머에 대한 암호화한다. (G) 첫 라운드 PCR 제품을 정화 반 중첩 된 PCR의 두 번째 라운드를 실시하고 있습니다. PCR이 라운드에서 함께 DNA 클러스터링 및 NGS 프라이머 결합 서열을 운반 번째 라운드 LTR 프라이머 (적색)과 다중화 바코드 (함께 첫 번째 라운드 (청색 + 녹색 부속물)와 같은 링커 프라이머를 사용 빨간색 LTR 프라이머에 녹색 부속)로 그룹화합니다. (H) (마젠타 색 원으로 표시된 통합 사이트, 마젠타 박스형) 최종 통합 사이트 라이브러리로 두 번째 라운드 PCR 생성물을 정제 하였다. QC 및 NGS에 대한 시퀀싱 시설에 나누어을 제출합니다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53840/53840fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img의 고도 = &quot;그림 2&quot;SRC = &quot;/ 파일 / ftp_upload / 53840 / 53840fig2.jpg&quot;/&gt; 그림 2 :. P 값 각각의 MRCS 대 효소 소화 초음파 처리 또는 제한에 의해 DNA 분열에 따라 통합 사이트 증폭의 비교에 대한 나온 RefSeq 유전자 근처의 CpG 섬과 TSSs 내에서 통합 사이트뿐만 아니라 지역 유전자 밀도 프로파일의 숫자에 나열되어 있습니다 . 굵게 및 기울임 꼴 텍스트로 강조 표시됩니다 ≥0.05 표 4 P 값 윌 콕슨 순위 합 테스트에 의해 계산 피셔의 정확한 테스트 ㄴ P 값으로 계산 된 P 값 C MRC ENZ :... 임의의 제어를 일치; 50000 고유 통합 사이트 집합 임의로 수은 빌드 MseI / BglII에 제한 사이트에 근접한 위치를 선택하여 생성 된 제 거라고 MRC 랜덤 : 랜덤 selecti 제조 만 고유 삽입 부위를 포함하는 임의의 제어 유사한제한 사이트 접근을 정상화하지 않고 hg19에서 NG 위치. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53840/53840fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/53840/53840fig3.jpg" /> 그림 3 : 대표 실험 도서관에서 순서 로고 묘사 한 HIV-1 기본 환경 설정 WebLogo 소프트웨어를 사용하여 정렬 된 제한 효소 (A) 소화 또는 (B) 초음파에 의해 제조 된 라이브러리의 통합 사이트.. 하단 15,625 : 적정 계열의 각 희석 한 최대 희석 도면의 상단 깔끔한 DNA에서 도시된다. 50,000 독특한 게놈 사이트의 MRC에 대한 (C) 순서 로고. 오차 막대는 기본적으로 특정 위치에 기본 통합의 표준 편차를 나타냅니다. 구체적으로는, t각 오류 줄의 otal 높이가 상대적으로 작은 데이터 세트에 존재하는 엔트로피의 과소 평가에 대한 컨트롤을 두 번 작은 샘플 보정 (66)에 해당합니다. x 축은 0 점에서 통합의 사이트에 대해 숙주 세포 게놈 DNA NT를 위치를 나타냅니다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53840/53840fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="1 번 테이블" src="/files/ftp_upload/53840/53840table1.jpg" /> . 표 1 : 링커 건설 및 PCR 증폭을위한 올리고 뉴클레오티드 시퀀스 링커 구체적이고 두 번째 라운드 LTR 프라이머는 색상 코드는 다음과 같습니다 DNA 클러스터링 어댑터 시퀀스, 인코딩 : 검정, 링커 또는 HIV-1 LTR에 상보적인 염기; 빨강, 고유 인덱스 또는 바코드; 녹색, 결합 부위 염기 서열의 프라이머; DNA 클러스터링 파란색, 어댑터 시퀀스. 싱글 엔드 (SE) 시퀀싱 정말이에요쌍 엔드 (PE) 반응 (READ1 및 READ2) 시퀀싱 프라이머를 모두 사용하면서 ctions는 제 2 라운드 LTR 프라이머 READ1 (녹색) 순서에 어닐링 시퀀싱 프라이머를 활용합니다. 링커 짧은 가닥 수정을 차단 3 &#39;아미노산이 포함되어 있습니다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53840/53840table1large.jpg" target="_blank">이 테이블의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 시약 </td><td> 반응에 따라 추가하는 방법 </td></tr><tr><td> 첫 번째 라운드 LTR 프라이머 (15 μM) : </td><td> 2.5 μL </td></tr><tr><td> 링커 특정 프라이머 (15 μM) : </td><td> 0.5 μL </td></tr><tr><td> 10 배 PCR 버퍼 : </td><td> 2.5 μL </td></tr><tr><td> 의 dNTPs (2.5 mM의 각) </td><td> 0.5 μL </td></tr><tr><td> DNA 중합 효소 믹스 : </td><td> 0.5 μL</td></tr><tr><td> 연결 반응 : </td><td> 100 NG </td></tr><tr><td> 클레아없는 물 : </td><td> 최대 25 μL </td></tr></tbody></table> 표 2. 1 라운드 PCR 레시피 지정된 각 시약의 양은 각각의 PCR 튜브에 첨가 표시한다. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 시약 </td><td> 반응에 따라 추가하는 방법 </td></tr><tr><td> 두 번째 라운드 LTR 프라이머 (15 μM) : </td><td> 2.5 μL </td></tr><tr><td> 링커 특정 프라이머 (15 μM) : </td><td> 0.5 μL </td></tr><tr><td> 10 배 PCR 버퍼 : </td><td> 2.5 μL </td></tr><tr><td> 의 dNTPs (2.5 mM의 각) </td><td> 0.5 μL </td></tr><tr><td> DNA 중합 효소 믹스 : </td><td> 0.5 μL </td></tr><tr><td> 첫 라운드 PCR : </TD&gt; <td> 100 NG </td></tr><tr><td> 클레아없는 물 : </td><td> 최대 25 μL </td></tr></tbody></table> 표 3. 두 번째 라운드 PCR 레시피 각 시약의 양은 각각의 PCR 튜브에 첨가 될가 표시된다. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 도서관 </td><td> #Unique 사이트 </td><td> % 나온 RefSeq </td><td> %의 CpG +/- 2.5 킬로바이트의 B </td><td> % TSS +/- 2.5 킬로바이트의 C </td><td> 부근에 있습니다. 유전자 밀도 +/- 500킬로바이트 d를 </td></tr><tr><td> 초음파, 깔끔한 </td><td> 3,169 </td><td> 71.2 </td><td> 5.1 </td><td> 3.7 </td><td> 15.8 </td></tr><tr><td> 초음파, 1 : 5 </td><td> 366 </td><td> 75.1 </td><td> 2.7 </td><td> 삼 </td><td> 16.3 </td></tr><tr><tD&gt; 초음파 처리 1:25 </td><td> (254) </td><td> (74) </td><td> 7.1 </td><td> 5.1 </td><td> 16.7 </td></tr><tr><td> 초음파, 1 : 125 </td><td> (430) </td><td> 69.8 </td><td> 6.9 </td><td> 6 </td><td> 14.6 </td></tr><tr><td> 초음파, 1 : 625 </td><td> (314) </td><td> 65.6 </td><td> 5.6 </td><td> 6.7 </td><td> 13.5 </td></tr><tr><td> 초음파, 1 : 3125 </td><td> (116) </td><td> 73.6 </td><td> 3.5 </td><td> 2.5 </td><td> 13.1 </td></tr><tr><td> 초음파, 1 : 15,625 </td><td> (72) </td><td> 62.5 </td><td> 0 </td><td> 1.4 </td><td> 14.7 </td></tr><tr><td> 다이제스트, 깔끔한 </td><td> 7,428 </td><td> 69.8 </td><td> 3.6 </td><td> 2.9 </td><td> 15.2 </td></tr><tr><td> 다이제스트, 1 : 5 </td><td> 1,460 </td><td> 71.4 </td><td> 4.4 </td><td> 3.4 </td><td> 14.9 </td></tr><tr><td> 다이제스트 1:25 </td><td> 394 </td><td> 68.8 </td><td> 4.3 </td><td> 3.3 </td><td> 15.8 </td></tr><tr> &lt;TD&gt; 다이제스트, 1 : 125 </td><td> (172) </td><td> (71) </td><td> 0 </td><td> 삼 </td><td> (14) </td></tr><tr><td> 다이제스트, 1 : 625 </td><td> (134) </td><td> 73.9 </td><td> 3.7 </td><td> 3.7 </td><td> 14.1 </td></tr><tr><td> 다이제스트, 1 : 3125 </td><td> (100) </td><td> 83.1 </td><td> 6.4 </td><td> 5.2 </td><td> 19.1 </td></tr><tr><td> 다이제스트, 1 : 15,625 </td><td> 73 </td><td> (74) </td><td> 4.1 </td><td> 1.4 </td><td> 9.7 </td></tr><tr><td> MRC ENZ 전자 </td><td> 50000 </td><td> 44.7 </td><td> 4.2 </td><td> 4 </td><td> 8.7 </td></tr><tr><td> MRC 임의 F </td><td> 만 </td><td> 41.3 </td><td> 5.3 </td><td> 4.2 </td><td> 8.6 </td></tr></tbody></table> 표 4 : 대표 적정 시리즈에서 통합 사이트의 게놈 배포 일 전체 통합 사이트의 비율입니다.TSSs의 2.5 킬로바이트 내에서의 CpG 섬의 2.5 킬로바이트에서 B A 나온 RefSeq 유전자 내에있는, 그리고 C에서 D 평균 통합 사이트를 둘러싸는 1 메가 내의 유전자 밀도 전자 MRC ENZ :.. 임의의 제어를 일치; 50000 고유 통합 사이트 집합 임의로 hg19에 MseI / BglII에 제한 사이트에 근접한 위치를 선택하여 제조 하였다 MRC 임의 F :. 임의로 고정 위치로 정규화하지 hg19의 위치를 선택하여 생성 만의 고유 통합 사이트를 함유하는 유사한 임의의 제어.

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Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

레트로 바이러스 통합 사이트의 증폭, 차세대 시퀀싱 및 게놈 DNA 매핑

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

17.5K 조회수.  Dana-Farber Cancer Institute. We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

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Bidirectional Retroviral Integration Site PCR Methodology and Quantitative Data Analysis Workflow

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral gene therapy studies, IS assays, in combination with next-generation sequencing, have been used as a cell-tracking tool to characterize clonal stem cell populations sharing the same IS. For the accurate comparison of repopulating stem cell clones within and across different samples, the detection sensitivity, data reproducibility, and high-throughput capacity of the assay are among the most important assay qualities. This work provides a detailed protocol and data analysis workflow for bidirectional IS analysis. The bidirectional assay can simultaneously sequence both upstream and downstream vector-host junctions. Compared to conventional unidirectional IS sequencing approaches, the bidirectional approach significantly improves IS detection rates and the characterization of integration events at both ends of the target DNA. The data analysis pipeline described here accurately identifies and enumerates identical IS sequences through multiple steps of comparison that map IS sequences onto the reference genome and determine sequencing errors. Using an optimized assay procedure, we have recently published the detailed repopulation patterns of thousands of Hematopoietic Stem Cell (HSC) clones following transplant in rhesus macaques, demonstrating for the first time the precise time point of HSC repopulation and the functional heterogeneity of HSCs in the primate system. The following protocol describes the step-by-step experimental procedure and data analysis workflow that accurately identifies and quantifies identical IS sequences.

This manuscript describes the experimental procedure and software analysis for a bidirectional integration site assay that can simultaneously analyze upstream and downstream vector-host junction DNA. Bidirectional PCR products can be used for any downstream sequencing platform. The resulting data are useful for a high-throughput, quantitative comparison of integrated DNA targets.

양방향 레트로 바이러스 통합 사이트 PCR 방법론 및 정량적 데이터 분석 워크 플로

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral ...

연구

유전학

Retroviral Scanning: Mapping MLV Integration Sites to Define Cell-specific Regulatory Regions

Moloney murine leukemia (MLV) virus-based retroviral vectors integrate predominantly in acetylated enhancers and promoters. For this reason, mLV integration sites can be used as functional markers of active regulatory elements. Here, we present a retroviral scanning tool, which allows the genome-wide identification of cell-specific enhancers and promoters. Briefly, the target cell population is transduced with an mLV-derived vector and genomic DNA is digested with a frequently cutting restriction enzyme. After ligation of genomic fragments with a compatible DNA linker, linker-mediated polymerase chain reaction (LM-PCR) allows the amplification of the virus-host genome junctions. Massive sequencing of the amplicons is used to define the mLV integration profile genome-wide. Finally, clusters of recurrent integrations are defined to identify cell-specific regulatory regions, responsible for the activation of cell-type specific transcriptional programs.
The retroviral scanning tool allows the genome-wide identification of cell-specific promoters and enhancers in prospectively isolated target cell populations. Notably, retroviral scanning represents an instrumental technique for the retrospective identification of rare populations (e.g. somatic stem cells) that lack robust markers for prospective isolation.

Here, we describe a protocol for genome-wide mapping of the integration sites of Moloney murine leukemia virus-based retroviral vectors in human cells.

레트로 바이러스 스캐닝 : MLV 통합 사이트 맵핑으로 세포 특정 규제 지역 정의

Moloney murine leukemia (MLV) virus-based retroviral vectors integrate predominantly in acetylated enhancers and promoters. For this reason, mLV ...

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

So this is a 10 day old mouse pup and I'm going to be taking a tail biopsy and then I'm going to extract genomic DNA from its tail. So what I'm gonna do is snip a little bit of its tail off, roughly about three millimeters, and then I'll place the piece of tail in an einor tube and I'll place the einor tube on dry ice. Now, to avoid contamination from one mouse to another, I usually mark the razor blade at the part in which I made the last cut.That way for the next mouse, I'll be sure to use a clean piece of razor blade for taking the next tail biopsy. In order to distinguish between the different mice in your litter, you're gonna need a way to identify the mice. One way to do that is by punching a hole in their ears using an ear hole puncher that's shown here.Gently take the mouse by the scruff of its neck like so turn it over and pinch its tail between your fingers. Take the ear hole puncture in the other hand and make a quick snip in the mouse's ear there. See how painless that was?Okay, so now you can see I've got some pieces of tail in these einor tubes and now I'm gonna add the solutions that will help them to digest. First I'm going to add 720 microliters of STE solution, and then I'm going to add 30 microliters of protein. Ace K.So here's a look at the piece of tail that we've cut prior to digestion.Now I'm gonna place the tail pieces on a 55 degree heating block. Many protocols call for continuous motion rocking at 55 degrees, but for my purposes this won't be necessary because I'll be vortexing the tail pieces. Now I'm gonna vortex the piece of tail for two seconds.One, two. So after vortexing, here's a look at what's left inside the einor tube here, and you could see that the piece of tail has been completely dissolved and activate the proteinase K at 70 degrees Celsius for five minutes. Quench on ice for five minutes.Spin down tail pieces in a micro centrifuge for 10 minutes at full speed. In this micro centrifuge, full speed is 13, 000 RPMs. While the digestive tails are spinning down, label some einor tubes fill the einor tubes with 750 microliters of isopropanol.After spinning down the digested tails, the hair and undigested material will form a pellet at the bottom of the tube decant. The solution containing the digested material, STE and proteinase K into the einor tube containing the isopropanol DNA will begin to come out of solution, will appear ghostlike and feather like, and right there swimming around that bubble is genomic DNA that's been isolated from the mouse's tail. After mixing the isopropanol and STE solution, the genomic DNA will come out of solution and it is appear as this little ball right here, spin down the precipitated genomic DNA for five minutes at full speed in a micro centrifuge.There at the bottom of the tube is a look at our pelleted genomic DNA. Now I'm going to aspirate out the solution inside the tube, leaving only the pellet of genomic DNA behind. Each time I aspirate another tube, I'll change the pipe.Pet tip on the tip of this aspirator. After aspirating away the STE and isopropanol, I'll add one milliliter of 70%ethanol to wash the genomic DNA pellet. Because the pellet of genomic DNA usually adheres to the side of a micro fuge tube and is difficult to get off to thoroughly wash it in the 70%ethanol, you'll need to rake it across the micro fuge tube rack I have here.You can do that like so. So here's a look at the genomic DNA after it's been pelleted and washed in 70%ethanol. I'm gonna spin this down again at full speed for five minutes and then aspirate away the 70%ethanol spin down the genomic DNA pellets after they've been washed.Their 70%ethanol five minutes at full speed, going to aspirate the 70%ethanol and let the DNA dry for five minutes. There's a look at the genomic DNA pellet at the bottom of the tube, and that's about as dry as you want to get it. So I've dried out the pellets of genomic DNA from the mouse tails, and now I'm gonna add a hundred microliters of 40 millimolar triss at pH eight.So I've got the genomic DNA at 50 degrees Celsius, where it will go into solution more rapidly than add room temperature. After about an hour or so at 50 degrees, I'll either freeze it or put it at four degrees until I want to run my PCR reactions to actually figure out which mice are positive for my transgene.

마우스 뒷면에서 게놈 DNA의 분리

생물학

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near full-length (intact and defective), HIV-1 proviruses. FLIPS allows determination of the genetic composition of integrated HIV-1 within a cell population. Through identifying defects within HIV-1 proviral sequences that arise during reverse transcription, such as large internal deletions, deleterious stop codons/hypermutation, frameshift mutations, and mutations/deletions in cis acting elements required for virion maturation, FLIPS can identify integrated proviruses incapable of replication. The FLIPS assay can be utilized to identify HIV-1 proviruses that lack these defects and are&#160;therefore potentially replication-competent. The FLIPS protocol involves: lysis of HIV-1 infected cells, nested PCR of near full-length HIV-1 proviruses (using primers targeted to the HIV-1 5&#39; and 3&#39; LTR), DNA purification and quantification, library preparation for Next-generation Sequencing (NGS), NGS, de novo assembly of proviral contigs, and a simple process of elimination for identifying replication-competent proviruses. FLIPS provides advantages over traditional methods designed to sequence integrated HIV-1 proviruses, such as single-proviral sequencing. FLIPS amplifies and sequences near full-length proviruses enabling replication competency to be determined, and also uses fewer amplification primers, preventing the consequences of primer mismatches. FLIPS is a useful tool for understanding the genetic landscape of integrated HIV-1 proviruses, especially within the latent reservoir, however, its utilization can extend to any application in which the genetic composition of integrated HIV-1 is required.

Full-length individual proviral sequencing (FLIPS) provides an efficient and high-throughput method for the amplification and sequencing of single, near full-length (intact and defective) HIV-1 proviruses and allows for determination of their potential replication-competency. FLIPS overcomes limitations of previous assays designed to sequence the latent HIV-1 reservoir.

다음-세대 시퀀싱에 대 한 전체 길이 HIV-1 Proviruses 근처의 증폭

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

InSET: A Novel Tool for Unbiased Genome-Wide Functional Element Discovery

Identification of Functionally-Relevant Lentivirus Integration Sites in an Insertional Mutagenesis Cell Library

The extent of functional sequences within the human genome is a pivotal yet debated topic in biology. Although high-throughput reverse genetic screens have made strides in exploring this, they often limit their scope to known genomic elements and may introduce non-specific effects. This underscores the urgent need for novel functional genomics tools that enable a deeper, unbiased understanding of genome functionality. This protocol introduces the Insertion-based Screen for functional Elements and Transcripts (InSET), a method for identifying lentivirus integration sites within a lentivirus-based insertional mutagenesis cell library. InSET facilitates the capture of genome-wide lentiviral integration sites, with next-generation sequencing used to detect and quantify flanking sequences. InSET's design enables the analysis of integration site abundance variations in phenotypic screens on a large scale, establishing it as a robust tool for forward genetics and for identifying functional genomic elements. A key benefit of InSET is its capacity to reveal previously unidentified genomic elements, including novel functional exons of both protein-coding and non-coding RNAs, independent of prior annotation. Overall, InSET holds significant value in studying the intricate complexity of the human genome and transcriptome, where many genomic elements await functional characterization.

Insertional mutagenesis is an essential tool in forward genetics for identifying functional genomic elements. Here, we describe the Insertion-based Screen for functional Elements and Transcripts (InSET), a method for detecting lentivirus integration sites within a lentivirus-based insertional mutagenesis cell library.

The extent of functional sequences within the human genome is a pivotal yet debated topic in biology. Although high-throughput reverse genetic screens ...

Genomic MRI - a Public Resource for Studying Sequence Patterns within Genomic DNA

Non-coding genomic regions in complex eukaryotes, including intergenic areas, introns, and untranslated segments of exons, are profoundly non-random in their nucleotide composition and consist of a complex mosaic of sequence patterns. These patterns include so-called Mid-Range Inhomogeneity (MRI) regions -- sequences 30-10000 nucleotides in length that are enriched by a particular base or combination of bases (e.g. (G+T)-rich, purine-rich, etc.). MRI regions are associated with unusual (non-B-form) DNA structures that are often involved in regulation of gene expression, recombination, and other genetic processes (Fedorova &amp; Fedorov 2010). The existence of a strong fixation bias within MRI regions against mutations that tend to reduce their sequence inhomogeneity additionally supports the functionality and importance of these genomic sequences (Prakash et al. 2009).
Here we demonstrate a freely available Internet resource -- the Genomic MRI program package -- designed for computational analysis of genomic sequences in order to find and characterize various MRI patterns within them (Bechtel et al. 2008). This package also allows generation of randomized sequences with various properties and level of correspondence to the natural input DNA sequences. The main goal of this resource is to facilitate examination of vast regions of non-coding DNA that are still scarcely investigated and await thorough exploration and recognition.

We present a public computational web site for the analysis of genomic sequences. It detects DNA sequence patterns with various non-random nucleotide compositions. This resource also generates randomized sequences with diverse levels of complexity.

게놈 MRI - 게놈 DNA 시퀀스 내의 패턴을 학습에 대한 공개 자료

Non-coding genomic regions in complex eukaryotes, including intergenic areas, introns, and untranslated segments of exons, are profoundly non-random in ...

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily. The tempo of these advances is accelerating, promising greater depth and breadth. In light of these extraordinary advances, the need for fast, parallel methods to define gene function becomes ever more important. Collections of genome-wide deletion mutants in yeasts and E. coli have served as workhorses for functional characterization of gene function, but this approach is not scalable, current gene-deletion approaches require each of the thousands of genes that comprise a genome to be deleted and verified. Only after this work is complete can we pursue high-throughput phenotyping. Over the past decade, our laboratory has refined a portfolio of competitive, miniaturized, high-throughput genome-wide assays that can be performed in parallel. This parallelization is possible because of the inclusion of DNA 'tags', or 'barcodes,' into each mutant, with the barcode serving as a proxy for the mutation and one can measure the barcode abundance to assess mutant fitness. In this study, we seek to fill the gap between DNA sequence and barcoded mutant collections. To accomplish this we introduce a combined transposon disruption-barcoding approach that opens up parallel barcode assays to newly sequenced, but poorly characterized microbes. To illustrate this approach we present a new Candida albicans barcoded disruption collection and describe how both microarray-based and next generation sequencing-based platforms can be used to collect 10,000 - 1,000,000 gene-gene and drug-gene interactions in a single experiment.

We have developed comprehensive, unbiased genome-wide screens to understand gene-drug and gene-environment interactions. Methods for screening these mutant collections are presented.

Barcoded 효모 게놈 라이브러리의 경쟁력 화면

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the subcellular distribution of a specific tagged fluorescent marker in the secretory pathway. Arabidopsis is a powerful biological model for genetic studies because of its genome size, generation time, and conservation of molecular mechanisms among kingdoms. The array genotyping as an approach to map the mutation in alternative to the traditional method based on molecular markers is advantageous because it is relatively faster and may allow the mapping of several mutants in a really short time frame. This method allows the identification of proteins that can influence the integrity of any organelle in plants. Here, as an example, we propose a screen to map genes important for the integrity of the endoplasmic reticulum (ER). Our approach, however, can be easily extended to other plant cell organelles (for example see1,2), and thus represents an important step toward understanding the molecular basis governing other subcellular structures.

A fundamental quest in cell biology is to define the mechanisms that underlie the identity of the organelles that make eukaryotic cells. Here we propose a method to identify the genes responsible for the morphological and functional integrity of plant organelles using fluorescence microscopy and next-generation sequencing tools.

형광 - 현미경 검사와 차세대 장면 : Organelle 무결성에 관련된 유전자의 식별을위한 유용한 도구

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene expression, maintenance of genome integrity, parental imprinting, X-chromosome inactivation, regulation of development, aging, and cancer1. Recently, the presence of an oxidized 5-mC, 5-hydroxymethylcytosine (5-hmC), was discovered in mammalian cells, in particular in embryonic stem (ES) cells and neuronal cells2-4. 5-hmC is generated by oxidation of 5-mC catalyzed by TET family iron (II)/&alpha;-ketoglutarate-dependent dioxygenases2, 3. 5-hmC is proposed to be involved in the maintenance of embryonic stem (mES) cell, normal hematopoiesis and malignancies, and zygote development2, 5-10. To better understand the function of 5-hmC, a reliable and straightforward sequencing system is essential. Traditional bisulfite sequencing cannot distinguish 5-hmC from 5-mC11. To unravel the biology of 5-hmC, we have developed a highly efficient and selective chemical approach to label and capture 5-hmC, taking advantage of a bacteriophage enzyme that adds a glucose moiety to 5-hmC specifically12.
Here we describe a straightforward two-step procedure for selective chemical labeling of 5-hmC. In the first labeling step, 5-hmC in genomic DNA is labeled with a 6-azide-glucose catalyzed by &beta;-GT, a glucosyltransferase from T4 bacteriophage, in a way that transfers the 6-azide-glucose to 5-hmC from the modified cofactor, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). In the second step, biotinylation, a disulfide biotin linker is attached to the azide group by click chemistry. Both steps are highly specific and efficient, leading to complete labeling regardless of the abundance of 5-hmC in genomic regions and giving extremely low background. Following biotinylation of 5-hmC, the 5-hmC-containing DNA fragments are then selectively captured using streptavidin beads in a density-independent manner. The resulting 5-hmC-enriched DNA fragments could be used for downstream analyses, including next-generation sequencing.
Our selective labeling and capture protocol confers high sensitivity, applicable to any source of genomic DNA with variable/diverse 5-hmC abundances. Although the main purpose of this protocol is its downstream application (i.e., next-generation sequencing to map out the 5-hmC distribution in genome), it is compatible with single-molecule, real-time SMRT (DNA) sequencing, which is capable of delivering single-base resolution sequencing of 5-hmC.

Described is a two-step labeling process using &beta;-glucosyltransferase (&beta;-GT) to transfer an azide-glucose to 5-hmC, followed by click chemistry to transfer a biotin linker for easy and density-independent enrichment. This efficient and specific labeling method enables enrichment of 5-hmC with extremely low background and high-throughput epigenomic mapping via next-generation sequencing.

게놈 DNA에서 도보로 5 hydroxymethylcytosine의 선택적 캡처

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

Linear Amplification Mediated PCR &#8211; Localization of Genetic Elements and Characterization of Unknown Flanking DNA

Linear-amplification mediated PCR (LAM-PCR) has been developed to study hematopoiesis in gene corrected cells of patients treated by gene therapy with integrating vector systems. Due to the stable integration of retroviral vectors, integration sites can be used to study the clonal fate of individual cells and their progeny. LAM- PCR for the first time provided evidence that leukemia in gene therapy treated patients originated from provirus induced overexpression of a neighboring proto-oncogene. The high sensitivity and specificity of LAM-PCR compared to existing methods like inverse PCR and ligation mediated (LM)-PCR is achieved by an initial preamplification step (linear PCR of 100 cycles) using biotinylated vector specific primers which allow subsequent reaction steps to be carried out on solid phase (magnetic beads). LAM-PCR is currently the most sensitive method available to identify&#160;unknown DNA which is located in the proximity of known DNA. Recently, a variant of LAM-PCR has been developed that circumvents restriction digest thus abrogating retrieval bias of integration sites and enables a comprehensive analysis of provirus locations in host genomes. The following protocol explains step-by-step the amplification of both 3&#8217;- and 5&#8217;- sequences adjacent to the integrated lentiviral vector.

Linear-amplification mediated (LAM)-PCR is a method developed to identify the exact positions of integrating viral vectors in the genome. The technique has evolved to be the superior method to study clonal dynamics in gene therapy patients, biosafety of novel vector technologies, T-cell diversity, cancer stem cell models, etc.

선형 증폭 매개 PCR - 알 수없는 측면에서는 DNA의 유전 적 요소와 특성의 현지화

Linear-amplification mediated PCR (LAM-PCR) has been developed to study hematopoiesis in gene corrected cells of patients treated by gene therapy with ...